Romanzo fotoacustico microscopia e tomografia a coerenza ottica doppia modalità coroidoretinica Imaging in vita gli occhi dei conigli

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Engineering

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Summary

Questo manoscritto descrive l'installazione di romanzo e procedura di una microscopia fotoacustico e il sistema di doppia modalità di tomografia ottica di coerenza per l'imaging non invasivo, privo di etichetta corioretinica di animali più grandi, come i conigli operativa.

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Tian, C., Zhang, W., Nguyen, V. P., Wang, X., Paulus, Y. M. Novel Photoacoustic Microscopy and Optical Coherence Tomography Dual-modality Chorioretinal Imaging in Living Rabbit Eyes. J. Vis. Exp. (132), e57135, doi:10.3791/57135 (2018).

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Abstract

Fotoacustico oculare imaging è un'emergente oftalmiche tecnologia non invadente può visualizzare tessuto oculare convertendo l'energia luminosa in onde sonore, che è attualmente sotto indagine intensiva di imaging. Tuttavia, la maggior parte segnalati lavoro fino ad oggi si concentra sull'imaging del segmento posteriore degli occhi di piccoli animali, come ratti e topi, che pone sfide per la traduzione clinica umana a causa di dimensioni piccole del bulbo oculare. Questo manoscritto descrive un romanzo fotoacustico microscopia (PAM) e il sistema di doppia modalità tomografia a coerenza ottica per l'imaging di segmento posteriore degli occhi di animali più grandi, come i conigli. La configurazione del sistema, sistema di allineamento, preparazione degli animali e doppia modalità protocolli sperimentali per in vivo, non invasivo, privo di etichetta coroidoretinica imaging in conigli sono dettagliati. L'efficacia del metodo è dimostrato attraverso rappresentante risultati sperimentali, tra cui il sistema vascolare retinico e coroideale, ottenuti da PAM e OCT. Questo manoscritto fornisce una guida pratica per riprodurre i risultati di imaging in conigli e avanzando fotoacustico imaging oculare in animali più grandi.

Introduction

Ultimi decenni hanno testimoniato lo sviluppo esplosivo del campo di fotoacustico biomedical imaging1,2,3,4,5,6,7 ,8. Basato sulla conversione di energia della luce in suono, l'imaging fotoacustico emergenti può visualizzare campioni biologici a scale da organelli, cellule, tessuti e organi al corpo intero di piccoli animali e può rivelare suo anatomiche, funzionali, molecolari, genetici, e informazioni metaboliche1,2,9,10,11,12. Formazione immagine fotoacustico ha trovato applicazioni uniche in svariati settori biomedicali, come cellula biologia13,14, biologia vascolare15,16, neurologia17,18 , oncologia19,20,21,22, dermatologia23, farmacologia24ed ematologia25,26. Sua applicazione in Oftalmologia, vale a dire fotoacustico oculare di imaging, ha suscitato notevole interesse da scienziati e clinici ed è attualmente sotto inchiesta attivo.

In contrasto con usato ordinariamente oculare imaging technologies27, quali angiografia della fluorescina (FA) e verde di indocianina (ICGA) (basato sul contrasto di fluorescenza), tomografia a coerenza ottica (OCT) (basato sul contrasto di dispersione ottica) e suoi derivato angiografia OCT (basata sul contrasto di movimento dei globuli rossi), oculare fotoacustico usi assorbimento ottico come il meccanismo di contrasto di imaging. Questo è diverso da tecnologie di imaging oculare convenzionali e fornisce uno strumento unico per lo studio di proprietà di assorbimento ottico dell'occhio, che solitamente sono associati con lo stato fisiopatologico del tessuto oculare28. Ad oggi, significativo lavoro eccellente è stato fatto in fotoacustico oculare imaging29,30,31,32,33,34,35, 36,37, ma questi studi concentrano sul segmento posteriore degli occhi di piccoli animali, come ratti e topi. Gli studi pionieristici ben dimostrano la fattibilità di fotoacustico imaging in Oftalmologia, ma c'è ancora una lunga strada da percorrere verso traduzione clinica della tecnologia dal dimensioni del bulbo oculare di ratti e topi sono molto più piccolo (meno di un terzo) di quello degli esseri umani. Dovuto la propagazione di onde ad ultrasuoni su una significativamente lunghe distanze, qualità di immagine e di intensità di segnale possono soffrire notevolmente quando la tecnica è utilizzata per il segmento posteriore degli occhi più grandi di imaging.

Verso questo obiettivo, abbiamo recentemente segnalato non invasivo, privo di etichetta coroidoretinica imaging in conigli vivente usando integrato fotoacustico microscopia (PAM) e spectral domain OCT (SD-OCT)38. Il sistema ha delle prestazioni eccellenti e potrebbe visualizzare la retina e la coroide degli occhi di animali più grandi basati su endogeno assorbimento e scattering contrasto del tessuto oculare. I risultati preliminari in conigli mostrano che il PAM non invadente ha potuto distinguere singoli vasi sanguigni della retina e della coroide usando una dose di esposizione del laser (~ 80 nJ) significativamente di sotto del limite di sicurezza di American National Standards Institute (ANSI) (160 nJ) a 570 Nm39; e l'OCT chiaramente potrebbe risolvere diversi strati della retina, la coroide e sclera. È la prima dimostrazione di formazione immagine del segmento posteriore di animali più grandi usando PAM e potrebbe essere un passo importante verso la traduzione clinica della tecnologia considerando che le dimensioni del bulbo oculare di conigli (18,1 mm)40 sono quasi l'80% della lunghezza assiale del esseri umani (23,9 mm).

In questo lavoro, forniamo una descrizione dettagliata del sistema di imaging doppia modalità e protocolli sperimentali utilizzati per l'imaging non invasivo, privo di etichetta coroidoretinica in conigli vivente e dimostrare le prestazioni del sistema tramite rappresentanza retinica e risultati di imaging coroidici.

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Protocol

I conigli sono che un United States Department of Agriculture (USDA) coperto specie. Suo uso nella ricerca biomedica deve seguire regole severe. Tutti coniglio esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la dichiarazione di ARVO (associazione per la ricerca in Oftalmologia e la visione) per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research, dopo l'approvazione del protocollo di animali di laboratorio dall'Università Comitato per l'uso e cura degli animali (UCUCA) dell'Università del Michigan (protocollo PRO00006486, PI Yannis Paulus).

1. configurazione del sistema

  1. Fotoacustico microscopia (PAM)
    1. Uso un oscillatore parametrico ottico (OPO) laser pompato da un laser a stato solido pompato a diodi come la sorgente luminosa delle specifiche tecniche adeguate tratteresti Select, come ripetizione di impulso tasso 1kHz, impulso durata 3-6 ns e sintonizzabile lunghezza d'onda 405-2600 nm.
    2. Riflettere il raggio che emanano dal laser a 570 nm da due specchi (M1 e M2), quindi passarlo attraverso un attenuatore di mezza onda piatto montato su un filtro di fase di rotazione e, infine, messa a fuoco, motorizzato e collimi esso da un collimatore fascio (Figura 1). Ottimizzare la progettazione del collimatore fascio. Un esempio di configurazione del collimatore fascio comprende una lente di focalizzazione L1 (lunghezza focale 250mm), un foro stenopeico (diametro 50 µm) e un collimatore L2 (lunghezza focale 30 mm).
    3. Dividere il fascio collimato per un divisore di fascio (BS1) con un rapporto di divisione di 90/10 (riflessione/trasmissione). Registrare la parte trasmessa da un fotodiodo per monitoraggio di energia di impulso a impulso laser. Successivamente deviare la parte riflessa da uno specchio (M3) e uno specchio dicroico (DM) e raster-scan utilizzando un galvanometro bidimensionale. Il galvanometro è un componente condiviso con il dominio spettrale (SD)-sistema di OCT (descritto sotto).
    4. Consegnare il raggio acquisito attraverso un telescopio è composto da una lente di scansione (lunghezza focale 36 mm) e una lente oftalmica (OL, lunghezza focale 10 mm) e finalmente concentrarsi sul fondo dall'ottica dell'occhio coniglio.
    5. Selezionare un trasduttore ultrasonico aghiformi con specifiche tecniche corretta, ad esempio, il centro frequenza 27MHz, bidirezionale − 6 dB banda 60%. Posizionarlo a contatto con la congiuntiva fuori l'asse visivo centrale per catturare il segnale fotoacustico eccitato.
    6. Amplificare il segnale tramite un amplificatore ad ultrasuoni (ad esempio, 57 dB di guadagno), filtrare per un filtro passa-basso (ad esempio, la frequenza di taglio 32 MHz) e digitalizzarlo da un digitalizzatore ad alta velocità a una frequenza di campionamento di 200 MS/s.
    7. Posto un misuratore di potenza sopra il coniglio degli occhi e misura l'energia dell'impulso laser sulla cornea di coniglio per tenerlo sotto la sicurezza ANSI limitare 160 nJ a 570 nm38. Bloccare il fascio per evitare sovraesposizioni laser utilizzando un otturatore laser controllato da Matlab attraverso un'elettronica di sincronizzazione.
    8. Sincronizzare il laser, il galvanometro e digitalizzatore attraverso una scheda (DAQ) di acquisizione dati. Programma software per acquisizione dati e controllo di sistema in Matlab.
  2. Tomografia a coerenza ottica spectral-domain (SD-OCT)
    1. Adattare il sistema SD-OCT basato su un sistema disponibile in commercio con l'aggiunta di una lente oftalmica (OL) dopo la scansione lente (SL) e un pezzo di vetro di compensazione di dispersione (DCG) del braccio di riferimento (Figura 1). La modifica permette che il sistema OCT può immagine il segmento posteriore dell'occhio di coniglio.
    2. Utilizzare un alloggiamento tubo zoom per regolare la lunghezza del braccio di riferimento per garantire la sua partita con la lunghezza del percorso ottico del braccio del campione. Utilizzare un diaframma ad iride per controllare l'intensità della luce riflessa retrò riferimento per garantire la sua partita con intensità luminosa retro-sparsi dal fundus di coniglio per ottenere massima immagine contrasto.
    3. Impiegare una fotocamera di charge coupled device (CCD) incapsulata nella testa di scansione per la visualizzazione in tempo reale del fondo di coniglio con un'illuminazione diodo luminoso (LED come fonte di illuminazione esterna).

2. sistema di allineamento

  1. Inizializzare la posizione del galvanometro e allineare il sistema OCT regolando le viti del montaggio collimatore della fibra e il beamsplitter cubo.
    Nota: Le procedure dettagliate sono disponibili nel manuale del sistema OCT commercialmente acquisito e non saranno coperti qui. Questo passaggio è principalmente quello di garantire la corretti allineamenti di collimatore della fibra, il braccio di riferimento e la lente di scansione per ottimizzare le prestazioni del sistema OCT.
  2. Regolare la posizione x, ye z del foro stenopeico intorno la messa a fuoco della lente messa a fuoco per spazialmente filtrare il fascio laser e trasmettere al massimo l'energia del laser. Controllare l'altezza del raggio laser prima e dopo il foro stenopeico utilizzando uno strumento di misura di altezza per garantire che essi sono gli stessi.
  3. Regolare l'inclinazione, decenter e la posizione z del collimatore L2 per collimare il fascio filtrato. Garantire che il fascio ha circa le stesse dimensioni e altezza quando osservati in campo vicino e lontano dal campo.
  4. Co-assiale di combinare il fascio laser di PAM e il fascio di luce di OCT sintonizzando le inclinazioni dello specchio e il DM. Dopo questo passaggio, il PAM laser e luce di OCT dovrebbe essere completamente coincidente e scansione regioni sul fondo di coniglio sono le stesse.
  5. Regolare l'inclinazione e decenter della lente OL per allineare correttamente nel percorso ottico. Una volta fatto, il sistema di doppia modalità è pronto per l'imaging.
    Nota: Uno può utilizzare il metodo di auto-collimazione per ottenere questo, cioè, controllando la luce retro-riflettuto dalla superficie della lente OL per assicurarsi che va indietro lungo la stessa strada come la luce incidente.

3. preparazione coniglio

  1. Prendere un coniglio bianco della Nuova Zelanda dalla struttura animale e registrare informazioni individuali, come numero di animali e di peso di corpo.
  2. Montare piattaforme di coniglio, tra cui il supporto del corpo e supporto per la testa sul tavolo sotto il sistema di imaging ottico. Mettere una coperta di riscaldamento circolazione d'acqua sul supporto corpo e impostare la temperatura dell'acqua circolante a 38 ° C per aiutare a mantenere la temperatura corporea del coniglio caldo per tutta la durata dell'esperimento e della riscossione.
  3. Registrare i segni vitali pre-procedura, compreso stato nel complesso animale, membrana mucosa colore, frequenza cardiaca, frequenza respiratoria e temperatura corporea rettale. Anestetizzare il coniglio con una miscela di ketamina (40 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) tramite iniezione intramuscolare (IM) e registrare l'utilizzo di ketamina (tabella III sostanza controllata). Confermare il livello di anestesia controllando la frequenza cardiaca, frequenza respiratoria e stato generale.
  4. Dilatare le pupille di coniglio usando una goccia ogni di Tropicamide 1% oftalmica e fenilefrina cloridrato 2,5% oftalmico.
  5. Utilizzare uno speculum per tenere le palpebre di mezzo e applicare una goccia di lubrificante di occhio per inumidire la cornea. Instillare una goccia di attualità tetracaina 0,5% negli occhi prima la procedura di imaging.
    Nota: Per più procedure o procedure con eventuale disagio per l'animale, dare il coniglio un'iniezione sottocutanea di meloxicam prima dell'esperimento per garantire il comfort degli animali.

4. formazione immagine SD-OCT

  1. Trasferire il coniglio per la piattaforma di formazione immagine di una fotocamera di clinica del fondo e prendere 50 gradi immagini del fondo, rosso gratuita e autofluorescenza prima ottobre sessione di imaging. Questo aiuta a controllare la trasparenza ottica dell'occhio e riconoscere la morfologia di nave del fondo e luoghi d'interesse, come il nervo ottico e sistema vascolare retinico raggio midollare.
  2. Trasferimento il coniglio per la piattaforma del sistema OCT e regolare la sua postura per approssimativamente posizionare uno degli occhi sotto l'OL. Illuminare l'occhio utilizzando la luce del LED.
    Nota: Per facilitare la traduzione clinica della tecnica, gli occhi del coniglio non sono stabilizzati utilizzando altri metodi e la testa di coniglio è appena messo il supporto per la testa senza alcun fissaggio.
  3. Aprire il software OCT e verificare innanzitutto l'immagine della telecamera CCD del fondo. Regolare con precisione l'altezza e l'angolo di supporto per la testa se necessario per garantire la regione di interesse (ROI), come vasi coroideali e vasi retinici, sono all'interno del campo visivo (FOV) della fotocamera.
    Nota: Se il coniglio è sotto un livello di buona anestesia, una sessione di imaging sequenza può durare finchè 10 min senza la necessità di ri-regolare la testa di coniglio.
  4. Disegnare una linea retta per rappresentare l'OCT B-scan di interesse e avviare la scansione. Regolare la lunghezza del braccio di riferimento per visualizzare l'immagine OCT ed ottimizzare il fattore di compensazione della dispersione nel software OCT per ottenere le immagini più taglienti.
    Nota: Quando si regola la lunghezza del braccio di riferimento, due immagini di ottobre con mirroring verranno visualizzato uno dopo l'altro. L'immagine corretta potrebbe essere distinta in base alla conoscenza dell'anatomia del fondo.
  5. Impostare i parametri di acquisizione dati, quali il numero di pixel e medie e salvare le immagini.
  6. Osservare la frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca del coniglio per stimare il livello di anestesia e animale comfort. Per sessioni più lunghe, una dose di un terzo di ketamina supplementare o inalato isoflurano potrebbe considerare con intubazione endotracheale, un V-gel o una maschera facciale per mantenere l'aereo dell'anestesia quando necessario.
  7. Sciacquare la cornea di coniglio con collirio ogni 2 min durante l'esperimento per prevenire la disidratazione superficie corneale e keratopathy epiteliale punctate superficiale corneale. Monitorare e registrare i segni vitali animali ogni 15 min.

5. PAM imaging

  1. Indossare occhiali di sicurezza laser appropriato e accendere il laser OPO.
  2. Avviare il software di controllo PAM, sintonizzare la lunghezza d'onda laser ad uno dei picchi di assorbimento di cromofori mirati (ad es., 570 nm per l'emoglobina), inizializzare la posizione del galvanometro e dell'energia laser monitor prima la cornea di coniglio per garantire che è sotto il limite di sicurezza ANSI.
  3. Montare il trasduttore ultrasonico su un palco di traslazione tridimensionale (3D) e posizionare la punta del trasduttore a contatto con la congiuntiva di coniglio che punta al fondo uterino. Utilizzare una goccia di lubrificante occhio alla coppia migliore la congiuntiva di punta e coniglio di trasduttore.
  4. Accendere la luce di illuminazione LED e visualizzare il fundus di coniglio attraverso il software Matlab.
  5. Insieme il ROI scansione (vasi retinici o vasi coroideali), tra cui il centro e la dimensione fisica. Aprire l'otturatore laser e avviare B-scansione del fascio. Da approssimativamente allineare il trasduttore, uno dovrebbe essere in grado di vedere riconosciuto fotoacustico segnale sull'oscilloscopio. In caso contrario, modificare leggermente la posizione degli occhi per una regione diversa della cornea di scansione o passare all'altro occhio e ripetere i processi di cui sopra.
  6. Osservare il fotoacustico rilevato segnale sull'oscilloscopio e regolare la posizione del trasduttore per massimizzare l'intensità del segnale lungo l'intera B-scan.
    Nota: A causa della limitata larghezza, trasduttore ultrasonico ha solitamente un piccolo FOV41. Questo passaggio determina la modulazione di sfondo delle immagini finali di PAM. Disallineamento porterà a immagini di PAM con sfondo eterogeneo e degradare notevolmente la qualità dell'immagine.
  7. Impostare i parametri di acquisizione dati. Questo include il numero di pixel (ad es., 256 × 256 pixel), frequenza di campionamento (ad es., 200 MS/s) e il tempo di ritardo. Avviare l'acquisizione dei dati. Il software Matlab si aprirà automaticamente il pulsante di scatto per passare il raggio laser quando ha iniziato e chiudere l'otturatore per bloccare il fascio al termine per evitare sovraesposizioni di laser.
    Nota: Limitata dal tasso di ripetizione di impulso (1 kHz) del laser, ci vogliono circa 1 minuto per completare l'acquisizione di dati di un'immagine con 256 × 256 pixel.
  8. Elaborare i dati grezzi e visualizzare l'immagine di PAM in due dimensioni (2D) attraverso la massima intensità di proiezione (MIP)13 o in 3D e rendering volumetrico38.
  9. Smontare il trasduttore ultrasonico, risciacquare con acqua deionizzata e rimetterlo alla custodia.
  10. Trasferire il coniglio alla fotocamera del fondo e riprendere l'esame del fundus. Questo passaggio consente di verificare se ci sono eventuali cambiamenti morfologici del fondo dopo la sessione di imaging.
  11. Sciacquare la cornea di coniglio con collirio ogni due minuti durante l'esperimento per prevenire keratopathy e disidratazione superficie corneale. Monitorare e registrare i segni vitali animali ogni 15 min.
    Nota: Il PAM, OCT ed il fondo sessioni di imaging prendere circa 1 h.

6. post imaging

  1. Dopo il riesame del fondo utilizzando la fotocamera del fondo, scollegare il V-gel, se collegato. Sciacquare l'occhio con collirio, applicare unguento oftalmico desametasone, flurbiprofen oftalmica e neomicina e polimixina B solfati e chiudere l'occhio.
  2. Trasferire il coniglio con la coperta di circolazione d'acqua in una camera di recupero. Proteggere la casella da luce e attendere fino a quando il coniglio si sveglia naturalmente. Durante questo periodo, monitorare i segni vitali animali ogni 15 min e tenere il registro e consegnare una copia al centro di animale per mantenimento dei registri.
  3. Una volta che il coniglio si sveglia ed è attivo, vigile e camminare normalmente, il trasporto torna alla struttura animale. Se è previsto un esperimento acuto, eutanasia animale con soluzione di eutanasia (ad es., Beuthanasia, 0,22 mL/kg, iniezione endovenosa nella vena marginale dell'orecchio) e smaltire la carcassa.
  4. Disattivare il software e il laser. Pulire il banco ottico.

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Representative Results

Il sistema di doppia modalità di imaging e protocollo sperimentale sono stati testati con successo in laboratorio degli autori utilizzando quattro conigli bianchi della Nuova Zelanda. Il seguente mette in mostra alcuni risultati rappresentativi.

Figura 1 Mostra lo schema del sistema di imaging doppia modalità PAM e SD-OCT. È composto dai seguenti moduli: fotoacustico luce sorgente, attenuatore variabile laser, fascio collimatore, contatore di energia, testa di scansione, modulo di rilevamento e acquisizione fotoacustico, OCT ed sincronizzazione elettronica. Configurazioni di sistema dettagliate sono riportati in dettaglio nella sezione 1.1.

Nella figura 2 viene illustrato tipici risultati di imaging del sistema vascolare coroidica coniglio acquisiti utilizzando il sistema di doppia modalità di imaging. Figura 2 (a) è una fotografia del fondo mostrando che vasi coroideali diffuso su gran parte del fondo coniglio mentre vasi retinici sono confinati all'interno del raggio midollare. Figura 2 (b) vi è una tipica immagine PAM vasculature coroidico entro la fotografia del fondo. I vasi sanguigni della coroide sono stati delineati a elevata risoluzione laterale. Figura 2 (c) è un'immagine OCT B-scan acquistata per guardare l'anatomia del fondo e conferma la presenza di vasi coroideali. La retina, la coroide e sclera potrebbero essere visualizzate con un'alta risoluzione assiale con i vasi coroideali sotto lo strato di epitelio retinico del pigmento.

Nella figura 3 viene illustrato tipici risultati di imaging del sistema vascolare retinico coniglio acquisiti utilizzando il sistema di doppia modalità di imaging. Figure 3A e 3B sono 2D MIP e 3D rendering volumetrico dei vasi retinici ottenuti da PAM, rispettivamente. Figura 3 (c) Mostra ortogonali fette dell'immagine 3D. I risultati mostrano che il PAM potrebbe anche visualizzare singoli vasi retinici, che si trovano sopra lo strato RPE, e conferma che i vasi retinici e vasi coroideali sono a diverse profondità. Figura 3 (d) illustra una corrispondente immagine OCT B-scan, mostrando le sezioni trasversali dei singoli vasi retinici e strato delle fibre nervose (NFL).

Figure 1
Figura 1. Schematica della microscopia fotoacustico integrato e sistema di coerenza ottica tomografia doppia modalità imaging. OPO: Oscillatore parametrico ottico; BS: divisore di fascio; PD: fotodiodo; M: specchio; DM: specchio dicroico; SL: scansione lente; OL: lenti oftalmiche; SMF: fibra single-mode; DCG: vetro di compensazione dispersione; CCD: charge coupled device. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Nella figura 2. PAM e OCT imaging doppia modalità dei vasi sanguigni della coroide in conigli. (a) fotografia di del fondo che mostra che vasi coroideali (CVs) dislocate su fondo intero mentre vasi retinici (RVs) sono confinati all'interno del raggio midollare, dal momento che i conigli sono animali merangiotic. (b) immagine PAM C-scan di CVs mostrando che PAM può delineare CVs ad alta risoluzione laterale. (c) immagine OCT B-scan mostrando la struttura anatomica di coniglio fundus e posizione assiale dei vasi coroideali. GCL: Strato di cellule del ganglio; INL: strato nucleare interno; IPL: strato plessiforme interno; ONL: strato nucleare esterno; OPL: strato plexiform esterno; OLM: membrana limitante esterna; EZ: zona ellissoide; MZ: zona myoid; OS: segmento esterno; BM, membrana di Bruch; IZ: zona interdigitation38. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Nella figura 3PAM e OCT imaging doppia modalità dei vasi sanguigni retinici in conigli. (a) immagine PAM C-scan di RVs e CVs. (b) 3D rendering volumetrico dell'immagine PAM. (c) 2D fette ortogonale dell'immagine PAM mostrando che RVs e CVs sono a diverse profondità. (d) OCT B-scansione immagine che illustra la RVs, la NFL e la sclera38. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Un film lacrimale integro e regolare è essenziale per immagini di alta qualità del fondo. Un film di usura irregolare e deteriorato può degradare significativamente immagine qualità42. Per preservare l'integrità del film lacrimale ed evitare corneale keratopathy punctate superficiale, è fondamentale per lubrificare la cornea utilizzando collirio molto frequentemente, ogni due minuti circa. Se ci sono eventuali preoccupazioni per quanto riguarda l'opacità dell'occhio, utilizzare una lampada a fessura e della fluorescina strisce per verificare le condizioni di cornea.

Diversi possono essere presenti per l'imaging di segmento posteriore degli occhi di animali più grandi, tra cui fotoacustico attenuazione del segnale con la distanza particolarmente per componenti ad alta frequenza, disidratazione corneale e le aberrazioni ottiche. Ampiezza del segnale fotoacustico esperienze in genere significativa attenuazione prima di essere rilevato dal trasduttore ad ultrasuoni aghiformi. Maggiori sono le dimensioni del bulbo oculare, maggiore sarà l'attenuazione. Le dimensioni del bulbo oculare dei conigli (~18.1mm) sono circa tre volte superiore a quella dei ratti e sei volte più grande di quella dei topi, che rende la formazione immagine dell'occhio di coniglio particolarmente impegnativo. Per ottenere ragionevole imaging di qualità, un fascio laser con un diametro piccolo (2 mm dopo il collimatore fascio in questo studio) e collimata wavefront (idealmente planare wavefront) è preferito perché it sarà minimamente influenzato da aberrazioni ottiche intrinseche della cornea e possono essere ben focalizzato sulla retina. Questo punto è di importanza critica in termini di riduzione della dose di esposizione del laser e migliorare la risoluzione dell'immagine. In più, un trasduttore a ultrasuoni con una frequenza centrale di 27 MHz, piuttosto che una maggiore frequenza di centro a causa di risultati sperimentali che indica che questa è l'ecografia massimo segnale a questa distanza.

Mentre OCT e OCTA sono consolidate tecnologie utilizzate nella clinica per imaging anatomico e funzionale dell'occhio, la loro capacità di imaging molecolare è limitato dovuto i meccanismi di contrasto43. PAM è una modalità di formazione immagine dell'occhio emergenti basata sul contrasto di assorbimento ottico del tessuto oculare. È sensibile ai cromofori endogeni ed esogeni, come l'emoglobina, melanina e agenti di contrasto esternamente amministrato. Visualizzazione struttura vascolare ha dimostrata in questo lavoro è una delle molte applicazioni di PAM. Altre applicazioni importanti includono imaging funzionale e molecolare, come il rilevamento della velocità di flusso sanguigno, quantificazione di concentrazione di emoglobina, mappatura di saturazione di ossigeno e la visualizzazione di biomarcatore, che sono importanti per studiare la fisiopatologia della una miriade di malattie vascolari retiniche, tra cui la retinopatia diabetica, degenerazione maculare, occlusioni retiniche della vena, occlusioni dell'arteria retinica, retinopatia di cellule di falce e istoplasmosi oculare presunta, per citarne alcuni. Inoltre, il PAM ha una maggiore profondità di penetrazione di personalizzazione di Office, lo rende adatto per lo studio di alcune malattie della coroide, quali coroidico polypoidal, Corioretinopatia sierosa centrale, malattie pachychoroid e neovascularization coroidico. Da queste prospettive, PAM potrebbe essere in grado di fornire informazioni complementari utili al ott e OCTA per dare una valutazione più completa delle malattie oculari in futuro.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal generoso sostegno del 4K12EY022299 National Eye Institute (YMP), lotta per Vista-International retinica Research Foundation FFS GIA16002 (YMP), illimitato supporto dipartimentale dalla ricerca per prevenire la cecità e il Università del Michigan, dipartimento di oftalmologia e scienze visive. Questo lavoro utilizzata il Core Center per visione ricerca finanziata dal P30 EY007003 dal National Eye Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dual-modality imaging system
OPO laser Ekspla (Vilnius, Lithuania) NT-242
Beam attenuator Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) AHWP10M-600
Motorized rotation stage Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) PRM1/MZ8
Motorized rotation stage controller Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) TDC001
Focusing lens Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) AC254-250-B
Pinhole Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) P50S
Collimating lens Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) AC127-030-B
Photodiode Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) PDA36A 
Laser shutter Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada) LS6S2T0
Laser shutter driver Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada) VCM-D1
Dichroic mirror Semrock, Inc. (Rochester, NY, USA) Di03-R785-t3-25×36
Scan lens Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) OCT-LK3-BB
Ophthalmic lens Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) AC080-010-B-ML
Ultrasonic transducer Optosonic Inc. (Arcadia, CA, USA) Custom
Amplifier L3 Narda-MITEQ (Hauppauge, NY, USA) AU-1647
Band-pass filter Mini-Circuits (Brooklyn, NY, USA) BLP-30+
Digitizer DynamicSignals LLC (Lockport, IL, USA) PX1500-4 
Synchronization electronics National Instruments Corporation (Austin, TX, USA) USB-6353
OCT module Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) Ganymede-II-HR
Dispersion compensation glass Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) LSM03DC
Illumination LED light Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) MCWHF2 
Power meter Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) S121C 
Power meter interface Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) PM100USB 
Height measurement tool  Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) BHM1
Fundus camera Topcon Corporation (Tokyo, Japan)  TRC 50EX
Matlab MathWorks (Natick, MA, USA) 2017a
Oscilloscope Teledyne LeCroy (Chestnut Ridge, NY, USA) WaveJet 354T
Animal experiment
Water-circulating blanket Stryker Corporation (Kalamazoo, MI, USA) TP-700
Ketamine hydrochloride injection Par pharmaceutical, Inc. (Woodcliff Lake, NJ, USA) NDC code 42023-115-10
Xylazine hydrochloride VetOne (Boise, ID, USA) NDC code 13985-704-10
Tropicamide ophthalmic Akorn Pharmaceuticals Inc. (Lake Forest, IL, USA) NDC code 17478-102-12
Phenylephrine hydrochloride ophthalmic Paragon BioTeck, Inc. (Portland, OR, USA) NDC code 42702-102-15
Eye lubricant Hub Pharmaceuticals LLC (Rancho Cucamonga, CA, USA) NDC code 17238-610-15
Eyewash Altaire Pharmaceuticals, Inc. (Aquebogue, NY, USA) NDC code 59390-175-18
Tetracaine hydrochloride ophthalmic solution Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) NDC code 24208-920-64
Flurbiprofen sodium ophthalmic solution Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) NDC code 24208-314-25
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmic Ointment Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) NDC code 24208-795-35
Meloxicam injection Henry Schein Inc. (Queens, NY, USA) NDC code 11695-6925-1

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