आबंध डीएनए Adducts के गठन से Enzymatically आपन यलो और ड्रग्स इन विट्रो में और उनके निर्धारण के द्वारा 32पी-postlabeling

Biochemistry

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Summary

पर्यावरणीय रसायनों और दवाओं की शक्ति का मूल्यांकन, enzymatically आबंध डीएनए adducts पैदा करने के लिए सक्रिय किया जा करने के लिए, कैंसर और उसके उपचार के विकास में एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है । विधि यौगिक सक्रियण के लिए डीएनए adducts, साथ ही उनके पता लगाने और ठहराव के लिए तकनीक के रूप में वर्णित हैं ।

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Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).

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Abstract

आबंध डीएनए adducts कैंसर शक्ति के साथ रसायनों या दवाओं द्वारा गठित यलो प्रक्रियाओं के दीक्षा चरण में सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक के रूप में ंयाय कर रहे हैं । इस आबंध बाध्यकारी है, जो tumorigenesis का कारण माना जाता है, अब रासायनिक कैंसरजनन की एक केंद्रीय हठधर्मिता के रूप में मूल्यांकन किया है । यहां, तरीके cytochrome P450 द्वारा catalyzed प्रतिक्रियाओं और अतिरिक्त रूपांतरण एंजाइमों को अपने सक्रियण के लिए रसायनों या दवाओं की शक्ति की जांच करने के लिए चयापचयों इन डीएनए adducts बनाने को रोजगार वर्णित हैं । प्रक्रियाओं सेलुलर भागों के अलगाव का वर्णन प्रस्तुत कर रहे हैं (माइक्रोसोमल और cytochromes P450 या अन्य के साथ cytosolic नमूने रूपांतरण एंजाइमों, अन्य रूपांतरण एंजाइमों, अर्थात, peroxidases, NADPH: cytochrome P450 oxidoreductase, णड (पृ) H:quinone oxidoreductase, या xanthine oxidase) । इसके अलावा, तरीके वर्णित है कि इन एंजाइमों द्वारा विश्लेषण रसायनों के चयापचय सक्रियण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और साथ ही डीएनए के अलगाव के लिए उन । इसके अलावा, उपयुक्त का पता लगाने और रासायनिक/दवा-व्युत्पंन डीएनए adducts, यानी, 32पी-postlabeling तकनीक और रेडियोधर्मी-लेबल विश्लेषण रसायनों के रोजगार के विभिंन संशोधनों, विस्तार से दिखाया ।

Introduction

xenobiotics (पर्यावरणीय रसायनों या दवाओं) का चयापचय दो चरणों1में होता है । चरणों मैं और द्वितीय उद्देश्य मूल रूप से hydrophobic (पानी नहीं घुलनशील) यौगिकों अधिक हाइड्रोफिलिक (पानी में घुलनशील), इस प्रकार उंहें मूत्र, मल या पसीने के माध्यम से आसानी से उत्सर्जित कर प्रदान करने के लिए । चरण I (functionalization) प्रतिक्रियाओं में शामिल है ऑक्सीकरण, कमी, और एंजाइमों द्वारा hydroxylation catalyzed जैसे cytochrome P450s (P450s, CYPs), peroxidases (यानी, साइक्लोऑक्सीजिनेज, कॉक्स), aldo-कीटो reductases (AKRs), और माइक्रोसोमल फ्लेविन-युक्त monooxygenases (FMOs) । चरण मैं भी कमी प्रतिक्रियाओं, reductases अर्थात की एक किस्म द्वारा मध्यस्थता शामिल हैं , माइक्रोसोमल NADPH: cytochrome P450 रिडक्टेस () और cytosolic णड (पी) H:quinone oxidoreductase (NQO1), xanthine oxidase (XO), और एल्डिहाइड oxidase (ए ओ)1 . दूसरे चरण (विकार) में, कार्यात्मक समूहों है कि चरण में संलग्न किया गया था मैं छोटे ध्रुवीय अणुओं को संयुग्मी के लिए आगे ध्रुवीयता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । चरण II की प्रतिक्रिया में भाग लेने के लिए माने जाने वाले एंजाइमों के उदाहरणों में sulfotransferases (SULTs), N, o-acetyltransferases (NATs), methyltransferases जैसे catechol-O-methyltransferase (COMT), glutathione Sशामिल हैं- transferases (GSTs), और uridine diphosphate glucuronosyltransferases (UGTs)1. मैं या द्वितीय चरण में एंजाइमों का वर्गीकरण है, तथापि, कठोर नहीं है, और कुछ एंजाइमों यकीनन या तो श्रेणी में वर्गीकृत किया जा सकता है ।

P450 एंजाइमों (ईसी 1.14.14.1) विभिन्न जीवों में मौजूद प्रोटीन युक्त षयवस्तु हैं, जो अनेक रसायनों के पुनर्रूपांतर में भाग लेते हैं, catalyzing उनका रूपांतरण3,4. P450 एंजाइमों कई सब्सट्रेट के hydroxylation उत्प्रेरित, एक प्रतिक्रिया के साथ जहां dioxygen के एक एटम xenobiotics के अणु में शुरू की है, जबकि ऑक्सीजन का दूसरा परमाणु प्रतिक्रिया है कि दो इलेक्ट्रॉनों की आवश्यकता है द्वारा पानी के रूप में कम है [समीकरण (1 )]3,4:

आरएच + हे + NADPH + एच+ → रोह + जo + NADP+ (१)

P450 एंजाइमों स्तनधारी कोशिकाओं की endoplasmic जालिका झिल्ली में स्थानीयकृत (माइक्रोसोमल P450 सिस्टम्स) multienzyme monooxygenase प्रणाली है, जो आगे NADPH शामिल हैं के सदस्य हैं: cytochrome P450 रिडक्टेस (पॉर्न) और cytochrome b5 , एंजाइम के सब्सट्रेट नध के रूप में पद: cytochrome बी5 रिडक्टेस । एक आम तौर पर स्वीकार किए जाते है सिद्धांत hypothesizes कि दो P450 के लिए आवश्यक इलेक्ट्रॉनों के दाता NADPH/ फिर भी, cytochrome b5 P450 के लिए इलेक्ट्रॉनों के दाता के रूप में कार्य कर सकता है, अर्थात् इसकी प्रतिक्रिया चक्र की दूसरी कमी के दौरान P450 को कम करने वाले इलेक्ट्रॉन के दाता के रूप में, जहां यह नध के साथ एक साथ कार्य करता है: cytochrome b5 रिडक्टेस2,3,4.

स्तनधारी विभिंन P450 एंजाइमों का उपयोग (जैसे, परिवारों के एंजाइमों 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26, और 27) मूल्यवान अंतर्जात यौगिकों के संश्लेषण के लिए, ऐसे स्टेरॉयड के रूप में, और उन्हें प्राकृतिक उत्पादों की catabolism के लिए उपयोग करें2,3 . अंय सिप स्तनधारी एंजाइमों, जैसे मानव CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, और 3A4, metabolize exogenous रसायन है कि दवाओं के रूप में इस्तेमाल किया जाता है । 5 , 6 सबसे महत्वपूर्ण एंजाइमों दवाओं के catalyzing चयापचय 3 ए उपपरिवार, विशेष रूप से CYP3A4 के CYPs हैं । xenobiotics के रूपांतरण, जैसे प्रो-यलो और प्रो-विषालु, ह्यूमन CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1, और 3A42,5की मध्यस्थता कर रहे हैं । इनमें से अधिकांश CYPs यकृत (CYP1A1 और 1B1 को छोड़कर) में विद्यमान हैं. फिर भी, CYPs कई extrahepatic अंगों में व्यक्त कर रहे हैं । इस तरह के P450s महान महत्व का हो सकता है, मुख्य रूप से जब वे रसायन (ड्रग्स) के सक्रिय करने में भाग लेने के लिए इन अंगों में मध्यवर्ती प्रतिक्रियाशीलता7। विभिन्न P450s कई यौगिकों कि उनके सब्सट्रेट कर रहे हैं द्वारा प्रेरित कर रहे हैं, हालांकि यह जरूरी मामला नहीं है.

कई P450 एंजाइम रासायनिक (ड्रग) विषाक्तता में एक भूमिका निभाते हैं । वे न केवल अपने detoxification चयापचयों में xenobiotics परिवर्तित कर सकते हैं, लेकिन यह भी सक्रिय प्रजातियों, जो अंतर्जात अणुओं संशोधित करने के लिए सक्रिय है कि इसके अलावा विभिन्न जैविक गुणों का प्रदर्शन, आमतौर पर उनके विषाक्तता के कारण. डीएनए, लिपिड और प्रोटीन सक्रिय रसायनों से उत्पन्न प्रतिक्रियाशील electrophiles और कण द्वारा उनके संशोधन के लिए लक्ष्य हो सकता है । डीएनए के मामले में, कई महत्वपूर्ण जीन प्रतिक्रियाओं को हल करने और उनके तंत्र पहले से ही2,3,4,5जाना जाता है ।

डीएनए में परिवर्तन कोशिका वृद्धि नियंत्रण में कमी में परिणाम कर सकते हैं, और इस घटना को प्रमुख कारक यलो प्रक्रियाओं के विकास के लिए अग्रणी माना जाता है । यलो शक्ति वाले रसायनों के साथ आबंध डीएनए adducts की पीढ़ी को यलो प्रक्रियाओं8,9,10,11के दीक्षा चरण में सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक के रूप में ंयाय है । यह प्रदर्शित किया गया कि डीएनए adducts और tumorigenesis के गठन के बीच संबंध होते हैं, जबकि डीएनए adducts की मात्रा में कमी के लिए जिंमेदार है chemoprevention8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. यलो/ड्रग व्युत्पंन डीएनए adducts के गठन डीएनए के व्यक्तिगत ठिकानों पर निर्भर करता है, और डीएनए में इन ठिकानों के अनुक्रम से प्रभावित है । डीएनए adducts की मरंमत उनके स्थान (प्रतिलिखित या गैर-लिखित डीएनए कतरा पर) और संशोधित न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के प्रकार पर निर्भर कर रहे है8,11,12,15, 16.

इस अनुच्छेद में, हम एंजाइम का उपयोग प्रक्रियाओं का वर्णन-रसायनों की catalyzed रूपांतरण (दवाओं) उनकी शक्ति की जांच करने के लिए चयापचयों में सक्रिय हो जो डीएनए (डीएनए adducts पैदा) संशोधित । आबंध डीएनए बाध्यकारी के लिए, परीक्षण यौगिक आमतौर पर या तो ऑक्सीडेटिव या reactioning प्रतिक्रियाओं द्वारा, व्यक्तिगत दवाओं के आधार पर सक्रिय किया जाना चाहिए । परीक्षण रसायनों का ऑक्सीडेटिव या प्रतिक्रियाशील सक्रियण माइक्रोसोमल उपसेलुलर अंश में मौजूद एक P450-निर्भर एंजाइमी प्रणाली द्वारा या reductases में microsomes के साथ कमी के द्वारा मध्यस्थता की जाती है (पॉ, नध: cytochrome बी5 रिडक्टेस, P450 एंजाइमों) और सेलुलर cytosolic उपसेलुलर भागों में (NQO1, XO, ए ओ, peroxidase). डीएनए adducts बनाने के लिए प्रतिक्रियाशील चयापचयों बाि बाइंड । क्योंकि इन प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के लिए कई दवाओं को सक्रिय करने के लिए ऑक्सीडेटिव और प्रतिप्रेरक प्रतिक्रियाओं दोनों महत्वपूर्ण हैं, प्रायोगिक प्रक्रियाओं ऑक्सीकरण/कमी एंजाइमी प्रणाली का काम वर्णित हैं । इसके अलावा, उपयुक्त का पता लगाने और इन डीएनए adducts को बढ़ाता में सक्षम तरीकों विस्तार से वर्णित हैं ।

दो स्वतंत्र प्रक्रिया निर्धारित करने के लिए कि क्या परीक्षण रासायनिक, एंजाइमी प्रणालियों द्वारा सक्रिय, डीएनए के लिए बाध्य है सिफारिश कर रहे हैं: 32P-postlabeling तकनीक और उपयोग रेडियोधर्मी-लेबल यौगिक (उदा., 3एच या 14 C). पहले पायलट के लिए, स्क्रीनिंग की 32पी-postlabeling परख की सिफारिश की है । समाधान में डीएनए सामग्री का निर्धारण, ठीक मूल्यांकन, दोनों तरीकों से पहले करना चाहिए ।

32पी-postlabeling तकनीक द्वारा संशोधित डीएनए के एंजाइमी hydrolysis का इस्तेमाल गैर रेडियोधर्मी रसायनों (यलो ड्रग/) को 3 ´-phosphodeoxynucleosides, अतिरिक्त फास्फारिलीकरण के साथ रेडियोधर्मी फास्फोरस (32P) पर 5 ´- ओह, स्थिति, और रासायनिक की जुदाई-सामांय से deoxynucleotide adducts (संशोधित) deoxynucleotides द्वारा क्रोमैटोग्राफी17 (चित्रा 1) । रासायनिक यौगिक द्वारा संशोधित डीएनए endonuclease, micrococcal nuclease, और exonuclease, तिल्ली फोस्फोडाईस्टेरेज के रूप में जाना के एक मिश्रण द्वारा hydrolyzed है । hydrolyzed डीएनए के मिश्रण दोनों सामांय युक्त (unसंशोधित) और संशोधित deoxyribonucleoside 3 ´-monophosphates के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है [γ-32पी] कैरियर की उपस्थिति में एटीपी (गैर रेडियोधर्मी) एटीपी और टी-4-polynucleotide कळेनासे पीएच 9.5 पर फार्म 5 ´- 32P-लेबल 3 ´, 5 ´-bisphosphates ("मानक" प्रक्रिया में चित्रा 1) । इस्तेमाल किया alkaline पीएच टी-4 के एंजाइम गतिविधि को कम करने में सक्षम है-polynucleotide कळेनासे करने के लिए dephosphorylate deoxyribonucleoside 3 ´-monophosphates पर स्थिति-3 ´ । पृथक्करण और समाधान के लिए 32P-लेबलित adducts से रसायनों द्वारा संशोधित नहीं किए गए है जो deoxynucleotides multidirectional आयनों-विनिमय पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) पर polyethyleneimine (पी) फाइबर (चित्रा 2 ). पहले और दूसरे रेफरेंस स्टेप्स में (D1 और D2 दिशा में), लेबल नॉर्मल (unभएकै) deoxynucleotides साथ ही [32P] फास्फेट के एक छोटे टुकड़े पर इलेक्ट्रोलाइट के पानी के समाधान का उपयोग टीएलसी-पी-फाइबर प्लेट के शुरू से eluted रहे हैं क्रोमेटोग्राफिक कागज टीएलसी प्लेट के शीर्ष पर लागू किया गया है, जबकि बंधे रसायनों का प्रदर्शन hydrophobic गुण (यलो/ड्रग-adducts) पी-फाइबर प्लेट के शुरू में बनाए रखा जाता है इसके अतिरिक्त हल करने के लिए deoxynucleotides D3 और D4 दिशाओं (चित्रा 2) में कई अलग विलायक प्रणालियों के साथ । adducts के स्थानीयकरण स्क्रीन बढ़ाया autoradiography का उपयोग किया जाता है; अलग adducts एक्स-रे फिल्मों पर अंधेरे पहचानने धब्बे के रूप में पता चला रहे हैं । स्थानों के क्षेत्रों थाली से उत्पाद और तरल पदार्थ या Cerenkov गिनती से रेडियोधर्मिता का अंदाजा लगाने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । एक भंडारण फास्फोरस इमेजिंग विधि है कि नक्शे के लिए अनुकूलित किया गया है और 32पी postlabeling परख द्वारा पता लगाया chromatograms पर डीएनए adducts को बढ़ाता है अब भी प्रयोग किया जाता है । 18 झटपट Imager मशीन का उपयोग डीएनए adducts के ठहराव के लिए अक्सर किया जाता है । यह विधि स्क्रीन बढ़ाकर autoradiography19की तकनीक से 32पी का पता लगाने के लिए 10 गुना अधिक संवेदनशीलता प्रदान करती है ।

डीएनए adducts की मात्रा सापेक्ष adduct लेबलिंग (्ल), समीकरण (2) के रूप में इस प्रकार का उपयोग कर परिकलित के मूल्यों के रूप में निर्धारित कर रहे हैं:

सीपीएम. adduct deoxynucleotides में
्ल =-----------------------------------------------------------------------------------------(2)
32पी-एटीपी (सीपीएम./pmol में) x pmol deoxynucleotides की विशिष्ट गतिविधि

RALs के मूल् य कुल [adducted और सामां य (अनसंशोधित) deoxynucleotides] deoxynucleotides20,21की गणना दर से अधिक adducted deoxynucleotides की गणना दरों का अनुपात है । हालांकि, यह परिकलन adducts और सामांय deoxynucleotides22के समान लेबलिंग क्षमता पर आधारित है । शास्त्रीय ("मानक") 32पी-postlabeling तकनीक की प्रक्रिया विभिन्न डीएनए adducts (भारी और/या गैर-महाकाय adducts) के लिए उपयुक्त है, तथापि, इसकी संवेदनशीलता डीएनए में कम मात्रा में पाया adducts का पता लगाने के लिए संतोषजनक नहीं है । इस कार्यविधि का उपयोग करते हुए, डीएनए में 107 संशोधित deoxynucleotides (0.3 fmol adduct/µ g dna) में एक adduct की मात्रा का पता लगाने के लिए है ।

इस शास्त्रीय 32पी-postlabeling प्रक्रिया के संशोधनों की एक किस्म के लिए तकनीक की संवेदनशीलता तरक्की का उपयोग किया गया है । अप करने के लिए 10-100 बार उच्च adducts के निर्धारण की संवेदनशीलता से 32पी-लेबलिंग [γ-32p] एटीपी (गहनता प्रक्रिया) के स्तर को सीमित का उपयोग कर प्राप्त किया गया है । 23 , 24 एक और प्रक्रिया की संवेदनशीलता में वृद्धि प्रदान करने के लिए 32पी-postlabeling विधि nuclease P1 के साथ adducts युक्त पचा डीएनए की एक मशीन का इस्तेमाल ( Penicillium citrinum)21 (चित्रा 1) । इस एंजाइम को dephosphorylate deoxyribonucleoside 3 ´-monophosphates, जबकि बंधे रसायनों के साथ deoxynucleotides (adducted न्यूक्लियोटाइड) अनिवार्य रूप से नहीं कर रहे है इस एंजाइम के सब्सट्रेट पसंद करते हैं । इसलिए, dephosphorylated deoxyribonucleoside 3 ´-monophosphates (यानी, deoxyribonucleosides) टी-4 द्वारा phosphorylated नहीं कर रहे हैं-polynucleotide कळेनासे द्वारा [32p] फास्फेट से γ-32पी] एटीपी. हालांकि, न्यूक्लियोटाइड के कुछ जहां रसायनों (adducted deoxynucleotides) बंधे हैं, जैसे arylamine adducts C8 के deoxyguanosine में प्रतिस्थापित, इस एंजाइम द्वारा bedephosphorylated कर सकते हैं । इसके विपरीत, अधिकांश अंय adducts (जैसे, adducts deoxyguanosine के एन2 पर प्रतिस्थापित) nuclease P1 द्वारा dephosphorylated नहीं हैं । इस संशोधन के 32पी-postlabeling इस विधि को काफी अधिक संवेदनशील बनाता है, परिमाण के तीन से अधिक आदेशों के द्वारा अपनी संवेदनशीलता में वृद्धि । इसके अलावा, 32पी-postlabeling के इस संस्करण में एक विधि प्रदान करता है जहां डीएनए की उच्च मात्रा (5-10 µ जी) और वाहक के एक अतिरिक्त मुक्त [γ- 32पी] एटीपी का उपयोग किया जा सकता है ।

एक अंय विधि adducts, गुप्ता द्वारा वर्णित समृद्ध करने के लिए25, भारी deoxynucleotide adducts, जो एक चरण स्थानांतरण एजेंट की उपस्थिति में n-ब्यूटानॉल में निकाला जा सकता है के भौतिक गुणों का उपयोग करता है tetrabutylammonium क्लोराइड (टीबीए) (चित्रा 1) से पहले [32P] फॉस्फेट लेबलिंग, जबकि undeoxynucleotidesed खराब इस कार्बनिक विलायक द्वारा निकाले जाते हैं । हालांकि, कम hydrophobic adducts, deoxynucleotides के उदाहरण के लिए शामिल गैर खुशबूदार भारी moieties या छोटे alkyl अवशेषों के साथ संशोधित, प्रभावी रूप से n-ब्यूटानॉल के साथ नहीं निकाले जाते हैं । इसलिए, वे अनिवार्य रूप से undetectable है जब 32P-postlabeling विधि के इस संशोधन द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं ।

दोनों पहले उल्लेख किया है 32पी-postlabeling की संवेदनशीलता और ठहराव के डीएनए adducts में वृद्धि (परिमाण के तीन आदेश तक), 109प्रति एक adduct का पता लगाने में सक्षम किया जा रहा है,10 सामांय न्यूक्लियोटाइड (0.3-3 अमोल/µ g DNA). इन दोनों तरीकों से डीएनए को covalently बाँधने के लिए उनकी कार्यकुशलता के लिए रसायनों के परीक्षण की सिफारिश की जाती है और इसीलिए, उन्हें इस कार्य में विवरण में वर्णित किया गया है.

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए विनियमों के अनुसार प्रदर्शन किया गया (311/1997, कृषि मंत्रालय, चेक गणराज्य), जो हेलसिंकी की घोषणा के अनुपालन में है.

1. यकृत माइक्रोसोमल और Cytosolic अंशों का अलगाव

  1. तैयार यकृत उपसेलुलर भिंन (microsomes P450 एंजाइमों या cytosols में अमीर reductases या घुलनशील peroxidases में रिच) द्वारा चूहों से सरल विभेदक केंद्रापसारक (१०५,००० एक्स जी) ।
    नोट: गोली और supernatant क्रमशः microsomes और cytosols के रूप में लिया जाता है ।
    1. 50 mM Tris-HCl बफर के साथ दो बार लिवर के नमूनों (1-10 ग्राम) को धो लें, पीएच 7.4 जिसमें 150 mM KCl बफर (बफर 1) (ऊतक के वजन से 10 गुना अधिक मात्रा, यानी 10-100 मिलीलीटर) और ऊतकों को छोटे टुकड़ों में काट कर (लगभग 2 x 2 मिमी साइज के) होते हैं ।
    2. Homogenize 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर homogenizer में इस बफर (> 3 volume/वजन एमएल/जी) की उपस्थिति में ऊतक, और फिल्टर कागज का उपयोग निस्पंदन द्वारा ऊतक के अवशिष्ट गैर homogenized टुकड़े त्यागें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 600 एक्स जी में homogenate केंद्रापसारक और एक और केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए supernatant हस्तांतरण ।
    3. फिर से 1 बफर में गोली homogenize (1 ऊतक के जी प्रति 1 मिलीलीटर), दोहराने कदम 1.1.3., और गोली त्यागें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 15,000 x g पर supernatants परित । एक और केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए supernatant स्थानांतरण ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए १०५,००० x g पर supernatant केंद्रापसारक । supernatant (cytosol) को लीजिए और aliquots (1-10 एमएल) में-80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें । प्रोटीन की मात्रा के लिए cytosol विशेषता ब्रैडफोर्ड द्वारा वर्णित विधि का उपयोग कर26
    5. फिर से 100 मिमी सोडियम फॉस्फेट बफर में गोली निलंबित, पीएच 7.4 (> 2 volume/वजन एमएल/जी), 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए १०५,००० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें । री-homogenize में गोली (microsomes) 50 मिमी Tris-एचसीएल बफर, पीएच 7.4 में 150 मिमी KCl और 20% ग्लिसरॉल (< 5 volume/वजन एमएल/homogenizer में 4 डिग्री सेल्सियस से कम) शामिल है । -80 ° c में 0.5-1 मिलीलीटर aliquots में microsomes स्टोर । प्रोटीन की सामग्री के लिए microsomes विशेषता ब्रैडफोर्ड द्वारा वर्णित विधि का उपयोग कर26
    6. microsomes में cytochrome P450 की एकाग्रता का निर्धारण करते हैं.
      नोट: microsomes में P450 एंजाइमों की एकाग्रता ओमुरा और सातो द्वारा वर्णित के रूप में मापा जाता है27, कार्बन मोनोऑक्साइड (CO) के साथ कम P450 के परिसर के अवशोषण का निर्धारण । कार्बन मोनोऑक्साइड एक विषैला यौगिक है, और देखभाल के साथ और एक हुड में नियंत्रित किया जा करने के लिए है ।

2. एंजाइमी प्रणालियों की उपस्थिति में डीएनए के साथ परीक्षण रसायनों (यलो दवाओं/

  1. cytochromes P450 युक्त ऑक्सीडेटिव एंजाइमी प्रणालियों की उपस्थिति में डीएनए के साथ परीक्षण रसायनों (यलो दवाओं/
    1. 4 डिग्री सेल्सियस, निम्नलिखित यौगिकों और एंजाइमी प्रणालियों में 0.75 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में युक्त, मशीन मिश्रण तैयार करें ।
      1. मिश्रण 100 मिमी फॉस्फेट बफर, पीएच 7.4, (०.३७५ एमएल) 10 एमएम NADPH या NADPH-जनरेटिंग सिस्टम के साथ (10 एमएम MgCl2, 10 एमएम डी-ग्लूकोज 6-फास्फेट, 10 एमएम NADP+, 1 यू/एमएल डी-ग्लूकोज 6-फास्फेट डिहाइड्रोजनेज) (75 µ एल) ।
      2. इस मिश्रण में जोड़ें microsomes या Supersomes में शुद्ध रिकॉमबिनेंट P450, जो कीट कोशिकाओं microsomes से अलग कर रहे हैं transfected baculovirus युक्त सीडीएनए रिकॉमबिनेंट एंजाइमों, 50 P450 pmol एंजाइमों के 50 P450 में शामिल हैं l µ या माइक्रोसोमल तैयारी-यकृत माइक्रोसोमल भिंन प्रयोगशाला में पृथक या एक वाणिज्यिक स्रोत से ।
      3. जोड़ें 1 मिलीग्राम बछड़ा थाइमस डीएनए (स्टॉक समाधान के 0.3 मिलीलीटर-आसुत पानी में 3.3 मिलीग्राम/एमएल), और 5 एस के लिए एक भंवर शेखर पर हिला ।
      4. अंत में, 7.5 µ एल 0.1 mM परीक्षण ellipticine DMSO और ४२.५ µ l आसुत जल में भंग दवा जोड़ने के लिए 0.75 मिलीलीटर की मशीन मिश्रण की मात्रा तक पहुंचने । डीएनए adducts का पता लगाने की प्रक्रिया के आधार पर 3एच या 14सी या अनलेबल्ड रसायनों के साथ लेबल वाले रसायनों का प्रयोग करें ।
      5. 5 एस के लिए एक भंवर शेखर पर शेक 37 ° c में खोला ट्यूबों में मशीन 30-60 मिनट के लिए ।
      6. इसके अलावा दो नियंत्रण गर्मी इसी तरह तैयार है, लेकिन (i) एक सक्रिय प्रणाली के बिना (माइक्रोसोमल नमूने) या (ii) इसके साथ, लेकिन बिना परीक्षण यौगिक.
  2. परीक्षण रसायनों (यलो एंजाइमी सिस्टम की उपस्थिति में डीएनए के साथ) दवाओं की मशीन
    1. 4 डिग्री सेल्सियस, निम्नलिखित यौगिकों और एंजाइमी प्रणालियों में 0.75 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में युक्त, मशीन मिश्रण तैयार करें ।
      1. 4 डिग्री सेल्सियस, मिश्रण 100 मिमी Tris-एचसीएल बफर, पीएच 7.4, 0.2% के बीच 20, (०.३७५ मिलीलीटर), 10 मिमी NQO1ात्मक एंजाइम (NADPH) (75 µ एल) के cofactor का समाधान, cytosolic भिन्न (यकृत cytosolic भिन्न-पृथक प्रयोगशाला में या cytosolic का उपयोग करने के मामले में अलग मानव दाताओं वे वाणिज्यिक 1 मिलीग्राम प्रोटीन (50 µ एल)) से युक्त स्रोत से प्राप्त किया गया भिंन से अलग ।
      2. जोड़ें 1 मिलीग्राम बछड़ा थाइमस डीएनए (शेयर समाधान के 0.2 मिलीलीटर-आसुत जल के 3.3 मिलीग्राम/एमएल), और 5 एस के लिए एक शेखर पर हिला ।
      3. अंत में, 7.5 µ एल 0.1 mM परीक्षण रासायनिक जोड़ें (आसुत जल में भंग, मेथनॉल, इथेनॉल या DMSO, यौगिक के घुलनशीलता पर निर्भर करता है) और ४२.५ µ l आसुत पानी के लिए मशीन मिश्रण के लिए 0.75 मिलीलीटर की मात्रा तक पहुंचने के लिए । डीएनए adducts का पता लगाने के लिए प्रक्रिया के आधार पर 3H या 14C या अनलेबल्ड रसायनों के साथ लेबल किए गए रसायनों का उपयोग करें (नीचे देखें) ।
      4. 1 min. शेक के लिए आर्गन के साथ रिएक्शन मिक्सचर को पर्ज करे 5 s. 30-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बंद ट्यूबों में मशीन ।
      5. इसके अलावा दो नियंत्रण गर्मी इसी तरह तैयार है, लेकिन (i) एक सक्रिय प्रणाली के बिना (cytosolic अंशों) या (ii) इसके साथ, लेकिन परीक्षण रसायनों के बिना.
  3. कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ मशीन मिश्रण का निष्कर्षण परीक्षण रसायनों की अधिकता को दूर करने के लिए
    1. इन सॉल्वैंट्स जोड़कर एथिल एसीटेट (या diethyl ईथर या hexane) की एक ही मात्रा के साथ एक टोपी के साथ एक टेस्ट ट्यूब में मशीन मिश्रण मिश्रण । एक पायस रूपों तक एक शेखर पर ट्यूब की सामग्री हिला ।
    2. (3 मिनट) 1,600 x जी में परिवेश के तापमान पर एक केंद्रापसारक में स्पिन । यदि कार्बनिक और जलीय चरणों ठीक से अलग नहीं कर रहे हैं, स्पिन एक लंबी अवधि के लिए एक बार और अधिक या एक उच्च केंद्रापसारक गति से ।
    3. ऊपरी, कार्बनिक चरण एक पिपेट के साथ एकत्रित निकालें । यदि छोटे वॉल्यूम (< 400 µ l) का उपयोग किया जाता है, तो उपयुक्त टिप के साथ फ़िट किए गए स्वचालित पिपेट का उपयोग करें । एक तरफ इस कार्बनिक चरण कास्ट ।
    4. चरण 2.3.1., 2.3.2 और 2.3.3 दोहराएं । नाइट्रोजन गैस की एक धारा से अवशिष्ट कार्बनिक सॉल्वैंट्स निकालें (हटाने की जरूरत है कम से 5-10 मिनट) ।
  4. डीएनए की मशीन से अलगाव
    1. phenol/क्लोरोफॉर्म और इथेनॉल के साथ अपनी वर्षा के साथ समाधान से डीएनए का निष्कर्षण
      1. phenol, phenol/क्लोरोफॉर्म (1:1), और क्लोरोफॉर्म के साथ डीएनए के समाधान से प्रोटीन निकालने के द्वारा मशीन मिश्रण से डीएनए को अलग करने के लिए प्रोटीन को हटा दें नीचे दिखाए गए प्रक्रिया द्वारा ।
      2. एक टोपी के साथ एक बाज़ या Eppendorf ट्यूब में phenol या phenol/क्लोरोफॉर्म (1:1) की एक ही राशि के साथ मशीन मिश्रण गठबंधन । एक पायस रूपों तक मिश्रण हिलाओ ।
      3. (3 मिनट) 1,600 x जी में परिवेश के तापमान पर एक केंद्रापसारक में स्पिन । यदि कार्बनिक और जलीय चरणों ठीक से अलग नहीं कर रहे हैं, स्पिन एक लंबी अवधि के लिए एक बार फिर या एक उच्च केंद्रापसारक गति से ।
      4. एक पिपेट के साथ ऊपरी जल चरण एक नया के लिए स्थानांतरण ट्यूब । यदि छोटे वॉल्यूम (< 400 µ l) का उपयोग किया जाता है, तो उपयुक्त टिप के साथ फ़िट किए गए स्वचालित प्लास्टिक का उपयोग करें । कार्बनिक चरण के साथ प्रोटीन इंटरफेस निकालें ।
      5. ऊपरी जल चरण को phenol और क्लोरोफॉर्म (1:1) के मिश्रण की समान मात्रा के साथ संयोजित करें । पुनरुत्पादन चरण 2.4.1.2 । -2.4.1.4 ।
      6. ऊपरी जल चरण को क्लोरोफॉर्म की समान मात्रा के साथ संयोजित करें और चरण 2.4.1.2 दोहराएँ. -2.4.1.4 । ठंड (-20 डिग्री सेल्सियस) इथेनॉल के 2 संस्करणों के साथ वर्षण से डीएनए की वसूली । डीएनए समाधान की मात्रा निर्धारित करें ।
      7. 0.1 m के अंतिम सांद्रता के लिए 5 एम सोडियम क्लोराइड के अलावा monovalent cations की एकाग्रता अनुकूलन । जोरदार हलचल । ठंड (-20 डिग्री सेल्सियस) इथेनॉल के 2 संस्करणों के साथ गठबंधन और ठीक से मिश्रण । कूल-20° c.
      8. -20 ° c जब तक डीएनए में संग्रहीत है । जब डीएनए (जैसे, एंजाइमी सक्रियकरण प्रतिक्रिया के दौरान ऑक्सीजन कण के गठन के द्वारा) (जैसे,) (< 1 kb) या छोटी मात्रा में डीएनए है कि डीएनए के आकार के लिए अलगाव की प्रक्रिया के दौरान, मशीन के दौरान खंडित है (< 0.1 mg/ एमएल), ठंडा होने के समय में वृद्धि हुई है और तापमान में कमी आई-70 ° c ।
      9. स्पिन (10 मिनट) में 1,600 x g पर 0 ° c एक केंद्रापसारक में । यदि डीएनए कम सांद्रता पर या छोटे टुकड़ों के रूप में मौजूद है, एक लंबी अवधि के लिए एक बार और स्पिन (30 मिनट) । supernatant को त्यागें ।
      10. किसी भी solutes (या परीक्षण रासायनिक के अवशिष्ट अंश) जो उपजी डीएनए में मौजूद हो सकता है हटाने के लिए, 70% इथेनॉल और diethyl ईथर के साथ डीएनए धोने । धो शीत (-20 ° c) 70% इथेनॉल के साथ उपजी डीएनए । स्पिन (10 मिनट) में 1,600 x g पर 0 ° c एक केंद्रापसारक में । supernatant को त्यागें ।
      11. चरण 2.4.1.10 दोहराएं । धो शीत (-20 ° c) 70% इथेनॉल के साथ उपजी डीएनए । स्पिन (10 मिनट) में 1,600 x g पर 0 ° c एक केंद्रापसारक में । supernatant को त्यागें ।
      12. चरण 2.4.1.10 दोहराएं । शोषक कागज पर एक ऊर्ध्वाधर राज्य में ट्यूब डाल अवशिष्ट supernatant हटाने के लिए । अलग डीएनए से परीक्षण रासायनिक के संभावित अवशेषों को त्यागने के लिए diethyl ईथर के 1 मिलीलीटर जोड़कर डीएनए गोली धो लें । स्पिन (10 मिनट) में 1,600 x g पर 0 ° c एक केंद्रापसारक में । supernatant को त्यागें ।
      13. उचित मात्रा में डीएनए गोली को भंग (आमतौर पर 100-400 µ एल में 0.5-1 µ जी की डीएनए एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए) आसुत जल की (या में 0.15 mm सोडियम साइट्रेट और 1.5 mm सोडियम क्लोराइड) । डीएनए समाधान रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर खड़े हो सकते हैं, या डीएनए भंग बढ़ाने के लिए 10-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म किया जा सकता है ।
      14. भंडारण से पहले, छोटे aliquots (10-20 µ एल) में डीएनए अलग है, क्योंकि दोहराया ठंड और डीएनए समाधान के गल adduct सांद्रता में कमी में परिणाम हो सकता है । पर स्टोर-80 ° c या ठंडा ।
        नोट: स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक डीएनए का निर्धारण: सरल और सटीक तरीका है, जो व्यापक रूप से एक तैयारी में डीएनए की मात्रा को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है अगर नमूना शुद्ध है (यानी, जैसे प्रोटीन, phenol, या अन्य के रूप में दूषित पदार्थों की महत्वपूर्ण मात्रा के बिना न्यूक्लिक एसिड), कुर्सियां द्वारा अवशोषित पराबैंगनी विकिरण के डीएनए की मात्रा का स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक माप है (पहले वर्णित प्रक्रियाओं देखें)28
  5. डीएनए adduct गठन का पता लगाने के लिए प्रक्रिया
    1. 32 पी-postlabeling परख
      नोट: डीएनए hydrolysis adducts के विश्लेषण के लिए इस स्तर पर तैयार hydrolysate (2.5.1.) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सामांय के रूप में (संशोधित) deoxynucleotides (2.5.7.) का इस्तेमाल करता है ।
      1. ~ 450 यूनिट (यू)/mL. के एक एकाग्रता पर पानी में micrococcal nuclease (MN) भंग आसुत जल के खिलाफ Dialyze और समायोजित करने के लिए 300 U/एमएल । Dialyze तिल्ली फोस्फोडाईस्टेरेज (एसपीडी) समाधान और समायोजित करने के लिए 4 यू/एमएल ।
      2. मिश्रण mn और एसपीडी अंतिम सांद्रता 150 ंयू/µ एल MN और 2.5 ंयू/µ l एसपीडी (mn/एसपीडी समाधान) । डीएनए समाधान 12.5 µ जी युक्त ले लो, और एक वाष्पीकरण में सूखापन के लिए लुप्त हो जाना । में भंग 6.5 µ l आसुत जल ।
      3. 5.0 µ l mn/एसपीडी समाधान (MN के अंतिम एकाग्रता 60 म्यू/µ एल, एसपीडी के अंतिम एकाग्रता है 1 म्यू/µ एल), और 1.0 µ l पाचन बफर (सोडियम succinate के अंतिम एकाग्रता 20 मिमी है, CaCl की अंतिम एकाग्रता2 8 मिमी है) । मिश्रण की अंतिम मात्रा 12.5 µ एल मिश्रण और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 ज के लिए प्रतिक्रियाओं की अनुमति है ।
      4. 2.5 µ निकालें l (एक और ट्यूब के लिए स्थानांतरण) आगे कमजोर पड़ने और undeoxynucleotides (2.5.7.) के विश्लेषण के लिए
    2. Nuclease P1 संवर्धन प्रक्रिया
      1. को शेष 10.0 µ l के hydrolysate, 0.65 µ एल सोडियम एसीटेट बफर जोड़ें (अंतिम एकाग्रता, 40 मिमी), 0.65 µ एल ZnCl2 समाधान (अंतिम एकाग्रता 0.1 मिमी), 1.25 µ एल NP1 समाधान (अंतिम एकाग्रता, ०.३८५ µ जी/µ एल), और 0.45 µ l आसुत जल । मिश्रण का अंतिम आयतन 13 µ l है ।
      2. मिश्रण 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति दें, और Tris समाधान के 3 µ एल के अलावा के साथ प्रतिक्रिया अंत ।
    3. n-ब्यूटानॉल संवर्धन प्रक्रिया
      1. डीएनए hydrolysate के शेष 10.0 µ एल करने के लिए, 11.6 mm अमोनियम formate समाधान के 215 µ एल जोड़ने के लिए, पीएच 3.5, और 25 µ एल 10 मिमी टीबीए क्लोराइड समाधान । 250 µ एल n-ब्यूटानॉल के साथ निकालें (पानी से संतृप्त) जोरदार मिश्रण द्वारा । 1600 x जी में स्पिन (3 मिनट) अलग परतों के लिए, और बंद ऊपरी n-ब्यूटानॉल परत ले । 250 µ एल एन-ब्यूटानॉल के साथ एक बार और निकालें (पानी के साथ संतृप्त), स्पिन, ऊपरी n-ब्यूटानॉल परत दूर ले, और पूर्व निकालने के साथ गठबंधन ।
      2. 400 µ l पानी जोड़ें ( nके साथ संतृप्त-ब्यूटानॉल) इस निकालने के लिए, और जोरदार मिश्रण । स्पिन अलग परतों के लिए और नीचे जलीय परत को हटा दें । दोहराएं इस धोने की प्रक्रिया का उपयोग कर 400 पानी की µ l ( n-ब्यूटानॉल के साथ संतृप्त) । 250 mM Tris-HCl सॉल्यूशन, pH 9.5 के 3 µ l को n-ब्यूटानॉल लेयर में जोड़ें । परिवेश के तापमान पर एक वाष्पर में सूखापन के लिए एन-ब्यूटानॉल लुप्त हो जाना ।
      3. 100 µ l n-ब्यूटानॉल में अवशेषों को भंग, फिर से सूखापन के लिए लुप्त हो जाना, और १६.० µ l पानी में अवशेषों को भंग.
    4. adducts का लेबल
      1. 1 µ l जोड़ें bicine बफ़र समाधान (लेबलिंग बफ़र) और 4.5 µ l युक्त मिश्रण के 100 µ ci [γ-32P] एटीपी, 45 शीत एटीपी के pmol, और 10.0 टी-4 के यू-PNK (टी-4-phosphonucleotide कळेनासे) से १६.० µ एल समाधान NP1 या ब्यूटानॉल संवर्धन मिश्रण से । रिएजेंट के अंतिम सांद्रता निम्नलिखित होगा: 20 मिमी bicine, 10 मिमी MgCl2, 10 मिमी dithiotreitol, 0.5 मिमी spermidine, और 0.5 U/µ एल टी-4-PNK, 3 µ एम एटीपी. मिश्रण का कुल आयतन 20 µ l है ।
      2. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए मिश्रण की अनुमति दें । पूरे नमूने (अर्थात20 µ l) को बेई-फाइबर टीएलसी प्लेट (2.5.6.) पर लागू करें ।
    5. NP1 या n -ब्यूटानॉल बढ़ाने की प्रक्रियाओं की प्रभावकारिता का मूल्यांकन
      1. ट्यूब के नीचे 50 µ l पानी से धो लें । मिश्रण के लिए जोरदार 30 एस और स्पिन (1 मिनट) में 1,600 x g एक को स्थापित करने के लिए ढक्कन पर कोई संदूषण है । एक पी-फाइबर टीएलसी प्लेट पर 5 µ एल स्पॉट (20 x 20 सेमी) । Chromatograph का उपयोग कर एक समाधान 280 मिमी में (NH4)2तो4 और 50 मिमी णः2PO4, पीएच 6.8.
    6. adducted deoxynucleotides की टीएलसी जुदाई
      1. पूर्व-टीएलसी प्लेटों को आसुत जल से धोएं । यह विशेष रूप से घर में बनाया प्लेटों के लिए सिफारिश की है ।
        नोट: इस धोने बाहर किया जाना चाहिए प्लेटों से पीले रंग को दूर करने के लिए, एक रंग है जो पृष्ठभूमि तरक्की कर सकते हैं, विशेष रूप से विलायक मोर्चे पर ।
      2. पी-फाइबर टीएलसी प्लेट पर पूरे नमूने स्पॉट और क्रोमैटोग्राफी शुरू (2.5.4.); adducts की साफ-अप D1 और D2 दिशाओं (चित्रा 2) में प्लेट विकसित करके किया जाता है ।
      3. एक D1 दिशा में थाली विकसित (चित्रा 2). डीएनए adducts टीएलसी प्लेट के शुरू में शेष रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए 1.7 M सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच 6.8, का उपयोग करें । Analogously, इस बफर का उपयोग कर एक D2 दिशा में थाली विकसित करना । प्रक्रियाओं के लिए संभावित बफ़र्स पर जानकारी के लिए, adducts20,28के कई प्रकार के समाधान के लिए वर्णित समाधान देखें ।
        नोट: D2 दिशा में प्लेट का विकास छोड़ा जा सकता है ।
      4. दो लगातार स्नान में लगभग 5 मिनट के लिए क्रोमैटोग्राफी के बाद पानी में थाली धो लो । उसके बाद प्लेटों को सुखा लें ।
      5. 3 डी और D4 दिशा में प्लेटें विकसित 3.5 m लिथियम प्रारूपण बफर, पीएच 3.5, d3 दिशा और 0.5 m Tris-एचसीएल बफर, पीएच 8.0 के लिए 8.5 मीटर यूरिया युक्त, 0.8 m LiCl और D4 दिशा के लिए 8.5 मीटर यूरिया युक्त (चित्रा 2) । सॉल्वैंट्स टीएलसी प्लेट पर adduct धब्बे विकसित करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए । D3 और D4 विकासशील कार्यविधियों के लिए संभावित बफ़र्स पर जानकारी के लिए, adducts23,24,25,28के कई प्रकारों के रिज़ॉल्यूशन के लिए वर्णित समाधान देखें ।
      6. D4 में किसी भी समस्याओं से बचने के लिए, एक D4 दिशा में विकास के बाद और एक पानी धोने, प्लेटों विकसित (D4 के साथ) में 1.7 M सोडियम फॉस्फेट, पीएच 6.0 (आमतौर पर दिशा में विकास के रूप में सौंपा D5), एक कागज बाती के शीर्ष करने के लिए (12 x 11.5 cm).
        नोट: D5 दिशा का लोप भी किया जा सकता है । इस मामले में, यह टीएलसी टैंक खोलने के लिए जब विलायक टीएलसी के शीर्ष पर पहुंच गया है, और 60 मिनट तक के लिए एक रन की अनुमति आवश्यक है । इस विधि भी एक बाती जोड़ने (विधि अक्सर कई प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल के लिए D4 में किसी भी समस्याओं को हटाने से बेहतर है) ।
    7. ठहराव of normal (अनसंशोधित) deoxynucleotides के बाद hydrolysis
      1. hydrolysate के एक aliquot ( 2.5.1. का वर्णन डीएनए hydrolysis से) आसुत जल के साथ पतला, (यानी, 2.5 µ से पाचन मिश्रण की एल 2.5.1. 250 µ एल के लिए समायोजित, और इस समाधान के 10 µ एल के लिए समायोजित 150 µ एल) ।
      2. ले एक 5 µ एल (10 pmol सामांय deoxynucleotides) इस डाइजेस्ट के aliquot, जोड़ें 2.5 µ एल 10 मिमी Tris-एचसीएल बफर, पीएच 9.0, और लेबल के रूप में 2.5.4. (मिश्रण की अंतिम मात्रा 10 µ एल है) । कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करने की अनुमति दें ।
      3. मिश्रण के 4 µ l aliquot लें और 10 mM Tris-HCl, pH 9.0 के साथ 750 µ l को पतला करें । मिश्रण और स्पिन स्थापित करने के लिए ढक्कन की कोई संदूषण है । एक पी-फाइबर टीएलसी प्लेट पर 5 µ एल लागू करें । 280 mm (NH4)2तो4 और 50 mm णः2PO4, pH 6.5 के सॉल्यूशन में टीएलसी प्लेट को डेवलप करें । टीएलसी के बाद सूखने की अनुमति दें ।
      4. का प्रयोग करें autoradiography कि परिवेश के तापमान पर लगभग 45 मिनट के लिए किया जाता है के लिए चार unभएकै deoxynucleotide बीआईएस-फास्फेट स्थानीयकृत । या तो तरल पदार्थ या Cerenkov गिनती द्वारा ठहराव के लिए स्पॉट कट ।
    8. सापेक्ष adduct लेबलिंग (्ल) की गणना
      1. adduct स्पॉट में गिना के मान निर्धारित करें और लेबल की aliquot में गिना जाता है (सामांय) संशोधित deoxynucleotides ।
        नोट: बाद के लिए १८०,००० पर निर्धारित किया जाना है पूर्व, एक आंकड़ा है जो रूपांतरण कारक के लिए संशोधित (सामांय) deoxynucleotides के ्ल मूल्यों के मूल्यांकन के लिए की गिनती के लिए लागू है की तुलना में कम सामग्री adduct स्तर । डीएनए adducts के ्ल (2) ऊपर दिखाए गए समीकरण के अनुसार गणना की जाती है ।
    9. परीक्षण कैंसर या रेडियोधर्मी-लेबल दवा का उपयोग डीएनए के लिए दवाओं के बंधन का पता लगाने
      1. तरल पदार्थ गिनती द्वारा रसायनों के साथ संशोधित डीएनए के 3एच या 14सी रेडियोधर्मिता का मूल्यांकन करें ।
      2. जोड़ें डीएनए समाधान के 10-50 µ एल जुटाना शीशी में एक जुटाना समाधान के 3 मिलीलीटर । अच्छी तरह मिलाएं । जुटाना काउंटर का उपयोग रेडियोधर्मिता को मापने ।

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Representative Results

रसायनों की शक्ति की जांच करने के लिए एंजाइम-catalyzed सक्रियण (जैसे, P450, peroxidase, रिडक्टेस) के उपयोग के लिए यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना (यलो/ड्रग्स) उनके metabolized में जिसके परिणामस्वरूप मध्यवर्ती करने के लिए आबंध किया जा करने के लिए डीएनए के लिए बाध्यकारी (डीएनए adducts की पीढ़ी), हम (मैं) विरोधी एजेंट ellipticine के औषधीय कार्रवाई के एक उपंयास तंत्र को हल करने में सक्षम थे (एक समीक्षा के लिए देखें,29,30,31), (ii) दो की एटियलजि ऊपरी urothelial पथ संयंत्र उपक्षार aristolochic एसिड (aristolochic एसिड नेफ्रोपैथी और बाल्कन स्थानिकमारी नेफ्रोपैथी) की वजह से कैंसर के साथ जुड़े nephropathies (एक समीक्षा के लिए देखें,32,33,34, 35,36,37,38,39), और (iii) कई यलो कार्सीनोजेनिसिटी के genotoxic तंत्र जैसे एक वायु वायू 3- nitrobenzanthrone (3-एनबीए)40,41,42,43,44,45 और इसके प्रतिआगमनात्मक समकक्ष, 3-aminobenzanthrone (3-आबा),46 ,४७,४८ पादप उपक्षार aristolochic अम्ल,३२,३३,३४,३५,३६,३७ , 38 , ३९ और एक सुगन्धित अमीन -anisidine. 49 , 50 , 51 , 52 इसके अलावा, इन रसायनों के जैविक प्रभावों का निर्धारण एंजाइमों वर्णित तरीकों को रोजगार निर्धारित किया गया ।

यहां, P450s और डीएनए के साथ आबंध adducts की पीढ़ी में जिसके परिणामस्वरूप peroxidases द्वारा ellipticine के ऑक्सीडेटिव सक्रियण पर प्रतिनिधि परिणाम, और 3 की कमी पर-एनबीए चयापचयों है कि covalently संशोधित डीएनए, दिखाया जाता है ।

संयंत्र उपक्षार ellipticine (5, 11-dimethyl-6एच-pyrido [4, 3-बी] carbazole) और उसके डेरिवेटिव अर्बुदरोधी एजेंट, जो कई तंत्र के माध्यम से डीएनए हानिकारक दवाओं के रूप में कार्य कर रहे हैं, सेल चक्र और प्रेरण की गिरफ्तारी में शामिल apoptosis (अवलोकन के लिए,29,30,31) देखें । इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम प्रदर्शन किया है कि विरोधी दवा माइक्रोसोमल P450s (चित्रा 3) और peroxidases (चित्रा 4)29द्वारा चयापचय के बाद आबंध डीएनए adducts उत्पन्न करता है, 30 , 31 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59 , 60 , 61, और यह कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ इस एजेंट की मजबूत दक्षता समझाया30। [3एच]-radiolabeled ellipticine और 32पी postlabeling तकनीक के nuclease P1 संस्करण मुख्य रूप से अध्ययन में29,30,31,53 का उपयोग किया गया ,61. उपसेलुलर एंजाइम सिस्टम, एंजाइम अवरोधकों और वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगों में शुद्ध एंजाइमों के साथ जटिल अध्ययन का उपयोग करना, प्रमुख P450 एंजाइमों के डीएनए adducts और संरचनाओं बनाने प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के लिए ellipticine ऑक्सीकरण इन प्रतिक्रियाशील प्रजातियों29,30,31,55की विशेषता थी । P450s की जांच की, मानव CYP3A4 एंजाइम ellipticine ऑक्सीकरण में सबसे कुशल है 12-hydroxyellipticine और 13-hydroxyellipticine, ellipticine चयापचयों, जो अनायास ellipticine को मिटता-12-ylium और ellipticine-13-ylium डीएनए के लिए बाध्यकारी (चित्रा 5) । 55 , 61 सिप एंजाइमों भी आगे चयापचयों जैसे 9-hydroxyellipticine, जो एक detoxification metabolite, 7-hydroxyellipticine और ellipticine एन2-ऑक्साइड, जो नाबालिग के रूप में गठित कर रहे है माना जाता है उत्पंन ellipticine चयापचयों. 9-hydroxyellipticine के रूप में अच्छी तरह से 7-hydroxyellipticine और ellipticine एन2-ऑक्साइड मुख्य रूप से CYP1A1 और CYP2D6, क्रमशः द्वारा बनाई गई हैं । 55 , 57 , 58

Peroxidases (अर्थात, सहिजन peroxidase (एचआरपी), lactoperoxidase (LPO), myeloperoxidase (MPO) और cyclooxygenases (कॉक्स-1 और कॉक्स-2)) metabolize ellipticine उत्पन्न करने के लिए समान ellipticine-प्राप्त डीएनए adducts (चित्रा 4)61 चित्रा 5में दिखाया तंत्र द्वारा ।

nitroaromatic 3-एनबीए (3-नाइट्रो-7एच-बेंजडेanthracen-7-एक) डीजल निकास का एक घटक है और हवाई कणों62,63,64में पाया जाता है । इस वायू के प्रमुख metabolite, 3-आबा,64,65 नमक खदानों के मजदूरों के मूत्र में पता लगाया गया कि डीजल उत्सर्जन में लम्बे समय से63के मामले सामने आ रहे थे । इस खोज का प्रदर्शन किया है कि इन श्रमिकों 3 एनबीए के संपर्क में थे । यह nitroaromatic intratracheal जगाकर67के बाद चूहों में फेफड़े के ट्यूमर का कारण बनता है । 3-एनबीए भी एंस साल्मोनेला typhimurium परीक्षण में एक mutagen के रूप में कार्य करता है (में तनाव YG1024 एक्सप्रेस nitroreductase और -acetyltransferase), इस तनाव62में प्रति revertants से अधिक ६,०००,००० nanomole पैदा । इसकी genotoxic शक्ति भी इन विट्रो में डीएनए के साथ आबंध adducts की पीढ़ी द्वारा प्रदर्शन किया गया था, कई एंजाइमों द्वारा सक्रियण के बाद, इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग, और vivo में कुतर जानवरों के कई अंगों में (चित्रा 6 )39,40,41,42,43,44,45,46,47 ,६४,६७,६८.

3-एनबीए-व्युत्पंन डीएनए cytosolic reductases (यानी, NQO1) के साथ 3-एनबीए सक्रियकरण के बाद गठित adducts 32पी-nuclease विधि प्रोटोकॉल में वर्णित के ब्यूटानॉल P1 और n-postlabeling संवर्धन विधियों द्वारा मापा गया इस अध्ययन में प्रस्तुत किया । परिणामों ने पांच डीएनए adducts के गठन का संकेत दिया (adduct में स्पॉट 1-5 का आंकड़ा 7), और उनमें से तीन की विशेषता थी 2-(2 '-deoxyadenosin-N6-yl) -3-aminobenzanthrone (dA-N6-c2-आबा; adduct स्पॉट 1), n-(2 '-deoxyguanosin-n2-yl) -3-aminobenzanthrone (dG-N2-c2-आबा; adduct रपोट 3) और N-(2 '-deoxyguanosin-8-yl) -3-aminobenzanthrone (डीजी-C8-एन-आबा; adduct लूटे 4 और 5) (चित्रा 7 और चित्रा 8) । 32पी-postlabeling विधि के nuclease P1 संस्करण का उपयोग, डीजी-C8-एन-आबा (adduct स्पॉट 4 और 5) undetectable था (चित्रा 7 और चित्रा 8) । इस परिणाम को रेखांकित करता है कि 32पी-postlabeling के इस संस्करण की कुछ सीमाएं होती हैं, अर्थात्, कम (यदि कोई हो) adducted deoxynucleotides कि dephosphorylated द्वारा nuclease P1 ( यानी, adducts के दौरान गठित का पता लगाने arylamines के ऑक्सीकरण या खुशबूदार nitroderivatives की कमी से N-hydroxyarylamine-deoxyguanosine के C8 में प्रतिस्थापित डेरिवेटिव) । ellipticine के साथ अध्ययन के लिए इसी तरह, उपसेलुलर एंजाइम सिस्टम के साथ जटिल अध्ययन का उपयोग, एंजाइम अवरोधकों, शुद्ध एंजाइमों, और डीएनए adduct मानकों इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल रोजगार प्रयोगों में, प्रमुख cytosolic कमी एंजाइमों metabolizing 3-एनबीए डीएनए adducts, अर्थात्, 3-एनबीए (N-OH-आबा), और तीन डीएनए adducts द्वारा उत्पंन की संरचनाओं 3-एनबीए की कमी के द्वारा गठित चयापचयों पैदा करने के लिए विशेषता थे (चित्रा 7 और चित्र 8) । जिगर में, 3-एनबीए की इन विट्रो में के लिए मुख्य रूप से मानव और चूहे NQO1 के कारण पाया गया था (चित्रा 7), जबकि मानव एन,-acetyltransferases (NATs), NAT2, NAT1, sulfotransferase (स्लट), SULT1A1 और, को एक हद से कम, SULT1A2 चरण 3-एनबीए42सक्रिय द्वितीय के प्रमुख एंजाइमों हैं । यकृत माइक्रोसोमल है भी 3 के सक्रियकरण में प्रभावी-एनबीए41, लेकिन चूहों में, 3-एनबीए मुख्य रूप से NQO1 द्वारा बजाय इस माइक्रोसोमल42से सक्रिय है । फेफड़ों में, जो 3-एनबीए कार्सीनोजेनिसिटी के लिए लक्ष्य ऊतक है67, दोनों NQO1 और XO को कम करने के लिए 3-एनबीए चयापचयों पैदा करने के लिए डीएनए adducts । हालांकि, XO के रूप में कार्य करने के लिए लगता है एक नाबालिग 3-एनबीए सक्रिय इस अंग में एंजाइम69.

Figure 1
चित्रा 1: 32पी-postlabeling परख की योजना । 32पी-postlabeling विधि और उसकी बढ़ी हुई प्रक्रियाओं के अलग-अलग चरण दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: पी-फाइबर टीएलसी प्लेटों पर डीएनए adduct रेफरेंस के पैटर्न । पी-फाइबर प्लेट पर डीएनए adducts का multidirectional क्रोमैटोग्राफी दिखाया गया है । उत्पत्ति पी-फाइबर टीएलसी प्लेट पर एक शुरुआत की स्थिति है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: 32पी-postlabeling डीएनए adducts का विश्लेषण में गठित बछड़ा थाइमस डीएनए ellipticine, NADPH और (एक) चूहा और (ख) मानव यकृत microsomes, (ग) microsomes बिना एक नियंत्रण नमूना के साथ मशीन । Adducts 1 और 2 तीर द्वारा सौंपा ellipticine microsomes के साथ सक्रिय द्वारा डीएनए में deoxyguanosine में उत्पंन कर रहे हैं । 32 P-postlabeling विधि (चरण 2.5.2.) के nuclease P1 संस्करण को नियोजित किया गया था मूल नीचे बाएं कोनों पर स्थित है (नीचे से D3 ऊपर और D4 बाएं से दाएं) । D2 छोड़ा गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र ४: ३२पी-postlabeling िरा का ellipticine-मध्यस्थता डीएनए adducts. Adducts में गठित बछड़ा थाइमस डीएनए में ellipticine (100 µ m) के साथ प्रतिक्रिया और सहिजन peroxidase (), गोजातीय lactoperoxidase (B), मानव myeloperoxidase (C), ovine साइक्लोऑक्सीजिनेज-1 (D), मानव साइक्लोऑक्सीजिनेज-2 ( ) (5 µ जी peroxidases गर्मी में मौजूद थे), चूहों के जिगर डीएनए से 40 मिलीग्राम ellipticine प्रति किलोग्राम शरीर के वजन (bw) (एफ), बछड़ा थाइमस डीएनए से प्रतिक्रिया के साथ इलाज किया ellipticine और मानव CYP3A4 (जी) के साथ, 13 के साथ hydroxyellipticine(एच), ellipticine एन2-ऑक्साइड (I), और 12-hydroxyelipticine (जे) । प्रयोगों परख के nuclease P1 संस्करण का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया (2.5.2 कदम.) मूल नीचे बाएं कोनों पर है (नीचे से D3 ऊपर और D4 बाएं से दाएं) । D2 छोड़ा गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: peroxidases और CYPs द्वारा ellipticine के ऑक्सीकरण ellipticine चयापचयों दिखा रहा है और उन डीएनए adducts उत्पन्न करने के लिए सुझाव दिया. कोष्ठक में यौगिकों प्रयोगात्मक प्रयोगों में इस्तेमाल की शर्तों के तहत अभी भी पता नहीं किया गया है, और वे परम डीएनए के लिए बाध्यकारी प्रजातियों के रूप में electrophilic चयापचयों माने हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: के चयापचय सक्रियण और डीएनए adduct गठन द्वारा 3-nitrobenzanthrone. 3-एनबीए, 3-nitrobenzanthrone; NQO1, णड (प) H:quinone oxidoreductase; नात, एन,-acetyltransferases; स्लट, sulfotransferase; सिप, cytochrome P450; , NADPH: cytochrome P450 oxidoreductase; एचआरपी, सहिजन peroxidase; LPO, lactoperoxidase; MPO, myeloperoxidase; कॉक्स-1, साइक्लोऑक्सीजिनेज-1. R =-COCH3 या-सू3ज; दा-N6-आबा, 2-(2 '-deoxyadenosin-N6-yl) -3-aminobenzanthrone; डीजी-एन2-आबा, एन-(2 '-deoxyguanosin-एन2-yl) -3-aminobenzanthrone; डीजी-C8-एन-आबा, एन-(2 '-deoxyguanosin-8-yl) -3-aminobenzanthrone. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: 32पी-postlabeling का विश्लेषण 3-एनबीए-व्युत्पन्न डीएनए adducts. nuclease P1-(बाएं पैनलों) और n-ब्यूटानॉल निष्कर्षण संस्करण (विधि का सही पैनल) का उपयोग किया गया । एक और एकबी, adducts बछड़ा थाइमस डीएनए में गठित 3 के साथ प्रतिक्रिया-एनबीए (300 µ एम) चूहे यकृत cytosols के साथ सक्रियण के बाद । बी और बीबी, adducts बछड़ा थाइमस डीएनए में गठित, 3 के साथ प्रतिक्रिया-एनबीए (300 µ एम) मानव यकृत cytosol (परित अंश) के साथ सक्रियण के बाद । सी और सीबी, adducts बछड़ा थाइमस डीएनए में गठन, 3 के साथ प्रतिक्रिया-एनबीए (300 µ एम) शुद्ध चूहा यकृत NQO1 (०.०९ इकाइयों) के साथ सक्रियण के बाद । डी और डीबी, बछड़ा थाइमस डीएनए में गठित adducts, मानव रिकॉमबिनेंट NQO1 (०.०६ इकाइयों) के साथ सक्रियण के बाद 3-एनबीए (30 µ मीटर) के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की । ए और बी, adducts में गठित सामन वृषण डीएनए का इलाज एन-ओह-आबा के साथ किया । एफ और एफबी, adducts जंगली के जिगर डीएनए में गठन-प्रकार littermates एक C57BL पर 2 मिलीग्राम 3-एनबीए प्रति किलो बीवीएससी के उजागर करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: 32P-postlabeling का विश्लेषण 3-एनबीए-व्युत्पन्न डीएनए adduct मानक [dG-N2-c2-आबा (A), डीए-N6-c2-आबा (बी) और डीजी-C8-एन-आबा (सी)] (पैनलों A) और 3 के ढांचे-एनबीए और इन 3-एनबीए-डीएनए adducts ( पैनलों बी) । विधि का n-ब्यूटानॉल निष्कर्षण संस्करण (एक में पैनल) का उपयोग किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस पत्र में, यह एक व्यापक रूप से सुलभ पद्धति का प्रदर्शन किया है रसायनों की शक्ति का अध्ययन करने के लिए चयापचय मध्यवर्ती के लिए सक्रिय हो, आबंध डीएनए adducts की पीढ़ी में जिसके परिणामस्वरूप । यह एक महत्वपूर्ण मुद्दा है, क्योंकि पर्यावरणीय रसायनों या उनके एंजाइमी सक्रियण के ड्रग्स की शक्ति का मूल्यांकन चयापचयों पैदा करने आबंध डीएनए adducts कैंसर और उसके इलाज के विकास में एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है । कैंसर ट्यूमर के विकास के कारण माना जाता द्वारा डीएनए के संशोधन अब कैंसरजनन के एक केंद्रीय हठधर्मिता के रूप में फैसला किया है यलो की वजह से । इस सुझाव के निष्कर्षों की एक किस्म है, जैसे कि घटना की पुष्टि की है: (i) विभिन्न यलो के यलो गुण इन यौगिकों के चयापचयों में nucleophilic केन्द्रों के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए निर्भर करता है । (ii) डीएनए adducts का स्तर अक्सर कई यलो प्रतिक्रियाओं के अनुरूप होता है; (iii) और कुछ ट्यूमर दमन जीन और कई आद्य oncogenes के सक्रियकरण में उत्परिवर्तन यलो potencies के साथ रसायनों के साथ उनके संशोधन के कारण हो सकता है । इसके अलावा, विरोधी दवाओं द्वारा डीएनए के आबंध संशोधन सबसे कुशल डीएनए इन दवाओं, जो कैंसर के इलाज में उनके उपयोग में परिणाम के हानिकारक प्रभावों में से एक के रूप में प्रदर्शित किया गया है ।

वहां दो महत्वपूर्ण अंक जो अपने genotoxic संपत्तियों के लिए रसायनों का सफल मूल्यांकन निर्धारित करते हैं, अर्थात उनके potencies आबंध डीएनए adducts, विशेष रूप से: (i) को खोजने के लिए, संकल्प, और एंजाइमी की क्षमता की विशेषताएं electrophilic प्रजातियों के डीएनए के nucleophilic केन्द्रों के लिए यलो/दवाओं को सक्रिय करने में सक्षम सिस्टम, और (ii) सबसे उपयुक्त तकनीकों का विकास और उपयोग करने के लिए, जिसके द्वारा यलो ड्रग-डीएनए adducts पाए जाते हैं और संरचनात्मक रूप से विशेषता होती है । इस अध्ययन में दोनों सुविधाओं के लिए उपयुक्त तरीके बताए गए हैं ।

सेलुलर (माइक्रोसोमल या cytosolic नमूने P450s रखने और अतिरिक्त सक्रिय एंजाइमों, peroxidases या reductases, NQO1, XO और ओ . ए. ) के लिए प्रोटोकॉल के साथ-साथ रूपांतरण एंजाइमों के लिए अलगाव की प्रक्रिया एंजाइमी प्रणालियों (डीएनए के साथ गर्मी) द्वारा परीक्षण कैंसर/दवाओं के लिए, और उनके उपयोग इस काम में दिखाया गया है, के रूप में प्रतिनिधि परिणामों द्वारा प्रदर्शन, रसायनों के genotoxic गुणों के मूल्यांकन के लिए उनकी उपयुक्तता ।

इसके अलावा, पता लगाने और इस तरह के दो संवर्धन संस्करण के रूप में डीएनए के साथ adducts के ठहराव के लिए उपयुक्त तरीके 32P-postlabeling तकनीक (nuclease P1-और n-ब्यूटानॉल निष्कर्षण प्रक्रियाओं) और का उपयोग रेडियोधर्मी-लेबल परीक्षित यौगिकों को genotoxicity ऑफ यलो/ड्रग xenobiotics के मूल्यांकन के अध्ययन के लिए उपयुक्त दिखाया गया ।

आबंध डीएनए adducts के निर्धारण के विषय में, न केवल इन दो तरीकों, लेकिन यह भी पता लगाने और डीएनए adducts की माप के लिए उपयुक्त अन्य तरीकों की स्थापना की गई है8,70,71,72 ,73,74,75,76,77,78,79,80,81 , 82. 1981 तक, डीएनए adducts के ठहराव का उपयोग रेडियोधर्मी रसायनों (यलो दवाओं/), 3एच या 14सी द्वारा लेबल, कि कृत्रिम रूप से तैयार किया गया है । इस तरह के तरीकों के रूप में इस काम में वर्णित ellipticine के साथ अध्ययन के लिए उपयोगी उपयोग किया गया है (देखें53,54) । फिर भी, यह आमतौर पर उनके सफल उपयोग73,80,81के लिए उच्च रेडियोधर्मिता के साथ डेरिवेटिव तैयार करने के लिए मुश्किल है । इसलिए, भले ही इस प्रक्रिया अभी भी प्रयोग किया जाता है, यह दुर्भाग्य से इन विट्रो प्रयोगों यहां वर्णित करने के लिए इसी तरह के लिए सीमित है । अंय तकनीकों, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, इलेक्ट्रॉन स्प्रे ionization (ईएसआई), मैट्रिक्स की सहायता से लेजर desorption ionization (मालदी), त्वरक जन स्पेक्ट्रोमेट्री (एंस), प्रतिदीप्ति, जैविक तरीकों जैसे immunoassay, और 32 पी-postlabeling विस्तार में वर्णित इस अध्ययन में, विकसित किया गया (समीक्षा के लिए, देखें8,16,70,71,72,73, 74,75,76,77,78,79,80,81,82).

इस काम के प्रोटोकॉल में वर्णित 32पी-postlabeling परख दिखाया गया है, जो न केवल इन विट्रो प्रयोगों में लागू किया गया है (प्रतिनिधि परिणाम देखें), अर्थात्, genotoxicity या यंत्रवत के लिए नए यौगिकों का परीक्षण यलो/ड्रग सक्रियण की जांच, लेकिन यह भी आगे के उपयोग जैसे पर्यावरणीय कैंसर के लिए मानव जोखिम का मूल्यांकन, ट्यूमर के विकास के तंत्र पर अध्ययन, डीएनए की मरंमत की निगरानी, अंतर्जात द्वारा डीएनए क्षति की जांच यौगिकों और ऑक्सीडेटिव प्रतिक्रियाओं, और रोगियों की प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए साइटोटोक्सिक विरोधी ड्रग्स72,83

इस तकनीक है, तथापि, नहीं कुछ सीमाओं के बिना73। डीएनए में घाव, जो monodeoxynucleotides के रूप में स्थिर नहीं हैं, मज़बूती से निर्धारित नहीं किए जा सकते. 32पी-postlabeling विधि डीएनए adduct की संरचनाओं की पहचान करने में सक्षम नहीं है । इसलिए, डीएनए adducts के संरचनात्मक लक्षण वर्णन अक्सर उनके सह ज्ञात संरचनाओं के सिंथेटिक मानकों के साथ क्रोमैटोग्राफी प्रदर्शन पर निर्भर करता है । दरअसल, इस तरह के एक विधि प्रतिनिधि इस काम में दिखाया परिणामों के दोनों उदाहरणों में इस्तेमाल किया गया था (ellipticine, 3-एनबीए) ।

अंत में, इस काम में दिखाया प्रोटोकॉल उपयुक्त तरीकों के रूप में विचार किया जा सकता है पर्यावरणीय रसायनों या दवाओं की शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए enzymatically चयापचयों पैदा आबंध डीएनए adducts, एक अति महत्वपूर्ण प्रक्रिया के लिए सक्रिय हो कैंसर और उसके इलाज का विकास ।

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Disclosures

लेखक का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को चेक साइंस फाउंडेशन (GACR, ग्रांट 17-12816S) ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40

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