Kvantificering af Lipid overflod og evaluering af Lipid Distribution i Caenorhabditis elegans af Nilen rød og olie røde O farvning

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Nile rød farvning af fast Caenorhabditis elegans er en metode til kvantitativ måling af neutrale lipid indskud, mens olie røde O farvning letter kvalitativ vurdering af lipid fordeling blandt væv.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining. J. Vis. Exp. (133), e57352, doi:10.3791/57352 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Caenorhabditis elegans er en enestående model organisme i at studere lipid metabolisme og energi homøostase. Mange af dens lipid gener er bevaret hos mennesker og er forbundet med metabolisk syndrom eller andre sygdomme. Undersøgelse af lipid ophobning i denne organisme kan udføres af Fikseringsvæske farvestoffer eller etiket-fri metoder. Fikseringsvæske pletter som Nilen rød og olie røde O er billige og pålidelige måder at måle kvantitativt lipidniveauer og kvalitativt observere lipid distribution på tværs af væv, henholdsvis. Derudover tillader disse pletter high throughput screening af forskellige lipid metabolisme gener og veje. Derudover deres hydrofob karakter letter fedtopløselighed, reducerer interaktion med omgivende væv, og forhindrer dissociation i opløsningsmidlet. Selv om disse metoder er effektive til at undersøge generelle lipid indhold, giver de ikke detaljerede oplysninger om den kemiske sammensætning og mangfoldighed af lipid indskud. Til disse formål, etiket-gratis metoder såsom GC-MS og biler mikroskopi er bedre egnet, deres omkostninger uanset.

Introduction

Lipider er afgørende for liv. De er integrerende dele af membraner, fungere som sekundære budbringere og signal transducere og er livsvigtige funktioner i energilagring. Når lipid metabolisme er dysregulated, fører det til sygdomme som fedme og type II diabetes, som presser offentlige sundhed bekymringer9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en fremragende model organisme i at studere lipid metabolisme, fordi det har en relativt kort levetid, en gennemsigtig krop, en kendt celle afstamning og en fuldt sekventeret genom. Primært en hermafrodit, C. elegans kan forskere at hæve store antal isogene dyr i korte perioder af tid til at foretage høj overførselshastighed fremad genetiske skærme til at studere en bred vifte af metaboliske gener og veje4. Denne tilgang har afsløret en høj grad af bevarelse i 273 C. elegans lipid metabolisme gener blandt mennesker, mus, rotter og drosophila. Derudover har over 300 lipid gener i C. elegans menneskelige orthologues, der er knyttet til sygdomme relateret til Metaboliske syndrom11. Undersøgelse af lipid opbevaring i C. elegans har traditionelt, for det meste påberåbt dye-mærket assays, som giver robust oplysninger om lipid ophobning. Mindre udbredt er en beskrivelse af hvor lipider lokalisere og målte forskelle i lipid overflod på tværs af væv. Seneste arbejde viste imidlertid, at lipid distribution kan være lige så vigtig som lipid ophobning6.

Sidst, studier er begyndt at integrere metoder såsom højtydende liquid chromatography-massespektrometri (HPLC-MS), gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS), og sammenhængende anti-stokes Raman spredning (biler) mikroskopi til adresse den mangler af pletten-baserede tilgange ved direkte analysere indholdet af lipid ekstrakter, specifikke lipid fraktioner og lipid indskud, henholdsvis10,11. Derudover har biler mikroskopi afsløret, at Nilen rød kun kan tjene som en proxy for fedtophobning når det bruges som en Fikseringsvæske farvestof, for dets anvendelse som en vital pletten fører til off-target farvning af auto-fluorescerende organeller10. Men den nødvendige tekniske ekspertise og omkostningerne forbundet med disse kromatografi og mikroskopi metoder gøre deres brug uholdbar for mange forskningsspørgsmål. I denne artikel vil diskutere vi en bekvem og pålidelig metode til at fiksere og plette neutral lipid indskud i C. elegans ved hjælp af Nilen rød og olie røde O for at skelne lipid overflod i hele dyr og i bestemte væv.

Nile rød, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, er en benzophenoxazone farvestof, der let opløses i forskellige organiske opløsningsmidler, men er for det meste uopløseligt i vand. Det er en fremragende lysochrome farvestof bruges til at plette neutral lipider som triglycerider eller kolesterol estere fordi det har en stærk farve, solubilizes godt i lipider, har ubetydelig interaktion med omgivende væv, og er mindre opløselige i opløsningsmiddel end i lipider. Det har en excitations- og maxima af 450-500 og 520 nm, henholdsvis1. Når Nile rød-farvede C. elegans ses til grønne fluorescens, kan diskrete lipid organer overholdes i hele tarmen og andre væv enten i klynger eller jævnt spredt, afhængig af dyrets genotype eller eksperimentel behandling 7.

Olie røde O er en lysochrome, fedtopløselige farvestof bruges til at plette triglycerider og lipoproteiner. Det kaldes et azofarvestof, fordi dens kemiske struktur indeholder to azo grupper knyttet til tre aromatiske ringe. Det er vanskeligt at ionisere, som gør det meget opløseligt i lipider. Dens pletten farve er rød og dens maksimale lysabsorption er 518 nm 3. C. elegans farves med olie røde O Vis rød lipid dråber, der skiller sig ud mod dyrets gennemsigtige krop, som letter kvalitativ vurdering af lipid fordelingen mellem forskellige væv6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Nilen Red (NR) farvning af lipider

  1. Forberedelse af 5 mg/mL NR stamopløsning
    1. I en 500 mL flaske, tilføje 100 mg NR pulver til 200 mL 100% acetone.
    2. Dække flaske med aluminiumsfolie at undgå eksponering for lys.
    3. Før brug, opløsningen for 2 h omrøres i mørke.
    4. For lang tids brug, skal du gemme NR stamopløsning i en tætsluttende flaske uden nogen lys eksponering. Skala NR stamopløsning ifølge forskningsbehov. Sikre, at samme stamopløsningen anvendes på tværs af NN-farvning forsøg for at opnå ensartet farvning og imaging resultater.
  2. Forberedelse af NN brugsopløsning
    1. For hver 1 mL 40% isopropanol (v/v), tilføje 6 µL af NN stamopløsning.
    2. Forberede 600 µL af NN brugsopløsning til hver prøve.
      Bemærk: Gøre friske NR arbejder løsning ret før farvning. Afhængigt af NN stamopløsning behov dimitterede brug enten en 15 mL eller 50 mL koniske rør.
  3. Forberedelse af orme til NN lipid farvning
    1. Vokse orme til L4 tidligt ved 20 ° C på ødelægge vækstmediet (NGM) seedede med sen-log OP50 E. coli.
    2. Vaske orme off plade med 1 mL af 1 x fosfatbufferet saltopløsning + 0,01% Triton X-100 (PBST) løsning og sætte orm suspension i en 1,5 mL mikrofuge tube.
    3. Centrifuge orme på 560 x g i 1 min. Fjern supernatanten og Gentag dette trin indtil E. coli er ryddet fra suspension.
    4. Tilføje 100 µL af 40% isopropanol til orm pellet og inkuberes ved stuetemperatur i 3 min.
    5. Centrifugeres orme på 560 x g i 1 min og Fjern supernatanten uden at forstyrre orm pelleten.
      Bemærk: Brug større mængder af PBST at vaske orme off pladerne hvis ved hjælp af større plader eller farvning mere orme pr. plade. Lave ikke afvaske orme i PBST mere end 15 min. før prøven fiksering. Udføre yderligere vasker hvis supernatanten ikke er renset for bakterier. Udføre inkubation i 40% isopropanol ved hjælp af en nutator eller en rocker. Altid kontrollere rør for at sikre fuld prøve agitation forekommende.
  4. Lipid farvning med NR
    1. I mørke, skal du tilføje 600 µL af NN brugsopløsning til hver prøve. Invertere rør tre gange og fuldt Bland orme i NR løsning.
    2. Rotere prøven i mørke ved stuetemperatur i 2 timer.
    3. Efter inkubation, centrifugeres orme på 560 x g i 1 min og Fjern supernatanten.
    4. Tilføje 600 µL af PBST og inkuberes prøver i mørke for 30 min til at fjerne overskydende NR pletten.
    5. Centrifugeres prøver på 560 x g i 1 min og fjerne alle men ca 50 µL af supernatanten.
      Bemærk: NN inkubation kræver ikke agitation. Afregning af orme er fælles i dette trin.
  5. Fremstilling af dias til mikroskop imaging
    1. Resuspenderes orm i resterende supernatanten.
    2. Placere 5 µL af ormen suspension på et objektglas og sætte en coverslip på omhyggeligt for at undgå at fange eventuelle luftbobler.
    3. Forsegle coverslip med neglelak før imaging orme.
    4. Forberede kun et par dias ad gangen. Dette vil sikre NR imaging forbliver konstant på tværs af prøver. Kvaliteten af NN-farvede billeder aftager efter 6 h. diskrete lipid dråber er vanskelige at observere og baggrunden fluorescens stiger, som forstyrrer NR signal detektion.
  6. Billeddannelse af NN-farvede orme
    1. Image orme på 5 X forstørrelse at fange flere dyr pr. synsfelt.
    2. Skifte til 10 X forstørrelse til bedre kvantificering af individuelle orme.
    3. Bruge FITC/NGL kanal til billede NR-farvede orme og prøve forskellige eksponeringstider til at bestemme de optimale betingelser for kvantificering.
    4. Gemme filer i TIF format til at undgå at miste data på grund af kompression.
      NOTE: Typisk eksponering gange spænder fra 100-1000 ms. har en optimal eksponeringstid, bruge det til alle prøver for at opretholde imaging konsistens.
  7. NR farvning billede kvantificering
    1. Uploade micrographs at ImageJ. I rullemenuen Plugins brug funktionen Bio-formater hvis billedfilen ikke er genkendt.
    2. I billedet bruge pull-down menuen under funktionen stakke billeder til stakken til at oprette en billedstak sammenlignet flere micrographs.
    3. I den samme pull-down menu, justere lysstyrke/kontrast af billedstak og udbrede ændringer til alle billeder ved at klikke på Anvend.
    4. Ansætte Polygon markeringsværktøjet til at afgrænse hver afbildet orm og brug funktionen under rullemenuen analyser til at kvantificere fluorescens intensitet udsendes af NR.
    5. For hvert billede, måle fem baggrund placeringer og beregne den gennemsnitlige baggrundskoncentrationer fluorescens intensitet.
    6. Subtrahere baggrund fluorescens intensitet fra hver afbildet orm ved hjælp af formlen N = G - (A x B), hvor N står for netto fluorescens, G til brutto fluorescens, A for samlede orm område og B for gennemsnitlige baggrundskoncentrationer fluorescens.
    7. For at normalisere fluorescens-intensiteten af ormen størrelse, opdele hver orm netto fluorescens af sin samlede areal. Resultaterne rapporteres som fluorescens intensitet i arbitrære enheder (a.u.), per pixel.
      Bemærk: Undgå at eksportere billeder i JPEG-format. Mens komprimering gør filer mere overskueligt at gemme, er dataintegritet kompromitteret af dette format. Sørg for, at alle billeder er ændret og analyseret identisk. Husk at medtage en skalalinjen til korrekt vurdering af størrelse ved forskellige forstørrelser. For at bedre visualisere forskelle i fluorescens intensitet ved hjælp af ImageJ, Skift billedtype fra RGB til 8-bit og Vælg brand fra menuen billede opslag tabeller (LUT). Dette skaber en zonekort billede i hvilket øget farve lysstyrke korrelerer med øget fluorescens intensitet.

2. olien røde O farvning (ORO) af lipider

  1. Forberedelse af ORO stamopløsning
    1. I en 250 mL flaske, tilføje 500 mg ORO pulver til 100 mL 100% isopropanol og bland det godt.
    2. Når der tilberedes, gemme løsningen tætsluttende lukket med ingen lys eksponering.
  2. Forberedelse af ORO brugsopløsning
    1. Fortynd ORO stamopløsning i vand (3:2) til 60% isopropanol.
    2. Før brug, arbejder ORO Opløsningen filtreres gennem et 0,2 µm celluloseacetat steril sprøjte filter.
      Bemærk: For bedste løsning kvalitet, forberede ORO brugsopløsning dagen før, og lad det mix natten over. Men, hvis løsning er nødvendige samme dag, fortyndes og bland ORO løsning på en rocker i mindst 2 timer før brug. Før vuggende, wrap koniske rør i paraffin tape til at undgå udsivning af ORO løsning.
  3. Forberedelse af orme til ORO lipid farvning
    1. Vokse orme ved 20 ° C på ødelægge vækstmediet (NGM) seedede med sen-log OP50 E. coli til ønskede livsstadium.
    2. Der tilsættes 1 mL af PBST løsning til pladen og slyng indtil alle orme er off pladen. VIP pladen og vaske det med 1 mL af PBST. Overføre orm suspension til en 1,5 mL mikrofuge tube.
    3. Centrifuge orme på 560 x g i 1 min. Fjern supernatanten uden at forstyrre pellet og Gentag vask trin med 1 mL af PBST tre gange. Fjerne alle supernatanten men 100 µL.
    4. Tilføje 600 µL af 40% isopropanol til orm pellet og rock det ved stuetemperatur i 3 min.
    5. Der centrifugeres orme på 560 x g for 30 s og fjern alle supernatanten men 100 µL uden at forstyrre orm pelleten.
      Bemærk: Bruge større mængder af PBST for at vaske orme off plader, hvis gør høj overførselshastighed farvning. Lave ikke afvaske orme i PBST mere end 15 min. før prøven fiksering. Gøre yderligere vasker hvis supernatanten ikke er renset for bakterier. Udføre inkubation i 40% isopropanol ved hjælp af en nutator eller en rocker. Altid kontrollere rør for at sikre fuld prøve agitation forekommende.
  4. Lipid farvning med ORO
    1. Tilføje 600 µL ORO brugsopløsning til hver prøve. Vend røret tre gange og bland ormene godt i ORO.
    2. Rotere prøver på 30 rpm i 2 timer ved stuetemperatur.
    3. Centrifugeres prøver på 560 x g i 1 min og fjerne alle supernatanten men 100 µL.
    4. Resuspend prøverne i 600 µL af PBST og rotere rørene ved 30 rpm for 30 min til at fjerne overskydende ORO pletten.
    5. Centrifugeres prøver på 560 x g i 1 min og fjerne alle undtagen 50 µL af supernatanten.
    6. For at bedre skelne placeringen af dyrets kønscelleoverførsel og tarmcellerne, pletten kerner ved at tilføje 1 µL af (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-indol-6-carboxamidine) (DAPI) for hver 1 mL af ORO brugsopløsning. Udføre ORO farvning for 2 h med at tilføje DAPI før montering dias til billedbehandling. Tarm kerner er større i størrelse og gonade udmærker sig ved at udvikle kønsceller.
      Bemærk: Efter ORO farvning, orme kan overholde siderne af det mikrofuge rør og undlade at danne en mærkbar pellet. Hvis dette sker, centrifugeres ormene igen eller tillade orme at afregne ved tyngdekraft i mindst 10 min.
  5. Fremstilling af dias til orm imaging
    1. Resuspend orme i den resterende supernatanten og bland opløsningen godt.
    2. Sætte 5 µL af ormen suspension på et objektglas og placere en coverslip omhyggeligt, at sikre, at ingen luft bobler form.
    3. Forsegle coverslip med neglelak og billede orme.
      Bemærk: Efter fastsættelse og farvning, orme kan være meget stift og vanskeligt at afpipetteres. For at omgå dette, skal du gøre wide-bore pipetter ved at afskære deres tips.
    4. Gemme diasene i et mikro-centrifuge rack ved 4 ° C i op til 24 timer, hvis ikke imaging straks efter farvning.
  6. Billeddannelse af ORO-farvede orme
    1. Bruge en farve-habil kamera til billede ORO-farvede orme.
    2. Brug 5 X forstørrelse til at afbilde flere orme i én synsfelt.
    3. Skifte til 10 X forstørrelse for bedre behandling af individuelle orme.
    4. Eksportere billeder i TIF format til at undgå datatab på grund af kompression.
      Bemærk: Hvis farvning med ORO + DAPI, Skift den farve-habil kamera til en, der kan optage fluorescens.
  7. Billedanalyse af ORO-farvede orme
    1. Uploade micrograph(s) at ImageJ. I rullemenuen Plugins brug funktionen Bio-formater hvis billedfilen ikke er genkendt.
    2. I billedet bruge pull-down menuen under funktionen stakke billeder til stakken til at oprette en billedstak sammenlignet flere micrographs.
    3. Justere lysstyrke/kontrast under samme pull-down menuen til at forbedre synligheden af lipid dråber.
    4. Kategorisere billeder ifølge lipid ophobning i hele dyrets krop eller i bestemte væv.
    5. For bedre evaluering af lipid lokalisering og identifikation af uspecifik billede artefakter ved hjælp af ImageJ, Vælg funktionen farve under billedet pull-down menuen og klik på Stack til RGB viser signaler af hver RGB-komponent.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SKN-1 er en bZip, cytoprotective transkriptionsfaktor, der deler homologi med pattedyr NRF2 og har vist sig at mægle fedtsyre oxidation. Afhængigt af koncentrationen af glukose i deres kost viser orme med en constitutively aktiveret skn-1 allel forskellige lipidniveauer når farves med Nilen rød7. Figur 1A -C viser aktiverede skn-1 dyr udsættes for forhold, der fører til stigende lipidniveauer. NR fluorescens fanget ved hjælp af et FITC/NGL kanal er fremtrædende langs tarmen, men er svagere i hoved, hale og intestinal lumen. Som lipidniveauer øge, er diskrete NR-farvede partikler mere vanskeligt at skelne, som kan nødvendiggøre lavere eksponering gange. Selvom denne metode bruger fluorescens intensitet som en kvantitativ proxy for lipid ophobning, det er utilstrækkelig på skelne uspecifik farvning af cellulære strukturer, der ikke er fedt butikker og er tilbøjelig til at signalere indblanding fra tarm auto fluorescens. Derfor, alternative etiket og udenmærket metoder skal anvendes parallelt til utvetydigt kvantificere neutral lipider i den animalske10.

Aldersbetinget somatiske nedbrydningen af fedt (Asdf), er en fænotype, der opstår i alderen orme hvorved dyrene vise faldt somatisk lipider, mens kønscelle lipider forbliver uændret6. Olie røde O farvning er ikke en metode, der pålideligt kvantificerer lipidniveauer, men er fremragende til at visualisere lipid lokalisering og er nyttig til bestemmelse af fedt udtynding fænotyper som Asdf i ormen. Mens det er let at kategorisere orme ifølge tilstedeværelsen eller fraværet af Asdf, kan det være vanskeligt at identificere dyr med mellemliggende fedttab (figur 2A). I forhold til ikke-Asdf dyr, der udviser lyse røde pletter over hele kroppen med få gennemsigtige områder (figur 2B), udviser Asdf orme mærkbar fedt iltsvind i tarmcellerne (figur 2 c). Dyr ved at udvikle Asdf (figur 2D) ofte vise gennemskinnelige steder hvor de fleste fedt tab i sidste ende opstår. Asdf orme kan desuden stadig har lyse røde pletter i regionerne hoved og hale, fordi fænotype ikke er defineret ved komplet somatiske fedttab, men ved omfattende fedt udtynding i forhold til ikke-alderen (ikke-Asdf) dyr. Brug af olie røde O farvning, således giver mulighed for kvalitativ bestemmelse af lipid lokalisering og kortlægning af fænotyper, der væsentligt ændre fedtdepoter i ormen.

Figure 1
Figur 1: farvning af lipider ved Nilen red. Nile rød farvning af aktiveret skn-1 mutanter under betingelser, der fremkalde øget lipid ophobning (A-C). Gevinst på funktion skn-1 stamme (lax188) havne en E237K aminosyre substitution, der gengiver SKN-1 constitutively aktive. L4-fase orme blev udsat for 0, 15 og 30 J/m2 UV-lys efterfulgt af en 12-h restitutionsperiode på unseeded NGM plader før NR-farvning og billedbehandling. Billeder vist er repræsentative for fænotype. Lipid kvantificering blev udført som nævnt i afsnit 1.7. Brand er en ImageJ look up table (LUT) bruges til at oprette en termisk billede, der viser fluorescens intensitet forskelle mellem billeder. Flet viser FITC/normal god landbrugspraksis og DIC billeder kombineres. Kvantificering af fluorescens intensitet for hvert billede vises i bunden af billedet montage. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: farvning af lipider af olie røde O. Olie røde O farvning af aktiveret skn-1 mutanter (lax188) viser tilstedeværelse eller fravær af Asdf fænotype (A-D). A & D Vis dyr med mellemliggende Asdf fænotyper. B & C vise modsatte ORO-farvning. Mens B er ikke-Asdf, viser C betydelig somatiske fedt udtynding med ledsagende stigning i kønscelleoverførsel fedtophobning, som definerer Asdf fænotype. Ormene blev farves med ORO efterfulgt af imaging 144 hafter L1-synkroniseret dyr blev placeret på NGM media seedede med OP50 bakterier. Billeder vist er repræsentative for dyr, med eller uden Asdf fænotype. Inset tegnefilm er ændret fra Lynn, et al. 6 og repræsenterer fravær (B) eller tilstedeværelse (C) af somatiske fedt udtynding. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Stigningen i fedme og metaboliske sygdomme priser gør C. elegans en passende model til at studere de mekanismer, der regulerer fedt ophobning i celler og væv. Seneste tyder på, at ændringer i lipidniveauer er korreleret med cellulære processer lige fra insulin signalering8, aktivering af hormonet receptorer2, at formeringsevnen5. I forhold til etiket-fri mikroskopi og kromatografi metoder, Nile rød og olie røde O er relativt billig farvestoffer anvendes til at plette neutral lipider i ormen konsekvent og reproducerbar10,12,13. Først giver mulighed for kvantificering af samlede lipidniveauer, mens andet fremmer evalueringen af lipid fordeling blandt væv som hypodermis, tarmen og germinallinjen. Når det bruges sammen, aktiverer NR og ORO forskere til at bestemme hvordan genotype og miljøforandringer påvirker lipid ophobning og hvor i ormen ændringerne opstår.

Disse farvestoffer, dog vurderer ikke direkte lipid ophobning i samme ikke-invasiv måde som gør biler mikroskopi12. Derfor, de er tilbøjelige til at fejl under fiksering og farvning, der kan kompromittere måling nøjagtighed13. Derudover disse farvestoffer kan uforvarende interagere med lipofuscin og tarm granulat, hvilket resulterer i fluorescens relateret til intracellulære neutral fedt gemmer10,14. Desuden, i tilfælde hvor lipidniveauer vises lav, NR og ORO kan ikke farvning skelne hvis resultatet skyldes permeabilitet spørgsmål eller nedsat fedtophobning. Derudover kræver følsomheden af disse pletter til lys særlige foranstaltninger under oplagring og aktive håndtering at begrænse nedbrydning og foto blegning. Men hvis forsigtig når udføre og drage konklusioner fra etiket-baserede assays, NR og ORO farvning er fremragende middel til fremad genetiske skærme til at studere lipid metabolisme veje og undersøge deres vekselvirkninger med andre fysiologiske funktioner. Brugen af daf-2 og fedt-6 orme anbefales at foretage relative sammenligninger af øget og nedsat lipid ophobning, henholdsvis. Vask og fikserer trin for NR og ORO farvning er ens. Derfor kan både udføres på den samme dag. Kun diasene med ORO-farvede orme kan dog opbevares i imaging senere fordi NR farvning er inkonsekvente efter 6 h. Under vask er det kritisk at medtage Triton 100-X ikke blot at forbedre permeabilitet til NN og ORO, men også at undgå orm tab på grund af overdreven overholdelse af plasticware. Derudover bør ormene vasket mindre end 30 min før farvning for at sikre maksimal permeabilitet til hver plet. Mens NR og ORO inkuberingstider kan nedsættes til 1 timer og 30 min, henholdsvis, opfordres det til at følge den tid, der er foreslået i denne artikel for mere konsekvent farvning og imaging resultater. Langvarig udsættelse af NN løsning for lys og manglende evne til at filtrere ORO løsning før brug vil øge baggrunden fluorescens under imaging. Udfører disse farvningsprotokoller kræver 3-4 h ud over imaging tid. Selvom pletten inkubation tilbud på højst 2 h af pause mellem trin, anbefales det kraftigt, at protokollerne, der gennemføres med så få afbrydelser som muligt for at reducere de iboende til alle dye-baseret metoder af lipid kvantificering mange fejlkilder og undersøgelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev muliggjort af NIH grant: R01GM109028 (S.P.C.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Imager.M2m Microscope Zeiss n/a Fluorescence microscope
ERC5s camera Axiocam n/a Color-capable
MRm camera Axiocam n/a Fluorescence-capable
Nile red Thermo Fisher N1142 Lipid Stain
Oil red O Alfa Aesar A12989 Lipid Stain
DAPI Thermo Fisher D1306 DNA stain
Isopropyl Alcohol BDH BDH1133-1LP Fixative solution
0.2 µm seterile syringe filter VWR 28145-477 Cellulose acetate filter
Centrifuge 5430 Eppendorf 5428000015 Centrifuge
Shaker Rotisserie Lab Quake 400110Q Shaker
Tube Rotator VWR 10136-084 Rotator
K2HPO4 Sigma-Aldrich 7758-11-4 NGM
KH2PO4 Sigma-Aldrich 7778-77-0 NGM
MgSO4 Alfa Aesar 7786-30-3 NGM
CaCl2 Sigma-Aldrich 10035-04-8 NGM
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5 NGM
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5 NGM
Peptone BD Biosciences 211677 NGM
Agar Teknova L9110 NGM
LB media Sigma-Aldrich L3147 Bacterial growth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, (3), 965-973 (1985).
  2. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. J Cell Sci. 122, (6), 749-752 (2009).
  3. Horobin, R. W., Kiernan, J. A. Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. BIOS Scientific Publishers. (2002).
  4. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angew Chem Int Edit. 50, (21), 4774-4807 (2011).
  5. Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis. Cell Rep. 9, (6), 2180-2191 (2014).
  6. Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans. P Natl Acad Sci USA. 112, (50), 15378-15383 (2015).
  7. Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation. Nat Commun. 5, (2014).
  8. Saltiel, A. R., Kahn, C. R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature. 414, (6865), 799-806 (2001).
  9. Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans. Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).
  10. Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PloS One. 5, (9), e12810 (2010).
  11. Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 14, (1), 164 (2013).
  12. Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr Opin Genet Dev. 21, (5), 585-590 (2011).
  13. Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (73), (2013).
  14. O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10, (5), 430-435 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics