A longo prazo viver-pilha de imagem para avaliar o destino da célula em resposta ao Paclitaxel

Cancer Research

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Summary

Imagem latente da viver-pilha fornece uma riqueza de informações sobre células únicas ou populações inteiras que é inatingível por célula fixa imagem sozinho. Aqui, viver-pilha protocolos de imagens para avaliar as decisões de destino célula após o tratamento com a droga antimitótica paclitaxel são descritos.

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Bolgioni, A. F., Vittoria, M. A., Ganem, N. J. Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel. J. Vis. Exp. (135), e57383, doi:10.3791/57383 (2018).

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Abstract

Imagem latente da viver-pilha é uma técnica poderosa que pode ser usada para visualizar diretamente fenômenos biológicos em células únicas durante longos períodos de tempo. Na última década, tecnologias novas e inovadoras melhoraram grandemente a praticidade da imagem latente da viver-pilha. As células podem agora ser mantidas em foco e continuamente imagem durante vários dias, enquanto mantida sob a 37 °C e 5% CO2 condições de cultura celular. Além disso, vários campos de visão que representam diferentes condições experimentais podem ser adquiridos em simultâneo, proporcionando elevado-throughput dados experimentais. Imagem latente da viver-pilha fornece uma vantagem significativa sobre imagem fixa-celular, permitindo a visualização direta e quantificação temporal de eventos celulares dinâmicos. Imagem latente da viver-pilha também pode identificar a variação no comportamento de células únicas que seria caso contrário ter sido perdido usando ensaios baseados na população. Aqui, descrevemos a viver-pilha protocolos de imagens para avaliar as decisões de destino célula após o tratamento com a droga antimitótica paclitaxel. Vamos demonstrar métodos para visualizar se mitotically prenderam células morrem diretamente da mitose ou slip volta em interfase. Também descreveremos como o sistema de indicadores (FUCCI) fluorescente ciclo celular baseado em do pode ser usado para avaliar a fração de células de interfase nascida do resvalamento mitótico que são capazes de re-introdução do ciclo celular. Finalmente, descrevemos um método de viver-pilha de imagens para identificar eventos de ruptura do envelope nuclear.

Introduction

Drogas antimitóticas têm sido muito utilizadas nos regimes quimioterápicos de vários tipos de tumores sólidos e frequentemente apresentam grande eficácia1,2,3. Mecanicamente, estas drogas perturbar a normal progressão mitótica e promover a prisão mitótica proliferam rapidamente as células cancerosas. No entanto, destino de célula em resposta a prisão mitótica é bastante variável: enquanto uma fração das células sofre morte celular diretamente da mitose, outros saída da mitose e retornar para o interphase como células tetraploide (um processo denominado slippage mitótico)4, 5,6,7,8. Estas células de interfase podem executar apoptose, sofrer prisão permanente ciclo celular ou mesmo re-introduzir o ciclo celular4,5,6,7,8,9 ,10,11. Células que evitar a morte celular mitótica pelo deslizar na interfase, somente para re-introduzir o ciclo celular após a remoção da droga, portanto, podem contribuir para a re-emergência de populações de células de câncer. Além disso, as células que deslize de mitose são tetraploide, e tetraploidy é conhecido por promover a instabilidade de cromossomo que impulsiona o tumor recaída12,13,14,15. Definir os fatores que controlam o destino da célula em resposta a tratamentos com drogas antimitótica, portanto, é fundamental para otimizar a terapêutica atual.

Neste protocolo, descrevemos os métodos para diretamente observar e estudar o destino das células que se submetem a prolongada detenção mitótica em resposta ao paclitaxel droga antimitótica. Paclitaxel é estabelecido terapêutico na clínica e provou-se altamente eficaz em muitos tipos de tumores, incluindo os de mama, ovários e pulmões16,17,18,19, 20. Paclitaxel, que é um alcaloide vegetal derivado da casca da árvore do Yew, estabiliza os microtúbulos e evita sua dinamicidade21,22. Enquanto o amortecimento da dinâmica do microtubule por paclitaxel não afeta a progressão do ciclo celular entre G e1 G2, a droga leva a ativação sustentada do ponto de verificação de montagem do eixo durante a mitose por dificultando acessório do microtubule-cinetócoro (revisto em profundidade aqui23,24)25. Como consequência, início da anáfase é impedido em células tratados com paclitaxel e resultados em uma detenção prolongada mitótica.

Este protocolo irá primeiro descrever abordagens para identificar células mitóticas em experiências de imagens ao vivo-celular. Mitose pode ser visualizada em células de cultura de tecidos aderentes devido a duas alterações biológicas de célula perceptível. Primeiro, cromossomos tornam-se altamente condensados imediatamente antes da ruptura do envelope nuclear. Enquanto muitas vezes detectável por microscopia de contraste de fase padrão, condensação do cromossomo pode ser mais claramente detectada usar fluorescente tags esse rótulo cromossomas (por exemplo, as proteínas fluorescente-etiquetadas histona). Segunda, mitóticas de células também podem ser identificadas pelo dramáticas mudanças morfológicas que resultam de arredondamento de célula.

Este protocolo então irá demonstrar como usar abordagens de imagens ao vivo-celular para controlar o destino das células experimentando prolongada detenção mitótica. Preso na mitose de células passam por um dos três destinos distintos. Primeiro, as células podem sofrer morte celular durante a mitose. Este fenômeno é facilmente visualizado por microscopia de luz, como são observadas células morrendo para psiquiatra, bolha, e/ou ruptura. Em segundo lugar, células podem sair da mitose e retorno para interphase sem segregação do cromossomo ou citocinese, um processo denominado resvalamento mitótico. Ocorre a descondensação dos cromossomos e/ou o achatamento da célula mitótica prontamente identifica este processo. Células que escorrega da mitose também frequentemente exibir núcleos múltiplos lóbulos, irregulares e frequentemente abrigam vários micronúcleos5. Em terceiro lugar, presos na mitose de células podem iniciar anáfase e prosseguir através de mitose, após um longo atraso. Apesar de incomum em altas concentrações de droga, esse comportamento sugere que as células presas podem ter satisfeito o ponto de verificação do conjunto de eixo, ou que o ponto de verificação do conjunto de eixo é parcialmente enfraquecido ou defeituoso. Início da anáfase pode ser visualizado pela segregação do cromossomo e citocinese subsequente usando a imagem latente da viver-pilha.

Viver-pilha de imagem métodos para controlar o destino das células que iludir a morte celular mitótica através de deslizamento mitótico também serão descritos. Células que passam por deslizamento mitótico morrem no período do intérfase subsequente, desencadear uma detenção de ciclo celular de1 G durável ou re-introduzir o ciclo celular para iniciar um novo ciclo de divisão celular4. Uma abordagem usando o sistema de FUCCI (fluorescente ciclo celular baseado em do indicador) para determinar a fração de células que re-introduzir o ciclo celular mitótica derrapagem a seguir será descrita. FUCCI, permite a visualização directa da transição G1/s e pode ser usado em conjunto com a longo prazo viver-pilha de imagem tanto in vitro e in vivode26,27. O sistema FUCCI aproveita-se de duas proteínas fluorescente etiquetadas, truncadas formas de hCdt1 (licenciamento de cromatina e replicação do DNA factor 1) e hGeminin, cujos níveis oscilam com base na posição do ciclo celular. hCdt1 (fundido a uma proteína fluorescente vermelha) está presente em níveis elevados durante a fase de1 G onde atua para licenciar o DNA para replicação, mas é ubiquitinated pelo E3 ubiquitina ligase do SCFSkp2 e degradadas nas fases S/G2/m para evitar Re-replicação do DNA,26. Por outro lado, hGeminin (fundido a uma proteína verde fluorescente), é um inibidor de hCdt1 cujo pico de níveis durante S/G2/M, mas é ubiquitinated pelo E3 ubiquitina ligase do APCCdh1 e degradado no final da mitose e em toda a G1 26. por conseguinte, FUCCI oferece uma leitura de fluorescência direta da fase do ciclo celular, como células exibem fluorescência vermelha durante da fluorescência verde e1, G durante S/G2/M. O sistema FUCCI é um avanço significativo sobre outras abordagens (como a coloração de bromodeoxyuridine) para identificar células proliferativas, porque não exige a fixação de célula e permite a imagem única célula sem a necessidade de adicional farmacológica tratamentos para sincronizar populações de células. Embora não discutidos neste protocolo, sensores de viver-pilha adicionais também foram desenvolvidos para visualizar a progressão do ciclo celular, incluindo um sensor do helicase B G128, DNA ligase-RFP29 e sensores de30 PCDNA-GFP para a fase S e o recente FUCCI-4 sensor, que detecta todas as fases do ciclo celular31.

Finalmente, será descrito um método de imagem de viver-pilha para detectar a ruptura do envelope nuclear. Estudos recentes têm revelado que os envelopes nucleares das células cancerosas são instável e propenso a estourar, permitindo assim que o conteúdo do nucleoplasma e o citoplasma para misturar. Este fenômeno, denominado ruptura nuclear, pode promover danos ao DNA e estimulação da resposta imune inata32,33,34,35,36,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. enquanto as causas subjacentes da ruptura nuclear permanecem incompleta caracterizadas, sabe-se que as deformações na estrutura nuclear correlacionam com um aumento da incidência de ruptura nuclear42. Um conhecido efeito do tratamento com paclitaxel é a geração de contundentemente anormais estruturas nucleares após a mitose; como tal, um método usando a imagem latente viver-pilha quantificar ruptura nuclear será descrito, enquanto explora também se paclitaxel tratamento aumenta a frequência de eventos de ruptura nuclear. Ruptura nuclear pode ser detectada pelo escapamento observado de uma proteína fluorescente nuclear-alvo para o citoplasma (por exemplo, um dímero em tandem repeat de RFP fundido a um sinal de localização nuclear, TDRFP-NLS). Este escapamento é claramente visível a olho nu, que permite a quantificação simples de eventos de ruptura.

Este protocolo requer um microscópio de epifluorescência widefield que está equipado com um palco codificado e software de focagem automática. O estágio codificado permite movimento automatizado preciso para definidas as coordenadas X-Y, enquanto software de autofoco mantém células em foco para a duração do período de imagem. Além disso, este protocolo requer equipamento para manter úmido de células a 37 ° C com 5% CO2 atmosfera. Isto pode ser conseguido colocando-se o microscópio inteiro dentro de uma temperatura e atmosfera controlada de cerco, ou usando dispositivos de palco-top localmente que mantém a temperatura e ambiente. O objetivo de contraste de fase, utilizado neste protocolo é um fluor plano 10 x com uma abertura numérica de 0,30. No entanto, 20 objetivos X também são suficientes para identificar as duas células arredondadas interfase mitótica e achatado em um único plano focal. Se executar o contraste de fase de imagem (como descrito neste método), a tampa pode ser ou o vidro ou o plástico. Se a microscopia de interferência diferencial (DIC) de contraste é usada, é imperativo usar uma tampa de vidro para impedir a despolarização da luz.

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Protocol

Este protocolo se concentra no uso não-transformadas e cromossomicamente estável da retina pigmentados epiteliais (RPE-1) linhagem celular para experiências de imagens ao vivo-celular. No entanto, este protocolo pode ser adaptado a qualquer linha de células aderentes, desde que as condições de cultura celular são ajustadas, se necessário. Todos os procedimentos devem aderir às normas e diretrizes éticas e biossegurança institucional.

1. preparar células para a imagem latente da viver-pilha

  1. Usar passagem recém descongelado e cedo RPE-1 células expressando humana histona que H2B fundido a uma proteína fluorescente (por exemplo, H2B-GFP), ou o sistema FUCCI (um protocolo detalhado sobre como gerar células FUCCI-expressando pode ser encontrado na referência45) para avaliar o destino da célula mitótica.
    1. Para medir a frequência de ruptura nuclear, use RPE-1 células expressando tanto H2B-GFP e um dímero em tandem da proteína fluorescente vermelha fundida a um sinal de localização nuclear único (TDRFP-NLS).
      Nota: Construções de três proteínas fluorescentes verdes fundiram em conjunto a um sinal de localização nuclear único (GFP3- NLS) também têm sido utilizados para demonstrar a ruptura (como referência42).
    2. Manter as células em placas de cultura de tecidos de 10cm no meio de crescimento adequado. As células de RPE-1 são mantidas em vermelho de fenol-livre, modificado águia médio/nutriente mistura F-12 de Dulbecco (DMEM:F12) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 UI/mL penicilina e estreptomicina 100 μg/mL.
  2. Aspire médio das pilhas, lave o prato de cultura de tecido com 10 mL de estéril, temperatura de solução salina tampão fosfato (PBS) para remover restante médio e em seguida aspirar a PBS.
    1. Adicionar 2 mL de 0,25% tripsina com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para as células e incubar a 37 ° C por 3 min ou até que a maioria das células ter retirado a placa.
      Nota: Não manter as células em tripsina mais tempo do que o necessário.
  3. Adicione 10 mL de meio completo para coletar as células trypsinized com um stripette de 10ml serológicos e dispensar em um tubo cônico de 15 mL.
    1. Granule as células por centrifugação a 180 x g durante 3 min à temperatura ambiente.
  4. Aspirar o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar a pelota e então completamente resuspenda o pellet em 10 mL de meio fresco pipetando suavemente meio de cima e para baixo no stripette serológico.
  5. Use um hemocytometer ou célula automatizada contando a máquina para contar células46.
    1. Dilua as células em um novo tubo cónico de 30.000 células/mL de meio completo.
    2. Placa de células de RPE-1 30.000 (volume de 1 mL) por bem de um copo de 12-poço fundo (#1.5 espessura) prato para atingir a densidade celular necessária no dia seguinte (30 – 50% de confluencia) de imagem.
      Nota: Sempre manipular a placa com luvas e tome cuidado para não tocar no vidro-fundo.
  6. Permitir que as células a crescer em uma incubadora de cultura de tecidos de 37 ° C até eles totalmente anexar e achatam-se com a placa de imagem com fundo de vidro. Enquanto as células podem anexar em menos de 4h, é recomendável que as células não são tratadas com drogas e fotografadas até ao dia seguinte.
  7. Adicione o paclitaxel (dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO)) para a concentração final desejada em meio completo e misture completamente.
    1. Prepare o meio completo com um volume igual de DMSO em paz para usar como um controle.
    2. Aquecer o meio contendo drogas ou DMSO a 37 ° C antes de adicionar as células. Isto evitará focal deriva devido a uma mudança brusca de temperatura.
    3. Adicione 1 mL de meio contendo paclitaxel ou sozinho para poços individuais do prato de imagem 12-poços de DMSO.

2. Configurando o microscópio para a imagem latente da viver-pilha

  1. Limpe o vidro-fundo do prato de imagem com óptica de limpeza para remover qualquer impressões digitais ou poeira que pode interferir com a imagem. Use o limpador de óptica suficiente para molhar a superfície do vidro inteiro.
  2. Coloque o prato de vidro-fundo no palco microscópio o adaptador da imagem latente do prato, remova a tampa de plástico do prato e cubra o prato com uma câmara de tampo de vidro. Assegure que a câmara tem uma válvula para permitir um fluxo constante de ar consistindo de 5% de CO2.
    Nota: Para umidificar a 5% de CO2, o gás é vertido tubo inserido em uma carcaça de banho de água estéril. Isso permite que o gás se tornar equilibrado para 95% de umidade.
  3. Iniciar/calibre o estágio codificado usando o software programa controlando o microscópio. Isto assegurará exatas coordenadas X-Y e evitar deriva focal.
  4. Concentre-se nas células usando a ótica de contraste de fase e realizar a iluminação de Kohler (descrita em detalhes na referência47) para concentrar a luz e proporcionar contraste ideal.
  5. Use software de aquisição para determinar os tempos de exposição ideal para luz branca e todos os canais fluorescentes sendo usados (exposições que dar 75% saturação de pixel da câmera são ideais, desde que esta quantidade de luz não é tóxica para as células).
    1. Use o software de aquisição para selecionar vários, não-sobreposição de campos de visão de cada poço para a imagem latente. Selecione regiões de imagens onde células aderiram bem ao vidro-fundo e são entre 50% e 70% de Confluencia. Evite áreas de células agrupadas, pois isso fará a análise subsequente difícil.
      Nota: É importante ter disjunto campos de visão de cada poço para evitar que as mesmas células de controle duas vezes. Se as células são altamente motile, pode ser necessário adquirir várias imagens irradiando para fora de um ponto central e costura-los juntos novamente para fazer um grande campo de visão.
  6. Ative o recurso de focagem automática do microscópio para garantir a que manutenção de todos os pontos em foco para a duração do experimento.
  7. Para avaliar o destino da célula mitótica, defina o software de imagem para coletar imagens de cada campo de vista selecionado cada 10min para cima-96 h. imperturbável mitose dura 20-40 min, e assim a intervalos de 10 min irão fornecer suficiente amostragem para identificar quando as células se dividem. Para identificar a ruptura nuclear, que é um evento transitório, adquira imagens cada 5 min.
    Nota: Verifique se o computador, o software de aquisição de imagem de condução tem atualização automática, screensavers e modos de poupança de energia desabilitados, como estas muitas vezes podem interferir com a aquisição de imagem sobre experimentos de longos.
  8. Inicie o experimento de imagem. Periodicamente, confirme que a aquisição de imagens está funcionando perfeitamente ao longo do vídeo.

3. a análise para identificar o destino da célula em resposta ao Paclitaxel

  1. Confirme que células de imagens são saudáveis ao longo da experiência de imagem. Células de controle tratadas com DMSO devem ser viável e ativamente proliferando.
    Nota: Se as células exibem sinais de estresse, não dosar o vídeo e em vez disso, concentre-se na otimização de imagem condições48. Sinais de estresse de imagem incluem células blebbing/morrendo, células que não anexar/propagação na placa e células que mostram um baixo índice mitótico e/ou prolongada da mitose. Possíveis fontes de estresse incluem flutuações de temperatura ou CO2 níveis dentro da câmara ou fototoxicidade imagem48.
  2. Quando a imagem de um campo de visão inteiro com um 10 X ou 20 X de objectivo, centenas de células individuais podem estar presentes. Portanto, para auxiliar de quantificação, divida o campo de visão em quadrantes menores usando ferramentas de software disponíveis. Marca as células dentro de cada quadrante separadamente (conforme descrito em etapas 3.3.1–3.6.2).
  3. Ao analisar o vídeo, rastrear cada célula em uma exibição mesclada com contraste de fase e/ou imagens fluorescentes. Use ferramentas de análise de software para criar a exibição mesclada.
    1. Começando no início do vídeo, identificar uma célula única interfase e acompanhar o seu progresso através do ciclo celular, usando o sistema ótico de fase. Para rastrear uma única célula, observe a célula de quadro a quadro pelo olho. Identificam as células de interfase devido a sua morfologia achatada (como avaliado por contraste de fase) e sua falta de condensação do DNA (como avaliado pela H2B-GFP) (figura 1A).
  4. Identificar as células que entram mitose pela observação da célula arredondamento (usando a ótica de contraste de fase) e/ou condensação cromossomo (usando H2B-GFP) (figura 1A-C). Ambos condensação de arredondamento e cromossomo da célula são facilmente visualizados pelo olho.
    1. Anote o tempo quando a célula entra em mitose. Continue rastreando o celular até que ele atinja seu destino (anáfase como passo 3.5, morte celular da mitose etapa 3.6.1 ou resvalamento mitótico etapa 3.6.2).
  5. Células de controle eficiente devem alinhar seus cromossomos e digite anáfase dentro de 1h (Figura 1). Visualize anáfase pela ótica de contraste de fase como a célula começa a beliscar em dois, ou através de visualização dos cromossomos em movimento desloca rotulado com H2B-GFP (figura 1A). Anote o tempo quando a célula sofre anáfase.
  6. Por outro lado, as células tratadas com paclitaxel permanecerá arredondadas com cromossomas condensadas durante várias horas (3-40 h) (Fig. 1B-D).
    1. Identifica as células mitotically-preso que se submetem a morte celular.
      Nota: As células que morrem durante a mitose são visualizadas por microscopia de contraste de fase, como células serão bleb, psiquiatra e/ou ruptura (figura 1B). Se imagem H2B-GFP, os cromossomos também se fragmentará durante a morte celular.
    2. Identifica as células mitotically-preso que se submetem a derrapagem da célula.
      Nota: As células que passam por deslizamento mitótico são observadas por microscopia de contraste de fase, como eles volta achatam em interfase e decondense cromossomos sem sofrer anáfase (Figura 1). Células que passam por deslizamento mitótico dão origem a células tetraploide grandes que são frequentemente multinucleada (Figura 1).
  7. Continue rastreando as células do campo de vista original. Uma vez que um campo de visão todo é controlado, mover para um separado do campo de visão adquirido do mesmo bem e continuar rastreando as células.

4. a análise para identificar a célula destino seguindo Slippage mitótico

  1. Avaliar o destino célula mitótica derrapagem a seguir (conforme descrito na etapa 3.6.2) usando células RPE-1 expressando o sistema FUCCI. Além de imagens de contraste de fase, é necessário adquirir tanto fluorescência vermelha (indicativa de fase de1 G) e imagens de fluorescência verde (indicativo de S/G2/M)).
    1. Rastrear as células de RPE FUCCI-1 conforme descrito na etapa 3.3 através de 3.7.
      1. Para confirmar que o sistema FUCCI está funcionando corretamente, valide que o controle de células alternativo expressão das proteínas fluorescentes vermelhas e verdes apropriadamente de análise dos dados da imagem latente de viver-pilha. Células de controle devem transição de apresentando fluorescência vermelha inteiramente nuclear para expor inteiramente nuclear fluorescência verde durante a interfase como um progresso de células de G1 a fase S. As células devem continuar apresentando fluorescência verde durante a realização da mitose. Imediatamente após a mitose, as células mais uma vez devem apresentar fluorescência totalmente vermelha durante a interfase.
        Nota: Enquanto existem métodos para quantificar tanto RFP e GFP intensidades de fluorescência do sistema em células únicas usando traços fluorescentes49FUCCI, isso muitas vezes não é necessário, como a mudança de cor de fluorescência é robusto e visível a olho nu.
  2. Identificar células presos em mitose usando microscopia de contraste de fase e rastreá-los até que passam por deslizamento mitótico, conforme descrito em 3.4 e 3.6.2. Células que deslize fora mitose e volta em interfase mudará de apresentando fluorescência verde durante a mitose para fluorescência vermelha durante a fase de1 G (Fig. 2A- C).
    1. Rastrear estas escorregou células usando o contraste de fase e epifluorescente imagem pelo olho para avaliar o seu destino de célula (Figura 2D).
      1. Identifica as células que re-introduzir o ciclo celular. Estas células são identificadas pela verde-vermelho-a mudança na expressão de fluorescência usando o sistema FUCCI que indica a transição de /S de1G (Figura 2A).
      2. Identifica as células que se submetem a detenção de ciclo celular de1 G. Estas células são identificadas pela expressão de fluorescência vermelha que persiste por > 24 h (Figura 2B).
      3. Identifica as células que morrem em interfase. Estas células são identificadas por célula ruptura/blebbing/encolhendo utilizando imagens de contraste de fase (Figura 2).

5. a análise para identificar a frequência de ruptura do Envelope Nuclear

  1. Use RPE-1 células expressando H2B-GFP e TDRFP-NIS para avaliar a ruptura do envelope nuclear. Além de imagens de contraste de fase, adquira tanto fluorescência vermelha (TRITC) e imagens de fluorescência verde (FITC). Adquira imagens cada 5min para visualizar a ruptura.
    Nota: É fundamental para gerar linhas de células em que o TDRFP-NLS é eficientemente importados para o núcleo com fluorescência citoplasmática mínima.
  2. Células de imagem conforme descrito na etapa 3.3 através de 3.4. O sinal de fluorescência TDRFP-NLS e H2B-GFP co devem localizar durante a interfase. Sobre a mitose (como visualizada pela célula arredondamento usando condensação de ótica e/ou cromossomo fase por H2B-GFP), o envelope nuclear quebrará para baixo e o sinal de TDRFP-NLS se tornará citoplasmática (Figura 3A). Após a mitose, corrige o envelope nuclear em células-filhas e o sinal de TDRFP-NLS irá tornar-se nuclear.
  3. Faixa de células-filhas durante a intérfase subsequente por imagem latente da viver-pilha. Identifica os eventos de ruptura nuclear, observando uma rajada transitória de TDRFP-NLS nuclear-localizada no citoplasma circundante. Minutos depois, o envelope nuclear será reparado e o TDRFP-NLS vai ser relocalized para o núcleo (Figura 3A).
    Nota: Muitas vezes, o DNA nuclear, como visualizado pela H2B-GFP, será visto para se projetar fora do site da ruptura como uma pequena bolha.
  4. Marca a fração de núcleos que se submetem a um evento de ruptura durante a interfase. Para marcar esta fração, contar o número de células que passam por um evento de ruptura sobre o número total de células controladas.

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Representative Results

Usando o protocolo descrito acima, as células de RPE-1 expressando H2B-GFP foram tratadas com um controle antimitótico ou veículo (DMSO) e analisadas pela imagem latente da viver-pilha. A análise revelou que 100% das células mitóticas de RPE-1 controle iniciado anáfase uma média de 22 min depois de entrar em mitose (figura 1A, D 1). Por outro lado, as células de RPE-1 tratadas com paclitaxel exibiram uma profunda apreensão mitótica dura várias horas (Figura 1). Imagem latente revelou que 48% dessas células mitotically preso sofreu morte celular mitótica (figura 1B, 1E), enquanto os restantes 52% foram submetidos a derrapagem mitótica (Figura 1, 1E).

Para avaliar o destino das células RPE-1 que sofreu deslizamento mitótico, as células de RPE-1 expressando o sistema FUCCI foram tratadas com qualquer baixa dose 50 nM paclitaxel, elevado-dose 5 µM paclitaxel, ou veículo controlar (DMSO) e analisados pela imagem latente da viver-pilha de longo prazo. Os dados revelaram que as células de RPE-1 que sofreu deslizamento mitótico após o tratamento com 50 nM paclitaxel, 22% morreram no ciclo celular subsequente (Figura 2, 2D), 72% induzida por detenção do ciclo celular (Figura 2B, 2D), e apenas 5% reentrou S-fase (Figura 2A, 2D). Por outro lado, as células de RPE-1 tratados com altas doses 5 µM paclitaxel que sofreu deslizamento mitótico, 35% morreu no ciclo celular subsequente, 65% induzida por detenção do ciclo celular, e nenhum reentrou S-fase (Figura 2D).

Curiosamente, baixa dose paclitaxel-tratamento promove a ruptura do envelope nuclear em células RPE-1 após a mitose. Após a conclusão mitótica células-filhas foram controladas e marcou para quaisquer eventos de ruptura nuclear, revelando que somente ~ 4% de controle (DMSO-tratada) RPE-1 filha células rompidas, Considerando que ~ 23% de células tratadas com 10 nM paclitaxel exibiu ruptura ( Figura 3A, 3B).

Figure 1
Figura 1: destino de células mitóticas em resposta ao tratamento antimitótica. RPE-1 células expressando estàvel H2B-GFP foram tratadas com o controle do veículo DMSO (A) ou 5 µM paclitaxel (B, C) e fotografaram usando o lapso de tempo de contraste de fase e microscopia de epifluorescência widefield para avaliar o destino da célula mitótica. Células de interfase (painéis esquerdos) foram rastreadas como eles entraram mitose (painéis de médios) e até que eles iniciaram anáfase (A), sofreu a morte celular mitótica (B) ou escorregado de mitose voltar à interfase (C). As setas brancas indicam células controladas. (D) a quantidade de tempo que controlam as células (DMSO-tratados) e células mitotic antitratado passaram na mitose, como quantificados pela imagem latente da viver-pilha (n = 100 células para cada condição). (E), a fração de células (n = 100) que sofreu morte celular mitótica, anáfase ou resvalamento mitótico em células DMSO-tratados ou tratados com 5 µM paclitaxel. H:min. tempo, barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: destino de células que passam por deslizamento mitótico. RPE-1 células estàvel expressando o sistema FUCCI foram tratadas com 50 nM paclitaxel ou 5 µM paclitaxel e fotografaram usando o lapso de tempo de contraste de fase e microscopia de fluorescência widefield para dosar o destino célula mitótica derrapagem a seguir. As células foram marcadas como qualquer re-inserir o ciclo celular, como julgado por uma fluorescência verde-vermelho-a mudança no sistema FUCCI (A); prender-se em fase de1 G, como julgado por fluorescência vermelha persistente para > 24 h (B); ou morrer durante a mitose subsequente, como julgado por blebbing/ruptura celular (C). As setas brancas indicam células controladas. (D), a fração de células (n = 100) que foram submetidos a cada destino. Barras de erro representam o desvio padrão da média de dois experimentos independentes. H:min. tempo, barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: frequência de ruptura do envelope nuclear em células tratados com paclitaxel. As células de RPE-1 estàvel expressando TDRFP-NLS e H2B-GFP foram tratadas com 10 nM paclitaxel ou veículo controlar (DMSO) e fotografada usando o lapso de tempo de contraste de fase e microscopia de epifluorescência widefield (A). Durante a mitose (metafase/anáfase) o envelope nuclear é discriminado e TDRFP-NLS se torna citoplasmática. Após a mitose, a TDRFP-NLS relocalizes para o núcleo das células de interfase (pre-ruptura). Eventos de ruptura nuclear são identificados pela deslocalização de TDRFP-NLS do núcleo para o citoplasma em células de interfase (ruptura), seguido do relocalization de TDRFP-NLS para o núcleo após reparo envelope nuclear (pós ruptura). As setas brancas indicam células controladas. (B), a fração de células (n > 100 por condição) que mostre a ruptura do envelope nuclear após a mitose, na presença de controle paclitaxel ou veículo. H:min. tempo, barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O aspecto mais importante da imagem latente da viver-pilha a longo prazo é garantir a saúde das células sendo fotografada. É essencial que as células sejam expostas a mínimas externos estressores ambientais, tais como condições precárias em relação a temperatura, umidade e/ou os níveis de CO2 . Também é importante limitar Fotodano de iluminação fluorescente de excitação, como stress de imagem é conhecido por afetar o comportamento de célula50. Limitar o Fotodano pode ser conseguido de várias maneiras, como detalhado em outro lugar,48. Em geral, é melhor usar o menor tempo de exposição necessário para produzir um sinal de fluorescência suficientemente brilhante o suficiente para controlar eficientemente as células, limitando assim a fototoxicidade. No entanto, se as células são fotografadas somente uma vez cada 10 – 20 min, exposições mais longas (que se aproximam a saturação do pixel) são normalmente bem tolerados (embora isto deve ser determinado empiricamente para cada tipo de fluoróforo e célula). Porque a imagem de células são sensíveis a estresses ambientais e de imagens, é imperativo que as células de controle são sempre incluídas em experiências de imagens ao vivo-celular e monitoradas para confirmar a proliferação normal.

Uma limitação para a imagem latente da viver-pilha a longo prazo é que ele requer equipar um microscópio existente com uma câmara ambiental que mantém a temperatura e a 5% humedecidas atmosfera de CO2 , ou uma câmara de palco-top que também é capaz de apoio à temperatura apropriada e atmosfera. Enquanto flui CO2 é o ideal, as células também podem ser fotografadas para até 48 h usando CO2-médio independente se umedecido de uma câmara ambiental com 5% de CO2 não está disponível. No entanto, muitos tipos de células são intolerantes de tal meio, e isso deve ser determinado empiricamente medindo a viabilidade e crescimento celular. Sobrepor as células com óleo mineral também pode ser usado para evitar a evaporação média.

Uma segunda grande limitação para este método é que destinos de célula de rastreamento manualmente é altamente trabalhosa e demorada. No entanto, programas de rastreamento de celular estão disponíveis e podem ser otimizados para automatizar a análise de imagem51,52,53. Uma limitação mais com esse método é que células altamente motile são frequentemente difíceis de acompanhar ao longo de períodos prolongados de tempo. Se isto constitui um problema significativo, todo o bem pode ser fotografada e as imagens costuradas para formar um grande campo de visão. Muitos programas de software suportam este método.

Autofluorescência é outra restrição que deve ser abordada com este protocolo. Vermelho de fenol livre médio reduz autofluorescência de fundo durante a imagem latente de células vivas. Também foi demonstrado que duas vitaminas comumente encontradas no meio de crescimento, riboflavina e piridoxal, pode diminuir a fotoestabilidade de proteínas fluorescentes. Assim, meio falta essas vitaminas também pode ser usado durante a fluorescência de imagem para melhorar o sinal para ruído rações. Enquanto pratos de plástico inferior são menos caros e podem fornecer resultados de imagem adequados, eles também produzem uma quantidade maior de autofluorescência que afeta negativamente a relação sinal-ruído. Além disso, pratos de plástico inferior tem maior variação de espessura, que pode interromper o recurso de autofoco de muitos microscópios. A espessura do vidro com fundo de imagem prato neste protocolo é 0,17 mm, que é o vidro ideal para uso com microscópios modernos.

Por último, filmes a longo prazo, abrangendo vários campos de visão e adquirir vários canais de fluorescência produzem arquivos de dados massivo (dezenas de gigabytes até mesmo terabytes cada), que representam um problema para o armazenamento de dados e backup. Para atenuar esse problema, recomenda-se que todas as imagens ser adquirido usar 2x2 ou 4x4 binning, fornecido a perda resultante na resolução é aceitável. Binning não apenas limita a tempos de exposição (ou seja, celulas que expressam estàvel H2B-GFP ou o sistema FUCCI devem ter exposições menos de 500 ms), mas reduz drasticamente o tamanho dos arquivos de dados (uma imagem que é de 2 x 2 binned é um quarto do tamanho do arquivo de um imagem não guardado).

Apesar dessas limitações, a imagem latente da viver-pilha a longo prazo representa o melhor método para controlar o destino célula individual de populações inteiras, especialmente quando a célula de destino é altamente heterogênea. Quanto mais viver-pilha marcadores fluorescentes e sensores tornam-se disponíveis, viver-pilha de imagem abordagens será expandido para visualizar e dosar vários aspectos adicionais da biologia celular. Por exemplo, sensores de viver-pilha existem atualmente para dosar focos de dano do ADN, níveis de p53, posição do ciclo celular e apoptose26,54,55,56,57,58 . Assim, experimentos de imagem têm a capacidade de revelar as propriedades celulares subjacentes que determinam como e por que células únicas variàvel respondem a agentes quimioterápicos.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

AFB, MAV e NJG gostaria de agradecer Ryan Quinton para comentários sobre o manuscrito e Adrian sálica para a construção de TDRFP-NLS. AFB e MAV são financiados pelo 5T32GM008541 NIGMS Biomolecular farmacologia formação Grant. NJG é um membro da ISA e Ashraf Dahod laboratórios de pesquisa de câncer da mama e é apoiado por subsídios de NIH GM117150 e CA-154531, a Karin Grunebaum Foundation, programa de prêmios da família Smith, o programa de estudiosos de Searle e a pesquisa de Melanoma Aliança.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
phenol red-free, DMEM:F12 media Hyclone SH3027202
10% fetal bovine serum (FBS) Gibco 10438026
100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. Gibco 15070063
PBS Gibco 10010049
0.25% Trypsin/EDTA Gemini 50-753-3104
12-well glass bottomed imaging dish Cellvis P12-1.5H-N
Paclitaxel TSZ Chem RS036
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma NC0215085
Environmental Chamber In Vivo Scientific
5% CO2 Airgas Z03NI7432000201
15 mL Conical Tubes Fisherbrand 05-539-12
10 cm polystyrene tissue culture plates Falcon 08772E
10 mL Disposable Serological Pipette Fisherbrand 4488
5804R 15 amp Centrifuge Eppendorf 97007-370
1000 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
20 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
p1000 Pipette Tips Sharp p1126
p20 Pipette Tips Sharp P1121
RPE-1 Cells ATCC CRL-4000
Incubator Galaxy 170S Eppendorf CO17011005
Pipette Boy Integra 156401
Hemacytometer Fisher Scientific 0267110
Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging Micro Video Instruments, Inc. MEA53100
Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator Micro Video Instruments, Inc. 500-H117P1N4
Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders Micro Video Instruments, Inc. 500-H31XYZE
Andor Digital Camera Micro Video Instruments, Inc. D10NLC
Nikon NIS Elements AR Software Micro Video Instruments, Inc. MQS31000
SOLA LED Illuminator for Fluorescence Micro Video Instruments, Inc. SOLA-E
InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control Micro Video Instruments, Inc. Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece Micro Video Instruments, Inc. MEP59391
Ti-C System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL51000
Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL56200
Te-C LWD Ph1 Module Micro Video Instruments, Inc. MEH41100
CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm Micro Video Instruments, Inc. MRH10101
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective Micro Video Instruments, Inc. MRH48230

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