I filamenti intermedi e microtubuli con microscopia di ricostruzione ottico stocastico diretto 2-dimensionale di imaging

Biology

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Summary

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di dare le condizioni sperimentali ottimali dalla preparazione del campione per acquisizione di immagini e la ricostruzione al fine di eseguire immagini dSTORM 2D doppio colore dei microtubuli e filamenti intermedi in celle fisse

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Leduc, C., Salles, A., Shorte, S. L., Etienne-Manneville, S. Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. J. Vis. Exp. (133), e57087, doi:10.3791/57087 (2018).

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Abstract

Il citoscheletro, composto di microfilamenti di actina, microtubuli e filamenti intermedi (IF), svolge un ruolo chiave nel controllo della forma delle cellule, la polarità e la motilità. L'organizzazione delle reti di actina e dei microtubuli è stato studiato estesamente, ma quella di IFs non è ancora pienamente caratterizzato. IFs hanno un diametro medio di 10 nm e forma una rete che si estende in tutto il citoplasma delle cellule. Sono fisicamente associate con l'actina e i microtubuli attraverso motori molecolari e linker del citoscheletro. Questa stretta associazione è al centro dei meccanismi normativi che garantiscono la regolazione coordinata delle tre reti del citoscheletro necessari per la maggior parte delle funzioni delle cellule. È pertanto fondamentale per visualizzare IFs da solo e anche insieme a ciascuna delle altre reti del citoscheletro. Tuttavia, se le reti sono estremamente dense nella maggior parte dei tipi di cellule, soprattutto nelle cellule gliali, che rende molto difficile da raggiungere con microscopia di fluorescenza standard la sua risoluzione (risoluzione di ~ 250 laterale nm). Microscopia ottica stocastica diretta di ricostruzione (dSTORM) è una tecnica che permette un guadagno nella risoluzione laterale di un ordine di grandezza. Qui, indichiamo che laterale dSTORM risoluzione è sufficiente per risolvere l'organizzazione densa delle reti se e, in particolare, dei pacchi di se che circondano i microtubuli. Tale stretta associazione è probabile che partecipano alla regolazione coordinata di queste due reti e maggio, spiegare come modello IFs vimentin e stabilizzare la organizzazione dei microtubuli, nonché potrebbe influenzare il traffico vescicolare dipendente dei microtubuli. Più in generale, vi mostriamo come l'osservazione di due componenti citoscheletriche con tecnica dual-color dSTORM porta nuova comprensione nella loro reciproca interazione.

Introduction

I filamenti intermedi citoplasmatici (IFs) sono 10 nm di diametro omo - o eteropolimeri di un sottoinsieme specifico del tipo di cella di proteine se. IFs partecipare a una vasta gamma di funzioni cellulari quali risposte di motilità, proliferazione e lo stress delle cellule. Loro ruolo chiave è evidenziato dal fatto che più di 90 malattie umane sono direttamente causati da mutazioni in proteine se; per esempio, cambiamenti nella composizione se accompagna la crescita del tumore e la diffusione di1,2,3. Vi è crescente evidenza che i tre sistemi di citoscheletro lavorano in collaborazione per controllo funzioni cellulari quali la polarizzazione della cellula, divisione e migrazione2,3. Poiché non vi è un accoppiamento stretto tra architettura spaziale e funzioni, è fondamentale ottenere approfondimenti l'organizzazione strutturale del se con altri filamenti e capire meglio il cross-talk del citoscheletro. Questo articolo fornisce un protocollo per eseguire il Super-risoluzione tecnica dual-color dSTORM (diretto stocastico microscopia ottica a ricostruzione)4 e come utilizzarlo per studiare l'interazione tra se e i microtubuli in fisso, coltivate cellule in 2 dimensioni (2D).

Diverse tecniche di Super-risoluzione sono state sviluppate nel corso degli ultimi dieci anni e là scoperte furono all'origine del premio Nobel in chimica nel 20145. Tra tutte queste tecniche si trova i metodi basati su localizzazione singola molecola come PALM6 (Photo-Activated localizzazione microscopia) che utilizza proteine fluorescenti fotomodulabili, tempesta7 con coppie di fluorofori o dSTORM4 con fluorofori convenzionali. Tutti questi metodi sono basati sullo stesso principio che consiste di (i) l'interruttore della maggior parte dei reporter fluorescente in un stato "spento" "di stato (ii) l'attivazione stocastica di un sottoinsieme di essi in una fluorescente (non fluorescente), al fine di localizzare loro posizione spaziale con precisione nanometrica e (iii) la ripetizione di questo processo al fine di attivare come molti sottoinsiemi di fluorofori come possibile. Un'immagine finale viene ricostruita utilizzando tutte le localizzazioni delle molecole attivate, fornendo una risoluzione laterale fino a ~ 20-40 nm. Diversi sistemi ottici commercializzati permettendo PALM/STORM sono ora disponibili per i biologi per esperimenti di routine. Qui, uno di questi sistemi è stato usato per studiare l'associazione strutturale dei microtubuli e IFs. Tra tutti i singola molecola basati su localizzazione metodi, la tecnica di doppio-colore dSTORM è stata selezionata, perché è adatto per osservare regioni lamellare molto sottile (< 1 µm) delle cellule aderenti e può fornire un significativo miglioramento della risoluzione dell'immagine con investimento minimo di tempo e denaro. Infatti, dSTORM è una tecnica molto comoda e versatile che è compatibile con i coloranti organici standard abitualmente utilizzati per la colorazione cellulare e immunofluorescenza.

Mentre un colore dSTORM immagini sono relativamente semplici da ottenere utilizzando il fluoroforo Alexa6478, dSTORM doppio colore richiede per ottimizzare le condizioni sperimentali, in modo che due coloranti possono lampeggiare correttamente nel buffer selezionate, soprattutto quando c'è limitato potere del laser. Eccellente documenti sono già disponibili sui metodi per impostare la pagina di formazione immagine di multi-colore con dSTORM9,10,11,12,13, e questi documenti spiegano in dettaglio le possibili fonti di artefatti e risoluzione dell'immagine degradata e come superarli. In questo articolo, le condizioni sperimentali ottimali in termini di cellule fissazione, immunostaining, preparazione del campione, sono descritti al fine di acquisire immagini di fitte reti di IF citoplasmatici e microtubuli in imaging acquisizione e ricostruzione dell'immagine cellule gliali con dual-color dSTORM. Brevemente, il metodo di estrazione/fissazione descritto in Chazeau et al12 è stato adattato alle cellule gliali e utilizzato con un passaggio di post-fissazione, concentrazione di anticorpi ottimizzata, un buffer di tempesta con 10mm MEA descritto in Dempsey9 et al., che era risultati ottimali per la sperimentale messa a punto e il tipo di campione.

Cellule gliali esprimono principalmente tre tipi di proteine se: il vimentin, nestina e GFAP (proteina fibrillare acida). Queste tre proteine sono state indicate per co-polimerizzare in astrocytes14. Precedentemente abbiamo mostrato usando microscopia di Super-risoluzione strutturato illuminazione (SR SIM) che queste tre proteine se possono essere trovate nel singolo filamento di se stesso e consentono di visualizzare simile distribuzione e dinamica in cellule gliali 15. Dovuto le somiglianze tra le tre proteine di se, vimentin macchiatura è stata usata come reporter per l'intera rete di se. Utilizzando dSTORM, siamo riusciti a risolvere come fasci di forma se lungo i microtubuli, che non era possibile con la diffrazione limitata microscopia tecniche15. Queste osservazioni possono aiutare a comprendere come il vimentin IFs può microtubuli modello e regolare la loro traiettoria di crescita, promuovendo il mantenimento di un asse di polarità durante la migrazione di cellule16. Immagini di Super-risoluzione fornito informazioni chiave sull'interazione reciproca dei due sottosistemi del citoscheletro e portato approfondire il legame tra associazione spaziale e funzione locale che potrebbe essere il tipo di cella specifici17. In generale, dSTORM dual-color consente di studiare il crosstalk tra elementi del citoscheletro o altri tipi di organelli, condizione che immunostaining buone condizioni sono raggiunti in termini di densità e specificità. Questa tecnica sarà utile per caratterizzare meglio i cambiamenti di citoscheletro osservati durante astrogliosis e nel glioblastoma, il tumore più comune e più maligni del sistema nervoso centrale, dove l'espressione di proteine se è alterato 18 ,19,20,21.

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Protocol

1. vetrini coprioggetti preparazione (giorno 1, 30 min)

  1. Posizionare le lamelle di vetro di 18 mm nº1.5H (170 µm + /-5 µm) su una cremagliera in plastica.
  2. Inserite la griglia in un becher da 100 mL riempito con acetone e ammollo per 5 min.
  3. Trasferimento del rack in un becher da 100 mL riempito con etanolo assoluto e ammollo per 5 min.
  4. Trasferire il rack in un becher da 100 mL nuovo riempito con etanolo assoluto e porre il becher in un dispositivo di pulizia ad ultrasuoni (Vedi tabella materiali) a temperatura ambiente. Premere "on" e attendere per 10 min.
  5. Inserite la griglia sotto cappa a flusso laminare e lasciare i coprioggetti asciugare o asciugare i vetrini coprioggetti con flusso di aria filtrata.
  6. Mettere il rack con i vetrini coprioggetti in un dispositivo di pulizia al plasma. Accendere la pompa del vuoto, chiudere la porta, attendere 3 minuti fare il vuoto e accendere il plasma per 1 min. uso i coprioggetti poco dopo la pulizia. Non riporli.

2. cellula placcatura (1 giorno, 20 min)

  1. Crescere la linea delle cellule gliali U373 in Medium essenziale minimo (MEM) con 10% siero bovino fetale, 1% penicillina-streptomicina e l'1% non essenziali aminoacidi in piastre Petri in plastica di diametro 10cm.
  2. Posto pulito vetrini coprioggetti in 12 pozzetti sotto la cappa a flusso laminare e aggiungere 1 mL di medium preriscaldato cellule per pozzetto.
  3. Prendete un piatto che contiene le cellule dall'incubatrice delle cellule (37 ° C, 5% CO2).
  4. Rimuovere il mezzo e aggiungere 10 mL di PBS.
  5. Rimuovere il PBS e aggiungere 1 mL 0.05% tripsina-EDTA.
  6. Posizionare il piatto indietro nell'incubatore per 2-3 min.
  7. Aggiungere 10 mL di medium caldo preriscaldato a 37 ° C sul piatto e risospendere le cellule.
  8. Seme circa 100 000 cellule per pozzetto (~ 150 µ l di cellule) nelle piastre 12-pozzetti contenenti i coprioggetti.
  9. Attendere almeno 6 h (o durante la notte) consentire la diffusione delle cellule.

3. fixation cell (giorno 2, 2h)

  1. Preparare il tampone di citoscheletro con tubi da 80 mM, 7 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl e regolare il pH a 6,9.
  2. Lavare le cellule una volta con PBS.
  3. Rimuovere il PBS e delicatamente aggiungere 1 mL / pozzetto di soluzione di estrazione/fissazione (0,25% glutaraldeide, 0,3% Triton X-100 nel buffer del citoscheletro) preriscaldato a 37 ° C.
  4. Incubare per 60 s a temperatura ambiente.
  5. Rimuovere la soluzione e delicatamente aggiungere 1 mL per pozzetto preriscaldato e preparata al momento soluzione di PFA (paraformaldeide) 4% diluito nel buffer del citoscheletro.
    Attenzione: Utilizzare guanti e lavorare sotto cappa chimica.
  6. Rimettere la piastra 12-pozzetti nell'incubatore a 37° C per 10 min.
  7. Rimuovere il PFA e aggiungere 3 mL di PBS per pozzetto.
    Nota: Lavorare sotto cappa chimica con i guanti e mettere il PFA riciclato in una collocazione specifica.
  8. Lavare due volte con PBS.
  9. Rimuovere il PBS ed aggiungere la soluzione appena preparata 10mm NaBH4 diluita in PBS per placare l'autofluorescenza provenienti da glutaraldeide.
  10. Incubare per 7 min a temperatura ambiente.
  11. Mettere il riciclato NaBH4 in una collocazione specifica.
  12. Lavare tre volte 5 min con PBS.
  13. Rimuovere il PBS e aggiungere la soluzione bloccante (soluzione 5% BSA in PBS).
  14. Incubare per 1 h a temperatura ambiente (o durante la notte a 4 ° C).
    Nota: Il tampone di citoscheletro può essere conservato a temperatura ambiente per un paio di mesi. PFA, NaBH4 e glutaraldeide devono essere maneggiati con cura speciale (cappuccio, guanti e bidoni di riciclaggio specifici). Soluzioni dovrebbero essere aggiunti e rimossi delicatamente al fine di preservare l'integrità delle cellule. È importante non lasciare che le celle a secco.

