Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para identificar compostos que interrompem a ligação do ligante de Chemokine fluorescente-etiquetadas CXC 12 a CXC Chemokine Receptor 4

Biology

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Summary

Um fluxo de ensaio de ligação celular baseados em citometria é descrito que é usado principalmente como uma ferramenta de triagem para identificar compostos que inibem a ligação de um ligante de chemokine CXC fluorescente etiquetada 12 (CXCL12) para o receptor do chemokine CXC 4 (CXCR4).

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Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4. J. Vis. Exp. (133), e57271, doi:10.3791/57271 (2018).

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Abstract

Como alvo farmacológico dos receptores de acoplado à proteína G (GPCRs) é de grande importância para a saúde humana, como disfuncional GPCR mediada por sinalização contribui para a progressão de muitas doenças. O par ligante/receptor ligante de chemokine CXC 12 (CXCL12) / receptor do chemokine do CXC 4 (CXCR4) tem gerado interesse clínico significativo, por exemplo, como um alvo em potencial para o tratamento de câncer e doenças inflamatórias. Pequenas moléculas, bem como anticorpos terapêuticos que especificamente alvo CXCR4 e inibem a função do receptor, portanto, são considerados valiosas ferramentas farmacológicas. Aqui, um fluxo baseados em citometria celular ensaio que permite a identificação de compostos (por exemplo, pequenas moléculas) que revogará CXCL12 vinculação de CXCR4, é descrita. Essencialmente, o ensaio se baseia na competição para receptor vinculação entre uma quantidade fixa de CXCL12 fluorescente etiquetadas, o agonista chemokine natural para CXCR4 e compostos sem rótulo. Portanto, é evitar a utilização indesejável de sondas radioactivamente marcadas neste ensaio. Além disso, as células vivas são usadas como a fonte do receptor (CXCR4) ao invés de preparações de membrana celular. Isto permite uma fácil adaptação do ensaio para um formato de chapa, o que aumenta a taxa de transferência. Este ensaio tem demonstrado ser um ensaio de descoberta valiosa medicamento genérico para identificar compostos CXCR4-direcionamento. O protocolo pode provavelmente ser adaptado para outros GPCRs, pelo menos se fluorescente etiquetadas ligantes estão disponíveis ou podem ser gerados. Conhecimento prévio sobre as vias de sinalização intracelulares que são induzidas após a ativação destas GPCRs, não é necessário.

Introduction

G receptores (GPCRs) são proteínas de superfície celular que podem ser ativadas por ligantes extracelulares (por exemplo, peptídeos, hormônios proteicos, aminas), desse modo regular muitos fisiológicos e do desenvolvimento de processos1. Quando um agonista ocupa seu bolso de vinculação GPCR, a mudança conformacional induzida da proteína do receptor promove a ligação de proteínas intracelulares associadas do receptor via G, consistindo de Gα- PIB e Gβγ subunidades. A subsequente troca de GTP para PIB sobre os resultados de subunidadeα G na dissociação das subunidades de proteína G (Gα-GTP e Gβγ) que, por sua vez, ainda mais iniciará a jusante sinalizando caminhos2,3. Quando o Gα-GTP se torna hidrolisado, re-associação da Gα- PIB e Gβγ subunidades irão converter a proteína G volta em seu descanso de3,de estado4. Tipos distintos de proteínas G existem (Gs, G,i/o, Gq, G12/13), que são classificados com base na similaridade de sequência com o de subunidadeα G5. Todas estas proteínas G induzem definidas vias de sinalização intracelulares que fundamentam a resposta biológica à ativação do receptor. Na sequência de ativação do receptor, quinases GPCR (GRKs) fosforilar a cauda intracelular de GPCRs, promovendo a interação com β-arrestins. Este processo leva à rescisão da proteína G, sinalização,6, de dessensibilização e internalização do receptor. Β-arrestins também são parte dos complexos multi moleculares que gatilho sinalizando cascatas independentes da proteína G sinalização7.

GPCRs estão entre os alvos moleculares mais validados para a intervenção terapêutica, como desregulamentado GPCR mediada por sinalização, por exemplo devido a mutações de ganho de função no gene do receptor ou superexpressão do receptor, contribui para a etiologia de muitas doenças humanas8. Portanto, GPCRs representam uma das mais importantes classes de alvos de drogas investigados pela indústria farmacêutica8,9,10. Um exemplo notável de um GPCR clinicamente relevante é a CXC receptor do chemokine 4 (CXCR4), que pode ser ativado por um ligante natural único, o CXC chemokine ligante 12 (CXCL12)11. Devido ao seu papel estabelecido como um grande receptor de co para vírus de imunodeficiência humana 1 (HIV-1) entrada e infecção em cluster de diferenciação 4 (CD4) positivo linfócitos T12, CXCR4 primeiro foi investigada como alvo uma droga antiviral. CXCL12-CXCR4 interação na medula óssea mais regula a retenção e orientação de tronco e progenitor células13. Também, dado o seu envolvimento em muitos aspectos do câncer biologia (por exemplo, sobrevivência de células de tumor, metástase, relacionados ao tumor angiogênese)14 e várias outras doenças humanas (por exemplo, doenças inflamatórias)15, CXCR4 criou um interesse significativo como um alvo promissor para a descoberta de medicamentos. AMD3100, uma pequena molécula que se destina especificamente a CXCR4, descobriu-se, inicialmente, como uma droga de anti-HIV candidato16 e ainda é um dos mais potentes antagonistas CXCR4 descritos a data17. Seu desenvolvimento como uma droga antiviral foi, no entanto, descontinuado18. Atualmente, esta molécula é usada como um agente de mobilização de células-tronco durante o tratamento de pacientes de mieloma múltiplo e linfoma18. Várias outras moléculas pequenas quimicamente independentes e produtos biológicos que inibem a função de CXCR4 com potência variando foram descritos19.

Métodos de ligação do receptor são ferramentas valiosas em farmacologia que permitem a identificação de compostos (por exemplo, pequenas moléculas) que interagem diretamente com o GPCR de interesse. Para realizar estudos de ligação, não há nenhuma necessidade de conhecimento prévio sobre a funcionalidade de um determinado GPCR ou a propriedades de sinalização intracelulares. Embora isto pode ser considerado uma vantagem, sugere que compostos que receptor vinculação pode ser demonstrada precisam ainda mais ser caracterizada através da avaliação da sua potencial atividade agonística ou antagônica. Esta atividade pode ser avaliada usando ensaios farmacológicos, ou biológicos relacionados com o GPCR sob estudo. Dependente de seu perfil de atividade, moléculas de ligação do receptor podem então potencialmente evoluir para tornar-se os compostos de chumbo romance para investigação em estudos pré-clínicos e clínicos. As moléculas que se ligam especificamente a um receptor com alta afinidade também podem servir como andaimes para gerar ferramentas de diagnósticos ou terapêuticas, por exemplo, os radioativos para a imagem latente não-invasiva na vivo de células de tumor20, ou como potencial veículos para entrega alvo da terapêutica21. Em caso de CXCR4, imagem latente na vivo de células tumorais já foi demonstrado usando modelos de rato onde moléculas CXCR4-direcionamento rotuladas permitiu a visualização de câncer humano xenografts20,22,23 .

Neste relatório, descrevemos um protocolo detalhado para um ensaio de vinculação de competição que permite a identificação de moléculas pequenas e produtos biológicos que interferem diretamente com agonista (CXCL12) vinculativa de CXCR4. O princípio básico do ensaio é a concorrência entre uma quantidade fixa de ligante fluorescente etiquetada (CXCL12AF647, consulte tabela de materiais e reagentes) e unlabeled compostos para a ligação com o receptor da proteína17, 24. o sinal fluorescente específico do ligante rotulado vinculado a única células expressando CXCR4 é então analisado por citometria de fluxo. Este sinal fluorescente diminui quando as moléculas pequenas sem rótulo perturbam a interação entre CXCL12AF647 e CXCR4. O ensaio utiliza células de vida não-manipulada que expressam endogenamente CXCR4 (i.e., células Jurkat). Portanto, nenhuma preparação da membrana celular é necessária, o que torna o ensaio conveniente, rápido e compatível com maior throughput. Desde que é usado um ligante fluorescente etiquetado, radioatividade é evitada.

Porque CXCL12 é o agonista natural para CXCR4, compostos de pequenas moléculas que interferem com a vinculação de CXCL12AF647 no ensaio são susceptíveis de interagir com o sítio de ligação orthosteric do receptor (ou seja, o sítio de ligação ocupado pelo natural agonista). Moléculas que iria interagir com locais de ligação do receptor topograficamente distintas do local de ligação do orthosteric despercebido, se elas não influenciam a vinculação de CXCL12. Por exemplo, moduladores alostéricos positivos e negativos, uma categoria importante e emergente de GPCR como alvo moléculas atuando em sítios de ligação alostéricos25, serão potencialmente não apanhados com este ensaio. Além disso, se os compostos identificaram com esta função de ensaio de ligação como antagonistas dos receptores ou como agonistas não podem ser derivado. Investigação dos compostos identificados em adicionais ensaios relacionados ao receptor farmacológicos ou funcionais, portanto, serão necessária. Estes ensaios podem incluir (uma combinação de) celular fluorescência ou luminescência-com base em ensaios para a detecção de segundo mensageiros (por exemplo, Ca2 +, adenosina monofosfato cíclica (cAMP)), fenotípicas ou ensaios biológicos e β-arrestin ensaios de recrutamento, a escolha dos quais depende as propriedades específicas de sinalização do GPCR sob estudo. Portanto, o ensaio de ligação competitiva descrito neste documento principalmente serve como um ensaio de triagem inicial que precisa de ser complementada com outros ensaios cell-based para permitir uma caracterização aprofundada de compostos com potência de ligação do receptor.

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Protocol

1. a manutenção da cultura de pilha

Nota: Todos os passos descritos em 1 e 2 são realizados em condições estéreis em um fluxo laminar.

  1. Desenvolvem-se células em frascos de cultura T75 em 37 ° C e 5% CO2 em uma incubadora umidificada.
    Nota: Neste ensaio, são utilizadas células Jurkat (isto é, células de humanas leucêmicas dos linfócitos T que expressam endogenamente CXCR417). Expressão do CXCR4 na superfície da célula deve ser avaliado ao longo do cultivo de células através da citometria de fluxo. Uma descrição do procedimento de citometria de fluxo e reagentes para determinar os níveis de expressão de receptores na superfície celular, no entanto, não é no âmbito do presente protocolo, mas tem sido descrito anteriormente a17.
  2. Deixe as células Jurkat crescer em suspensão até atingirem 80-85% Confluencia. Antes de passagem as células para um balão de romance, permitir que todos os reagentes atingirem a temperatura (RT).
  3. Adicione 20 mL de meio fresco crescimento completo (meio RPMI-1640, 10% soro bovino fetal (FBS), glutamina 2mm) para um balão de cultura T75 romance.
  4. Adicione 5 mL de suspensão de células Jurkat do recipiente original T75 (contendo 25 mL de suspensão de células) para a novela T75 frasco de cultura. Incube a 37 ° C e 5% CO2 em uma incubadora umidificada.

2. preparação de células Jurkat, Buffer de ensaio e CXCL12 para a competição de vinculação do ensaio.

  1. Prepare uma solução stock de CXCL12AF647 (20 µ g/mL; ver tabela de materiais e reagentes) dissolvendo-se o reagente liofilizado (armazenado a-80 ° C, no escuro) em água ultrapura suplementado com 0,01% (volumétrica) de polissorbato 20. Loja única usar alíquotas desta solução a-80 ° C, protegido da luz.
  2. Prepare-se buffer de ensaio, adicionando 40 mL HEPES (concentração final 1 M, 20 mM) para equilibrada solução 200 mL do Hank salina (HBSS, 10 x, sem vermelho de fenol e sem bicarbonato de sódio, 1 x concentração final). Adicione água ultrapura para obter um volume final de 2 L. adicionar 4 g (0,2% peso/volume) albumina de soro bovino (BSA) e dissolver a BSA através do magnético mexendo. Finalmente, ajustar o pH para 7,4 (usar NaOH para isso) e filtrar a solução através de 0,2 µm poros (ver tabela de materiais e reagentes) usando um distribuidor de vácuo.
    Nota: Esse buffer de ensaio será usado em todas as etapas adicionais do protocolo.
  3. Conte o número e a viabilidade das células. Para isso, tirar uma amostra da suspensão celular e diluí-la em salina tamponada fosfato (PBS).
    Nota: Usamos rotineiramente com um analisador de viabilidade celular automatizada (ver tabela de materiais e reagentes) capaz de contagem de suspensões celulares em diferentes concentrações. Para a contagem de células, dilua 0,5 mL de suspensão de células em 1,5 mL de PBS (outras diluições, por exemplo, 0,1 mL em 1,9 mL de PBS, também são possíveis). O uso desse método, que se baseia o método de exclusão do corante azul de Tripan, tem sido descrito anteriormente26. Vários outros dispositivos são comercialmente disponíveis para a contagem celular e viabilidade que deve funcionar igualmente bem.
  4. Recolher o número desejado de células (ou seja, ~ 24 x 106 células para executar o ensaio com uma placa de 96 poços completa) em um tubo estéril 50 mL por centrifugação (veja tabela de materiais e reagentes para o tipo de centrífuga usada) a 400 x g durante 5 min à RT.
  5. Despeje delicadamente o sobrenadante sem perturbar o centrifugado. Adicionar o buffer de ensaio fresco (por exemplo, 20 mL) e ressuspender as células pipetando delicadamente acima e para baixo.
  6. Centrifugar as células novamente a 400 x g, durante 5 min à RT
  7. Despeje novamente o sobrenadante e ressuspender as células em buffer de ensaio fresco para obter uma densidade de 5 x 106 células/mL.

3. concorrência ensaio

Nota: O ensaio de ligação real concorrência é realizado a RT e pode ser realizado em condições não estéreis.

  1. Diluir os compostos sob investigação no buffer de ensaio (ver 2.2) para obter a concentração desejada. Quer preparar uma concentração fixa de composto para triagem inicial (por exemplo, 10 µM concentração final) ou, alternativamente, uma série de série de diluição das concentrações para mais detalhadas caracterização dos compostos (por exemplo, um 1/3, 1/4 ou 1 / 5 séries de diluição começando com 1 µM, concentração final). Tenha em mente que o composto solução irá tornar-se, finalmente, 2 x diluído no ensaio; Portanto, prepare uma solução concentrada de 2x.
  2. Dispensar 100 µ l de solução de composto (2x concentrado) num claro 96-poço redondo placa inferior (veja tabela de materiais e reagentes) de acordo com um leigo experimental pre-definido para fora (por exemplo, Figura 1).
    Nota: Nesta fase, as amostras de controle negativo e positivo são incluídas no ensaio. Na amostra de controlo negativo, 100 µ l de buffer de ensaio é adicionado ao invés de composto aos poços da placa de 96 poços. Para a amostra de controlo positivo, buffer de ensaio também é adicionado durante esta etapa. Veja também a Figura 1 para um layout experimental típico em que uma série de diluições de diversos compostos é testada.
  3. Adicionar 50 µ l de suspensão de células (ver 2.7; 0,25 x 106 células) de um reservatório de reagente na placa de 96 poços, com uma pipeta multicanal. Incube a placa por 15 min em RT no escuro.
  4. Adicionar 50 µ l de CXCL12 fluorescente etiquetadas (ou seja, 100 ng/mL de CXCL12AF647 no buffer de ensaio, 4 x concentrado, concentração final de 25 ng/mL) de um reservatório de reagente semelhantes aos poços da placa de 96 poços. Incube durante 30 min à RT no escuro.
    Nota: Para as amostras de controlo negativo, adicione o buffer de ensaio em vez disso. Portanto, o sinal fluorescente detectado nas amostras de controlo negativo irá corresponder ao sinal de fundo de autofluorescent (figura 1A). Para as amostras de controlo positivo, adicione 50 µ l/poço de CXCL12AF647. As amostras de controlo positivo irão produzir o sinal de fluorescência máxima detectado, uma vez que nenhum potencial inibição por pré-incubação com compostos foi incluída (figura 1A).
  5. Centrifugue a placa de 96 poços a 400 x g durante 5 min à RT. Remove o sobrenadante das células peletizadas lançando-se sobre a placa. Seca a placa em um tecido.
  6. Adicione 200 µ l de buffer de ensaio fresco de um reservatório de reagente nos poços utilizando uma pipeta multicanal. Proceda imediatamente.
  7. Centrifugue a placa novamente por 5 min a 400 x g em RT. Remove o sobrenadante por capotar a placa e secá-lo novamente no tecido.
  8. Delicadamente resuspenda o pellet de células em 200 µ l de 1% paraformaldeído dissolvido em PBS. Esta etapa irá corrigir as células.
  9. Continue o protocolo imediatamente com a quantificação da fluorescência por citometria de fluxo.

4. análise das amostras por citometria de fluxo

CXCL12AF647 manchado e células fixadas agora estão prontas para ser analisado usando citometria de fluxo. Vários tipos de citômetros podem ser usados, mas eles precisam ser equipados com o laser correto (ou seja, um laser vermelho, excitação gama ~ 630 nm) para excitação e filtros adequados para a deteção de fluoróforo (emissão filtros ~ 660 nm). Eles precisam ser capazes de lidar com amostras em um formato de placa de 96 poços. Exemplos de dispositivos de citometria de fluxo adequado são dadas na tabela de materiais e reagentes.

  1. Iniciar o dispositivo e abrir o software correspondente (ver tabela de materiais e reagentes).
  2. Selecione os seguintes parâmetros celulares sejam visualizadas em um formato de borrão ponto: encaminhar scatter (FSC), dispersão lateral (SSC) e o canal de deteção de fluoróforo (CXCL12AF647).
    Nota: Com o parâmetro FSC, as células são discriminadas com base no seu tamanho, uma vez que a absorção da luz detectada é proporcional ao diâmetro da célula. O parâmetro SSC, medir o espalhamento de luz em um ângulo de 90°, fornece informações sobre a granularidade das células.
  3. Escolha uma amostra (por exemplo, uma amostra de controlo negativo) para realizar a retenção de uma população celular homogênea definidos com base nos parâmetros de FSC e SSC.
    1. Selecione injeção automática de ~ 100 µ l de células fixadas nesta amostra de controlo negativo para o citômetro de fluxo. Selecione a opção "mistura" antes da injeção e usar uma taxa de fluxo da amostra de 1,5 µ l/s.
    2. Executar este exemplo, selecionando "Adquirir dados." O FSC e SSC parâmetros para esta amostra aparecerá na tela.
    3. Selecione a ferramenta associada do software. Baseia-se a visualização de borrão ponto FSC e SSC, pré-defina uma população homogénea e viável célula gating. Para fazer isso, criar um polígono (usando a ferramenta associada do software) que inclui as células única homogênea distribuídas ("eventos") baseia-se estas duas dimensões.
      Nota: O procedimento associado visa definir uma população de células viáveis e homogênea que será usada para uma análise mais aprofundada. Gating baseia-se no pressuposto de que a maioria das células viáveis irá formar uma população homogênea de células com base em parâmetros FSC e SSC. Realizando este passo, restos celulares, células mortas e agregados de células podem amplamente ser excluídos uma análise mais aprofundada. Uma ilustração do processo associada é dada na figura 1B.
  4. Selecione para analisar 20.000 "eventos" (isto é, células únicas) por exemplo.
    Nota: Isto significa que para cada amostra, 20.000 células que caem dentro do portão pré-definidos serão eventualmente analisadas. Aquisição de dados para cada amostra irá continuar até que este número de eventos é analisado.
  5. Começa a correr (selecione "gravar dados"). O dispositivo de citometria de fluxo agora vai analisar todas as amostras, um por um, gravando-a intensidade de fluorescência média (IFM) para cada amostra. Esta IFM corresponde ao sinal fluorescente médio correspondente as 20.000 células que caem dentro do portão pré-definido.

5. análise de dados

Use o IFM obtido para cada amostra para realizar todos os cálculos mais. Análise dos dados de citometria de fluxo pode ser realizada por vários pacotes de software disponíveis no mercado (ver tabela de materiais e reagentes).

  1. Para determinar a porcentagem de inibição do sinal fluorescente de ligação, como resultado de pré-incubação composto, aplica a seguinte fórmula:
    Equation 1
    Onde:
    IFMExp = IFM de experimental (= composto-tratados) amostra
    IFMPC = IFM do controlo positivo
    IFMNC = IFM do controlo negativo
  2. Para determinar o valor de IC50 de um composto (ou seja, a concentração de compostos que podem reduzir o sinal fluorescente vinculação de 50%), aplica a seguinte fórmula:
    Equation 2
    Onde:
    Logconc.2 = o registo de uma concentração de composto que resulta em menos de 50% inibição da diferença entre o valor de IFM da NC e PC
    Logconc.1 = o registo de uma concentração de composto que resulta em mais de 50% inibição da diferença entre o valor de IFM da NC e PC
    Nota: Como alternativa, no caso de compostos altamente ativos, uma curva de dose-resposta, cobrindo vários registros de magnitude pode ser gerada baseia a IMF correspondentes a cada concentração testada de composto. Aplicando o encaixe de curva de regressão não-linear usando o software apropriado (ver tabela de materiais e reagentes), valores de IC50 então podem ser deduzidas a partir das curvas geradas. Um exemplo desta abordagem de análise é mostrado na Figura 3.

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Representative Results

O fluxo de trabalho geral do ensaio vinculação é apresentado na figura 1A. Uma ilustração do tipo de dados de citometria de fluxo obtidos para tipos diferentes de amostra em um experimento de padrão (ou seja, o controlo negativo, controle positivo e amostra experimental) está representada na figura 1Be um layout de placa possível para executar o ensaio em um formato de placa de 96 poços é dada na Figura 1. Incubação de células Jurkat, que endogenamente expressam o receptor do chemokine CXCR4 (i.e., o GPCR de interesse neste ensaio), com quantidade crescente de CXCL12 fluorescente etiquetadas (i.e., CXCL12AF647) resultou em aumento níveis de fluorescência (Figura 2), refletindo o aumento dos níveis de ligação do ligante a CXCR4. Para demonstrar a receptor-especificidade de ligação CXCL12AF647 , utilizou-se um bem estabelecido e específicos do receptor CXCR4 antagonista (a pequena molécula AMD3100). Células Jurkat pre-primeiro foram incubadas com uma série de diluição de 1/5 de AMD3100 variando de 0,064 ng/mL a 1.000 ng/mL, seguido de uma incubação com uma concentração final de 25 ng/mL CXCL12AF647 (i.e., a quantia fixa de chemokine rotulada rotineiramente utilizados no ensaio). Em seguida, células Jurkat foram processadas conforme descrito no protocolo. O sinal fluorescente (a média fluorescente intensidade, IFM) após a adição do montante fixo de CXCL12AF647 para as células Jurkat pré-incubado, foi obtida pela análise de citometria de fluxo para todas as amostras. Este sinal fluorescente pode quase inteiramente inibido no caso de células Jurkat foram pré-tratados com a maior concentração de AMD3100 (1.000 ng/mL). Sob esta condição, o nível inibido de fluorescência foi apenas ligeiramente acima do nível do fundo correspondente ao nível de autofluorescência para células Jurkat. Em conclusão, aplicar 25 ng/mL (concentração final) de CXCL12AF647 no ensaio de ligação gerada uma janela grande sinal fluorescente (quando comparado com o controle negativo) com um nível mínimo residual do receptor específico ( de vinculação Figura 3A).

Este ensaio tem sido usado principalmente para a tela para interromper a ligação do ligante em painéis de compostos sem rótulo em uma única concentração fixa de compostos, ou para estudar o efeito dose-dependente de compostos ativos. Neste último caso, o objetivo é obter IC50 valores (ou seja, a concentração de um composto que inibe o sinal de ligação por 50%), que refletem a potência de ligação dos compostos. A Figura 3 ilustra como os dados de citometria de fluxo obtidos com este ensaio podem ser usados para determinar a potência inibitória (em termos de IC50) de pequenas moléculas, interrompendo a ligação do CXCL12 de CXCR4. Com base na inibição dose-dependente da ligação CXCL12AF647 AMD3100, o IC50 valor foi determinado aqui aplicando a análise de regressão não-linear. Neste exemplo, o valor de50 IC calculado para AMD3100 corresponde a 18.12 ng/mL. Porque em campanhas de rastreio, a maioria dos compostos selecionados aleatoriamente é esperada para não inibir a ligação do CXCL12AF647 de CXCR4+ Jurkat cells, um exemplo de um inativo composto também foi incluído neste estudo. Aqui, o maraviroc pequena molécula, que apresenta potente atividade anti-HIV-1 por atuar como um antagonista específico para o receptor do chemokine CC 5 (CCR5)27, foi testado no ensaio de ligação. Sem inibição do sinal máxima ligação fluorescente foi detectada depois de pré-incubação de células Jurkat com maravoric, mesmo com a maior concentração testada (100 ng/mL; Figura 3B). No mesmo experimento, uma série de diluição serial de AMD11070, outra pequena molécula relacionada com AMD3100, mas com melhoria de propriedades farmacocinéticas,28, foi incluída. Ao contrário de maraviroc, uma série de diluições de 1/5 de AMD11070 desde 0.0064 até 100 ng/mL claramente e dose-dependente inibiam CXCL12AF647 ligação (Figura 3B).

Figure 1
Figura 1: visão geral do fluxo de trabalho e ilustração do tipo de dados obtidos. (A). as principais etapas do protocolo são esquematizadas para as amostras de controle negativo e positivo e amostras de composto-tratados. Amostras sem composto pré-incubação e sem adição de chemokine fluorescente etiquetada (CXCL12AF647) são incluídas para determinar a fluorescência de fundo (auto) (amostras de controlo negativo). Amostras sem composto pré-incubação, mas com a adição de uma quantidade fixa de CXCL12AF647 são usadas para determinar o sinal de ligação máxima no ensaio (amostras de controle positivo). Nas amostras tratadas composto, células pre-são incubadas com composto antes da adição de uma quantidade fixa de CXCL12AF647. (B). O sinal de má ligação fluorescente é determinado pela análise de citometria de fluxo das células Jurkat. De todos os eventos (i.e., células Jurkat) analisado (painel esquerdo), apenas o sinal fluorescente de um gated subpopulação de células é usado para posterior análise (painel central). Pré-incubação de células com pequenas moléculas (por exemplo, AMD3100) inibe a ligação do ligante-receptor fluorescente etiquetadas e isso irá reduzir o sinal de ligação máxima (painel à direita, mostrado uma representação de histograma). (C). um layout de placa possível ao realizar o ensaio de ligação competitiva em um formato de placa de 96 poços. Neste caso, seis diferentes compostos (cpd 1 - 6) são testados em uma série de diluição serial 1/5 (em duplicado) variando de 1.000 nM até 0.32 nM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Ligação de CXCL12AF647 para células Jurkat. Células Jurkat foram incubadas com a quantidade crescente de CXCL12AF647, na ausência de pré-incubação com composto. A fluorescência de média intensidade (IFM, expressa em unidades arbitrárias de luz) ± SD é mostrado (n = 2). Encaixe de curva foi realizada usando usando um modelo de ligação total de um site seguindo a equação de regressão não linear

Equation 3

com Bmáx (ligação específica máxima) = 18.345; Kd = 92.8 ng/mL; NS (a inclinação da ligação não específica) = 2,139; e plano de fundo = 332.6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Inibição da ligação de CXCL12AF647 por compostos ativos e inativos. (A) Dose-dependente da inibição da ligação CXCL12AF647 incubando pre-células com concentrações crescentes de AMD3100, antes da adição de 25 ng/mL CXCL12AF647. Nota que a máxima inibida a intensidade média de fluorescência (IFM; expressa em unidades arbitrárias de luz) é ainda um pouco acima da fluorescência de fundo (auto) obtida por células Jurkat (média ± DP (n = 3)). Encaixe de curva foi realizada utilizando regressão não-linear com uma inclinação variável (quatro parâmetros) de acordo com

Equation 4

Aqui o HillSlope é 1.313 e o IC calculado50 é 18.12 ng/mL. (B). efeito Dose-dependente de AMD11070 e maraviroc sobre CXCL12AF647 vinculação a CXCR4+ Jurkat células (IFM ± SD (n = 3)). Curva de encaixe para a resposta da AMD11070 foi realizada da mesma forma com um HillSlope de 1.458 e um valor de50 IC calculado de 0.9052 ng/mL. Para a resposta de maraviroc, nenhuma montagem foi realizada devido à falta de atividade deste composto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Ensaios obrigatórios de concorrência em comparação a outros tipos de ensaios obrigatórios (ou seja, a vinculação de saturação e experimentos de cinética de ligação), são mais adequados para fins de triagem. Na verdade, eles permitem avaliação de grandes lotes de compostos sem rótulo, por exemplo, pequenas moléculas, marcando sua capacidade de interferir com a ligação de uma quantidade fixa de um ligante-receptor rotulada. Compostos que se ligam a outros locais do receptor do que o ligante rotulado podem despercebido no ensaio. Embora a experiência de vinculação de concorrência aqui descritos centra-se sobre o receptor do chemokine CXCR4 em particular, ele provavelmente pode servir como um modelo para o desenho de ensaios obrigatórios de concorrência para outros GPCRs também. Por exemplo, o receptor do chemokine CXC 7 (CXCR7) foi descrito como um alternativa do receptor para CXCL12, capaz de ligação CXCL12 com alta afinidade29,30. Portanto, a mesma chemokine rotulado (CXCL12AF647) como usado para o CXCR4 descrito concorrência ensaio pode ser usado para realizar experiências de ligação CXCR7. Porque CXCR4 e CXCR7 compartilham CXCL12 como um ligante comum, seria importante trabalhar com modelos de celulares em que apenas um dos dois receptores é expresso na superfície celular, a fim de avaliar a ligação ao receptor específico. Nosso trabalho anterior demonstrou que células Jurkat não mostra a expressão endógena de CXCR717. Assim, no ensaio descrito aqui para CXCR4, interferência com ligação para CXCR7 é descartada.

Várias características-chave do ensaio a concorrência permitem que ele seja usado como uma rápido, inicial, rastreio ferramenta para identificar pequenas moléculas interferindo com agonista obrigatório de CXCR4. Uma das principais vantagens do ensaio é a utilização de células de vida inteira, expressando o receptor de interesse. Isto omite a necessidade de preparações de trabalho intensivo da membrana celular. Além disso, o baixo nível de fluorescência de fundo (auto) detectado com células Jurkat é benéfico. Juntamente com a janela grande sinal obtida após a adição da quantidade definida de sonda fluorescente etiquetada, contribui para um sinal favorável à relação de fundo. Isto facilita a detecção de potencial inibição de vinculação por compostos sem rótulo. No caso deste ensaio é realizado com outras células expressando CXCR4, recomendamos sempre avaliar esses parâmetros (fluorescência de fundo, janela de sinal) adiantado como eles podem diferir linha celular de linha celular. O fato de que células Jurkat endogenamente expressam CXCR4 em um nível consistente durante longos períodos, torna um modelo celular conveniente. O mesmo consistente nível de expressão do receptor pode ser obtido com clones de células transfectadas estàvel. Em contraste, não recomendamos o uso de células transfectadas transitoriamente porque este irá provavelmente resultar em uma distribuição muito mais ampla das intensidades de fluorescência, menos responsivas células no ensaio e menos consistência entre experiências. Uma vez que não há células Jurkat negativas de CXCR4 existem, especificidade de ligação ao receptor para estas células foi demonstrada por pré-incubação com antagonistas de receptor específico bem estabelecida (AMD3100 e AMD11070). Estes antagonistas são estruturalmente diferentes do ligante rotulado. Isto é importante porque, quando usando a variante sem rótulo do ligante como concorrente, etiquetado e sem rótulo ligante também pode competir para ligação a sítios de ligação não-específica potencialmente presentes na superfície da célula.

Além do host celular, vários outros aspectos do ensaio descrito aqui precisam ser levado em conta antes de começar a construir um ensaio semelhante para outros GPCRs. sondas fluorescente etiquetadas que destino GPCRs foram desenvolvidas como alternativas para radioativo sondas, mas atualmente só estão disponíveis para um número limitado de GPCRs e são relativamente caros. Além disso, a modificação de ligandos de receptores naturais com fluorophores pode alterar as propriedades de ligação em comparação com a molécula de pai sem rótulo, especialmente no caso de ligantes muito pequenos (por exemplo, aminas) ou pequenos peptídeos31, 32. por exemplo, no caso de pequenos ligantes, um vinculador é geralmente necessário para separar o farmacóforo o fluoróforo para permitir acesso aos orthosteric do receptor da ligação local31. Também, a estabilidade da sonda fluorescente-receptor complexa precisa ser levado em conta. Em nossa experiência, após 90-120 minutos (ou seja, o tempo necessário para executar duas placas de 96 poços consecutivas), a média intensidade fluorescente para os poços de controle positivo normalmente é reduzida por ~ 5% em comparação com a média de todos os poços de controle positivo sobre o placa, com exceções ocasionais entre 5 e 10%.

Além disso, a atividade intrínseca do ligante etiquetados é de importância. Considerando que os antagonistas dos receptores não exibem nenhuma atividade intrínseca no receptor, rotuladas agonistas provável induzem ativação do receptor e, em consequência, a internalização do receptor. Isto compromete a natureza reversível do interação ligante-receptor33. Para minimizar possíveis problemas com a internalização do receptor, incubação com o ligante rotulado (no caso de um agonista etiquetado) precisam ser limitada no tempo e devem ser realizados preferencialmente à temperatura ambiente ou inferior. O fato de que o procedimento é realizado em temperatura faz o ensaio também conveniente e mais compatível com rastreio esforços em formato de placa. Finalmente, um número suficiente de células por amostra (por exemplo, 250.000 por alvéolo de uma placa de 96 poços) deve ser usado no ensaio, em última análise, manter um número suficiente de células (20.000 células, "eventos, single" baseia a retenção da população de células inteiras; ver A Figura 1) para análise de citometria de fluxo. Usar menos células seria mais difícil de alcançar consistentemente este número de células analisadas, susceptíveis de comprometer a confiabilidade da ler. Usar menos células por amostra (por bem) também iria aumentar o intervalo de tempo necessário para analisar a amostra por citometria de fluxo e, portanto, aumenta o tempo total para analisar um prato inteiro de 96 poços. Compromete a maior throughput. Devido ao motivo acima referido, futura miniaturização do ensaio pode se tornar, assim, por não ser uma tarefa trivial.

Tomados em conjunto, um ensaio de vinculação de concorrência que é principalmente utilizado em nosso laboratório como uma ferramenta de triagem para identificar pequenas moléculas que podem competir com uma quantidade fixa de CXCL12 etiquetados para ligação a CXCR4 tem sido descrito em detalhe. Estes estudos de ligação são de interesse, como eles são um método relativamente rápido e simples para identificar compostos capazes de ligação ao receptor. Embora a identificação de compostos com capacidade de ligação já é valiosa em si, este tipo de ensaio não fornece informações sobre a atividade dos compostos identificados. Portanto, continua a ser necessário mais validar e caracterizar sua potencial atividade agonística ou antagônica em outros ensaios farmacológicos e funcional do receptor. De interesse, no caso de CXCR4 tem sido demonstrado que os antagonistas do receptor que mostram aumento de atividade no ensaio de ligação (ou seja, que geram baixos valores de50 IC para inibição de vinculação) executam relativamente melhor em outros funcional CXCR4-relacionados, bem como ensaios17.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostaria de agradecer Eric Fonteyn excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo KU Leuven (conceder n. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, conceder n. G.485.08) e a Fondation Dormeur Vaduz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD FACSCanto II Becton Dickinson Not applicable Flow cytometry device
BD FACSDIVA Software
BD FACSArray Becton Dickinson Not applicable Flow cytometry device
BD FACSArray System Software
Graphpad Prism Graphpad software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3
FlowJo FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.
Vi-CELL Beckman Coulter Not applicable cell viability analyzer
Sigma 3-18 KS Sigma Not applicable centrifuge
AMD3100 Sigma A5602-5mg specific CXCR4 antagonist
Maraviroc Pfizer antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)
h-SDF1a (AF647) ALMAC CAF-11-B-01 fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco (Life Technologies) 10270-106
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A1933-25G
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Gibco (Life Technologies) 14065-049
HEPES (1M) Gibco (Life Technologies) 15630-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco (Life Technologies) 14190-094
Jurkat cells ATCC
Reagent reservoir PP Sigma BR703411
Rapid flow filter: 0.2 µm aPES Thermo Scientific 566-0020
Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear Thermo Scientific 611U96
Falcon tubes, 50ml Greiner Bio-One 227 261
Tissue culture flask (T75) Corning 353024

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References

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