Rekombinante Kollagen Modell I Peptid-Microcarriers für Zelle Expansion und ihre mögliche Verwendung als Zelle-Delivery-System in einem Bioreaktor

Bioengineering

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Summary

Wir schlagen eine Zelle Erweiterung Protokoll über makroporöse Microcarriers und deren Verwendung als Delivery-System in einem Bioreaktor Perfusion eine decellularized Gewebe-Matrix zu säen. Wir gehören auch verschiedene Techniken um Zellproliferation und Lebensfähigkeit der Zellen kultiviert auf Microcarriers zu bestimmen. Darüber hinaus zeigen wir die Funktionalität der Zellen nach Bioreaktor Kulturen.

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Suarez Muñoz, M., Confalonieri, D., Walles, H., van Dongen, E. M., Dandekar, G. Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model. J. Vis. Exp. (132), e57363, doi:10.3791/57363 (2018).

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Abstract

Gewebe-Engineering ist ein vielversprechendes Feld, konzentrierte sich auf die Entwicklung von Lösungen für die steigende Nachfrage auf Gewebe und Organe zur Transplantationszwecke. Der Prozess um solche Gewebe zu generieren ist komplex und beinhaltet eine geeignete Kombination von bestimmten Zelltypen, Gerüste und körperliche oder biochemische Reize, Zellwachstum und Differenzierung zu führen. Microcarriers stellen eine ansprechende Werkzeug, Zellen in eine dreidimensionale (3D) Mikroumgebung zu erweitern, da sie höhere Oberfläche-Volumen-Verhältnis bieten und die in-Vivo -Situation im Vergleich zu herkömmlichen zweidimensionalen Methoden genauer zu imitieren. Das Gefäßsystem, liefert Sauerstoff und Nährstoffe zu den Zellen und die Gewährleistung der Abfallentsorgung, stellt einen wichtigen Baustein bei der Erzeugung von Geweben entwickelt. In der Tat fallen die meisten Konstrukte nach aufgrund fehlender vaskulären Unterstützung implantiert. In dieser Studie stellen wir ein Protokoll für die Endothelzellen Expansion auf rekombinante Kollagen-basierten Microcarriers unter dynamischen Bedingungen in Spinner Kolben und Bioreaktoren, und wir erklären, wie man in dieser Einstellung Zellviabilität und Funktionalität bestimmen. Darüber hinaus schlagen wir eine Methode für die Zelle Lieferung Vaskularisierung Zwecken ohne zusätzliche Ablösung Schritte notwendig. Darüber hinaus bieten wir eine Strategie, um die Zelle Vaskularisierung Potenzial in einem Bioreaktor Perfusion auf eine decellularized biologische Matrix bewerten. Wir glauben, dass die Nutzung der vorgestellten Methoden zur Entwicklung neuer zellbasierte Therapien für eine Vielzahl von Tissue engineering-Anwendungen in der klinischen Praxis führen könnte.

Introduction

Ein generelles Problem in Gewebe-engineering-Anwendungen ist eine hohe Zellmasse mit dem richtigen Differenzierung Phänotyp an der Stelle des weichen müssen. Die Anwendung des Microcarriers zur Behebung dieses Problems begann 1967 mit zunehmender Bedeutung bis heute in den Bereichen orthopädische Gewebetechnik für groß angelegte Generation von Haut, Knochen, Knorpel und Sehnen1. Sie ermöglichen das Handling von anhaftenden Kulturen in Hinsicht ähnelt der Aussetzung Cultures2 durch den Ausbau der Zellen auf Microscale dreidimensionale (3D) Substraten. Dabei erleben die Zellen eine homogene Nährstoffversorgung und Zelle-Matrix Interaktionen, dass Blei, bessere Wartung der in Vivo3,4 Differenzierung, die oft verloren im Laufe der Zeit in 2D5nähert. Eine höhere Oberflächen-Volumen-Verhältnis - führt schließlich zu einer Zelle höhere Erträge6,7, höhere gas und Nährstoff Wechselkurse im Vergleich zu statischen Systemen8, die Möglichkeit zu regulieren und die Kultur nach körperlichen Reize9und das Potenzial für die Aufstockung der Erweiterung Prozess7 sind weitere Vorteile. Verschiedene Funktionen wie Durchmesser, Dichte, Porosität, Oberflächenladung und Adhäsion Eigenschaften10,11 unterscheiden die verschiedenen im Handel erhältlichen Mikro - und Makro-Träger. Einer der wichtigsten Vorteile ist jedoch deren Potenzial als Microtissues Zustellung an Seite defekt oder Nachfrage.

Für Anwendungen der Microcarrier Technologie im Knochen Tissue Engineering, illustriert wir in einem früheren Bericht12 die Produktion der neuen Microcarrier Typ konstituiert eine rekombinante Kollagen ich Peptid (RCP, als Cellnest im Handel erhältlich). Diese neue Microcarrier ermöglicht die GMP-gerechte, Skalierung von Gerüst und Zelle Produktion Bedarf für die Zelle Lieferung in einem klinischen Szenario. In diesem Zusammenhang ermöglicht tuning Gerüst Stabilität, Abbaurate und Oberflächeneigenschaften durch geeignete Wahl einer geeignet Vernetzung Strategie anzupassen, die Technik, um die ausgewählte Anwendung, Zelltyp von Interesse oder gezielt Gewebe13. Vor allem macht der mögliche Einsatz von dieser Microcarrier als eine injizierbare Zelle Liefersystem für therapeutische Anwendung14 sie besonders interessant in einem klinischen Umfeld.

In diesem Beitrag zeigen wir daher die Kultivierung Verfahren zur Isolierung und Erweiterung der menschlichen Knochenmark stammenden mesenchymaler Stromazellen Zellen (hBMSCs) und menschlichen dermalen mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMECs) auf Kollagen-ich-basierten rekombinante Peptid-basierte Microcarriers und deren Vorbereitung für die Lieferung in einem klinischen Umfeld. Darüber hinaus beschreiben wir Zusatzprotokolle nützlich für die Aufrechterhaltung der Zellviabilität nach Implantation.

Zellviabilität nach der Implantation ist in der Tat stark abhängig von Vaskularisierung15,16,17, der Austausch von Sauerstoff und Nährstoffen gewährleistet und erleichtert die Entsorgung. Bioreaktoren sind ein Ansatz um Vaskularisierung meistern in Gewebe-Engineering und pflegen Zellviabilität durch Perfusion Kulturmedium bietet dabei Sauerstoff und Nährstoffe18. Hier zeigen wir eine in-vitro- Methode zur Bewertung der Migration Fähigkeit mikrovaskuläre Endothelzellen aus der RCP-Microcarriers zu einem Biomatrix und ihre Fähigkeit, de Novo Vaskularisierung und Angiogenese beizutragen. Diese Biomatrix ist ein decellularized Segment des porcinen Jejunum bezeichnet BioVaSc (biologische durchblutet Gerüst), reich an Kollagen und Elastin und vaskulären Strukturen, einschließlich Fütterung Arterie und eine drainierende Vene19 , die wurde mit bewahrt Einnistung Fragen20beantragt.

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Protocol

hBMSCs waren von der Femur-Leiter der Arthrose-Patienten, die eine Oberschenkel-Kopf TEP isoliert. Das Verfahren wurde unter die Zustimmung der lokalen Ethikkommission der Universität Würzburg und Einwilligung der Patienten durchgeführt. Primäre mikrovaskuläre Endothelzellen waren von Vorhaut Biopsien der juvenilen Spender isoliert. Ihre gesetzlichen Vertreter(n) vorgesehen vollen informierte Zustimmung in schriftlicher Form. Die Studie wurde von der lokalen ethischen Verwaltungsrat der Universität Würzburg (Abstimmung 182/10) genehmigt.

1. Isolierung von hBMSCs und HDMECs

  1. Menschlichen Knochenmark stammenden mesenchymaler Stromazellen Zellen (hBMSCs)
    1. Entfernen Sie Spongiosa aus dem Oberschenkelknochen Kopf mithilfe eines sterilen Löffels.
      Hinweis: Die Spongiosa erscheint als eine lose und körnige Substanz im Inneren der Kortikalis, die hart und steif ist. Es kann Kratzer Teile des spongiösen Knochens aus dem kortikalen Knochen erforderlich mit einem Skalpell.
    2. Legen Sie die entfernten Spongiosa in zwei 50 mL Röhrchen. Das Volumen des spongiösen Knochens variiert von 5 bis 10 mL je nach Größe des entfernten Femur Kopfes während der Hüftoperation.
    3. Waschen mit DMEM-F12 (1:1 Mischung von DMEM und Schinken F12 Medium), füllt das Rohr mit ca. 30 mL des Mediums.
    4. Schütteln Sie das Rohr manuell, gewissermaßen längs für 5 s, Fettzellen aus der Spongiosa zu lassen. Zentrifuge bei 300 X g und 22 ° C für 5 Minuten.
    5. Mit einer abgestuften Kunststoff-Pipette, die Fettzellen Schicht und ca. 20 mL der restlichen überstand Aspirieren. Lassen Sie genügend Mittel zur Deckung der Spongiosa.
    6. Füllen Sie die Rohre mit 10 ml DMEM-F12 und längs mit der Hand, für 10-15 s, die Zellen lassen sich schütteln Sie kräftig.
    7. Übertragen Sie 10-15 mL Zellsuspension mit einer abgestuften Kunststoff Pipette aus den Rohren auf eine neue 50 mL Tube.
    8. Wiederholen Sie ab Schritt 1.1.6 Zusammenlegung der erhaltenen Zellsuspension, bis die Spongiosa gesammelt in der 50 mL Tube weiß ist 2-3 Mal.
    9. Übertragen Sie die Zellsuspension mit einer abgestuften Kunststoff Pipette auf zwei neue Röhren, Absaugen der Kollagen-Pellets lagern sich auf den Boden der 50 mL Röhrchen zu vermeiden.
    10. Zentrifuge die Zellsuspension bei 300 X g und 22 ° C für 5 min. verwerfen den Überstand durch mit einer abgestuften Kunststoff Pipette absaugen.
    11. 40 mL DMEM-F12 10 % FCS 1 % Pen/Strep 50 µg/mL Ascorbat-2-Phosphat in einer dritten Röhre hinzugeben. Übertragen Sie 5 mL dieses Mediums auf jedes Röhrchen enthält die Zelle Pellet. Wieder aussetzen Sie der Zelle Pellets durch den Boden der Röhrchen kräftig flackern und übertragen Sie die Zellsuspensionen auf das Röhrchen mit nur Medium.
    12. OPTIONAL: Verdünnen Sie 100 µL Zellen Aufhängung für Zellzählung, Verdünnung 1: erste 100 mit PBS und dann 01:10 in Trypan blau, indem 15 µL der ersten Verdünnung zu 15 µL des DPBS und 30 µL Trypan blau, um ein DPBS zu erhalten: Trypan blau-Verhältnis von 1:1. Zählen Sie die Zellen mit einer standard Neubauer-Kammer.
    13. Samen der Zellen bei 109 Zellen/175 cm2 T-Kolben in 25 mL Medium wie in 1.1.11 beschrieben. Alternativ, teilen Sie die ganze Zellsuspension in bis zu zehn 175 cm2 Zellkulturflaschen nicht mitgerechnet. In diesem Stadium sind hBMSCs nicht zu unterscheiden von der Erythrozyten, die stark sie zahlenmäßig überlegen. hBMSCs erscheint als spärlich Kolonien (1-2/Kolben) im Laufe der ersten 7 Tage.
    14. Ändern Sie Medium nach 4 Tagen von der Saat zur Interaktion der Blutzellen mit den hBMSCs zu ermöglichen. Nach der ersten Datenträgeraustausch ändern Sie das Medium alle 2-3 Tage. Führen Sie den Datenträgeraustausch indem das Kulturmedium mit einer abgestuften Kunststoff Pipette vollständig zu entfernen, waschen zweimal mit DPBS (von adhärenten Zellen 10 mL des DPBS hinzufügen und entfernen vollständig DPBS mit einer abgestuften Kunststoff Pipette) und anschließend 20 mL frisches Medium, wie beschrieben in 1.1.11.
  2. Menschlichen dermalen mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMECs)
    1. Behandeln Sie die Hautbiopsien und isolieren Sie der HDMECs gemäß zuvor veröffentlichten Protokolle21. Kurz nach der Trennung der Dermis von Epidermis, inkubieren Sie Dermis in Trypsin für 40 min bei 37 ° C und 5 % CO2. Nach Inkubationszeit die Dermis auf einer Petrischale mit Nährmedium übertragen, und jedes Stück mit einem Skalpell zu kratzen. Übertragen der erhaltenen Zellsuspension auf eine 50 mL Kunststoffrohr und Zentrifuge für 5 min bei 300 x g und 22 ° C. Zählen Sie die Zellsuspension mit einem Neubauer Kammer und Saatgut bei einer Dichte von 1,2 x 104 Zellen/cm2. Verändern Sie das Medium vollständig täglich.

2. Aufbau und Entkeimung von Spinner Fläschchen, RCP Microcarriers und Bioreaktor

  1. Spinner-Fläschchen und RCP microcarriers
    1. Einen Tag vor den Experimenten, Aufbau der Spinner Fläschchen und bereiten sie für die Sterilisation von Autoklaven.
      Hinweis: Lassen Sie die Kappen der Spinner Kolben locker und wenn möglich, Sterilisieren sie in aufrechter Position.
      1. Wickeln Sie die Spinner-Fläschchen mit Alu-Folie um die Seitenkappen getrennt zur Vermeidung von Kontamination während Auspacken. Wickeln Sie die Fläschchen mit 1-2 Schichten Aluminiumfolie für Autoklavieren um Kontaminationsrisiken nach der Sterilisation zu minimieren.
    2. Wiegen Sie die erforderliche Menge an RCP makroporösen Microcarriers in 20 mL des DPBS.
      Hinweis: 30 mg ist erforderlich pro Spinner Kolben. Lassen Sie sie für mindestens 1 h vor der Sterilisation durch Hitze von Autoklaven (121 ° C für 15 min)-Hydrat.
  2. Perfusion Bioreaktor
    1. Verwenden Sie das beschriebene vaskularisierte Gewebe äquivalente20produzieren Bioreaktorsystem. Dieser Bioreaktor besteht aus einem Gefäß, in dem die Biomatrix befindet, einem Mediumspeicher und einer Druckflasche.
      1. Verbinden Sie das Schiff mit der Mediumspeicher und der Druckflasche durch Silikon-Schläuche (siehe Abbildung 3). Verlassen Sie die Kappen lose und legen Sie sie in eine Plastiktüte Autoklaven, verschließen Sie gut und platzieren Sie diese in einem zweiten Autoklaven Plastikbeutel. Von Autoklaven sterilisieren.

3. Kultur der hBMSCs und HDMECs auf RCP makroporösen microcarriers

Hinweis: Die HDMECs verwendet, um die RCP Microcarriers Samen wurden von Lentivirale Transduktion mit RFP bezeichnet. Dieses Protokoll wurde nach einer zuvor veröffentlichten Protokoll Nr.5geändert.

  1. Lassen Sie die RCP makroporösen Microcarriers auf den Boden absetzen und waschen Sie sie mit 10 mL Kulturmedium. Wiederholen Sie 3 Mal.
  2. Spinner-Fläschchen mit 10 mL Kulturmedium zu waschen.
  3. 30 mg von RCP makroporösen Microcarriers pro Flasche Spinner in 8 mL Kulturmedium hinzufügen. Equilibrate der Spinner-Fläschchen mit der RCP-Microcarriers bei 37 ° C und 5 % CO2 für 30 min vor der Aussaat der Zellen.
    Hinweis: Dies basiert auf ungefähre Trockengewicht von RCP Microcarriers vor der Sterilisation.
  4. Samen 5 x 105 hBMSCs oder HDMECs (Abschnitt 3) pro Spinner Kolben in 2 mL Kulturmedium.
  5. Legen Sie die Spinner-Kolben auf die Rührer Platte und Start Rühren bei 90 u/min für 5 min und 55 min bei 37 ° C und 5 % CO2, für eine Gesamtmenge von 1 h statisch/dynamisch Inkubationszeit ruhen lassen. Wiederholen Sie 4 Mal.
  6. Fügen Sie 10 mL Zellkulturmedium pro Spinner Kolben und starten Sie dann kontinuierliche Rühren bei 95 Umdrehungen pro Minute. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2.
  7. Mit dem Einsatz von einer Mikropipette Proben nehmen an den Tagen 1, 4 und 7:333 µL DNA-Inhalt (~ 0,5 mg), 1000 µL für SEM-Analyse (~ 1,5 mg) und 333 µL für lebenden/Toten Färbung (~ 0,5 mg).
    Hinweis: Dies basiert auf ungefähre Trockengewicht von RCP Microcarriers vor der Sterilisation.
  8. 10 mL Kulturmedium jeden zweiten Tag zu ändern. Dafür warten Sie, bis die RCP-Microcarriers nach unten zu Regeln und sehr sorgfältig 10 mL aus der Flasche Spinner, mit dem Einsatz von einem 10 mL-Pipette Aspirieren, und fügen Sie dann 10 mL frisches Nährmedium.
  9. Halten Sie die Kulturen auf die Rührer Platte 95 u/min, bei 37 ° C und 5 % CO2 für 7 Tage festgesetzt.

4. DNA-Gehalt, SEM Analyse Leben tot Färbung und sprießen assay

  1. DNA-Gehalt
    1. Mit dem Einsatz einer Mikropipette sammeln Sie ca. 0,5 mg Microcarriers von jedem Spinner Kolben (enthalten in 333 µL der Suspension) und Transfer zu einer 2 ml-Kunststofftube.
      Hinweis: Dies basiert auf ungefähre Trockengewicht von RCP Microcarriers vor der Sterilisation.
    2. Einmal mit 1 mL des DPBS waschen Sie, dann aspirieren Sie überstand.
    3. Entfernen Sie verbleibende DPBS in ein Gefriertrockner und Gewicht der gefriergetrockneten Microcarriers für spätere Normalisierung.
    4. Proben bei-80 ° C für mindestens 6 Stunden Einfrieren.
    5. Inkubieren Sie Proben bei 60 ° C über Nacht mit 300 µL Papain 5 U/mL.
    6. Schaffen die entsprechenden Titrierung Kurven den Anweisungen des Herstellers des Quantifizierung Assays (z.B. PicoGreen DsDNA-Assay) kit und führen Sie die Messung das Fluoreszenzsignal bei 520 nm mit einem Lumineszenz-Detektor.
  2. Scannen von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Analyse
    1. Sammeln Sie ca. 1 mg Microcarriers von jedem Spinner Kolben und Transfer zu einer 2 mL-Kunststofftube.
    2. Waschen Sie Microcarriers einmal mit 1 mL des DPBS.
    3. DPBS zu entfernen und in 1 mL 70 % igem Ethanol für 1 h inkubieren.
    4. Überstand zu entfernen und in 1 mL 80 % Ethanol 1 h inkubieren.
    5. Überstand zu entfernen und in 1 mL Ethanol 90 % für 1 h inkubieren.
    6. Überstand zu entfernen und in 1 mL 100 % Ethanol 1 h inkubieren.
    7. Überstand zu entfernen und in 1 mL Hexamethyldisilazane für 10 min inkubieren.
    8. Öffnen Sie den Verschluss und lassen Sie die Proben über Nacht trocknen unter eine chemische Haube.
    9. Beheben von Proben auf angemessene Unterstützung und fahren Sie mit SEM-Analyse nach etablierte Protokolle.
  3. DAPI und Live/Dead Färbung
    1. Am Tag 2, 4 und 7 nach der Aussaat auf die Microcarriers Zelle sammeln Sie 0,5 mg Microcarriers von jedem Spinner Kolben und Transfer zu einer 2 mL-Kunststofftube. Einmal waschen Sie, mit 1 mL des DPBS.
    2. DAPI
      1. Beheben Sie Proben für 10 min in genügend 4 % Paraformaldehyd, sie bedecken.
      2. Einmal waschen Sie, mit 1 mL des DPBS.
      3. Inkubation bei Raumtemperatur mit der Färbelösung für 45 min auf einen rockigen Shaker.
      4. DAPI Fluoreszenzsignal auf dem Fluoreszenzmikroskop mit 420 nm Emission Filter erkennen und Abrufen von Bildern.
    3. Lebenden/Toten Färbung
      1. Inkubieren Sie Proben in 500 µL Live/Dead Farbstofflösung. Halten Sie die Proben bei 37 ° C für 20 min, vor Licht geschützt werden.
      2. Einmal waschen Sie, mit 1 mL des DPBS.
      3. Fluoreszenzsignal lebender Zellen mit einem 490 nm Emission Filter und von abgestorbenen Zellen mit einem 545 nm Emission Filter auf dem Fluoreszenzmikroskop zu erkennen. Bilder zu erwerben.
    4. Sprießen Assay für HDMECs
      1. Mix 330 µL Kollagen R Lösung um 0,4 %, 170 µL 0.1 % Essigsäure und 50 µL des mittleren M199 in 15 mL Kunststoffhülse. Halten Sie auf dem Eis.
      2. Nehmen Sie ~0.375 mg Microcarriers (250 µL) mit dem Einsatz von einer Mikropipette. Übertragen auf ein Kunststoffrohr 1,5 mL, warten auf die RCP-Microcarriers nach unten und entfernen das Medium vollständig.
        Hinweis: Dies basiert auf ungefähre Trockengewicht von RCP Microcarriers vor der Sterilisation.
      3. Fügen Sie das Volumen der NaOH 0,2 N erforderlich, um das Kollagen-Gemisch zu neutralisieren und mischen Sie es sofort mit der RCP-Microcarriers.
        Hinweis: Bestimmen Sie die erforderliche Menge an NaOH 0,2 N im Voraus, indem es zu der Mischung bis Änderung des pH-Wertes (wiederum von gelb bis rosa), und setzen dann die Mischung in den Inkubator für 1 min, nach denen eine Gel gebildet werden muss.
      4. Platte die Kollagen Gel-RCP Microcarriers Mischung in einen Brunnen von einer 24-Well-Platte. Bei 37 ° C und 5 % CO2 für 30 min inkubieren.
      5. Fügen Sie 200 µL des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (z.B. VascuLife VEGF-Mv Nährmedium). Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 24 h.
      6. Unter eine umgekehrte Phase Kontrast Mikroskop, mit einem 10-fach Vergrößerung Objekt beobachten und Abrufen von Bildern.

5. Biomatrix seeding und Beginn der Bioreaktorsystem für HDMECs

  1. Einen Tag vor dem Bioreaktor Starterkulturen, offene BioVaSc (Biomatrix) Längsrichtung auf der antimesenteric Seite geschnitten und in einem zuvor desinfizierte Polycarbonat-Rahmen befestigen (siehe Abb. 3A, B).
    Hinweis: Die BioVaSc ist eine Biomatrix erhalten aus einem decellularized porcinen Jejunal-Segment, als zuvor veröffentlichten21vorbereitet.
    Hinweis: da der Polycarbonat-Rahmen nicht werden, durch Hitze sterilisiert kann, desinfizieren sie durch 20 min Inkubation in sonic Bad (40 kHz), gefolgt von 3 Mal Inkubation in Ethanol 70 % für 25 min. Dann waschen Sie den Rahmen 3 Mal mit DPBS steril.
    1. Platzieren Sie das Biomatrix-Frame-System in einem 100 mm Petrischale und füllen Sie ihn mit den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor + 1 % Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep).
    2. Equilibrate der Biomatrix durch Inkubation über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2.
  2. Spritzen Sie nach abnehmen und die Zellen zählen 10 x 107 HDMECs in 1000 µL Kulturmedium durch das erhaltene Gefäßsystem der Biomatrix mit dem Einsatz einer 2 mL Spritze.
    Hinweis: Spritzen Sie ~ 700 µL über den arteriellen Zulauf und ~ 300 µL durch die Vene Auslass.
  3. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 3 h um Zellhaftung zu ermöglichen.
  4. Füllen Sie das Bioreaktorsystem mit 350 mL des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor + 1 % Pen/Strep und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2.
  5. Setzen Sie den Rahmen im Innern des Behälters des Bioreaktors. Schließen Sie die arterielle und venöse Wirbelsäulenversteifung an das Schiff.
  6. Verbinden Sie die Bioreaktorsystem mit einer peristaltischen Pumpe zunächst Perfusion. Stellen Sie den Druck auf 10 MmHg und Amplitude ±1.
  7. Erhöhen Sie den Druck schrittweise jede Stunde bis 100 MmHg Druck, Amplitude ±20 zu erreichen.
  8. Halten Sie die Bioreaktorsystem für 7 Tage unter diesen Bedingungen bei 37 ° C und 5 % CO2.

6. Zusatz von RFP-HDMECs um die biomatrix

  1. Mischen Sie 330 µL 0,4 % Kollagen R Lösung, 170 µL 0.1 % Essigsäure und 50 µL des mittleren M199 in einem 15 mL Falcon-Röhrchen. Halten Sie auf dem Eis.
  2. Nehmen Sie die RCP-Microcarriers aus den Spinner-Kolben. Das Kulturmedium vollständig zu entfernen.
  3. Fügen Sie das Volumen der NaOH 0,2 N erforderlich, um das Kollagen-Gemisch zu neutralisieren und mischen Sie es sofort mit der RCP-Microcarriers.
  4. Fügen Sie die Kollagen-Gel-RCP-Microcarriers-Mischung auf das Lumen der Biomatrix. Gelierung für 30 min zu ermöglichen.
  5. Parallel, ändern das Medium des Bioreaktors durch das Medium vollständig entfernen und fügen Sie dann die 350 mL frisch, Pre erwärmt, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor + 1 % Pen/Strep.
  6. Schließen Sie des Bioreaktors der peristaltischen Pumpe an und der Druck bei 100 MmHg und Amplitude ±20 einrichten.
  7. Verändern Sie alle 7 Tage das Medium.
  8. Halten Sie den Bioreaktor in Kultur für 21 Tage.

7. Analyse und Auslesen der Bioreaktor Kulturen

  1. Vorbereitung der Proben
    1. Der Bioreaktor trennen Sie die Biomatrix und entfernen Sie es aus dem Polycarbonat.
    2. Schneiden Sie das erhaltene Stück in 6 Abschnitte: 2 für MTT, 2 für Paraffin einbetten/Färbung und 2 für SEM-Analyse.
  2. Paraffin einbetten
    1. Legen Sie die Abschnitte in einer Petrischale und waschen mit genügend DPBS um sie zu bedecken. Entsorgen Sie die DPBS.
    2. Befestigen Sie die Abschnitte in 4 % Paraformaldehyd über Nacht.
    3. Bereiten Sie die Kassetten für die Einbettung von Paraffin und führen Sie es nach standard-Protokolle.
    4. Bereiten Sie die Abschnitte in Paraffin-Blöcke und geschnitten Sie Proben von 3 µm für H & E Färbung, die mit einem Mikrotom.
  3. H & E Färbung
    1. Führen Sie eingeweichtes Abschnitte nach Standardprotokollen32zu Flecken.
  4. Scannen von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Analyse
    1. Legen Sie die Abschnitte in einer Petrischale und waschen mit genügend DPBS um sie zu bedecken. Entsorgen Sie die DPBS.
    2. Befestigen Sie die Abschnitte mit 4,75 % Glutaraldehyd über Nacht.
    3. Führen Sie Dehydratisierung-Kette mit steigenden Konzentrationen von Ethanol 50 % - 100 %.
    4. Sollte in den Kapiteln mit Hexamethyldisilazane (HMDS) für 10 min. verwerfen die verwendeten HMD und frische HMDS hinzufügen.
    5. Die Abschnitte über Nacht trocknen unter Abzug erlauben, und dann die Proben für die Abbilderstellung vorbereiten.
  5. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-YL)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid (MTT)
    1. Mischen Sie das MTT-Reagenz mit den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, in einer Konzentration von 1 mg/mL.
    2. Inkubieren Sie die Abschnitte in der MTT-Lösung für 90 min bei 37 ° C und 5 % CO2.
    3. Beobachten Sie die vaskulären Strukturen und Zellen ausgesät Microcarriers makroskopisch oder unter dem Hellfeld Mikroskop, metabolisch aktive Zellen zu erkennen. Bilder zu erwerben.

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Representative Results

Wie in Abbildung 1Adargestellt, erhalten wir hohe Anzahl der lebensfähigen Zellen auf die RCP-Microcarriers nach 7 Tagen Kultur, ermittelt durch die lebenden/Toten Färbung. Diese Ergebnisse wurden durch SEM Analyse bestätigt in denen vollständig kolonisierten Microcarriers rund um die Poren, zum Teil überwuchert sie (Abbildung 1 b) beobachtet wurden. Auf der anderen Seite führte Experimente, in denen Zellen nicht gleichmäßig ausgesät wurden, mehrere leere Microcarriers. Fehlgeschlagene Experimente zeichnen sich durch eine ungewöhnlich hohe Zahl von toten Zellen, die nicht mehr als 10 % des gesamten Zelle (Abbildung 1). Darüber hinaus zeigten DNA Inhalt Quantifizierung der HDMECs eine Zunahme der DsDNA im Laufe der Zeit (Abbildung 1).

Darüber hinaus konnten RFP-HDMECs ihre Funktionalität nach Kultur auf RCP Microcarriers halten wie in Abbildung 2gezeigt, wo die Zellen einen sprießenden Phänotyp bei einem Kollagen-Gel kultiviert angenommen.

Darüber hinaus haben wir RFP-HDMECs-kolonisierten RCP Microcarriers das Lumen der Biomatrix BioVaSc neu aussäen. Dazu beschäftigten wir ein Bioreaktorsystem für physiologische Durchblutung der vaskularisierte Gewebe äquivalente22 (Abbildung 3) in dem wir aufgeschnittenen die Biomatrix und legte ihn in eine Polycarbonat-Rahmen, so dass das Lumen, in einem sogar Set-up ausgesetzt war ( Abb. 3 b).

Nach 21 Tagen der Bioreaktor Kulturen, metabolisch aktive Zellen waren beide auf das erhaltene Gefäßsystem der Biomatrix sowie auf die RCP-Microcarriers (Abb. 4A und Abb. 3 b). Fehlgeschlagene Experimente oder eine falsche Wahl der Scheiben während der histologischen Proben-Schnitt führt zu fehlender besiedeln endotheliale Zellen in das Lumen der Gefäße die Biomatrix oder auf die Microcarriers. Diese Ergebnisse konnten durch SEM Analyse der Biomatrix-Abschnitte, wo beobachtet werden konnte, dass einige Bereiche der RCP Microcarriers Zellen noch abgedeckt wurden und dass die RCP-Microcarriers in unmittelbarer Nähe der Biomatrix bestätigt werden (Abbildung 4 und ( 4D).

Zu guter Letzt bestätigt H & E Färbung das Vorhandensein von HDMECs auf die Biomatrix, speziell in der vaskulären Strukturen (Abb. 5A). Unter Fluoreszenzmikroskop betrachtet, entpuppte sich die Zellen besiedeln die vaskulären Strukturen der Biomatrix RFP-HDMECs (Abb. 5 b), unter Angabe der Migration der Zellen aus der RCP-Microcarriers auf die Biomatrix. Einige RFP-HDMECs wurden auch auf die RCP-Microcarriers (Abbildung 5 und 5D) beobachtet. In Experimenten, in denen Zellen aufgrund nicht überlebt haben veränderte Bedingungen (z. B. kürzere Kulturzeiten) Kultivierung, konnte sie nicht innerhalb der Gefäßstruktur mit keiner der bisher gemeldeten Techniken (Abb. 5E und 5F nachgewiesen werden ).

Figure 1
Abbildung 1: Kultur der HDMECs und hBMSCs auf RCP-Microcarriers. (A, C) lebenden/Toten Färbung nach 7 Tagen des dynamischen Kulturen. (B) SEM Analyse der HDMECs nach 7 Tagen des dynamischen Kulturen auf RCP Microcarriers kultiviert. (D) DNA Inhalt durch PicoGreen Assay Kit bestimmt. Daten ausgedrückt als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). Skalieren Sie Bars: 200 µm für A, b 88 µm und 100 µm für C. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: sprießende Assay. Sprossen des RFP-HDMECs können unter Hellfeld (A) und Fluoreszenz Mikroskopie (B), aus den kolonisierten RCP Microcarrier nach 24 Stunden der Kultur in einem Kollagen-Gel beobachtet werden. (C) Overlay-Bild. Skalieren Sie Bars: 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Biomatrix und Bioreaktor Set-up. (A) Vorbereitung der Biomatrix und Montage auf dem Polycarbonat-Rahmen (B). (C) Bioreaktor Set-up. Das Schiff an der Mediumspeicher und der Druckflasche durch Silikon Schläuche angeschlossen ist, und das ganze System mit einer peristaltischen Pumpe verbunden ist. Der Druck wird über einen Drucksensor gemessen. AI: arterielle Einlass; VO: venöse Anschluss. Diese Zahl wurde von gröber Et Al. modifiziert 22 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Bioreaktor auslesen. MTT-Assay durchgeführt auf einem Biomatrix-Abschnitt nach 21 Tagen der Kultur, in denen metabolisch aktive Zellen in der erhaltenen Gefäßsystem Biomatrix (A) sowie auf die RCP-Microcarriers (B)beobachtet wurden. (C, D) REM-Bilder von RCP Microcarriers auf einem Biomatrix-Abschnitt. Skalieren Sie Bars: 0,28 cm für A, 0,45 cm B 47 µm für C und 225 µm für D. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: H & E Färbung & Fluoreszenz Bilder. (A, C, E) H & E Färbung. (B, D, F) Nach 21 Tagen der Kultur wurden RFP-HDMECs in das Gefäßsystem der Biomatrix (Pfeile) sowie auf die RCP-Microcarriers (Pfeilspitzen) beobachtet. Skalieren Sie Bars: 50 µm für A-D und 30 µm für E und F. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Ein Hauptziel des Microcarrier ist der Ausbau der Zellen unter Beibehaltung ihrer Differenzierung um Zellen an die Notwendigkeit zu liefern. Die dargestellte Methode einzuführen RCP Microcarriers Zellen in der Lage zu befestigen, vermehren und besiedeln die Microcarriers mit hoher Zelldichte waren. Dies wurde von lebenden/Toten Färbung, beobachtet, in denen mehr als 90 % der lebensfähigen Zellen gefunden wurden, während nur wenige Tote Zellen nach 7 Tagen des dynamischen Kulturen gewonnen wurden. Ebenso bestätigt die REM-Bilder, dass die Zellen die gesamte Oberfläche der Microcarriers nach 7 Tagen der Kulturen bedeckt.

Um Zelle Überleben in 3D-Modellen zu gewährleisten, ist es wichtig, die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen zu den Zellen zu erhalten und Beseitigung von Abfallstoffen zu ermöglichen. Blutgefäße sind die Verantwortlichen Strukturen dieses Austausch-Prozesses, in dem endotheliale Zellen eine wichtige Rolle spielen, da sie die Zellen, die entlang des inneren Teil der Blutgefäße23sind. Sie haben die Fähigkeit zu vermehren, migrieren, haften, sprießen und Schiff-artige Strukturen24zu bilden. Diese Eigenschaften wurden nach Kultur des RFP-HDMECs auf die RCP-Microcarriers beibehalten, da es beobachtet wurde, dass die Zellen den sprießenden Phänotyp annehmen konnten (siehe Abbildung 2). Wir könnten hier beweisen, dass diese kolonisierten RCP Microcarriers effektiv primäre endotheliale Zellen um das Lumen der ehemalige Schiffe der BioVaSc Biomatrix wieder Samen liefern waren. Dies zeigt unser System zur Verbesserung der Vaskularisierung Gewebezüchtungen Implantate für klinische Anwendungen geeignet. Derivate dieser Matrix sind erfolgreich benutzt worden, in Vaskularisierung Ansätze25, sowie in in-vitro- Tumor Sytems21,26,27,28 testen und für die Produktion Haut-äquivalenten als Alternativen zu Tierversuchen29. Hier dient es abgeflacht in eine offene Einrichtung und platziert in einem Bioreaktor Perfusion, wie für die Erzeugung von Gewebe äquivalente22angewendet.

Bioreaktoren wurden im Tissue Engineering zur produzieren Gewebe-Äquivalente, die lindern könnte der Nachfrage von Organen und die damit verbundenen Risiken wie Ablehnung und Morbidität30reduziert. Allerdings ist die Herstellung von Gewebe-ähnliche Konstrukte ein sehr komplexer Prozess, der beinhaltet die Verwendung von Gewebe-spezifischen Zelltypen, leski geeignet und angemessen Wachstumsfaktoren, die die richtige Differenzierung und Montage in 3D Gewebe ermöglichen. Ein großer Nachteil der technischen Konstruktionen ist das Fehlen eines richtigen vaskulären Netzwerks, das Überleben der Zellen unterstützt sowohl in Vitro und in Vivo17. Hier verbinden wir die RCP-kolonisierten Microcarriers mit einer decellularized Matrix in einem Bioreaktor-Modell bietet den Zelltyp erforderlich, ein Gerüst, die Zelladhäsion und Schiff Bildung und eine spezifische Kultur-Medium, das bietet die wesentlichen Faktoren für die Zellen vermehren sich und ihre funktionalen Eigenschaften. Ein wichtiges Ergebnis dieses Modells ist die Fähigkeit der HDMECs Migration von RCP-Microcarriers auf dem Gerüst ohne zusätzliche Ablösung oder Verdauung nach Bedarf in andere Ansätze-31. Anschließend kolonisiert sie speziell der vaskulären Strukturen der Matrix, beweist das Konzept, dass makroporöse Microcarriers als Zelle Liefersystem für Regenerationsmedizin Zwecke verwendet werden können.

Insgesamt dieses Protokoll stellt eine vielversprechende Strategie in der regenerativen Medizin für den Erhalt einer maximierten Zelle Expansion und es könnte dazu dienen, als Zelle Lieferung nach Implantation Websites, denen es Vaskularisierung Unterstützung für Gewebetransplantate entwickelt verbessern könnte.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Forschung führt zu diesen Ergebnissen wird finanziell von der Europäischen Union siebten Rahmen Programm RP7/2007-2013 unter Grant Vereinbarung n ° 607051 (BIO-INSPIRE). Wir danken Carolien van Spreuwel-Goossens von Fujifilm Manufacturing Europe b.v., für technische Hilfe bei der RCP-Herstellung und Werner Stracke vom Fraunhofer-Institut für Silikat Research ISC, um Unterstützung bei der SEM-Analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) Serva Electrophoresis GmbH 20395.01
4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
Acetic acid 100% Sigma-Aldrich 533,001
Analytical balance Kern EG 2200-2NM Kern & Sohn GmbH
Ascorbate-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Bright field microscope Axiovert 40C Carl Zeiss AG
Cellnest Fujifilm
Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) Greiner Bio-One
Collagen R solution 0,4% Serva Electrophoresis GmbH 47254.01
DMEM-F12 Gibco 11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537 Modified, without calcium chloride and magnesium chloride
Eosin 1% Morphisto 10177.01000
Ethanol 96% Carl Roth GmbH T171.4 Denatured
Fetal calf serum (FCS) Bio&SELL FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Fluorescence microscope BZ-9000 Keyence
Haematoxylin Morphisto 10231.01000
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191 Reagent grade, ≥99%
Incubator for bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Live/Dead Cell Double Staining Kit Fluka 04511KT-F
Magnetic stirrer plate 2Mag 80002
Medium 199 Sigma-Aldrich M0650 10X
Microplate reader
Tecan Infinite M200
Tecan
Needle 21G 16mm VWR 613-5389
Papain from papaya latex Sigma-Aldrich P4762 lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein
Paraffin Carl Roth GmbH 6642.6
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Peristaltic pump Ismatec
Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit Thermo Fischer Scientific P7589
Histofix 4% Carl Roth GmbH P087
Scanning Electron Microscope Supra 25 Carl Zeiss AG
Sodium hydroxide solution 1.0 N Sigma-Aldrich S2770
Spinner flasks (25 mL) Wheaton 356879
Syringe 1 mL VWR 720-2561
Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) TPP Techno Plastik Products AG
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154
VascuLife VEGF-Mv Lifeline cell technology LL-0005

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