Behandling med vankomycin lastade kalciumsulfat och autologt ben i en förbättrad kanin modell av benet infektion

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Denna studie presenterar en förbättrad kanin modell infekterade med Staphylococcus aureus genom att blockera samma mängd bakterier i benmärgen. Vankomycin laddad kalciumsulfat och autologt ben används för antibiotika och ben reparation behandling. Protokollet kan vara till hjälp för att studera ben infektion och förnyelse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhang, Y., Shen, L., Wang, P., Xi, W., Yu, Z., Huang, X., Wang, X., Shou, D. Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection. J. Vis. Exp. (145), e57294, doi:10.3791/57294 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Benet infektion resultat från bakteriell invasion, som är mycket svår att behandla vid klinisk, ortopediska och traumatisk kirurgi. Ben infektionen kan leda till ihållande inflammation, osteomyelit och eventuella ben utanför unionen. Inrättandet av en genomförbar, reproducerbara djurmodell är viktigt att Ben infektionsforskning och antibiotikabehandling. Som en Invivo modell används kanin modellen ofta i ben infektionsforskning. Tidigare studier på kanin ben dock infektion modeller visade att infektionsstatus var inkonsekvent, eftersom mängden bakterier var variabel. Denna studie presenterar en förbättrad kirurgisk metod för att inducera benet infektion på en kanin, genom att blockera bakterier i benmärgen. Multi-Level utvärderingar kan sedan utföras för att verifiera metoden modellering.

I allmänhet är debriderande nekrotisk vävnad och implantation av vancomycin-loaded kalciumsulfat (VCS) dominerande i antibiotikabehandling. Även om kalciumsulfat i VCS gynnar osteocyte kryper och nya bentillväxt, förekomma massiva ben defekter efter debridering. Autologt ben (AB) är en tilltalande strategi för att övervinna ben defekter för behandling av massiva ben defekter efter debridering av nekrotisk ben.

I denna studie använde vi svans ben som ett autologt ben som implanteras i ben defekten. Ben reparation mättes med hjälp av mikro--datortomografi (mikro-CT) och histologisk analys efter djuroffer. Som ett resultat i gruppen VCS erhölls ben utanför unionen konsekvent. Däremot var de ben defekt områdena i gruppen VCS-AB minskade avsevärt. Den nuvarande modellering metoden beskrivs en reproducerbar, genomförbart, stabil metod för att förbereda en benet infektion modell. VCS-AB behandling resulterade i lägre ben utanför unionen efter antibiotikabehandling. Den förbättra benet infektion modellen och kombinationsbehandling av VCS och autologt ben kan vara till hjälp i att studera bakomliggande mekanismer i benet infektion och ben förnyelse relevant för traumatologi ortopediska applikationer.

Introduction

Ben-infektionen resulterar vanligt från bakterier eller andra mikroorganismer invasion efter trauma, benbrott eller andra ben sjukdomar1. Benet infektion kan inducera en hög grad av inflammation och ben vävnad förstörs. I kliniken är Staphylococcus aureus (S. aureus) det dominerande smittämnet av benet infektion2,3. Ben infektionen är smärtsam, försvagande, och tar ofta en kronisk kurs som är extremt svårt att behandla4. För närvarande har debridering av nekrotisk vävnad och implantation av vancomycin-loaded kalcium (VCS) pärlor bekräftats som en effektiv strategi för att styra lokal infektion5,6. Dock upplevde 10% till 15% av patienterna en långvarig ben reparationsprocessen, fördröjd unionen eller utanför unionen efter anti infektion behandling7. Det stora segmentet av ben defekt är den svåraste frågan för ortopeder. En autolog bentransplantat anses optimal ben ersättning i benet utanför unionen behandling8,9.

Hittills har de flesta studier på benet har infektion och autologt ben implantation genomförts i olika typer av djurmodeller, såsom råttor, kaniner, hundar, grisar och får10,11. Kanin-modeller används oftast för benet infektion studier, som uruppfördes av Norden och Kennedy 197012,13. I vår tidigare studie, vi använde kanin modeller efter Nordens metod, och vi fann att kvantiteten av S. aureus injiceras i benmärgen inte kunde kvantifieras exakt, så att blod läcker ut ur benmärgen ledde till bakterier lösning spill.

Denna artikel presenterar en förbättrad kirurgisk metod för att inducera benet infektion på kaniner. I slutet av förfarandet utfördes ett blodprov för biokemi, en bakteriologisk undersökning och en histopatologisk undersökning för att kontrollera ben infektion modell. Sedan VCS var inopererad för att förhindra infektion och autologt ben var inopererad för att främja ben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De kaniner som används i den aktuella studien behandlades enligt guiden för skötsel och användning av försöksdjur. Alla experimentella procedurer följdes av reglerna av den bioetiska kommittén Zhejiang Academy av traditionell kinesisk medicin.

1. beredning av bakteriesuspensionen

  1. Lös 0,5 mg av S. aureus frystorkning pulver (ATCC 6538) med 0,3 mL av Luria-Bertani odlingsmedium. Blanda suspension helt.
  2. Strimma bakteriesuspensionen på tryptic soy agarplattor och inkubera i bakteriekolonier vid 37 ° C i 16 h.
  3. Välj en enda bakterie kolonibildande enhet (CFU) och kultur i tryptic soy buljong rör för 24 h. utför en subkultur för cirka 24 timmar vid 37 ° C och få mid-logaritmisk tillväxt fas bakterier efter 16-18 h, då värdet optiska densitet (OD) är 0,6 på 600 nm 14.
  4. Över 1 mL av bakteriesuspensionen i ett centrifugrör. Centrifugera i 5 min på 825 x g och 4 ° C, och kasta bort supernatanten. Omsuspendera och tvätta bakterierna med 100 µL av fosfatbuffrad saltlösning (PBS); Upprepa detta 3 gånger. Slutligen resuspendera bakterier med 3 mL PBS.
  5. Uppskatta den bakterier koncentration med hjälp av s turbidimetry15.
    1. Över 100 till 500 µL av bakteriesuspensionen till en kolorimetrisk röret tills turbiditeten motsvarar en 0.5 McFarland som standard.
    2. Bedöma grumlighet av visuell jämförelse till den 0.5 McFarland, när innehållet i bakterier når cirka 108 CFU/mL.
      Obs: Kontrollera att volymen av bakteriesuspensionen räcker för följande protokoll. För varje kanin är volymen av bakteriesuspensionen mindre än 1 mL.
  6. Överföra 0,2 mL av bakteriesuspensionen till en agarplatta och applicera det jämnt. Inkubera plattan vid 37 ° C i 16 h. räknas bakterier kolonierna för att verifiera CFU av bakteriesuspensionen.

2. utarbetande av benet infektion modeller

  1. Hålla manliga Nya Zeeland vita kaniner, åldern 3 månader, i enskilda burar, under luft-kontrollerade förhållanden (20 ± 1 ° C) och 12 h/12 h ljus-mörk belysning cykler. Erbjuda rutinmässiga kost och tryck vatten dagligen.
  2. Se till att vid tidpunkten för kirurgi att kanin väger mer än 3 kg.
  3. Bedöva kaniner av intraperitoneal injektion med pentobarbital natrium (3 mg per 100 g kroppsvikt). Kontrollera att kaniner är fullt anesthetized av en underlåtenhet att besvara en tass nypa. Fixa kaniner på operationsbordet under drift förfarandet.
    Obs: Kontrollera att modellering förfarande varaktighet är mindre än 1 h.
  4. Raka regionen proximala tibia med en rakapparat mot riktningen av hårväxt. Desinficera huden genom att tillämpa en povidon-jodlösning.
  5. Markera den övre delen av tibia och borrning hål ställning för injektion med S. aureus (avståndet till den övre delen av tibia är 1,5 cm) med penna och linjal. Se till att borra hål positioner är mitt tibial platån horisontellt (figur 1A).
  6. Skär tibia hud använda nr 11 skalpell och göra en 1 cm snitt i periostet (figur 1B, C). Slå ett 2 mm diameter hål i tibia med en elektrisk ben borr enhet (figur 1D).
  7. Tryck 2 mm diameter hål i den tibial platån med en cylinder med ben vax av diameter 2 mm och 2 mm höjd (figur 1E). Ta bort extra ben vaxet längs horisontalplan tibial platån (figur 1F). Kontrollera att 2 mm hål är full av ben vax (figur 1G).
    Obs: Se till att hålen är full av ben vax genom att kontrollera hålet med eller utan blod overflow.
  8. Sy upp periostet och huden med resorberbara kirurgiska sutur i en vertikal madrass sutur att hindra djuret från tugga suturerna (figur 1H).
  9. Injicera 1 x 108 CFU/mL av S. aureus lösningar (30 µL per 100 g kroppsvikt) med en 1 mL asepsis injektor (figur 1jag). Kontrollera att nålar penetrera ben vaxet och S. aureus lösningen injiceras i benmärgen långsamt.
  10. Hålla djuret i varma och rena förhållanden att undvika värmeförluster efter modellering. Övervaka andningsfrekvens och puls. Efter uppvaknandet, hus kaninerna i enskilda burar med fri tillgång till mat och vatten.

3. utvärdering av benet infektion modell

  1. På dag 7, 14, 21 och 28 efter infektion, placera kaniner kanin fixare med huvudet och örat utanför fixare.
  2. Rita 2 mL blod från auricular venerna behållare dikaliumvätefosfat etylendiamintetraättiksyra syra (EDTA-K2) blodförtunnande blod. Dra 1 mL blod från ett blodkärl i en blod-behållare. Centrifugera serumet för 10 min med en hastighet av 651 x g vid rumstemperatur.
    1. Bestämma antalet vita blodkroppar (WBC) i helblod med en blod biokemiska analysatorn, och C - reaktivt protein (CRP) av en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) metod16.
  3. På dag 7, 14, 21 och 28 efter infektion, bedöva en modell kanin med pentobarbital natrium vid dos på 3 mg per 100 g kroppsvikt. Skär tibia hud använda nr 11 skalpell och göra en 2 cm snitt i periostet (figur 2A).
  4. Rengör ben vax. Debride nekrotisk ben genom stansning två intilliggande 4,8 mm diameter hål med en elektrisk ben borr enhet (figur 2B). Debride nekrotisk benmärg och granulationsvävnad med en ben sked (figur 2C).
    Obs: Rengöra benvävnad under debridering att undvika benvävnad kvar i benmärgen.
  5. Skrapa och rengör benvävnaden mellan de två hålen (figur 2D).
  6. Sprida 1 mL benmärg på fåren blod agarplattor. Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C. Välj därför plattor av 30 – 300 kolonier, och beräkna antalet kolonier.
  7. I slutet av dag 28 efter infektion, extrahera tibia exemplar längs kanterna av knä-och fotled. Fixa tibia exemplar 4% paraformaldehyd för 24 h. avkalka tibia exemplaren i 10% EDTA i 8 veckor.
  8. Torkar en graderad serie av etanol utspädningar tibia exemplar, och sedan bädda in i paraffin vax. Skär 4 på varandra följande 5 µm sektioner från de koronala plan. Fläcken sektioner med en hematoxylin och eosin (H & E) färgning kit.
  9. Använda ett Mikroskop för att visa avsnitten betsad och posten överförs ljusa bilder med standardprogramvara.

4. beredning av VCS pärlor

  1. Tillsätt 1 g vankomycin hydroklorid pulver till 9,5 g av medicinsk kvalitet kalciumsulfat, och sedan lägga 3 mL fysiologisk koksaltlösning blandat makt. Blanda dem väl med en spatel för 30 till 45 s.
  2. Placera den blanda produkten i en flexibel kiselgel mögel (cylinder med diameter 4,8 mm och höjd 4,8 mm) och torka i rumstemperatur för 15 min. ta bort VCS pärlorna genom att böja formen.

5. antibiotikabehandling och Implantation av autologt ben

  1. Bedöva modell kaniner med pentobarbital natrium vid dos på 3 mg per 100 g kroppsvikt på den 28: e dagen efter smittotillfället. Raka regionen proximala tibia med en rakapparat. Desinficera huden genom att tillämpa povidon-jodlösning.
    Obs: Kontrollera att modellering förfarandet är mindre än 1 h.
  2. Raka regionen svans med en rakapparat och desinficera svansen genom att tillämpa povidon-jodlösning.
  3. Skära ner svansen med kirurgisk sax. Klipp svansen hud använda nr 11 skalpell och avslöja svans ben. Sy upp huden vid svansen regionen med resorberbara kirurgiska suturer i en vertikal madrass sutur att hindra djuret från tugga suturerna.
  4. Ta bort alla muskler, mjukdelar och periostet. Lossa svans ben på varje gemensamt och överföra ben fragmentet till en 100 mm plast maträtt som innehåller steril koksaltlösning.
  5. Implantat 4 bitar av VCS pärlor (cylinder med diameter 4,8 mm och höjd 4,8 mm, 1,25 mg vankomycin per bit pärla) i benmärgen kaviteten med böjd pincett (figur 2E).
  6. Fyll ben defekten med 8 bitar av autologt ben (cylinder diameter 2 mm och 4 mm höjd per varje bit) med böjd pincett (figur 2E).
  7. Sy upp periostet och huden med resorberbara kirurgiska suturer på en madrass suturen sätt (figur 2F).
    Obs: Hålla temperaturen vid 25 ° C under operationen.
  8. Hålla djuret i varma och rena förhållanden att undvika värmeförluster efter kirurgi. Övervaka andningsfrekvens och puls. Efter uppvaknandet, hus kaninerna i enskilda burar med fri tillgång till mat och vatten.

6. bedömningar av antibiotiska aktivitet

  1. Sätta kaniner i en kanin fixare och placera huvudet och örat utanför fixare på 2, 4, 6 och 8 veckor efter behandling.
  2. Dra blod från auricular vener med EDTA-K2 blodförtunnande blodkärl. Dra 1 mL blod från ett blodkärl i en blod-behållare. Centrifugera serumet för 10 min med en hastighet av 651 x g vid rumstemperatur.
  3. Bestämma antalet vita blodkroppar (WBC) i helblod med blod biokemiska analysatorn, och C - reaktivt protein (CRP) genom en ELISA metod16.

7. bedömningar av ben

  1. Avliva kaniner genom att injicera med över doser pentobarbital natrium, i slutet av 8 eller 12 veckor efter behandling.
  2. Extrahera tibia exemplar, längs kanterna av knä-och fotled. Debride muskler och fascian lager.
  3. Analysera strukturen av tibia med hjälp av mikro-datortomografi (mikro-CT). Välja en oval området 4,8 mm diameter och 9,6 mm lång som regionen av intresse (ROI). Rekonstruera 3D modell bilder med bitmappsdata.
  4. Välj betyg för förhållandet mellan volym/vävnad benvolym (BV/TV), trabekulära tjocklek (Tb.Th), trabecula nummer (Tb.N) och trabekulära separation (Tb.Sp)from the3D modeller för att bedöma ben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utvärdering av benet infektion modell
Efter infektion med S. aureusliknade de patologiska manifestationerna av kaniner till det representativa symptomet på kronisk osteomyelit i kliniken. I vår studie, 30 kaniner var infekterad, och föremål som modellgrupp och 10 kaniner utsattes som djuren i kontrollgruppen. Alla modell kaninerna har infekterade bihålorna av tibia lokala webbplatsen, med vitt och gult pus över flöde från bihålorna (figur 3A). Resultaten av H & E färgning tyder på bakteriell aggregat ligger runt döda ben i modellgruppen, som normala osteocyter kan inte identifieras. Nivåerna av CRP och WBC är högre i modellgruppen än kontrollgruppen (figur 3B). De nekrotiska benmärg lysates är streckade på agarplattor, vilket resultera i ett ökat antal kolonier för den modellgruppen efter infektion (figur 3C). I slutet av modellering fanns det 3 kaniner döda på grund av allvarlig infektion. Återstående smittade kaninerna identifierades som benet infektion modell och delades in i 3 grupper: modell grupp, VCS gruppen och VCS-AB-koncernen.

Bedömningar av antibiotiska aktivitet och ben
Vid 2, 4, 6 och 8 veckor efter behandling med VCS eller VCS-AB, nivåerna av CRP och WBC reduceras avsevärt (figur 4A). Efter 12 veckor av implantation av VCS och ben transplantatavstötning verkade tibial defekter i gruppen VCS-AB fullt coalescent. Tibial platå ytor i gruppen VCS-AB är plattare än för gruppen VCS. 2D återuppbyggnad bilder visar en progressiv ökning av benvolym under 12 veckor efter behandling med VCS-AB och VCS, medan benförlust är betydande i modellgruppen (figur 4B). För att analysera de bone regeneration kvantitativa index, en oval området 4,8 mm diameter och 9,6 mm lång valdes som regionen av intresse (ROI) (figur 4C) och 3D modell bilder rekonstruerades med bitmappsdata. Micro-CT indexen BV/TV i modellgruppen var betydligt lägre än att i VCS och VCS-AB grupper. Den Tb.N och Tb.Th värderingar i gruppen VCS-AB var betydligt högre än de i modellen och VCS-gruppen. Dessutom är Tb.Sp poängen i gruppen VCS-AB markant lägre än i modellgrupp VCS gruppen (figur 4D).

Dessa resultat tyder på att infektion med S. aureus orsakar ökande WBC och CRP i modellgruppen, som kan minskas med hjälp av Riskkapitalbolagen. Implantation av VCS betraktas som den optimala antibiotikabehandling. Men är Ben defekten observerbara i gruppen VCS. Av VCS och autologt ben behandling öka trabekelantal tjocklek och trabekelantal nummer och minska den trabekulära separationen. VCS-AB behandling visade kapacitet att främja läkning.

Figure 1
Figur 1 . Kirurgisk beredning av benet infektion modell. (A) visar den stansning position på skenbenet. Avståndet mellan borrning hål position för injektion med S. aureus till den övre delen av tibia är 1,5 cm. (B) görs snitt i huden att exponera periostet. (C) visar snitt genom periostet att exponera skenbenet. (D) Punch en 2 mm diameter hål i tibia. (E) fylla på 2 mm diameter hål full av ben vax. (F) avskurna reservdelar ben vax. (G) Visa ben vaxet fylla ben defekten. (H) sy upp periostet och huden. (jag) injicera med S. aureus lösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Beredning av ben transplantatavstötning och antibiotika behandling. (A) snitt i huden att exponera periostet. (B) två intilliggande 4,8 mm diameter hål. (C) Debride nekrotisk ben och inflammatoriska benmärg. (D) skrapa och rengör benvävnaden mellan de två hålen att göra en lång cirkel diameter på 4.8 mm och 9,6 mm lång. (E) fylla hålet med VCS och ben transplantatavstötning. (F) sy upp periostet och huden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Utvärdering av benet infektion modell. (A) utseende funktioner av kanin benen infekterade med S. aureusoch typisk histopatologi bilder av kanin skenbenet i grupperna modell och kontroll. Blå pil: osteocyte; rosa pil: Ben trabekelantal; gul pil: bakteriell aggregat; grön pil: döda ben. (B) de WBC och CRP resulterar i kaninserum vid tidpunkter av innan modellering, 7, 14, 21 och 28 dagar efter infektion. Kolumnerna representerar den genomsnittliga ±SE, *p < 0,05 jämfört med kontrollgruppen. (C) antalet bakteriekolonier i skenbenet benmärg räknas efter natten inkubation. Kolumnerna representerar den genomsnittliga ±SE, *p < 0,05 vs. kolonin räkna på dag 0. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Bedömningar av antibiotiska aktivitet och bone regeneration. (A) resultaten av WBC och CRP i kaninserum vid tidpunkter av 2, 4, 6 och 8 veckor efter implantation av VCS och VCS-AB, punkterna som representerar den genomsnittliga ±SE, #p < 0,05 och *p < 0,05 jämfört med modellgruppen. (B) den koronala delen bilder av tibia analyseras av mikro-CT. (C) platsen för ROI. (D), histogram Visa benet volym/vävnad volym (BV/TV), trabekulära tjocklek (Tb.Th), trabecula nummer (Tb.N) och trabekulära avskiljandet (Tb.Sp) betyg för ROI från fem kaniner per grupp. Kolumnerna representerar den genomsnittliga ±SE, *p < 0,05 vs. kontrollgruppen eller modellgruppen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Tidslinjen i alla förfaranden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I tidigare studier konstruerades olika typer av djurmodeller för att studera både akut och kronisk ben infektion; sökandet efter den perfekta modellen kvarstår dock fortfarande17,18. Dessutom förväntas perfekt ben infektion modellen simulera patologiska kännetecknen av benet infektion i klinisk miljö, medan modellering perioderna, förbli låg kostnad och enkel att genomföra. Hittills, är kanin ben infektion modellen den vanligaste modellen i inflammatoriska ben Sjukdomforskning, som kaninerna är tillgängliga, genomförbart och billig. I vår tidigare studie jämfördes vi dödstal och infektionsfrekvensen kaniner med varierande kroppsvikter. Resultaten visade att kroppsvikten bör vara mer än 3 kg. annars, det skulle vara en hög dödlighet eller en hög förekomst av haematosepsis och en högre dödlighet efter operation.

Till skillnad från tidigare studier överensstämmer kanin ben infektion modeller och antibiotikabehandling i vår studie med patologiska kännetecknen av mänskliga sjukdomar och kirurgiska terapin. I den tidigare studien har djur injicerade med natrium morrhuate och S. aureus inte patologiska status mer än 60 dagar. Dessutom var dödligheten mer än 20%12,19. Översvämningen S. aureus lösning från ben defekter hade visat sig inducera en låg infektionsfrekvensen. Vi använde ben vax för att fylla 2 mm hålet på skenbenet, för att blockera S. aureus lösningen i benmärgen och säkerställt att hålen var full av ben vax genom att kontrollera hålet med eller utan blod overflow. Som en kanin tibia tjocklek 2 mm, vi tryckte en cylinder med diameter 2 mm och 2 mm höjd ben vax i 2 mm diameter hålen, vilket garanterade ben vax fylld hålet och inte kunde infiltrera i benmärgen. Dessutom som ben vax var flexibel och stabil, kunde den fyllde hålen och inte smälta eller reagera med benmärg. I vår studie, på 28 dagen efter infektion, ben vaxet var fortfarande fullständig och fyllt hålen helt. Som vikter av kaniner var mer än 3 kg och mindre än 3,2 kg, var volymen av bakteriesuspensionen 900 µL till 960 µL. På grund av långsam hastighet injektion och blockeringen av ben vax, kunde denna volym av bakteriesuspensionen injiceras i benmärgen utan högtryck. Resultaten visade att detta protokoll garanterar kvantiteten av S. aureus smittade i benmärgen. En 2 mm diameter hål var stansade i tibia att se till att avståndet till den övre delen av tibia är 1,5 cm, som lokaliserar hålet vid tibial platån, att säkerställa tillräckligt utrymme för att debride och implantatet VCS pärlor och autologt ben för följande behandling. Under processen modellering dog 3 kaniner på grund av allvarlig infektion. De återstående kaninerna som benet infektion kaniner och infektion i resterande kaniner var 100%. Jämfört med andra benet infektion protokoll, såsom implantation av tvättsvamp indränkt med S. aureus eller implantation av främmande material, våra protokoll noggrant simulera benet infektion i klinisk miljö och ha liten effekt på förfaranden, sådana samt debriderande nekrotisk ben och antibiotikabehandling.

Diagnostisera benet infektion är en utmaning att kirurger. Laboratory testresultaten, inklusive serum inflammation markör upptäckt, mikrobiologi analys och histopatologisk analys användes för att utvärdera benet infektion i kliniska inställningar20. Dessutom tillämpades bilddiagnostik, såsom ultraljud, röntgen, datortomografi, magnetisk resonanstomografi eller Raman-spektroskopi för att upptäcka benet infektion21. Tyvärr, diagnosticera osteomyelit genom imaging metoder är ofta försenad eftersom ben nekros är svåra att upptäcka genom vanlig röntgen förrän vecka 3 av infektion. I vår studie använde vi serum inflammation markör upptäckt och histopatologisk analys för att utvärdera benet infektion modeller, som dessa metoder var effektiva, manövreras och index var känslig. Följande var de viktigaste stegen i den kirurgiska proceduren för att skapa en benet infektion modell i vår studie. Välj kaniner med lämplig kroppsvikt att utföra kirurgi och behandling. Upprätthålla en steril miljö under den prishöjande och kirurgisk proceduren och säkerställa varma förhållanden efter protokollet kirurgiskt ingrepp. Slå ett 2 mm diameter hål i tibia, och avståndet till den övre delen av tibia är 1,5 cm. Fyll hålet med ben vax och sy upp periostet och hud för att blockera bakterier lösningen. De viktigaste stegen av antibiotikabehandling är följande. Säkerställa patologiska ben infektionen av kaninerna genom att identifiera WBC i helblod och CRP i serum. Debride nekrotisk ben helt, två intilliggande 4,8 mm diameter hål och skrapa och rena benvävnaden mellan 2 hål. Implantat 4 bitar av VCS pärlor och 8 bitar av autologt ben in i benmärgen och ben defekt.

Efter antibiotikabehandling observerade vi att kaninerna i gruppen VCS-AB hade en högre osteogent potential än i gruppen VCS. Detta kan bero på autologt ben innehåller aktiverade osteocyter och ben bildandet tillväxtfaktorer, som producerar benmatrix hela transplantat ytan, medan nedbrytningen av VCS inducerar knappa ben matris på regionen defekt. Våra resultat tyder att autogen benet har överlägsen osteogent kapacitet. Även om autologt ben skörd är begränsad i volym och medför sjuklighet till webbplatsen givare, är vikten av autologt ben inte försumbar22,23,24. I vår studie förvärvades med autologt ben från svans ben, som undviker systemisk skada, och minskar dödligheten jämfört med att få autologt ben från iliaca ben. Autograft ben från svans ben är kanske materialet som föredras ympning i djurens studien av benet infektion.

Sammanfattningsvis, var en förbättrad kanin modell av benet infektion etablerad i denna studie. Inflammation index och blod biokemiska index användes att uppskatta benet infektion modellen. Också, efter antibiotikabehandling, multi-level analyser genomfördes för att upptäcka antibiotiska aktivitet och ben regeneration förmåga. Modellering, behandlingsprotokoll och utvärderingsmetoder är genomförbart och pålitliga. Fortsatta studier kommer att inriktas på att dra nytta av multimodalitet visuella enheter för att övervaka den patologiska processen av benet infektion och ben reparationsprocessen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna rapportera inga intressekonflikter i detta arbete.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av den National Natural Science Foundation Kina (81803808, 81873062), Zhejiang provinsiella medicinska och hälsa Science och Technology Fund (2017KY271) och vetenskap och teknik projekt i Zhejiang-provinsen (2017C 37181).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
absorbable surgical suture Jinghuan 18S0604A
asepsis injector Jinglong 20170501
bone wax ETHICON JH5CQLM
CCD camera Olympus DP72
EDTA-K2 anticoagulant blood vessel XINGE 20170802
Electric bone drill unit Bao Kang BKZ-1
Electric shaver Codos 3800
flexible silica gel mold  WRIGHT 1527745
Hematoxylin and Eosin Staining Kit Beyotime 20170523
Luria-Bertani culture medium Baisi Biothchnology 20170306
Medical-grade calcium sulphate WRIGHT 1527745
microcomputed tomography (micro-CT) Bruker SkyScan 1172 
Microscope Olympus CX41
New Zealand white rabbits Zhejiang Experimental Animal Center  SCXK 2014-0047
No. 11 scalpel  Yuanlikang 20170604
normal saline Mingsheng 20170903
PBS TBD(Jingyi) 20170703-0592
pentobarbital sodium Merk 2070124
povidone-iodinesolution Lierkang 20170114
S. aureus freeze drying powder China General Microbiological Culture Collection Center ATCC 6538
sheep blood agar HuanKai Microbial 3103210
tryptic soy agar plates HuanKai Microbial 3105697
tryptic soy broth tubes HuanKai Microbial 3104260
Vancomycin Lilly C599180

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malizos, K. N. Global Forum: The Burden of Bone and Joint Infection: A Growing Demand for More Resources. Journal of Bone and Joint Surgery-American Volume. 99, 20 (2017).
  2. Peeters, O. Teicoplanin - based antimicrobial therapy in Staphylococcus aureus bone and joint infection: tolerance, efficacy and experience with subcutaneous administration. BMC Infectious Diseases. 16, 622 (2016).
  3. Sugaya, H., et al. Percutaneous autologous concentrated bone marrow grafting in the treatment for nonunion. European Journal of Orthopeadic Surgery and Traumatology. 24, 671-678 (2014).
  4. Birt, M. C., Anderson, D. W., Bruce, T. E., Wang, J. Osteomyelitis: Recent advances in pathophysiology and therapeutic strategies. Journal of Orthopeadics. 14, 45-52 (2017).
  5. Walter, G., Kemmerer, M., Kappler, C., Hoffmann, R. Treatment algorithms for chronic osteomyelitis. Deutsches Arzteblatt International. 109, 257-264 (2012).
  6. Henriksen, K., Neutzsky-Wulff, A. V., Bonewald, L. F., Karsdal, M. A. Local communication on and within bone controls bone remodeling. Bone. 44, 1026-1033 (2009).
  7. Mendoza, M. C., et al. The effect of vancomycin powder on bone healing in a rat spinal rhBMP-2 model. Journal of Neurosurgery Spine. 25, 147-153 (2016).
  8. Cohn Yakubovich, D., et al. Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts. Journal of Visualized Experiments. (106), e53459 (2015).
  9. Brecevich, A. T., et al. Efficacy Comparison of Accell Evo3 and Grafton Demineralized Bone Matrix Putties against Autologous Bone in a Rat Posterolateral Spine Fusion Model. Spine Journal. 17, 855-862 (2017).
  10. Jensen, L. K., et al. Novel porcine model of implant-associated osteomyelitis: A comprehensive analysis of local, regional, and systemic response. Journal of Orthopeadic Research. 35, 2211-2221 (2016).
  11. de Mesy Bentley, K. L., et al. Evidence of Staphylococcus Aureus Deformation, Proliferation, and Migration in Canaliculi of Live Cortical Bone in Murine Models of Osteomyelitis. Journal of Bone and Mineral Research. 32, 985-990 (2017).
  12. Norden, C. W., Kennedy, E. Experimental osteomyelitis. I: A description of the model. Journal of Infectious Diseases. 122, 410-418 (1970).
  13. Mistry, S., et al. A novel, multi-barrier, drug eluting calcium sulfate/biphasic calcium phosphate biodegradable composite bone cement for treatment of experimental MRSA osteomyelitis in rabbit model. Journal of Controlled Release. 239, 169-181 (2016).
  14. Bernthal, N. M., et al. Combined In vivo Optical and µCT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51612 (2014).
  15. Koeth, L. M., DiFranco-Fisher, J. M., McCurdy, S. A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. Journal of Visualized Experiments. (103), e53028 (2015).
  16. Uttra, A. M., et al. Ephedra gerardiana aqueous ethanolic extract and fractions attenuate Freund Complete Adjuvant induced arthritis in Sprague Dawley rats by downregulating PGE2, COX2, IL-1β, IL-6, TNF-α, NF-kB and upregulating IL-4 and IL-10. Journal of Ethnopharmacology. 224, 482-496 (2018).
  17. Harrasser, N., et al. A new model of implant-related osteomyelitis in the metaphysis of rat tibiae. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 152 (2016).
  18. Abedon, S. T. Commentary: Phage Therapy of Staphylococcal Chronic Osteomyelitis in Experimental Animal Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1251 (2016).
  19. Tan, H. L., Ao, H. Y., Ma, R., Lin, W. T., Tang, T. T. In vivo effect of quaternized chitosan-loaded polymethylmethacrylate bone cement on methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis infection of the tibial metaphysis in a rabbit model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 6016-6023 (2014).
  20. Chiara, L., et al. Detection of Osteomyelitis in the Diabetic Foot by Imaging Techniques: A Systematic Review and Meta-analysis Comparing MRI, White Blood Cell Scintigraphy, and FDG-PET. Diabetes Care. 40, 1111-1120 (2017).
  21. Khalid, M., et al. Raman Spectroscopy detects changes in Bone Mineral Quality and Collagen Cross-linkage in Staphylococcus Infected Human Bone. Scientific Reports. 8, 9417 (2018).
  22. Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44, 513-517 (2015).
  23. Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7, 1169-1171 (2014).
  24. Takehiko, S., et al. Preliminary results of managing large medial tibial defects in primary total arthroplasty: autogenous morcellised bone graft. International Orthopaedics. 41, 931-937 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics