כימות של השומנים לשפע, הערכה של השומנים הפצה Caenorhabditis elegans ע י הנילוס אדום אדום שמן מכתים O

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

הנילוס אדום צביעה של קבוע Caenorhabditis elegans הוא שיטה למדידה כמותית של משקעי השומנים נייטרלי, בעוד שמן אדום O צביעת מקלה על הערכה איכותית של השומנים התפלגות בין רקמות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining. J. Vis. Exp. (133), e57352, doi:10.3791/57352 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל יוצא דופן שבו ללמוד השומנים ומטבוליזם אנרגיה הומאוסטזיס. רבים מבין הגנים השומנים שלו נשמרים אצל בני אדם, קשורים עם תסמונת מטבולית או מחלות אחרות. בחינה של הצטברות השומנים בתוך האורגניזם יכול להתבצע על ידי צבעי לשבועיים או שיטות ללא תווית. מקבע כתמים כמו הנילוס אדום, שמן אדום O דרכים זול, אמין למדוד באופן כמותי את רמות השומנים בדם, איכותית. מהניסוי לצפות השומנים הפצה ברחבי רקמות, בהתאמה. יתר על כן, הכתמים האלה מאפשרות תפוקה גבוהה הקרנת גנים מטבוליזם השומנים מסלולים שונים. בנוסף, הידרופוביות טבען מקלה על מסיסות השומנים, מפחית את האינטראקציה עם הרקמות הסובבות, ומונעת דיסוציאציה לתוך הממס. למרות ששיטות אלה יעילים בחינת תוכן שומני כללי, הם לא מספקים מידע מפורט אודות ההרכב הכימי ואת הרב-גוניות של משקעי השומנים. עבור מטרות אלה, ללא תווית שיטות כמו מיקרוסקופ GC-MS ומכוניות הם יותר מתאימים, שלהם עולה על אף האמור.

Introduction

שומנים חיוניים לחיים. הם חלק בלתי נפרד מרכיבי ממברנות, לשמש שליחים משניים, אות מתמרים, ויש פונקציות מכריע באחסון אנרגיה. כאשר מטבולי dysregulated, זה מוביל מחלות כמו השמנת יתר, סוכרת סוג II, אשר לוחץ על בריאות הציבור חששות9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא אורגניזם מודל מצוין שבו ללמוד מטבולי כי יש מחזור חיים קצר יחסית, גוף שקוף, שושלת תא ידוע ו גנום מלא ברצף. בעיקר אנדרוגינוס, C. elegans מאפשר לחוקרים להעלות מספר גדול של חיות isogenic בקיצור פרקי זמן למסכים carryout תפוקה גבוהה העברה גנטית ללמוד מגוון רחב של גנים מסלולים מטבוליים4. גישה זו חשפה רמה גבוהה של שימור גנים מטבוליזם השומנים של C. elegans 273 בין בני אדם, עכברים, חולדות, דרוזופילה. יתר על כן, הגנים השומנים מעל 300 C . elegans יש orthologues האנושי המשויכות עם מחלות שאינן קשורות תסמונת מטבולית11. באופן מסורתי, בחינת השומנים אחסון C . elegans הסתמכה בעיקר על מבחני התווית על-ידי צבע, המספקות מידע חזקה על הצטברות שומנים בדם. פחות נפוץ הוא תיאור של איפה לשפה ליפידים ההבדלים נמדד בשפע השומנים מעבר רקמות. עם זאת, העבודה האחרונה חשף כי השומנים הפצה יכול להיות חשוב כמו הצטברות השומנים6.

לאחרונה, מחקרים החלו שילוב שיטות כמו ביצועים גבוהים נוזלי כרומטוגרפיה מסות (HPLC-MS), גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS), ולא קוהרנטי אנטי-סטוקס ראמאן מיקרוסקופ פיזור (מכוניות) לכתובת החסרונות של גישות כתם על-ידי ישירות ניתוח התוכן של השומנים תמציות השומנים ספציפי שברים, השומנים פיקדונות, בהתאמה10,11. יתר על כן, מיקרוסקופיה מכוניות חשף כי הנילוס אדום יכול לשמש רק proxy עבור הצטברות שומן כאשר הוא משמש צבע מקבע, עבור השימוש כמו כתם חיוני שמוביל רחוק ממסלול הנחיתה-צביעת של auto-פלורסנט organelles10. עם זאת, נדרשת מומחיות טכנית של עלויות המשויכות גזים אלה ולעשות מיקרוסקופ שיטות השימוש שלהם רופף עבור שאלות מחקר רבות. במאמר זה נדון שיטה נוח ואמין שמלמדות, כתם משקעי השומנים נייטרלי C. elegans באמצעות הנילוס אדום, שמן אדום O להבחין שפע השומנים בבעלי חיים שלם, ברקמות מסוימות.

הנילוס אדום, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, הוא צבע benzophenoxazone ברצון מתמוסס בממיסים אורגניים שונים, אך בעיקר הוא מסיס במים. . זה צבע lysochrome מעולה נהגה כתם נייטרלי שומנים כגון טריגליצרידים או האסטרים כולסטרול כי הוא כולל צבע חזק, solubilizes גם שומנים, יש זניח אינטראקציה עם הרקמות הסובבות, והוא פחות מסיס הממס יותר ב שומנים. יש של maxima עירור, פליטה של 450-500 ו 520 ננומטר, בהתאמה1. כאשר הנילוס C. elegans המוכתמות באדום מוצג עבור קרינה פלואורסצנטית ירוק, גופים השומנים דיסקרטית ניתן נצפתה לאורך כל המעי לרקמות אחרות או אשכולות בתוך או באופן שווה התפזרו, בהתאם של החיה גנוטיפ או טיפול ניסיוני 7.

שמן אדום O היא lysochrome, צבע מסיס בשומן נהגה כתם lipoproteins טריגליצרידים. זה נקרא של צבע אזו כי המבנה הכימי שלו מכיל שתי קבוצות אזו המצורפת שלוש טבעות ארומטיות. זה קשה ionize, אשר הופך את מסיס מאוד שומנים. צבעה כתם אדום והוא קליטת האור שלה המרבי 518 nm 3. C. elegans מוכתם עם שמן אדום O להראות טיפות השומנים אדום אשר בולטות נגד גוף שקוף החיה, אשר מקלה על הערכה איכותית של השומנים התפלגות בין רקמות שונות6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הנילוס אדום (ע נ) צביעת של ליפידים

  1. הכנה של 5 מ"ג/מ"ל ע נ מניות פתרון
    1. בתוך בקבוק 500 מ"ל, להוסיף 100 מ ג של אבקת NR 200 מ של אצטון 100%.
    2. מכסה הבקבוק ברדיד אלומיניום, כדי למנוע כל חשיפה לאור.
    3. לפני השימוש, מוסיפים את הפתרון עבור 2 h בחושך.
    4. לשימוש לטווח ארוך, לאחסן את הפתרון ע נ מניות בבקבוק אטום בחוזקה ללא כל חשיפה קלה. סולם ע נ מניות פתרון בהתאם לצרכי מחקר. ודא כי הפתרון מניות אותו משמש לאורך מכתים NR ניסויים כדי להשיג תוצאות מכתים והדמיה עקבית.
  2. הכנת הפתרון עובד ע נ
    1. עבור כל 1 מ"ל של 40% אלכוהול איזופרופיל (v/v), להוסיף µL 6 ע נ מניות פתרון.
    2. היכונו 600 µL של הפתרון עובד ע נ כל דגימה.
      הערה: ודא NR טריים עובד פתרון נכון לפני צביעת. בהתאם לצרכי ע נ מניות פתרון, השתמש 15 מ"ל או צינור חרוטי 50 מ ל סיים את לימודיו.
  3. הכנה של תולעים NR השומנים מכתים
    1. לגדול תולעים שלב מוקדם L4-20 מעלות צלזיוס על מדיום הגידול נמטודות (NGM) עם יומן מאוחר OP50 e. coli.
    2. לשטוף את התולעים מחוץ לצלחת עם 1 מ"ל של 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח + 0.01% טריטון X-100 (PBST) פתרון ולשים את המתלים תולעת צינור microfuge 1.5 mL.
    3. צנטריפוגה שהתולעים ב 560 x גרם עבור מינימלית 1 הסר את תגובת שיקוע ואת חזור על שלב זה עד e. coli מנוקה ההשעיה.
    4. להוסיף 100 µL של 40% אלכוהול איזופרופיל בגדר תולעת, דגירה זה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
    5. Centrifuge התולעים ב x 560 גרם עבור 1 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע מבלי לשבש את פעולת בגדר תולעת.
      הערה: שימוש גבוה יותר אמצעי אחסון של PBST לרחוץ את התולעים מהצלחות, אם באמצעות לוחות גדולים יותר או צביעת יותר תולעים לכל צלחת. לא לשטוף את התולעים ב PBST יותר מאשר 15 דקות לפני הקיבעון הדגימה. ביצוע שוטף נוספים אם תגובת שיקוע אינה נמחקת של חיידקים. לבצע את הדגירה ב- 40% אלכוהול איזופרופיל באמצעות nutator או נדנדה. תמיד לפקח על הצינורות כדי לוודא עצבנות מדגם מלאה מתרחשת.
  4. השומנים מכתים עם נאט ו
    1. בחושך, להוסיף µL 600 של הפתרון עובד ע נ כל דגימה. היפוך הצינורות שלוש פעמים ומערבבים באופן מלא את התולעים בפתרון NR.
    2. לסובב את הדגימה בחושך בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
    3. בעקבות הדגירה, centrifuge את התולעים ב x 560 גרם עבור 1 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
    4. הוסף 600 µL של PBST, דגירה הדגימות בחושך למשך 30 דקות להסיר את הכתם NR עודף.
    5. Centrifuge את הדגימות ב x 560 גרם עבור 1 דקות ולהסיר והכל אבל µL כ-50 של תגובת שיקוע.
      הערה: הדגירה ע נ אינו דורש עצבנות. שיקוע של תולעים נפוץ במהלך שלב זה.
  5. הכנה של שקופיות מיקרוסקופ הדמיה
    1. Resuspend בגדר תולעת ב תגובת שיקוע הנותרים.
    2. מקום 5 µL של תולעת השעיה בשקופית מיקרוסקופ ולשים coverslip בקפידה כדי למנוע השמנה בועות אוויר.
    3. חותם את coverslip עם לק לפני הדמיה תולעים.
    4. להכין רק כמה שקופיות בכל פעם. פעולה זו תבטיח NR הדמיה נשאר קבוע מדגמים. איכות התמונות שהוכתמו NR פוחתת לאחר 6-אייץ השומנים דיסקרטית טיפות שקשה לצפות ומגביר את הרקע פלורסצנטיות, אשר מפריע ע נ אות זיהוי.
  6. הדמיה של תולעים שהוכתמו NR
    1. תמונה התולעים בהגדלה X 5 כדי ללכוד מספר בעלי חיים לכל שדה ראייה.
    2. לעבור 10 X הגדלה על כימות יותר של תולעים בודדים.
    3. השתמש FITC/GFP ערוץ תמונה צבעונית-NR תולעים ולנסות פעמים חשיפה שונים כדי לקבוע את התנאים אופטימליים עבור כימות.
    4. לשמור קבצים בפורמט TIF כדי למנוע איבוד נתונים עקב דחיסה.
      הערה: חשיפה טיפוסית הזמן נע בין גב' 100-1000 לאחר זמן של חשיפה אופטימלית, להשתמש בו עבור כל הדגימות כדי לשמור על עקביות הדמיה.
  7. כימות תמונה צביעת NR
    1. להעלות micrographs ImageJ. בתפריט הנפתח תוספים, השתמש בפונקציה ביו-תבניות אם קובץ התמונה לא מזוהה.
    2. בתפריט הנפתח ' התמונה, תחת הפונקציה ערימות, להשתמש בתמונות-כדי-מחסנית כדי ליצור אוסף תמונות כאשר micrographs מספר מושווים.
    3. התפריט הנפתח, התאם בהירות/חדות של אוסף התמונות, הפץ שינויים כל התמונות על ידי לחיצה על החל.
    4. מעסיקים הכלי בחירה מצולע ניסחו כל תולעת שבעורך ולהשתמש בפונקציה מידה תחת התפריט הנפתח ניתוח כדי לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית הנפלטת ע נ.
    5. עבור כל תמונה, למדוד את מיקומי רקע חמש, לחשב את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רקע הממוצע.
    6. להפחית את עוצמת קרינה פלואורסצנטית הרקע של כל תולעת הדמיה באמצעות הנוסחה N = G - (A x B), שבו N מייצג פלורסצנטיות נטו, G עבור קרינה פלואורסצנטית בוטה, A עבור אזור תולעת הכולל ו- B על רקע הממוצע זריחה.
    7. לנרמל את עוצמת קרינה פלואורסצנטית לפי גודל התולעת, לחלק זריחה של התולעת כל נטו לפי אזור הכולל שלה. התוצאות מדווחות כמו עוצמת קרינה פלואורסצנטית, ביחידות שרירותי (א"א), לפיקסל.
      הערה: להימנע ייצוא תמונות בתבנית JPEG. בזמן הדחיסה הופך קבצים יותר לניהול לאחסון, תקינות נתונים בסכנה על ידי תבנית זו. ודא כי כל התמונות הם שונו ולא מנותח באופן זהה. זכור כוללות סרגל קנה מידה כדי להעריך כראוי את גודל בהגדלות שונות. כדאי להמחיש את הבדלי עוצמת קרינה פלואורסצנטית באמצעות ImageJ, להחליף סוג תמונה מ- RGB ל- 8-bit ובחר אש ', מתפריט טבלאות (LUT) ' בדיקת מידע ' התמונה. זה יוצר תמונה חום-מפה באיזה צבע מוגברת בהירות בקורלציה עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית מוגברת.

2. שמן אדום O צביעת (אורו) של ליפידים

  1. הכנה של פתרון מניות אורו
    1. בבקבוק 250 מ ל, להוסיף 500 מ ג של אבקת אורו 100 מ של 100% אלכוהול איזופרופיל ומערבבים היטב.
    2. לאחר מוכן, אחסן את הפתרון בחוזקה חתום עם חשיפה קלה. לא.
  2. הכנת הפתרון עובד אורו
    1. אורו הפתרון מניות במים (3:2) 60% אלכוהול איזופרופיל מדולל.
    2. לפני השימוש, לסנן את הפתרון אורו עובד דרך מסנן סטרילי מזרק 0.2 µm אצטט תאית.
      הערה: לקבלת איכות הפתרון הטוב ביותר, להכין הפתרון אורו עובד יום לפני, ולתת לו לערבב בין לילה. עם זאת, אם הפתרון הדרוש באותו יום, לדלל, לערבב פתרון אורו על כיסא נדנדה כבר לפחות שעתיים לפני השימוש. לפני נדנדה, לעטוף את צינור חרוטי פרפין הקלטת כדי למנוע דליפה של אורו פתרון.
  3. הכנה של תולעים אורו השומנים מכתים
    1. לגדל את התולעים ב 20 מעלות צלזיוס על מדיום הגידול נמטודות (NGM) עם יומן מאוחר OP50 e. coli לשלב החיים הרצויה.
    2. להוסיף 1 מ"ל של פתרון PBST לצלחת, מערבולת עד כל התולעים רלוונטי. להטות את הצלחת, לשטוף אותו עם 1 מ"ל של PBST. להעביר את המתלים תולעת צינור microfuge 1.5 mL.
    3. צנטריפוגה שהתולעים ב 560 x גרם עבור מינימלית 1 להסיר את תגובת שיקוע מבלי להפריע את גלולה ולא לחזור על השטיפה צעד עם 1 מ"ל של PBST שלוש פעמים. הסר את כל µL supernatant אבל 100.
    4. להוסיף 600 µL של 40% אלכוהול איזופרופיל בגדר תולעת, שחק אותה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
    5. Centrifuge התולעים-560 x g עבור 30 s והסר כל supernatant אבל 100 µL מבלי לשבש את פעולת בגדר תולעת.
      הערה: השתמש כמויות גבוהות יותר של PBST לרחוץ תולעים את לוחות אם עושה מכתים תפוקה גבוהה. אנחנו לא שוטפים תולעים ב PBST יותר מאשר 15 דקות לפני קיבוע הדגימה. לעשות שוטף נוספים אם תגובת שיקוע אינה נמחקת של חיידקים. לבצע את הדגירה ב- 40% אלכוהול איזופרופיל באמצעות nutator או נדנדה. תמיד לפקח על צינורות כדי לוודא עצבנות מדגם מלאה מתרחשת.
  4. השומנים מכתים עם אורו
    1. להוסיף הפתרון עובד אורו µL 600 כל דגימה. היפוך הצינור שלוש פעמים ומערבבים את התולעים היטב אורו.
    2. לסובב את הדגימות-סל ד 30 עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
    3. Centrifuge את הדגימות ב x 560 גרם עבור 1 דקות, לחסל את כל µL supernatant אבל 100.
    4. Resuspend את הדגימות ב 600 µL של PBST, לסובב את הצינורות-30 סל"ד למשך 30 דקות להסיר את הכתם אורו עודף.
    5. צנטריפוגה דגימות ב x 560 גרם עבור 1 דקות, לחסל את כולם חוץ µL 50 של תגובת שיקוע.
    6. להבחין טוב יותר את המיקום של החיה germline ואת תאי המעי, כתם גרעינים על-ידי הוספת 1 µL של (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-אינדול-6-carboxamidine) (דאפי) עבור כל 1 מ"ל של הפתרון עובד אורו. לבצע את אורו צביעת עבור 2 h עם הוספת דאפי לפני הרכבה שקופיות עבור הדמיה. הגרעינים מעיים גדולה, בלוטת המין מאופיינת תאי נבט המתפתח.
      הערה: לאחר אורו מכתים, תולעים עלול לדבוק צידי הצינור microfuge, להיכשל בצורת גלולה מורגש. במקרה כזה, centrifuge את התולעים שוב או לאפשר תולעים להתפשר על ידי הכבידה לפחות 10 דקות.
  5. הכנה של השקופיות תולעת הדמיה
    1. Resuspend התולעים, תגובת שיקוע הנותרים ומערבבים היטב את הפתרון.
    2. לשים 5 µL של תולעת השעיה בשקופית מיקרוסקופ ומניחים coverslip בזהירות, המבטיח כי אין אוויר בועות טופס.
    3. חותם את coverslip עם לק ותולעים התמונה.
      הערה: לאחר תיקון מכתים, תולעים יכולה להיות מאוד נוקשה וקשה פיפטה. כדי לעקוף את זה, להפוך רחב נשא פיפטות שתורידו את העצות שלהם.
    4. אחסן את השקופיות במעמד מיקרו-צנטריפוגה ב 4 ° C עבור עד 24 שעות אם לא הדמיה מיד לאחר צביעת.
  6. הדמיה של תולעים שהוכתמו אורו
    1. השתמש מצלמה צבע בעל יכולת כדי התמונה שהוכתמו אורו תולעים.
    2. להשתמש 5 X הגדלה התמונה תולעים מספר אחד שדה ראייה.
    3. לעבור 10 X הגדלה יותר בחינת תולעים בודדים.
    4. לייצא תמונות בפורמט TIF כדי למנוע אובדן נתונים עקב דחיסה.
      הערה: אם מכתים עם אורו + דאפי, לעבור את המצלמה תומך-צבע אחד זה יכול ללכוד זריחה.
  7. ניתוח תמונות של תולעים שהוכתמו אורו
    1. להעלות micrograph(s) ImageJ. בתפריט הנפתח תוספים, השתמש בפונקציה ביו-תבניות אם קובץ התמונה לא מזוהה.
    2. בתפריט הנפתח ' התמונה, תחת הפונקציה ערימות, להשתמש בתמונות-כדי-מחסנית כדי ליצור אוסף תמונות כאשר micrographs מספר מושווים.
