多重の人工細胞の微小環境配列の作製

Bioengineering

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Summary

この資料は、物理と化学の高スループット操作キューが模倣した生体内で細胞微小と多重化人工細胞微小環境 (MACME) 配列を準備する詳細な方法についてを説明します単一セルのプロファイリングとひと多能性幹細胞 (hPSCs) に最適な携帯電話環境を識別します。

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Mashimo, Y., Yoshioka, M., Tokunaga, Y., Fockenberg, C., Terada, S., Koyama, Y., Shibata-Seki, T., Yoshimoto, K., Sakai, R., Hakariya, H., Liu, L., Akaike, T., Kobatake, E., How, S. E., Uesugi, M., Chen, Y., Kamei, K. i. Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array. J. Vis. Exp. (139), e57377, doi:10.3791/57377 (2018).

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Abstract

携帯電話微小はさまざまな成長因子、細胞外マトリックスは、細胞間相互作用などの手がかりから成っています。これらの手がかりも仕組まれた、生活システムの細胞機能の調節に重要であります。研究者の数は、必要な細胞の機能と環境要因の関係を明らかにしようとしましたが多くは未知に残る。これは、主にこのような環境の手がかりの in vitroを模倣し、同時に細胞の環境手がかり別のテストに適切な方法論の不足のためです。マイクロ流路と高コンテンツの単一細胞解析、環境の異なる要因によって変更される幹細胞表現型を調べるために続いてナノファイバー アレイの統合プラットフォームを報告する.このプラットフォームのアプリケーションを示すためには、この研究は、ひと多能性幹細胞 (hPSCs) の自己更新の表現型について説明します。多重化人工細胞微小環境 (MACME) 配列の作製におけるナノファイバー配列およびマイクロ構造の作製手順を紹介します。さらに、プロファイルでは、複数の蛍光マーカー、複数の蛍光イメージング統計解析と染色細胞単一細胞の全体的な手順を説明します。

Introduction

ひと多能性幹細胞 (hPSCs)1,2限りなく自己更新し、様々 な組織の血統があり、医薬品開発、細胞ベースの治療、ティッシュ エンジニア リング、再生医療に革命を起こす可能性を分化3,4,5,6一般的な文化料理、マイクロタイター プレートは細胞の拡張のための重要な要因である範囲のナノ-マイクロ/メートル、細胞レベルでの正確な物理的および化学的細胞操作を有効にするには設計されていない。自己複製と分化。この欠点に対処するための研究は細胞の運命決定とセル関数4の調節に細胞の微小の役割を検討しました。近年、研究数の増加は、細胞の微小培養78を再構築するため行われています。化学9,1011,12,13の操作を介してこれらの微小のナノ ・ マイクロ加工プロセスを確立しました。 14,15,16,17物理18,19,20環境手がかり。今までは、細胞の運命決定と単一のプラットフォームの機能に関する化学的・物理的環境手がかりの基になるメカニズムを体系的に調査への報告はありませんでした。

堅牢なスクリーニング プラットフォーム (図 1) を確立するシンプルなデザインの原則に基づいて戦略を紹介します。まず、ナノファイバー配列およびマイクロ構造体を使用して汎用性の高い、人工細胞微小を作成するための統合プラットフォームを開発する手順について述べる: 配列の多重化人工細胞微小環境 (MACME)(図 1Aおよび2 a)。ナノファイバーの配列では、ナノファイバー材料と密度のさまざまな組み合わせで 12 の異なる微小があります。静電紡糸ナノファイバーを作製する使用されました。ポリスチレン (PS)21polymethylglutarimide (PMGI)22ゼラチン (GT)23など、ナノファイバー材料が細胞接着と多能性 (のメンテナンスに影響を与える可能性があります彼らの化学的性質をテストするのには設計されていた図 2B)。エレクトロスピニング時間を変更することによって変化したナノファイバーの密度と生成されたナノファイバーの密度によると定義された (D と、リタイア = XLow/低/中/高)。ポリジメチルシロキサン (PDMS) 96 ウェル マイクロ プレートの標準寸法に沿って配置することができます 48 の細胞培養室をかくまっているマイクロ構造が構成されます。PDMS は、マイクロ流体デバイス24を作製する一般的に使用される生体適合性とガス交換ポリマーです。各マイクロ流路設計されました 700 μ m ワイドと 8.4 mm 長く (表 1) の端の 2 つの入り江があった。部屋は高さの異なる (250、500、および 1000 μ m)、初期細胞播種密度 (0.3、0.6、1.2 × 105セル/cm2)、hPSCs25 の分化、増殖、生存と相関する可能性がありますを操作するには(図 2C)。商工会議所に播種された細胞の数室床の上列密度に比例し、したがって初期細胞播種密度が異なる高さ文化区域に同じ細胞懸濁液を導入によって制御されました。すべてのチャンネルは ≥ 250 μ m 高26細胞の低酸素分圧27とせん断応力の28の影響を最小限に抑えるために設計されています。チャネル 250、500、1000 μ m の高さはここで省略表記として X と東カリブ ドル = 低中、高それぞれ。「Material_NF density_Cell 密度」として短くされた明確なナノファイバー密度と初期細胞播種密度と環境 (例えば、GT_HighNF_HighCD: 高密度 GT ナノファイバーと高い初期細胞播種によって特徴づけられる環境密度)。

その後、我々 は環境要因 (図 1B) への応答での細胞行動を体系的に調査する単一細胞解析を実行する方法をについて説明します。証拠の-概念として、hPSC の自己複製に最適な携帯電話環境を識別される、hPSC メンテナンス (図 1B)29のための重要な機能であります。イメージ ベース フローサイトメトリー、統計解析に続いてセルラ環境への個々 の形質細胞の定量的解釈ことができます。細胞機能の変化の中では、このペーパーは hPSC の自己複製を維持するための最適の条件を識別するために詳細な手順を提供します。

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Protocol

1. MACME アレイの作製

注: すべての材料および装置の材料表のとおりです。

  1. ナノファイバーの配列およびマイクロ構造の金型のマスクの準備
    1. ナノファイバーの配列および 3 D コンピュータ ・ グラフィックス ソフトウェア パッケージ (表 1) を用いたマイクロ構造の金型に使用されるマスクの三次元 (3 D) 画像を作成します。
      注:3 D 画像は読み取られ、3 D プリンターによって印刷されます。印刷マスクと金型ステップ 1.1.1 でグラフィック ソフトウェアを使用して定義した 3 D イメージを同じ寸法があります。
    2. マスクと 3 D プリンターを使用してこれらの設計に基づく金型を印刷します。
      注:このプロトコルでは、UV 硬化型樹脂をインク ジェットのような 3 D プリンター使用30だった。プリンターの解像度は 635 × 400 dpi と 15 μ m X、Y、および Z それぞれ、しかし、実際の X Y の解像度は約 4 倍より低かった。
  2. ナノファイバー ・ アレイの作製 (図 3A)
    1. 静電紡糸用高分子溶液を準備します。
      1. 9% (w/v)2213% テトラヒドロ フラン PMGI 液を希釈します。
      2. PS の 0.08 g を溶解 (数平均分子量 (Mn): 130,000) THF:dimethylformamide (1:1 の容積比)21、最終 1 mL (8% (w/v) PS ソリューション) までボリュームを表示する THF:dimethylformamide を追加します。
      3. 水の GT の 0.1 g を溶解: 酢酸酸: 酢酸エチル (1:1.6:2.1 容積比)、水を加える: 酢酸酸: 酢酸エチルとして最終 1 mL (10% (w/v) GT 溶液) までボリュームを持って説明23,31
    2. ポリスチレン (PS) プレート (127.7 × 85.5 mm)、エレクトロスピニング セットアップで陰極として機能するに 5 nm の厚さで白金薄膜を入金、マグネトロンスパッタ装置を使用します。
    3. 各高分子の溶液を 5 mL 注射器 23 G ステンレス鋼の鈍針装備に読み込みます。
    4. 置き、エレクトロスピニング装置のコレクターから離れて 12 cm 付きシリンジ ポンプの針と注射器を固定します。
    5. 注射針を高電圧の電源に接続し、11 に適用する kV。
    6. 0.2 mL/h の揚水量を設定します。
    7. 30 ° C と 30 < % (v/v) で温度と湿度を保ちます。
    8. 1.2.2 のステップで準備ベース プレートにマスクを配置します。
    9. エレクトロスピニング時間を変更することによって異なる密度でマスクの穴をベース プレートにナノファイバーを作製 (例えば、20、60、90、および 180 s)。
    10. ベース プレートからマスクを削除します。
      注意してください。エレクトロスピニング GT ナノファイバーにエタノールをスプレーすると、マスクと GT ナノファイバーを剥離を避けるためにマスクを削除する前に。
    11. ナノファイバー アレイの作製が完了するまでのステップ 1.2.4-1.2.10 を繰り返します。
    12. 残りの溶剤を蒸発させる 16 h 25 ° C で乾燥器でナノファイバーの配列を配置します。
    13. 0.2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド塩酸塩 (EDC) と 0.2 M N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) 4 h2325 ° C でエタノール架橋 GT ナノファイバー。
    14. 16 h 25 ° C で GT ナノファイバー 2 回エタノール 99.5% (v/v) と真空乾燥をすすいでください。
  3. マイクロ構造の作製 (図 3B)
    1. エージェントと PDMS ベース 20 g 硬化 PDMS の 2 g をミックス (1:10 の重量比。Pre-PDMS)。24
    2. 手順 1.2 で作製した金型に pre PDMS の混合物を注ぐ。
    3. 解消ガスで 30 分間乾燥器で pre PDMS 混合。
    4. 16 h の 65 ° C のオーブンで pre PDMS 混合物を治します。
  4. MACME アセンブリの配列 (図 3B)
    1. ステップ 1.3.4 金型から、70% (v/v) エタノールできれいに治る PDMS 構造をはがします。
    2. PDMS 構造32の下側に大気中のコロナ放電を扱います。
      注:このプロトコルでは、「ハンディ」コロナ放電装置と、3 または 4 回層の表面全体にコロナを放出します。酸素プラズマ処理は、表面の接着性を変更するコロナ放電に置き換えられました。
    3. すぐにナノファイバー配列を含む PDMS 構造を組み立てます。
    4. オーブンで焼く 65 ° C で 2 日間。

2. MACME 配列に hESCs を読み込む

  1. H9 ヒト胚性幹細胞 (hESCs) の日常文化、xeno フリー セル無血清培養培地の hPSC メンテナンス33 10 μ M Y-27632 岩阻害剤34 (hPSC 培地の名前) 35 mm 細胞培養の添加を維持します。基底膜のゲルのマトリックス (MG) をコーティングした一品。
  2. 通路細胞組換えトリプシン様プロテアーゼを使用してすべての 4 から 7 日間。
  3. 10 分室への読み込みで 99.5% エタノール、MACME 配列を滅菌し、エタノールを削除します。この手順を 3 回繰り返します。
  4. 12 μ MG、10 μ G/ml ビトロネクチン (VN) を紹介してインキュベート室チャンバの表面に塗布し 1 h の 37 ° C のコントロールに 0.1% (w/v) GT 文化室。
    注:このプロトコルでは、GT、VN、MG 細胞接着および文化のための参照タンパク質として選ばれました。ポジティブ コントロールとして使用される MG と VN は hPSC の自己複製を維持するために使用される標準的な細胞培養行列なので二次元の GT コーティング (2DGT)、非コーティング (NC) のネガティブ コントロールとして使用されました。
  5. MACME 配列のすべての部屋に予め温めておいた hPSC 媒体をご紹介します。37 ° C で 30 分間部屋を孵化させなさい
  6. 洗って H9 hESC DPBS と 35 mm ディッシュに培養皿に組換えトリプシン様プロテアーゼの 0.5 mL を追加, 1 分の 37 ° C でと慎重にプロテアーゼ混合のみ培養上清を吸引します。
    注:吸引手順では、セルは分離されていません。
  7. 優しく細胞を分離し、剥離細胞を 15 mL の円錐管に転送する繰り返し皿面に対して媒体を塗布、すぐに hPSC 媒体を追加します。
  8. 3 分吸引上清 200 x g で遠心し、予め温めておいた hPSC 培地で細胞を中断します。
  9. 各流体チャンバーに細胞懸濁液 (1.2 × 106セル/mL) の 12 μ L をご紹介します。
    注:マイクロ ピペットを使用して別から 1 つのチャンバーに細胞を紹介します。室に播種された細胞の数は商工会議所の床の上の列密度に比例して、同じ細胞懸濁液からのサンプルが使用されたにもかかわらず初期細胞播種密度が制御できます。ピペッティングはゆっくり行われますを確認します。読み込み後綿の先端の棒を使用して部屋から余分なメディアを削除します。MACME 配列は一般的に使用される室のピペットと自動ピペット システムの両方と互換性のある、特別な装置は必要ありません。
  10. 4 日間のすべての 12 h と文化 hPSC 媒体を変更します。
    注:媒体の一定のボリューム (1.6、3.2、および 6.4 μ L) の明瞭なサイズのチャンバーを使用して維持されます。細胞培養培地35,36の交換を除いてせん断応力を最小限に抑えるため静的条件下で培養細胞。

3. 定量単一セルのプロファイリング

  1. プレート蛍光細胞染色
    注:
    、自己更新 hPSCs の表現型の変化を分析するこのプロトコルは、このプロトコルの 3 つのキーの表現型マーカーを選択: OCT4、5-エチニル-2'-デオキシウリジン (EdU) および多能性・増殖・ アポトーシスの状態を測定するためのアネキシン V、それぞれ (図 2b)。4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)、細胞核を識別するために使用されます。OCT4 は多能性の重要な転写因子の一つであります。
    1. HPSC 培 37 ° C、30 分で 10 μ M エドゥ アルキンの MACME 配列の H9 hESCs を孵化させなさい。
    2. アネキシン結合バッファー (10 mM HEPES (pH 7.4) 140 mM の NaCl、2.5 mM CaCl2) で洗浄した後、オレンジ蛍光色素アネキシン V 共役 20 ° C 15 分で細胞を染色します。
    3. 20 の ° C、15 分間で 4% (v/v) パラホルムアルデヒドで PBS のセルを修正し、PBS のセルを 2 回リンスします。
    4. 0.3% (v/v) トリトン X-100 16 h 20 ° C で PBS を使用してセルを permeabilize します。
      注:パラホルムアルデヒド プラスチック ベース プレートと PDMS マイクロ流路構造の間の結合を弱めます。したがって、3.2.1 のステップで配列から PDMS 層の剥離は、このステップの直後にも実行できます。
    5. 20 ° C、30 分で赤い蛍光染料アジとトリス ベースの反応バッファー内セルを孵化させなさい。
    6. 16 h のための 4 ° C でのブロック バッファー (5% (v/v) ヤギ血清, 5% (v/v) 通常ロバ血清, 3% (w/v) ウシ血清アルブミン、0.1% (v/v)、Tween 20 と 0.1% (w/v) N-ドデシル-β-D-maltoside PBS) で細胞を孵化させなさい。
    7. 0.5% (v/v) トリトン X-100 ソリューション PBS の 16 h のための 4 ° C での人間の OCT3/4 抗体 (マウス IgG) 孵化させなさい。
    8. 37 ° C, 60 分で緑色蛍光色素標識ロバ抗マウス IgG (H + L) とバッファーの妨害で孵化させなさい。
    9. DAPI を PBS で 20 の ° c で 30 分間インキュベートします。
    10. PBS DAPI を PBS に置き換えます。
    11. 画像取得まで 4 ° c の MACME の配列を保持します。
  2. 画像取得 (図 4)
    1. MACME 配列から PDMS マイクロ流路構造をはがします。
    2. MACME 配列から残留の PBS を削除、セルに PBS で 90%(v/v) グリセロールを適用し、染色細胞上 coverslips を配置します。
    3. 逆さ倒立蛍光顕微鏡のステージ上のプレートを設定します。
    4. 顕微鏡のイメージング ソフトウェアによって制御されたすべてのモーターを備えられたコンポーネント (ステージ、フィルター、シャッター、およびフォーカス システム) を使用して自動的に 12 ビットのカラー画像を取得します。
      注意してください。最大照度値付近に到達するこのプロトコルで露光時間を調整 (最高輝度: 4096)、各イメージ、DAPI、OCT4、アネキシン V とエドゥの彩度なしが。
  3. コンピューター誘導画像処理や蛍光信号の定量化 (図 5)
    注:
    次の細胞画像解析、前述メソッド37に基づいて実行されます。
    1. カラー画像をグレースケールに変換します。
    2. 大津法と各 DAPI イメージの単一しきい値値を計算し、前景と以下のしきい値を超えるピクセルを分類の背景として。DAPI の蛍光の強度にフォア グラウンドの値が対応することを確認します。
      注:画像解析処理を含む 5 つのステップ。DAPI の主要オブジェクトの識別画像、OCT4、アネキシン V とエドゥ画像内のセカンダリ オブジェクトの識別、およびオブジェクトの強度を測定。図 3は、画像処理の設定にグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) の画像を提供します。
    3. 各画像を OCT4 とエドゥの蛍光強度を測定します。
    4. 伝搬法とアネキシン V で染色領域を識別して蛍光強度を定量化します。
  4. 3.4 単一細胞イメージングに個々 の細胞表現型を可視化する解析
    1. 中心とし、それらに等しい重量を与えるためにこれらの変数のスケーリング各形質マーカーの入力蛍光強度を標準化します。
    2. 自己組織化マップ (SOM) の解析を実行するには、統計計算とグラフィックス前研究38,39のとおりソフトウェア環境を使用します。
      1. 特徴的な 4 つ「コードブックのベクトル」4 つのマーカー DAPI エドゥ、アネキシン V、OCT4 の蛍光強度に対応する 25 SOM ノードを作成します。
      2. 各微小環境の個々 のセルを「勝利」(最も似ている) ノードに割り当てるしによると、ここで、重量は学習率加重平均を使用して勝利のノードのコードブック ベクトルが更新され、セルの周波数としてプロット (ここでは、として 0.05既定値)。
        注:未満 1000 個の細胞を含む少数の細胞を含むデータセットは SOM の統計的に関連した結果を提供しなかったため部屋からのデータを省略します。
    3. クラスタ リング ソフトウェア40ピアソン相関に基づく平均連携法を用いた SOM ノード値を持つ教師階層的クラスタ リングを実行します。
    4. デンドロ グラムとヒートマップ ビュー41にクラスタ リングのデータをレンダリングします。

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Representative Results

MACME アレイ: 設計と製作:ナノファイバー技術と組み合わせて、マイクロ細胞培養とスクリーニング以前 hPSC の自己複製と分化35,36 (図 1) のための最適な条件を識別するために用いられる技術を使いました。これは細胞培養チャンバーと条件が正確に制御可能な拡張可能な42,43,44 のため堅牢な高スループット細胞に基づく試金を確立することに適しています。ここでは、単純なナノファイバー堆積法、3 D プリントされたマスクとエレクトロスピニングによるナノファイバー配列が準備されました。マイクロ流体の一部は、簡単に多くの試行錯誤を通じてチャンバー構造を設計する 3 D プリントされた金型を作製しました。MACME 配列は 2 つの部分を組み合わせることによって建てられたし、48 環境では、両方のナノファイバーの Ecm (ナノファイバー材料の 3 種類と密度の異なる 4 または 4 のコントロールのさまざまな組み合わせによって異なる生物物理学的・生化学的手がかりを提供することが含まれています。基質タンパク質) と細胞間相互作用 (初期細胞播種密度の 3 範囲) に示す図 2として。

全体的な hESC の表現型に及ぼすカーボンナノファイバー プロパティと細胞密度の評価:次の細胞培養 MACME 配列とプレートに蛍光染色 (図 6A)、取得した画像と単一セル測定を行った。同質性と異質性各データセットの 4 つの表現型マーカーの発現レベルの比較すると、このプロトコルを使用 SOM 分析38,39, に高次元、多重のデータセットを変換します。低次元の 2 D マップ。特に、PS ナノファイバーおよび 2DGT 行列の結果は、ほとんどの細胞が付着しなかったことを考えればこの分析から省略されました。また、細胞が十分な直接 (例えば、juxtacrine) または間接 (パラクリン) 相互作用を生き残るために持っていなかった低 CD とそれらの実験していたこの分析から除外。SOM 分析以下教師階層的クラスタ リングをすべて分析サンプル (図 6B) の SOM ノードの行った。クラスター デンドロの高さを考慮した表現型の違いは、サンプルを 3 つのグループに分類するできました: グループ i、GT ナノファイバー、MG_HighCD、および VN_HighCD; を構成するサンプルのニッチのほとんどグループ ii、GT ナノファイバー (GT_XLow と MidNF_MidCD)、MG_MidCD、または VN_MidCD; を含むサンプルグループ iii, すべての PMGI_NF のサンプル。

(図 6Cの各グループから 1 つの代表的なサンプルを調べたグループ間の違いを研究するにはグループ ii-GT_MidNF_MidCD とグループ iii-PMGI_MidNF_HighCD グループ i GT_MidNF_HighCD)。OCT4 信号の面では、すべてのグループは、MG (MG_MidCD) のより高い表現を示した。ほとんどの細胞が増殖した積極的にことを示す高エドゥ信号を特徴としたグループ。したがって、微小細胞周期ギャップ相の頃、未分化の hPSCs が、通常急速に増殖するので、私は hPSC メンテナンスに適した条件として特徴付けられたグループでは、45,46を短縮しました。

GT_MidNF_HighCD と GT_MidNF_MidCD は、彼らの異なる初期セル読み込み密度によって区別されます。高初期細胞の密度には、細胞の生存・増殖47を強化近接細胞と対話する機会が増加しました。十分な初期密度 (3.0 × 104セル/cm2) で播種された細胞が生き残ったも実験期間 (4 日間) の間に育った。したがって、我々 は SOM 解析でこれらのサンプルを採用していません。細胞の数は、1000 の生きているセル ・ チャンバーのカットオフ以下だった。2DGT 足場に細胞のグループ ii セルとして分類されたもこれらの条件は、hPSC 自己更新48をサポートしていません。GT_MidNF_MidCD 細胞のエドゥ信号は失われ、アネキシン V のレベルが増加傾向、細胞の幹細胞性を失っていた徐々 にアポトーシスになっていたことを示します。PMGI ナノファイバー行列を構成する微小を表し、PMGI_MidNF_HighCD は、OCT4 とエドゥの信号が他の条件と比較して大きな変動を示した。

Figure 1
図 1.細胞機能を制御するための最適な細胞微小を識別するために戦略をスクリーニングします。(A) 多重化人工細胞微小環境 (MACME) 配列のコンポーネントの概要。配列は、2 つの部分で構成されています: 基底基板 (ナノファイバー配列)、ポリジメチルシロキサン (PDMS) にならってナノファイバー ベッド-マイクロ構造を用いた。MACME 配列は、さまざまな機能 (すなわち、ナノファイバー材料および密度) と様々 な細胞の播種量とナノファイバー Ecm を準備することです。MACME 配列の PDMS マイクロ流路構造機能 3 つのマイクロ流路高さ (250、500、および 1000 μ m) 初期の細胞播種密度を調節します。(B) 細胞の表現型の細胞の微小の影響が定量的に評価したイメージ ベースの単一細胞アッセイを用いた、自己組織化マップ (SOM) による統計データ解析に階層的クラスタ リングします。この図は、ワイリーの許可を得て参照49から適応されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2.MACME 配列のデザイン。(A) オーバーヘッドと全体の MACME 配列の高角度ショットとナノファイバー マトリックス (ピンク) マイクロ流路 (ライトブルー) の概念図。各チャンネルは、700 μ m 幅 8.4 mm 長い培養室と培地およびセルの導入のための 2 つの入り江で構成されます。(B) 細胞およびナノファイバー行列のサイズの比較。細胞及びナノファイバーのベッドの高さの範囲から 1-3 μ m および 0.05 5.0 μ m、それぞれ。(C) 250/500/1000 μ m の高さを持つ各マイクロ流路の断面。セル、ナノファイバーのベッドは、それぞれ青い円とオレンジ色の線として表されます。各商工会議所が同じ幅と長さがさまざまな高さ (250、500、および 1000 μ m)、商工会議所の各ボリュームはそれぞれ 6.4 μ L、3.2、1.6 と。図 2Cで黒の点線の四角形は、図 2Bを示します。図 2は、ワイリーの許可を得て参照49から適応されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3.MACME アレイの作製します。(A) ナノファイバー アレイの作製。マスク パターンの穴をベアリングのセットを使用して変更された静電紡糸法によるパターン、ベース プレートに複数のナノファイバーの行列を行った。プラチナ コーティングは、プラスチック ベース プレートのナノファイバー蒸着を容易にするため行われました。個別の穴パターンとマスクは、3 D プリンターにより作製しました。次のコレクション画面に置かれたプレート マスク セット プレートのプラチナ コーティング部分のマスキングと通常エレクトロスピニングを行った。初期のナノファイバーは、マスクの穴を板に Pt コート ポジションで形作られました。追加ナノファイバー ベッドは、既存のマスクを置き換える手順を繰り返して、プレート上に作製しました。(B) マイクロ構造の作製。UV 硬化型樹脂 3 D プリンターによって印刷される金型は、PDMS マイクロ流路デバイス層形。キャストの後、MACME 配列は、ナノファイバーの表面活性化配列と PDMS によるマイクロ流体層を接続することによって組み立てられました。図 3は、ワイリーの許可を得て参照49から適応されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4.顕微鏡画像の獲得のためのグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) の画像ですこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5.コンピューター誘導画像の単一細胞表現型解析の処理のグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) の画像です。画像解析処理を含む 5 つのステップ。DAPI の主要オブジェクトを (A) 識別画像、OCT4、Annexin V、エドゥの画像、セカンダリ オブジェクトの (B D) 同定, およびオブジェクトの強度を測定。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6.フェノタイピングと H9 hESCs 樹状細胞によって変更の表現型の分類。(A) 蛍光像 H9 hESCs ゼラチン (GT) ナノファイバー (GT_HighNF_HighCD) の高い初期播種密度で培養染色 3 細胞の表現型マーカー (OCT4、多能性;エドゥ、細胞増殖;アネキシン V、アポトーシス) と細胞核を DAPI。(B) A ヒートマップと教師なし階層的クラスタ リングのデンドロ。テストの微小は表現型の類似性に基づいた特徴を持つ 3 つのグループに分類されました。私は GT ナノファイバー、MG_HighCD、および VN_HighCD が含まれているグループ。グループ ii は、MG_MidCD、または VN_MidCD GT ナノファイバー (GT_XLow と MidNF_MidCD) のサンプルから成っていた。すべての PMGI_NF のサンプルは、iii 群にクラスター化されました。ヒートマップでは、ピンクとブルーの色はそれぞれ SOM 数区でハイとロー携帯電話の周波数を示します。(C) 1000 細胞 (グループ i GT_MidNF_HighCD, グループ ii-GT_MidNF_MidCD とグループ iii-PMGI_MidNF_HighCD) 各グループから 1 つの代表的なサンプルの定量化されたマーカー発現分布第 25 そして第 75 百分位数は、ボックスの制限として示されました。ひげは 25 そして第 75 百分位数から四分位範囲の 1.5 倍に拡張します。実験はグループごとに 3 回繰り返し。図 6A ~ Cは、ワイリーの許可を得て参照49から合わせられました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

チャネルの長さ (mm) チャネル幅 (μ m) 路高さ (μ m) 入口/出口径 (μ m) 入口/出口高さ (μ m) 金型の長さ (mm) 金型幅 (mm) 金型高さ (mm)
金型 8.4 700 250/500/1000 800 3000 127.76 85.48 14.35
厚さ (μ m) 穴の長さ (mm) 穴の幅 (mm) マスクの長さ (mm) マスク幅 (mm) 金型高さ (mm) 行オフセット (mm) 列のオフセット (mm)
マスク 1000 6 5 123.5 80.2 14.35 11.24 14.38

表 1。マイクロ流体構造とナノファイバー パターニングのマスクのための金型の寸法。

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Discussion

このプロトコルは、修飾 hPSCs の維持のための堅牢な文化システムを確立する最初のスクリーニング方法をについて説明します。まず、我々 はプラットフォームとして、多様な人工 Ecm と細胞ナノファイバー配列、MACME 配列を持つ統合マイクロ流体デバイスを用いた播種量を準備する方法を説明します。第二に、定量的画像に基づく単一セル フェノタイピングだった実行50個々 の細胞成果と生化学と生物物理学的特徴によって変更の動作を評価します。このプロトコルでは GT ナノファイバーと播種密度高い初期細胞の状態で肯定的な制御 ECM タンパク質から成る環境だった、未分化状態の機能によって特徴付けられる急速な拡散45と安定した OCT4 式51。この観測は、「細胞-細胞外マトリックス」、「細胞」相互作用に関する分子メカニズムは、hPSCs の多分化能に影響を与える可能性を示されました。

この戦略は、ユーザーの目的に合わせてカスタマイズできます。たとえば、細胞操作とスループット調整できますさまざまな実験設定の再図形およびマイクロ構造のパターンを設計することによって。スループット向上のための別の方法として各商工会議所の入口と出口の位置、96 ウェル プレート、生体分子科学会; によって標準化のマイクロ プレート標準に従って設計されていますしたがって、高スループット スクリーニングのため自動ロボット液体ディスペンサーを使用できます。さらに「細胞外マトリクス相互作用」の分子メカニズムを検討するため、シグナル分子52 でナノファイバーを化学修飾する生体内での条件をより正確に模倣する人工細胞微小を行うことができます。.

日には、細胞微小をスクリーニングするために開発されたほとんどのプラットフォームは、可溶性因子 (例えば、成長因子と化学化合物)42,43,44, しかし、ないナノファイバー Ecm をスクリーニングを狙ったされています。個別作製技術を組み合わせることの難しさ。たとえば、ナノファイバー シート マイクロ構造と、ベース プレートとの間の小さなギャップを生成し、結果の異なるサンプル間の交差汚染は培養液を混ぜてを介して別の商工会議所の 1 つの不安定な結合を起こします小さなギャップ。新手法は特定のサイトでナノファイバー行列のシンプルかつ正確な加工が容易になります、不安定な結合や交差汚染を防ぐベース プレートとの直接結合します。さらに、マイクロ流体と統合された少数のプラットフォーム53とに技術が必要なために、ナノファイバー行列が細胞機能に及ぼす影響を調査するため化学と物理の両方のキューの体系的な操作のアクセスされています。統合された高度です。簡単に達成可能な装置と簡単なテクニックで実行できる MACME 配列を持つ私たちの単一セルのプロファイリングの細胞環境をモデリングで使用するための大きな可能性を保持する発達と細胞生物学的研究と創薬/スクリーニング。

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Disclosures

なし。

Acknowledgments

ありがとう (名) 中辻教授京都大学 iCeMS でヒト ES 細胞を提供します。東京工業大学教授 A. 丸山をありがとうございますまた原子間力顕微鏡の使用の彼をサポートします。惜しみなく学術振興会によって提供された資金 (JSP; 22350104、23681028、25886006、および 24656502)。資金は、新エネルギー ・産業技術総合開発機構 (NEDO) テルモ ライフ サイエンス振興財団によって提供されたも。WPI iCeMS は、世界最高峰国際研究センター (WPI)、教育省、文化、スポーツ、科学、技術 (文部科学省)、日本によってサポートされます。この仕事の一部は京都大学ナノテクノロジー ハブ、日本文部科学省主催「ナノテクノロジー基盤プロジェクト」に産総研ナノ処理設備によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polystyrene (PS) Sigma #182435 Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000
Polymethylglutarimide (PMGI) MicroChem G113113
Gelatin (GT) Sigma G2625 From porcine skin, type A
Sylgard 184 silicone elastomer kit Doe Corning Toray #1064291 PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit.
OpenSCAD This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device.
AutoCAD 2014 Autodesk This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation.
3D printer, AGILISTA-3000 Keyence
UV-curable resin, AR-M2 Keyence This is used for 3D printing by Agilista.
Acetic acid Sigma #338826 ≥99.99%
Ethyl acetate Sigma #270989 Anhydrous, 99.8%
Tetrahydrofuran (THF) Sigma #401757
MSP-30T Vacuum Device Magnetron sputtering machine
Nunc OmniTray Thermo Fisher Scientific #242811 This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. 
Gun-type corona discharge machine Shinko Electric & Instrumentation CFG-500 This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol.
5 mL syringe Terumo SS-05SZ
Stainless-steel blunt needle (23-gauge) Nipro #2166 Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively.
High-voltage power supply TechDempaz
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride Dojindo W001
N-Hydroxysuccinimide Sigma #56480
Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning #354277 This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol.
CellAdhere Vitronectin, Human, Solution STEMCELL Technologies #07004
TeSR-E8 STEMCELL Technologies #05940 Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells
Y-27632 Wako Pure Chemical Industries #253-00513
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red Thermo Fisher Scientific #12605028 This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells.
Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides Thermo Fisher Scientific C10086 The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit.
Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13203
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Oct-3/4 Antibody (C-10) Santa Cruz Biotechnology sc-5279
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) abcam ab96875 This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining.
ECLIPSE Ti-E Nikon This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced Research Nikon This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition.
CellProfiler, Version 2.1.0 This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/).
R SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/).
Cluster 3.0 This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software.
Java TreeView This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram.
H9 human embryonic stem cell WiCell Stem Cell Bank WA09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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