4. Immunostaining (giorno 2, 5h)

  1. Preparare la soluzione di anticorpi primari utilizzando anti-vimentin e anti-tubulina con una diluizione di 1: 500 nella soluzione di blocco.
  2. Mettere 100 µ l gocce di anticorpi primari diluiti su uno strato di pellicola di paraffina e posizionare i vetrini coprioggetti sopra di loro con le cellule rivolto verso il basso.
  3. Incubare le cellule con anticorpi primari per 2 h. Put i coprioggetti indietro in una piastra 12-pozzetti riempiti con PBS. Sciacquare tre volte per 5 min ogni volta in PBS a temperatura ambiente su agitatore orbitale.
  4. Nel frattempo, preparare la soluzione di anticorpi secondari utilizzando anti-topo Alexa647 e anti-ratto Alexa555 ad una diluizione di un 1:1, 000 nella soluzione di blocco. Incubare le cellule con anticorpi secondari per 1 h a temperatura ambiente. Procedere come 4.2. proteggendo le cellule dalla luce.
  5. Mettere il vetrino coprioggetto indietro in un piatto di 12-pozzetti pieno di PBS. Sciacquare tre volte per 5 min ogni volta in PBS a temperatura ambiente su agitatore orbitale. Rimuovere il PBS e aggiungere 0,5 mL di PBS mescolato con 1 µ l di 0,1 µm tetraspeck perline.
  6. Mettere i pozzetti su agitatore orbitale per 30 min. Risciacquare con PBS. Rimuovere il PBS e incubare le cellule per 5 minuti con una soluzione PFA 4% in PBS. Sciacquare tre volte con PBS.
    Nota: Celle fisse possono essere conservate per un paio di settimane in PBS a 4° C. Immunostaining dovrebbe essere fatto all'ultimo minuto.

5. preparazione del campione (giorno 3, 5 min)

  1. Mettere le aliquote di MEA (cisteamina, 1 M, pH 8.3), glucosio ossidasi (100 x, 50 mg/mL), catalasi (500 x, 20 mg/mL) in un cestello di ghiaccio.
  2. Preparare 50 mL di tampone Tris-NaCl (50 mM Tris, 10 millimetri di NaCl, pH = 8) completati con 10% di glucosio (100 mg/mL).
  3. Preparare 1,2 mL di tampone appena prima dell'imaging con 10mm MEA, ossidasi di glucosio di 0,5 mg/mL (75 U/mL), catalasi di 40 µ g/mL (80-200 U/mL) di imaging nel buffer di Tris-NaCl con 10% di glucosio.
  4. Montare il vetrino coprioggetto contenente le celle con etichettate su supporto magnetico (ad es. sezione chamlide) e aggiungere il buffer di imaging per riempire completamente la camera. Mettere il coperchio e assicurarsi che non ci sia nessuna bolla di aria tra il buffer di imaging e il coperchio.
  5. Pulire il fondo del campione con etanolo assoluto e verificare che non vi sia perdita. Usare grasso per sigillare il portacampioni correttamente se necessario.
    Nota: Preparare 1 M stock di soluzione MEA (pH 8.3 regolata usando HCl), stock di ossidasi di glucosio 50 mg/ml e stock di catalasi a 20 mg/mL in acqua, fare aliquote e conservare a-20 ° C per fino a un mese per MEA e un anno per glucosio ossidasi e catalasi. Non ricongelare le aliquote. Preparare il tampone di Tris-NaCl in anticipo e conservare a temperatura ambiente per diversi mesi. Aggiungere glucosio il giorno dell'esperimento (punto 5.3).

6. acquisizione immagini (giorno 3, ~ 1h per cella)

  1. Accendere il microscopio. Accendere il software di acquisizione e premere Avvia il sistema.
  2. Selezionare acquisizione scheda Espandi lo strumento di Imaging installazione nel gruppo di strumenti di gestione guidata installazione. Selezionare la modalità laser WF (campo largo) di acquisizione. Selezionare l'obiettivo 100 X NA 1,46 . Selezionare la modalità TIRF u-HP che utilizza un collimatore per ridurre il campo di vista essere illuminato e concentrare l'energia del laser in un'area più piccola. Utilizzare il optovar lente 1,6 x che dà una dimensione di pixel di 100nm.
  3. Selezionare lo strumento di serie temporali e impostare il lasso di tempo con 50 000 cornici e 0.0 ms tra i fotogrammi. Espandere lo strumento canali nel gruppo di strumenti di acquisizione parametro e selezionare "Mostra tutti".
  4. Impostare la traccia Alexa647: verifica la 642 e 405 linee per l'eccitazione del laser e accettare per accenderli. Selezionare il filtro di emissione "655 LP" nel Setup di Imaging. Rinominare "647".
  5. Fare clic su '+' nello strumento canali per aggiungere un altro passaggio di luce e selezionare la modalità "interruttore traccia ogni: telaio" nello strumento Setup Imaging . Verifica 561, 488 e linee laser 405 e accettare per accenderli. Selezionare il "BP 570-650 + LP750" emissione filtrare e utilizzare optovar lente 1.6 x. Verifica che sia selezionata la modalità TIRF-uHP. Rinominare la traccia "555".
  6. Selezionare lo strumento in modalità di acquisizione e impostare le dimensioni della cornice a 200 x 200 pixel. Selezionare lo strumento di strategia e dispositivi di messa a fuoco e impostare lo stato attivo definito 1 000 fotogrammi (se c'è un sistema di blocco di messa a fuoco).
  7. Mettere olio sull'obiettivo e mettere il campione. Selezionare la scheda di Locate e aprire l'otturatore della lampada fluorescenza. Trovare la messa a fuoco e guardare per la cella all'immagine utilizzando l'oculare. Metterla al centro del campo di vista utilizzando il joystick.
  8. Selezionare la scheda di acquisizione per tornare alla modalità acquisizione. Selezionare la traccia "647", impostare la potenza del 642-laser allo 0,2%, la potenza di 405-laser impostato su 0, impostare il tempo di esposizione di 50 ms e il guadagno di 50. Scegliere la modalità di acquisizione continua ad osservare la cella sullo schermo. Regolare il fuoco. Assicurarsi che vi sia almeno un tetraspeck tallone nel campo visivo, aumentare il contrasto per vederli se necessario. Utilizzare una modalità di ridimensionamento automatico per la visualizzazione. Prendere un'immagine di grande campo epifluorescenza della rete il vimentin cliccando su snap e salvarlo. Per controllare l'illuminazione TIRF, fare clic su TIRF, regolare l'angolo di illuminazione e/o collimatore se necessario avere un campo omogeneo di illuminazione e salvarlo.
    Nota: È importante che le immagini TIRF ed epifluorescente sono di alta qualità prima di iniziare l'acquisizione di dati grezzi. Discontinui, non uniformemente con etichettati filamenti darà luogo a immagini di scarsa qualità dSTORM.
  9. Deselezionare la traccia "647", selezionare e controllare la traccia "555". Acquisire un'immagine di epifluorescenza della rete dei microtubuli e salvarlo. Prendere un'immagine TIRF e salvarlo troppo.
  10. Deselezionare la traccia "555", selezionare e controllare la traccia "647", quindi premere continua. Mettere il gain a 0 e tempo di esposizione di 10 ms. impostata la potenza del laser 642 nm al 100% per pompare la maggior parte delle tinture Alexa647 allo stato scuro (~ 2 kW/cm2). Una volta i fluorophores cominciano a lampeggiare, mettere l'esposizione a 15 ms e guadagnare a 300. Selezionare la modalità TIRF di illuminazione. Utilizzare la modalità di indicazione del campo senza scala automatica per verificare che i segnali di singola molecola non saturano la fotocamera (indicata dal colore rosso). In tal caso, diminuire il guadagno fino a quando scomparirà la saturazione. Tetraspeck perline rimane saturati all'inizio dell'acquisizione. Premere Stop per arrestare il continuo controllo della cella.
  11. Espandere lo strumento Online di elaborazione e verifica Online PALM di elaborazione per visualizzare l'immagine di tempesta durante l'acquisizione. Utilizzare i seguenti parametri: 9 per la dimensione di maschera di picco (diametro 9 pixel) e 6 per l'intensità di picco al rumore. I parametri tesi definirà le molecole che sono presi in considerazione nell'elaborazione (abbastanza luminoso e non sovrapposte). Nello strumento di Statistiche di PAL , selezionare il tipo di trama: istogrammae istogramma fonte: precisione. Premere Avvia acquisizione.
  12. Durante l'acquisizione, rimettere a fuoco se necessario (se non c'è nessun dispositivo di blocco messa a fuoco). Regolare i parametri (esposizione, laser poteri) e alla fine passare sulla linea laser 405 nm (a partire da 0,001%) mantenere una densità media di fluorofori con una distanza minima di 1 µm tra singole molecole (> 9 pixel di 100 nm, la dimensione di maschera di picco) ( Figura 1A-B). Se la densità di molecola è un po ' troppo alta, è possibile utilizzare la modalità di HILO (foglio altamente inclinata e laminato ottico) di illuminazione anziché TIRF. Ciò aumenterà la potenza del laser del 20%. Assicurarsi che il picco di precisione di localizzazione sull'istogramma sotto l'immagine ricostruita è centrato intorno o inferiore a 10 nm.
    Nota: Solitamente il numero di molecole diminuisce con il tempo, e la potenza del laser 405 nm è aumentata lentamente di conseguenza. L'obiettivo è quello di diminuire la precisione di localizzazione (istogramma visualizzato sotto l'immagine di Super-risoluzione) quanto più possibile con un picco inferiore a 10 nm (Figura 1). Aumentare il contrasto dell'immagine PALM se necessario, se troppi perle luminose sono presenti nel campo.
  13. Premere Stop per interrompere il filmato quando più di 106 localizzazioni sono stati raggiunti (in genere dopo 40 000 fotogrammi). Mettere i laser torna allo 0,2% (642 nm) e 0 (405 nm). Salvare i dati grezzi dell'acquisizione tempesta con il formato .czi. Deselezionare traccia "647" nello strumento di canali, selezionare e controllare la traccia "555".
  14. Impostare il tempo di esposizione a 25 ms e guadagno su 0. Premere il pulsante continua e impostato il laser sia 488 e 561 al 100% per pompa Alexa555 coloranti allo stato scuro (~ 2 kW/cm2 ). Quando i fluorophores cominciano a lampeggiare, mettere il guadagno a 250, utilizzare la modalità di illuminazione di HILO e verifica che singole molecole non saturano la fotocamera con la modalità di indicatore di intervallo. Se questo è il caso, diminuire il guadagno. Premere Stop. Diminuire la potenza di 488-laser al 50%.
  15. Premere Avvia acquisizione. Durante l'acquisizione, aumentare progressivamente il guadagno per essere sempre al limite della saturazione. Passo dopo passo aumentare la potenza laser 405 nm per mantenere una densità media di singola molecola nel campo visivo (vedere passo 6,18). Diminuire la potenza del 488 laser 20-30% quando il laser 405 è superiore al 15%. Quindi diminuire gradualmente la 488 aumentando la linea 405 laser al fine di mantenere il lampeggio delle molecole più velocemente possibile. La linea di 488 laser accoppiata con il laser di 561 eccitazione a massima intensità aumenta sia l'on e off tariffe di fluorofori, considerando che la linea 405 laser solo aumenta il tasso in.
  16. Interrompere l'acquisizione quando sono stati raggiunti più di 500 000 localizzazioni (dopo circa 20 000 fotogrammi) o più, quando non più molecole lampeggiano. Salvare i dati grezzi dell'acquisizione tempesta con il formato .czi.
    Nota: Iniziare sempre con la lunghezza d'onda superiore per evitare lo sbiancamento (o attivazione) degli altri colori. Poiché la camera di chamlide non è chiusa, è possibile modificare il buffer di imaging regolarmente, ad esempio per verificare le condizioni di buffer diversi. Utilizzando la linea 488 laser per vuotare le tinture di Alexa 555 è necessaria solo quando la potenza del 561 laser è limitata (con laser a 100 mW).

7. image reconstruction (5 min)

  1. Nello strumento di PAL-Drift , utilizzare il tipo di correzione basato su modello con segmenti automatici con una dimensione massima di 8. Premere applica più volte in una fila finché la deriva non è corretto. Questa correzione basati sul modello si applica un algoritmo basato sull'analisi di correlazione incrociata che corregge la deriva.
  2. Utilizzando gli strumenti di PAL-filtro , migliorare l'aspetto dell'immagine tempesta selezionando solo le molecole che meglio sono state localizzate. Ad esempio, limitare la precisione di localizzazione a 30 nm e il PSF a 120-180 nm.
  3. Utilizzare una risoluzione di pixel di 5 o 10 nm nello strumento PAL-rendering , come pure una modalità di visualizzazione gaussiana, con un fattore di espansione di 1 FPF selezionare il rendering dinamico gamma auto HR con un valore di 95% e gamma dinamica auto da Render SWF con un valore di 90%. Selezionare le migliori qualità di rendering.
  4. Selezionare PALM convertire, nel menu PALM della scheda elaborazione (modalità di post-elaborazione). Premere Seleziona e poi applicare. Salvare l'immagine creata con un formato. LSM (e non .czi, molto importante).
    Nota: La ricostruzione delle immagini può essere eseguita immediatamente dopo l'acquisizione o la successiva utilizzando la modalità di elaborazione dell'immagine del software di acquisizione. In fuori linea modalità di post-elaborazione, è possibile rianalizzare le pile con diversi valori dei parametri (dimensioni di picco della maschera, intensità di picco di rumore). Sempre scegliere di "scartare molecole sovrapposti" e non "media prima localizzazione".

8. stima della precisione di localizzazione di un'immagine di tempesta (10 min)

  1. Aprire i dati grezzi di tempesta e utilizzare elaborando sulla scheda e selezionare il metodo PALM e quindi PALM nuovamente l'immagine. Premere il tasto Select.
  2. Premere applica per avviare la ricostruzione utilizzando una dimensione di maschera di picco di 9 e un'intensità di picco al rumore di 6 (o i parametri che si sceglie per l'immagine).
  3. Selezionare lo strumento di grafica di rettangolo e disegnare un rettangolo sull'immagine raw intorno a una singola molecola presente sulla superficie del vetro. Ci sono solitamente alcune singole molecole ci.
  4. Premere applica nuovamente e solo le molecole presenti all'interno dell'area del rettangolo saranno analizzati.
  5. Nello strumento di Statistiche di PAL , selezionare il tipo di trama: istogramma e istogramma fonte: X posizione o posizione Y, per visualizzare gli istogrammi di posizione.
  6. Salvare la tabella con l'elenco delle localizzazioni a sinistra sotto le immagini.
  7. Utilizzando un software di analisi dei dati, creare istogrammi di X e Y posizioni (Figura 1).
  8. Montare le distribuzioni di una gaussiana e salvare il σX e σY valori. Secondo le stime il σ di precisione di localizzazioneSMLMX *σY) ^ 0,5.
  9. Ripetere il passaggio 8.3-8.8 su molecole come molti come possibile e media σSMLM

9. canale registrazione (5 min)

  1. Aprire l'immagine di tempesta di ogni colore utilizzando il software di Fiji (figura J).
  2. Selezionare lo strumento bacchetta per misurare le posizioni di ogni perle tetraspeck.
  3. Calcolare gli spostamenti X e Y per ogni perlina e media li.
  4. Utilizzare il comando "Translate" per tradurre la seconda immagine con la calcolata spostamenti X e Y.
  5. Sovrapporre le immagini utilizzando il comando Merge canali.

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Representative Results

Un microscopio dotato di 50 mW 405 nm e laser a stato solido da 100 mW 488, 561 e 642 nm, un EMCCD 512x512 fotocamera, un alpha Plan Apo 100 X / 1,46 obiettivo e Band Pass 570-650 / 655 emissione filtri passa-lungo è stato usato per i risultati rappresentativi presentati di seguito.

Figura 1A fornisce un esempio di molecola densità e segnale / rumore che deve essere utilizzato durante l'acquisizione di immagini raw. Immagini di buona qualità sono ottenute con un minimo di ~ 1 µm tra molecole vicine. In buone condizioni lampeggiante, fluorofori dovrebbero essere presenti in un solo fotogramma. Buona lampeggiante richiede per regolare le condizioni di buffer imaging (pH, agente riduttore, sistema di lavaggio dell'ossigeno) e poteri di laser, che influenzano le su-fuori-aliquote e fluorophores e pertanto il dovere ciclo (la frazione di tempo che trascorre un fluoroforo in stato on)9,11. Figura 1B, al contrario, fornisce un esempio di immagine raw, dove la densità di molecola è troppo alta e singola molecola non può essere risolto.

Figura 1 Mostra un istogramma tipico di precisione di localizzazione per tutte le molecole rilevati e analizzati dal software di produttori da una pila di 20 000 fotogrammi. Questo istogramma corrisponde all'immagine di dSTORM della rete dei microtubuli illustrata nella Figura 3B. I valori di precisione di localizzazione forniti dal software del produttore sono in buon accordo con il passaggio seguente stima i valori 8, utilizzando la precisione di puntamento di una singola molecola localizzata a tempi diversi punti22 (Figura 1).

La Figura 2A Mostra un tipico esempio di dSTORM immagine di vimentin filamenti immunolabeled con Alexa647. L'aumento della risoluzione può essere osservato chiaramente il confronto con l'immagine acquisita con un microscopio grandangolari standard (Figura 2B-C). I profili di intensità di fluorescenza rappresentati in Figura 2D mostrano che formazione immagine di microscopia di Super-risoluzione consente di risolvere il vimentin fasci. La risoluzione di dSTORM è sufficiente contare il numero di filamenti presenti nei pacchetti.

Figura 3 Mostra un esempio tipico di doppio-colore dSTORM immagine del vimentin e tubulina immunolabeled reti con Alexa647 e Alexa555 rispettivamente. La sovrapposizione delle due reti dimostra che i fasci di vimentin sono spesso localizzati lungo i microtubuli, fornendo informazioni strutturali chiave sull'accoppiamento tra i due sottosistemi di citoscheletro.

La figura 4 illustra vari esempi di immagini dSTORM dei microtubuli, ottenuti in condizioni non ottimali. In primo luogo, utilizzando Alexa488 e un buffer con 143 mM beta-mercaptoetanolo (un altro agente riduttore usato invece MEA9,10,11) e un sistema di scavenging di ossigeno (composto di 40 µ g/mL e 0,5 mg/mL glucosio ossidasi catalasi), fluorophores erano lampeggia ma non erano abbastanza brillante da essere precisamente localizzate (numero troppo basso fotone) (Figura 4A). In secondo luogo, utilizzando Alexa555 con beta-mercaptoetanolo 143 mM, 50 mM MEA e un ossigeno lo scavenging sistema, fluorophores potrebbe non essere pompato al loro stato scuro e quindi non essere ben spazialmente separati (troppo elevato duty cycle, cioè la frazione di tempo nello stato "on" è troppo lungo) (Figura 4B). Infine, utilizzando Alexa568, con 143 mM beta-mercaptoetanolo, 50mm MEA e un ossigeno lo scavenging sistema, fluorophores non erano luminose e sono stati lampeggiante lentamente con molto lungo "su" e "off" afferma (ciclo di lavoro numero e troppo alto basso fotone) (Figura 4). In tutte queste condizioni non ottimali, la rete dei microtubuli è stata scarsamente generata le immagini di Super-risoluzione. In conclusione, le condizioni ottimali richiedono fluorofori con numero di fotoni ad alta e basso fattore di servizio9,10 nel buffer immagini corrispondenti. Si noti che ottimizzazione etichettatura densità e condizioni di buffer per ottenere buone condizioni lampeggiante di imaging è una procedura standard per dual-color dSTORM e non è specifico per formazione immagine se-microtubule.

Secondo il teorema di Nyquist-Shannon, è necessario disporre di fluorofori almeno ogni 10 nm per avere una risoluzione di 20 nm. Esteso alle strutture 2D, Dempsey et al stimato che un'etichettatura di fluorofori4 ~ 10 a µm2 è necessaria. Come la rete se è più densa e suoi filamenti sono più sottili (10 nm vs 25 nm di diametro senza gli anticorpi primari e secondari) rispetto alla rete dei microtubuli, abbiamo osservato che due volte più localizzazioni sono necessari per descrivere la rete di se. Abbiamo ottenuto buone immagini con 5 000 localizzazioni/µm2 per se e 2500 localizzazioni/µm² per i microtubuli, ottenuti con cornici di 40 000 e 20 000 rispettivamente. L'immagine ad alta risoluzione è stata ottenuta con una precisione di localizzazione di σSMLM ~ 8-12 nm stimato a seguito di passaggio 8 del protocollo (precisione di puntamento di una singola molecola localizzata in tempi diversi punti22). Questa stima della precisione di localizzazione era in buon accordo con i valori forniti dal software del produttore indicato in un istogramma delle precisioni di localizzazione estratte da tutte le molecole rilevate nei dati grezzi (esempio illustrato nella Figura 1). Tale precisione di localizzazione potrebbe fornire un'immagine con una risoluzione di ~ 30 nm (2,35 * Precisione) se la densità di etichettatura è abbastanza alta. Abbiamo osservato ordinariamente il vimentin filamento con una larghezza piena a metà massimo (FWMH) di ~ 40 nm e microtubuli con una larghezza FWMH di ~ 55 nm. Poiché la risoluzione dell'immagine dipende sia la precisione di localizzazione e la densità di localizzazione, forniamo condizioni sperimentali che consentono i migliori risultati tenendo conto di entrambi i criteri.

Figure 1
Figura 1 : Densità ottimale delle singole molecole durante la stima di precisione di acquisizione e localizzazione.
(A-B)
Sinistra: Rappresentante immagini raw da un singolo fotogramma con una densità ottima di singole molecole nello stato brillante (A) e con una densità troppo alta (B) durante l'acquisizione di tempesta (passo 6.12.) di celle fisse U373 macchiato con anti-vimentin e anti-topo Alexa647. Destra: Immagini RAW dove le singole molecole con livello di fluorescenza sopra l'intensità di picco alla soglia di rumore (impostato su 6) sono circondate da cerchi (bianco o rosso). Il diametro del cerchio è impostato per la dimensione di maschera di picco (insieme a 9 pixel) e il colore determina se le molecole si sovrappongono (rosso) o non (bianco). Si noti che ad alta densità di singole molecole (a (B)) conduce ad un'elevata quantità di molecole che non sono presi in considerazione per la ricostruzione di immagine tempesta di sovrapposizione. A Inset: grafico che mostra un profilo di intensità di fluorescenza tipica di una singola molecola in rosso e sua gaussiana fit in nero. In questo esempio, la precisione di localizzazione è σx = 6,7 nm. Barra della scala, 1 µm. istogramma tipico (C) di precisione di localizzazione per tutte le molecole rilevati e analizzati dal software del produttore. Esso può essere visualizzato e viene aggiornato regolarmente durante l'acquisizione dei dati grezzi grazie l'elaborazione online. Questo istogramma corrisponde all'immagine di dSTORM della rete dei microtubuli illustrata nella Figura 3B. (D) Sinistra: Immagine di tempesta di una singola molecola presenta sulla superficie del vetro dopo la ricostruzione. Destra: Istogrammi delle posizioni X e Y ottenuti dopo il montaggio gaussiana. Gaussiana raccordo le distribuzioni di X e Y darà una stima della precisione di localizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Immagine rappresentante dSTORM di una rete di vimentin. immagine di dSTORM (A), corrispondente standard largo campo immagine (B) e (C) risultati all'avanguardia di una cellula di glial U373 fisso come descritto nel protocollo e macchiato per il vimentin con Alexa647 di sovrapposizione. Fondo: zoom della regione evidenziata. Profili di intensità trasversale (D) lungo la linea gialla sulle immagini ingrandite nella A e B. barra della scala, 2 µm e 500 nm nello zoom. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Immagine dSTORM colori dual rappresentativi delle reti dei microtubuli e il vimentin. (A) il Vimentin rete macchiato con Alexa647 (stesso come in Figura 2A). (B) rete dei microtubuli etichettata con Alexa555. (C) sovrapposizione delle reti dei microtubuli (ciano) con un'area di zoom sulla destra e il vimentin (rosso). L'immagine di dSTORM di vimentina è stato ottenuto con ~1.5 milioni di localizzazioni fuori 40 000 fotogrammi. L'immagine di dSTORM dei microtubuli è stata ottenuta con localizzazioni ~ 850 000 fuori 20 000 fotogrammi. Barra della scala, 2 µm e 500 nm nello zoom. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Esempi di condizioni non ottimali di formazione immagine dei microtubuli. Quando i fluorophores lampeggia ma non sono abbastanza luminoso con un Alexa488 di etichettatura di tubulina nelle cellule gliali U373 e 143 mM BetaMercaptoethanol e organismo saprofago di ossigeno nel buffer di imaging (A), quando i fluorofori sono abbastanza brillanti, ma non possono essere correttamente impoverito nello stato scuro (presso la potenza del laser massima disponibile) e batter lentamente con Alexa555 etichettati tubulina in 143 mM BetaMercaptoethanol, 50mm MEA e buffer dell'organismo saprofago di ossigeno (B) e quando fluorofori lampeggiano lentamente e non sono brillanti utilizzando Alexa568 tubulina in un buffer di tempesta che contiene 143 mM BetaMercaptoethanol, 50mm MEA e organismo saprofago di ossigeno con l'etichetta (C). In tutti questi casi, le immagini di dSTORM hanno degradato ad alta risoluzione. Barra della scala, 2 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Immagine rappresentativa dual-color dSTORM delle reti il vimentin e microtubuli di un cellulare U373 fisso con metanolo freddo per 5 min. (A) il Vimentin e (B) reti di microtubuli etichettato con Alexa647 e Alexa555 rispettivamente con zoom evidenziata. Si noti la presenza di singole molecole nella parte anteriore delle cellule localizzate nel citoplasma diminuendo la risoluzione globale delle reti del filamento. Barra della scala, 2 µm e 500 nm nello zoom. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : Confronto di dSTORM ricostruite immagini
Immagine di dSTORM ricostruito dal produttore software (A) e temporale (FiJi plugin) (B). (C) sovrapposizione di (A) a magenta e (B) in verde. Barra della scala, 2 µm e 500 nm nello zoom. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Fasi critiche nel protocollo

Presentiamo qui un protocollo che riduce al minimo gli artefatti nelle immagini dSTORM dei microtubuli e IFs nelle cellule gliali. Gli artefatti possono essere creati in ogni fase della preparazione del campione e la formazione immagine: fissazione, blocco, immunolabeling, deriva durante l'acquisizione, non ottimale lampeggiante condizioni23. Elenchiamo qui di seguito le fasi più critiche.

Pulizia lamelle è un passo importante per limitare il legame non specifico di fluorofori sulla superficie e quindi di limitare il rumore di fondo nell'immagine dSTORM.

Ti consigliamo di fissare il campione con un passo di estrazione e fissazione soluzioni utilizzando un mix di glutaraldeide e triton e quindi la fissazione con PFA (paraformaldeide) (passo n ° 3). Il protocollo di fissazione è stato adattato da Chazeau et al12: abbiamo diminuito il tempo di incubazione del passaggio di estrazione/fissazione per 60 s (punto 3.4), rimuovere il glucosio dal buffer del citoscheletro e saltato il passo extra di permeabilizzazione. Il vantaggio di questo metodo è che le subunità liberamente commovente del citoscheletro sono drenate di distanza, consentendo la formazione immagine di Super-risoluzione con meno priorità bassa12. Più in generale il passaggio di fissazione è fondamentale perché piombo cattiva fissazione (usando vecchio PFA, soluzioni a freddo, troppo lungo/breve incubazione passi) alla parziale distruzione delle reti di filamenti (microtubuli rotti, microtubuli che non raggiungono la parte anteriore delle cellule e/o in un bassa densità). Si noti che è anche possibile utilizzare fissazione di metanolo, soprattutto se solo la rete di vimentina è imaged come descritto in Leduc et al15. Tuttavia, il rumore di fondo può essere osservato all'interno della cellula (Figura 5). Anche se dSTORM le immagini ottenute con metanolo fissata le cellule sono di qualità più scadente, che ancora forniscono informazioni su cosa sia se e reti microtubule dovrebbero assomigliare ad es. in termini di densità di filamenti. Fissazione con solo glutaraldeide ha dato risultati molto poveri per IFs, sebbene sia il protocollo migliore per microtubule fissazione23.

Nella parte di immunostaining, è importante utilizzare gli anticorpi anti-topo che minimizzano il cross-reazione con anticorpi sviluppati nel ratto. Non abbiamo potuto utilizzare frammenti Fab (anti-topo) per questo motivo, perché essi cross-reagiscono non specifico con la anti-tubulina ratto oltre il mouse anti-vimentin.

A causa della potenza laser limitata disponibile, è necessario utilizzare sia 488 e 561 nm laser linee per pompare i coloranti Alexa555 allo stato scuro. Ad alta potenza laser 488 (~ 50%) è necessario anche durante l'acquisizione di osservare buona lampeggiante e basso duty cycle (la frazione di tempo un fluoroforo spende in stato on), anche se aumenta anche il rumore di fondo. La modalità di illuminazione TIRF limita l'eccitazione di fluorofori in uno strato sottile (~ 200 nm sopra il vetrino coprioggetti). Esso aumenta il rapporto segnale-rumore facendo diminuire la luce di sfondo, ma diminuisce anche il potere di eccitazione. La modalità di HILO consente taglio assiale e può essere efficiente per ottimizzare il rapporto segnale-rumore. È quindi un bene intermedio tra epi e TIRF. Utilizzando la modalità di HILO è essenziale per eccitare in modo efficiente i fluorofori Alexa555, che richiedono ad alta potenza laser a lampeggiare correttamente.

Un altro passaggio fondamentale è l'acquisizione di dati grezzi (passaggio 6). È necessario regolare i parametri di acquisizione (esposizione, guadagno, TIRF e messa a fuoco anche quando nessun dispositivo di blocco di messa a fuoco è disponibile) mentre il film viene acquisito. Mantenere una densità ottima di fluorofori brillante è importante (Figura 1A): deve essere sufficientemente bassa per separare spazialmente ogni colorante, ma abbastanza in alto per visualizzare la struttura intera dopo 40 000 fotogrammi. Se il numero di molecole attivate è troppo basso, gli stack più lunghi dovrebbero essere acquisiti. Abbiamo ottenuto buone immagini con ~ 5000 localizzazioni per µm² per IFs e 2 500 localizzazioni per cm ² per i microtubuli.

Le modifiche e la risoluzione dei problemi del metodo

È importante lavorare con campioni freschi e ottimizzata buffer di imaging. pH dovrebbe essere adattata con precisione, specialmente per la MEA.

Il vimentin e microtubuli dovrebbero essere uniformemente con etichettati quando imaged con tecnica di microscopia grandangolari standard (WF). Se filamenti Guarda punteggiato/tratteggiata con microscopia classica, questo sarà amplificato quando si utilizza la risoluzione super. In questo caso, è preferibile preparare nuovi campioni. Condizioni di fissazione non ottimizzato (vecchio PFA ecc) potrebbero microtubuli cercando frammentato. Alta priorità bassa sulla superficie del vetro può derivare da un blocco inefficiente. In tal caso, BSA (albumina di siero bovino) può essere sostituito da FBS (siero fetale bovino) e utilizzato in ogni fasi di incubazione.

Se la densità di etichettatura è troppo alta (Figura 1B) e non può essere sufficientemente spinto nello scuro fuori-stato, anche con la più alta potenza del laser, la quantità di secondaria anticorpi dovrebbero essere abbassati (meglio di diminuire la quantità di anticorpi primari). Tuttavia, questo richiede la preparazione di nuovi campioni. In generale, è necessario valutare empiricamente la quantità di anticorpi secondari da utilizzare.

Se non lampeggia normalmente i fluorofori (dovrebbero essere nello stato brillante durante un solo frame), verificare che il pH del tampone imaging è corretta (pH 8.3). Se il problema persiste (soprattutto MEA), preparare nuove soluzioni. Verificare sempre che il collimatore TIRF su (TIRF u_HP). Con potenza limitata del laser, ottenendo corretta lampeggiante può essere impegnativo (on e off tariffe così come tintura luminosità dipende dalla potenza del laser, come descritto van de Linde et al.11). Altri coloranti come Alexa488 o Atto488 può essere esplorato se più potenza del laser di eccitazione è disponibile14.

Se i fluorophores smette di lampeggiare prima della fine dei 40 000 telai, modificare il buffer di imaging che potrebbe avere stato ossidato. Verificare che non ci sia bolle d'aria tra il buffer e il coperchio dopo la modifica di buffer. Sigillato campioni potrebbero essere imaged per qualche ora in un formato raw.

Se i film di tempesta vengono acquistati su un normale microscopio TIRF equipaggiato con un EMCCD, è possibile utilizzare ThunderSTORM24 per ricostruire le immagini. Opzioni simili sono disponibili per la correzione di deriva, filtro immagini e rendering delle immagini. Temporale è un plugin utilizzato con il software di Fiji/imageJ. Risultati simili sono stati ottenuti con il software del produttore e temporale (Figura 6).

CULLA (cicloottatetraene) può essere aggiunto al buffer imaging per migliorare la precisione di localizzazione delle singole molecole. Aumenta il numero di fotoni emessi per ciclo per Alexa64725. Infatti è stata osservata una migliore precisione di localizzazione (fino a 6 nm) quando l'aggiunta di 2 mM culla nel buffer di tempesta descritta nella fase 5 o con 100mm MEA come descritto nel riferimento25. Tuttavia, in queste condizioni, il numero di molecole luminose durante acquisizione diminuisce molto più veloce senza culla, limitando il numero totale delle localizzazioni di molecola alla fine dell'acquisizione e conseguente potenziale sotto-campionamento della rete se. Altri buffer di formazione immagine sono stati segnalati a lavorare bene con le tinture di Alexa, ad esempio utilizzando lattasi e oxyrase come ossigeno lo scavenging sistema26. In questo protocollo, segnaliamo la composizione del tampone che ha dato i migliori risultati in termini di risoluzione per il nostro tipo di campioni e imaging istituito, ma ogni tipo di campione richiede buffer ottimizzazione, oltre a etichettatura e ottimizzazione di condizioni di fissazione.

Limiti del metodo e possibili miglioramenti

Il metodo presentato qui è limitato a celle fisse e immagini 2D. Utilizzando uno standard set di immagini fino con un microscopio TIRF e un EMCCD, il fattore più limitante era le potenze laser (100 mW per il laser 561 nm non era sufficiente per far i coloranti Alexa555 lampeggiare). Una linea di 532 nm laser può essere più efficiente per eccitare questi coloranti. Un possibile miglioramento del metodo sarebbe quello di eseguire dSTORM 3D utilizzando ottiche astigmatismo27. Ciò richiederebbe modifiche minime del protocollo, ad eccezione di una minore densità di etichettatura e un numero di telaio aumentato. 3D doppio colore immagine tempesta fornirebbe una vista migliore di IFs avvolto intorno i microtubuli, soprattutto in fasci. Si noti che i filamenti dell'actina ha potuto essere osservati anche utilizzando lo stesso metodo di fissazione e una quantità ottimizzata di falloidina fluorescente8. 3 colore tempesta potrebbe essere usato per osservare l'organizzazione dei tre sottosistemi del citoscheletro.

Usando gli anticorpi primari e secondari aumenta la dimensione dell'oggetto di interesse poiché l'anticorpo secondario è localizzato fino a 20 nm dalla destinazione. In genere, un microtubulo 25-nm di diametro avrà una larghezza di ~ 50 nm dopo l'etichettatura. Una possibilità per migliorare la distanza tra il bersaglio e il colorante è etichettare direttamente gli anticorpi primari con i coloranti appropriati. Idealmente nanobodies etichettati con coloranti organici dovrebbero essere usate28.

Forniamo qui solo un metodo semplice per stimare la precisione di localizzazione medio di una singola molecola seguire Endesfelder et al.22. La risoluzione generale delle immagini che prende in considerazione entrambi precisione di localizzazione ed etichettatura densità, può anche essere misurata utilizzando l' approccio di Fourier anello correlazione29.

Per quanto riguarda la registrazione del canale, è difficile per sovrapporre perfettamente tutte le perline presenti nel campo visivo. Una correzione più complessa si trovano in Chazeau et al 12.

Limitazioni derivanti dal lampeggiare di fluorofori e candeggio delle sonde possono essere superate utilizzando DNA-vernice (accumulo di punti del DNA per l'Imaging in scala nanometrica topografia)30. In questo metodo, il lampeggio necessarie per la localizzazione di singola molecola viene creato dall'associazione transitoria di breve-tingere-contrassegnati oligonucleotidi a loro obiettivi complementari.

Conclusione

Questo articolo presenta un robusto protocollo per eseguire doppio-colore dSTORM imaging in 2 dimensioni dei filamenti del citoscheletro in cellule fisse. Le condizioni sperimentali che sono state trovate ottimale in termini di fissazione, immunolabeling e imaging buffer per il nostro tipo di campione sono descritti nel dettaglio. Quindi, il processo di acquisizione di dati grezzi e il tipo di lampeggiante immagini che devono essere registrati (densità di molecola, rapporto segnale-rumore, fluoroforo dovere ciclo ecc) è presentato così come come ricostruire le immagini dSTORM, correggere la deriva e filtrare i dati. Questi passaggi sono generici per l'imaging di doppio-colore dSTORM e non assaggiare il tipo specifico. Infine, viene mostrato come questa tecnica aiuta a risolvere l'organizzazione densa delle due reti del citoscheletro accoppiate.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgements

Ringraziamo Mickael Lelek, Orestis Faklaris e Nicolas Bourg per la proficua discussione, Andrey Aristov ed Elena Rensen per aiuto con la tecnica di Super-risoluzione e Shailaja Seetharaman per una lettura attenta del manoscritto. Noi riconosciamo con gratitudine Citech UtechS fotonici Bioimmagini (Imagopole) dell'Institut Pasteur (Parigi, Francia), nonché la rete di infrastrutture di Francia-bioimmagini supportato da French National Research Agency (ANR-10-INSB-04; Investimenti per il futuro) e la Région Ile de France (programma Domaine d'Intérêt Majeur-Malinf) per l'uso del microscopio Elyra. Questo lavoro è stato supportato dalla Ligue Contre le Cancer e la French National Research Agency (ANR-16-CE13-0019).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Gibco 41090-028 cell culture
non essential amino acid Gibco 1140-050 cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum Gibco 10270-106 cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25300-054 cell culture
PBS 10x fischer scientific 11540486 cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H Marienfield/Dominic dutsher 900556 coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution Sigma F8775 cell fixation
glutaraldehyde Sigma G5882 cell fixation
triton X100 Sigma T9284 non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4) Sigma 452904-25ML cell fixation
BSA Sigma A7906 sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse Sigma V6630 primary antibodies
Rat anti alpha tubulin Biorad MCA77G primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Fisher scientific 10635923 secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Fisher scientific 10226162 secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Fisher scientific T7279 fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA) Sigma 30070 for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger Sigma G0543 for the blinking buffer
glucose sigma for the blinking buffer
catalase from bovine liver Sigma C9322 for the blinking buffer
Tris (trizma) Sigma T1503 for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack Sigma Z688568
Parafilm Sigma P7793-1EA paraffin film
ultrasonic cleaner Fisher scientific 15-335-6
plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G-2

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References

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