    3. התאם בהירות/חדות תחת התפריט הנפתח כדי לשפר את הנראות של השומנים טיפות.
    4. לסווג את התמונות לפי הצטברות שומנים בדם לאורך כל גוף החיה או ברקמות מסוימות.
    5. עבור הערכה טובה יותר של השומנים לוקליזציה ועבור זיהוי חפצים שאינם ספציפיים התמונה באמצעות ImageJ, בחר בפונקציה צבע תחת התפריט הנפתח התמונה ולחץ על מחסנית ל- RGB כדי להראות את הסימנים של כל רכיב RGB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SKN-1 הוא bZip, גורם שעתוק cytoprotective מניות הומולוגיה עם NRF2 יונקים, הוכח לתווך חמצון חומצות שומן. בהתאם ריכוז הגלוקוז בתזונה שלהם, להראות תולעים עם אלל צורונים מופעל skn-1 רמות השומנים בדם שונה כשהוא מוכתם הנילוס אדום7. איור 1A -C מראה מופעל skn-1 בעלי חיים שנחשפו לתנאי להוביל להגברת רמות השומנים בדם. קרינה פלואורסצנטית NR שנלכדה באמצעות ערוץ FITC/GFP בולט לאורך המעי, אך עמעם הראש, הזנב ו לומן מעיים. גם להגביר את רמות השומנים בדם, דיסקרטית שהוכתמו NR חלקיקים הם יותר קשה להבחין בכך, אשר עשויים להצריך פעמים חשיפה נמוכה יותר. על פי שיטה זו משתמשת עוצמת קרינה פלואורסצנטית כמדד כמותי עבור הצטברות שומנים בדם, זהו לקוי להבחנה מכתים לא ספציפי של מבנים הסלולר שאינם מאגרי שומן והוא נוטה אות הפרעות מעיים אוטומטי קרינה פלואורסצנטית. לכן, תווית חלופי ושיטות ללא תווית יש להשתמש במקביל חד משמעית לכמת ליפידים נייטרלי בעלי חיים10.

תלויי-גיל סומאטית דלדול של שומן (Asdf), הוא הפנוטיפ המתרחש בגילאי תולעים לפיה חיות להציג ירידה תאים סומטיים שומנים, בעוד תא הנבט ליפידים נשארות ללא שינוי6. שמן אדום O צביעת היא לא שיטה אמינה מכמתת את רמות השומנים בדם, אבל מעולה להמחשת השומנים לוקליזציה, שימושי לקביעת פנוטיפים הידלדלות שכבת שומן כמו Asdf של התולעת. בזמן זה קל לסווג את התולעים על פי נוכחות או היעדרות של בנצי טייץ, זה עשוי להיות קשה לזהות חיות עם ביניים שומן הפסד (איור 2 א). בהשוואה ללא-Asdf חיות, אשר מראים אדום בהיר מכתים בכל הגוף עם כמה אזורים שקופים (איור 2B), תולעים Asdf התערוכה מורגש המחסור שומן בתאי המעי (איור 2C). חיות פיתוח Asdf (איור דו-ממדי) לעתים קרובות מראים כתמים שקוף שבו מתרחשת רוב שומן הפסד בסופו של דבר. יתר על כן, תולעים Asdf עשויים עדיין כוללים בהיר אדום מכתים באזורים ראש ולא זנב כי פנוטיפ שאינה מוגדרת על ידי מלאה סומאטית שומן הפסד, אלא על ידי דלדול שומן נרחב יחסית בעלי חיים שאינם בגיל המעבר (שאינם Asdf). השימוש של שמן אדום O צביעת, לפיכך, מאפשר קביעה איכותית של השומנים לוקליזציה וזיהוי של פנוטיפים שמשתנים באופן משמעותי משקעי שומן התולעת.

Figure 1
איור 1: צביעה של שומנים על ידי הנילוס חא כתמים אדומים הנילוס מופעל skn-1 המוטציות בתנאים להפיק הצטברות השומנים מוגברת (A-C). הרווח של הפונקציה skn-1 זן (lax188) בנמלים של החלפת חומצת אמינו E237K שמעבדת SKN-1 צורונים פעילים. L4-שלב תולעים נחשפו ל- 0, 15, 30 J/m2 ואחריו נקודה 12-h השחזור על צלחות NGM unseeded לפני מכתים NR והדמיה אור UV. הראו תמונות הם נציג פנוטיפ. כימות השומנים בוצעה כאמור בסעיף 1.7. האש היא מראה ImageJ למעלה בטבלה (LUT) המשמש ליצירת תמונה תרמית המציג פלורסצנטיות בעוצמה ההבדלים בין תמונות. מיזוג מציג תמונות FITC/GFP ו- DIC בשילוב. כימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית עבור כל תמונה מוצגת בתחתית מצרף התמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: צביעה של שומנים על ידי שמן או אדום שמן אדום O צביעת של הפעלת מוטציות skn-1 (lax188) מראה נוכחות או היעדרות של פנוטיפ בנצי טייץ (A-D). A & D חיות הצג עם פנוטיפים Asdf ביניים. B & C להציג מכתים אורו הנגדי. בעוד B שאינם Asdf, C מציג ניכר דלדול השמן סומאטית עם עליית והמצוות germline הצטברות שומן, המגדיר את פנוטיפ Asdf. . התולעים היו מוכתמים אורו ואחריו הדמיה 144 hafter L1-מסונכרנות חיות הונחו על מדיה NGM עם חיידקים OP50. הראו תמונות הם נציג של חיות עם או בלי פנוטיפ של בנצי טייץ. שיבוץ קריקטורות עוברות שינוי של לין, et al. 6 מייצגים העדר (B) או נוכחות (C) של דלדול השמן סומאטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עליית השמנת יתר, מחלות מטבוליות המחירים גורם C. elegans מודל מתאים ללמוד את המנגנונים המווסתים הצטברות שומן ב תאים ורקמות. ממצאים אחרונים מעידים כי השינויים ברמות השומנים נמצאים בקורלציה עם תהליכים תאיים החל אינסולין איתות8, ההפעלה של הורמון קולטנים2, פלט הרבייה5. בהשוואה ללא תווית מיקרוסקופ ושיטות כרומטוגרפיה, הנילוס אדום ושמן O אדום הינם צבעי זול יחסית נהגה כתם ליפידים נייטרלי של התולעת בעקביות reproducibly10,12,13. הראשון מאפשר כימות של רמות השומנים בדם הכולל, בעוד השנייה מקלה את ההערכה של השומנים התפלגות בין רקמות כגון את ובהיפודרמיס, המעי הקו נבט. בעת שימוש בשילוב, ע נ ואורו מאפשרים לחוקרים לקבוע כיצד גנוטיפ ושינויים סביבתיים משפיעים על הצטברות שומנים בדם ואת שם בהתולעת שינויים אלה מתרחשות.

צבעים אלה, בכל זאת, לא ישירות להעריך הצטברות שומנים בדם באופן בלתי פולשני זהה כמו גם מכוניות מיקרוסקופ12. לכן, הן נוטות שגיאות במהלך הקיבעון, מכתים, אשר עלול לפגוע דיוק המדידה13. בנוסף, צבעים אלה שדואגים בטעות עם lipofuscin ואת בגרגרים מעיים, וכתוצאה מכך פלורסצנטיות שאינן קשורות שומן נייטרלי תאיים מאחסן10,14. בנוסף, במקרים שבהם מופיעות רמות השומנים בדם נמוכה, ע נ ואורו מכתים לא יכול להבחין אם התוצאה היא תוצאה של בעיות חדירות או מופחתת הצטברות שומן. יתר על כן, הרגישות של הכתמים האלה לאור דורשת אמצעים מיוחדים במהלך אחסון וטיפול פעיל ממגבלה זו השפלה של צילום הלבנת. עם זאת, אם התראה מבוצעת כאשר ביצוע והפקת לקחים מן מבחני מבוסס על תוויות, NR, אורו מכתים הם אמצעי מעולה של קדימה גנטי מסכים ללמוד משעולים חילוף החומרים של השומנים ולבחון את הגומלין שלהם עם אחרים פיזיולוגיים פונקציות. השימוש של תולעים הדף היומי-2 ושומן-6 מומלץ לערוך השוואות היחסי של הצטברות השומנים מוגברת, ירידה, בהתאמה. הכביסה, קיבעון צעדים ע נ ו אורו מכתים דומים. לכן, שניהם יכול להתבצע באותו יום. עם זאת, ניתן לאחסן רק את השקופיות עם תולעים שהוכתמו אורו הדמיה מאוחר יותר כי NR מכתים אינו עקבי לאחר 6 שעות. במהלך הכביסה, חיוני כדי לכלול טריטון 100-X לא רק כדי לשפר את החדירות NR, אורו, אלא גם כדי למנוע את אובדן תולעת בשל ההקפדה plasticware מוגזמת. בנוסף, התולעים צריך לרחוץ פחות מ 30 דקות לפני צביעת כדי להבטיח חדירות המרבית על כל כתם. בעוד NR וזמני הדגירה אורו וייתכן שיצומצמו כדי 1 h ו- 30 דקות, בהתאמה, זה מומלץ לעקוב אחר הזמן הציע במאמר זה לקבלת תוצאות מכתים והדמיה עקבית יותר. חשיפה ממושכת של פתרון ע נ אור וכישלון לסינון פתרון אורו לפני שימוש יגדיל רקע זריחה במהלך דימות. בביצוע פרוטוקולים מכתימים אלה דורש 3-4 h בנוסף לזמן הדמיה. למרות כתם הדגירה מציע לכל היותר 2 h של הפסקה בין השלבים, מומלץ מאוד כי הפרוטוקולים מתבצעות עם ההפרעות מעטים ככל האפשר כדי להפחית את מקורות רבים של שגיאה הטבועה בכל שיטות מבוסס-צבען של השומנים כמת, בדיקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו התאפשרה על ידי המענק-NIH: R01GM109028 (S.P.C.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Imager.M2m Microscope Zeiss n/a Fluorescence microscope
ERC5s camera Axiocam n/a Color-capable
MRm camera Axiocam n/a Fluorescence-capable
Nile red Thermo Fisher N1142 Lipid Stain
Oil red O Alfa Aesar A12989 Lipid Stain
DAPI Thermo Fisher D1306 DNA stain
Isopropyl Alcohol BDH BDH1133-1LP Fixative solution
0.2 µm seterile syringe filter VWR 28145-477 Cellulose acetate filter
Centrifuge 5430 Eppendorf 5428000015 Centrifuge
Shaker Rotisserie Lab Quake 400110Q Shaker
Tube Rotator VWR 10136-084 Rotator
K2HPO4 Sigma-Aldrich 7758-11-4 NGM
KH2PO4 Sigma-Aldrich 7778-77-0 NGM
MgSO4 Alfa Aesar 7786-30-3 NGM
CaCl2 Sigma-Aldrich 10035-04-8 NGM
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5 NGM
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5 NGM
Peptone BD Biosciences 211677 NGM
Agar Teknova L9110 NGM
LB media Sigma-Aldrich L3147 Bacterial growth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, (3), 965-973 (1985).
  2. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. J Cell Sci. 122, (6), 749-752 (2009).
  3. Horobin, R. W., Kiernan, J. A. Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. BIOS Scientific Publishers. (2002).
  4. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angew Chem Int Edit. 50, (21), 4774-4807 (2011).
  5. Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis. Cell Rep. 9, (6), 2180-2191 (2014).
  6. Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans. P Natl Acad Sci USA. 112, (50), 15378-15383 (2015).
  7. Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation. Nat Commun. 5, (2014).
  8. Saltiel, A. R., Kahn, C. R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature. 414, (6865), 799-806 (2001).
  9. Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans. Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).
  10. Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PloS One. 5, (9), e12810 (2010).
  11. Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 14, (1), 164 (2013).
  12. Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr Opin Genet Dev. 21, (5), 585-590 (2011).
  13. Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (73), (2013).
  14. O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10, (5), 430-435 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics