Langsiktig Live-celle Imaging for å vurdere celle skjebne som svar på paklitaxel

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Live-celle imaging gir et vell av informasjon på enkeltceller eller hele befolkninger som er uoppnåelig av fast celle imaging alene. Her beskrives live-celle tenkelig protokoller for å vurdere celle skjebne beslutninger etter behandling med anti-mitotisk stoffet paklitaxel.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bolgioni, A. F., Vittoria, M. A., Ganem, N. J. Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel. J. Vis. Exp. (135), e57383, doi:10.3791/57383 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Live-celle imaging er en kraftfull teknikk som kan brukes direkte visualisere biologiske fenomener i enkeltceller over lengre tid. Det siste tiåret, har nye og innovative teknologier kraftig forbedret praktisk bruk av live-celle bildebehandling. Celler kan nå holdes i fokus og kontinuerlig avbildes over flere dager mens opprettholdes under 37 °C og 5% CO2 celle kultur forhold. Dessuten kan flere synsfelt som representerer ulike eksperimentelle forhold skaffes samtidig gir høy gjennomstrømming eksperimentelle data. Live-celle imaging gir en betydelig fordel over fast-celle bildebehandling ved at for direkte visualisering og tidsmessige kvantifisering av dynamiske mobilnettet hendelser. Live-celle bildebehandling kan også identifisere variasjon i virkemåten for enkeltceller som ville ellers mangler ved hjelp av befolkningen-baserte analyser. Her beskriver vi live-celle tenkelig protokoller for å vurdere celle skjebne beslutninger etter behandling med anti-mitotisk stoffet paklitaxel. Vi viser metoder å visualisere om mitotically arrestert celler dør direkte fra mitose eller gli tilbake i interphase. Vi beskriver også hvordan fluorescerende ubiquitination-baserte celle syklus indikator (FUCCI) systemet kan brukes til å vurdere brøkdel av interphase celler født fra mitotisk glidning som er i stand til å skrive inn celle syklus. Til slutt, beskriver vi en live-celle bildebehandling metode for å identifisere kjernefysiske konvolutten ruptur hendelser.

Introduction

Anti-mitotisk narkotika har lenge vært brukt i de chemotherapeutic regimer av ulike typer solide svulster og ofte viser stor effekt1,2,3. Mechanistically, disse stoffene forstyrre normal mitotisk progresjon og fremme mitotisk arrestasjon i raskt voksende kreftceller. Men cellen skjebne svar mitotisk arrestasjonen er svært variabel: mens en brøkdel av cellene gjennomgår celledød direkte fra mitose, andre avslutte mitose og gå tilbake til interphase som tetraploid celler (en prosess kalt mitotisk glidning)4, 5,6,7,8. Disse interphase cellene kan utføre apoptose, gjennomgå permanente celle syklus arrestasjon eller selv re-Enter celle syklus4,5,6,7,8,9 ,10,11. Celler som unngå mitotisk celledød ved slipping i interphase, bare å skrive inn celle syklus etter narkotika, derfor bidra til re-fremveksten av kreft celle populasjoner. Videre tilbakefall celler at slip fra mitose er tetraploid, og tetraploidy er kjent for å fremme kromosom ustabilitet som driver svulst12,13,14,15. Definere faktorer som kontrollerer celle skjebne svar på anti-mitotisk medikamentelle behandlinger er derfor viktig å optimalisere gjeldende therapeutics.

I denne protokollen beskriver vi metoder for å direkte observere og studere skjebnen til celler som gjennomgår langvarig mitotisk arrestasjonen svar på anti-mitotisk stoffet paklitaxel. Paklitaxel er en etablert terapeutiske i klinikken og har vist seg svært effektiv i mange svulster typer, inkludert de av bryst, eggstokker og lungene16,17,18,19, 20. paklitaxel, som er en plante alkaloid fra Barken av barlind treet, stabiliserer piskehale som henger og dermed hindrer deres dynamicity21,22. Mens dempe av microtubule dynamikk av paklitaxel ikke påvirker cellen syklus progresjon fra G1 -G2, fører stoffet til vedvarende aktivering av spindelen montering sjekkpunkt under mitose ved å hindre kinetochore-microtubule vedlegg (omtalt i dybden her23,24)25. Som en konsekvens, deaktiveres anaphase utbruddet i paklitaxel-behandlet celler og resultater i en langvarig mitotisk arrestasjon.

Denne protokollen først beskrive tilnærminger identifisere mitotisk celler i live-celle tenkelig eksperimenter. Mitose kan visualiseres i tilhenger vev kultur celler på grunn av to merkbare celle biologiske endringer. Først bli kromosomene svært kondensert umiddelbart før kjernefysiske konvolutten sammenbrudd. Mens ofte oppdages av standard kontrast mikroskopi, kan kromosom kondens klarere oppdages bruke fluorescerende tags at etiketten kromosomene (f.eks fluorescently-merket histone proteiner). Andre, mitotisk celler kan også bli identifisert av de dramatiske morfologiske endringene som følge av cellen avrunding.

Denne protokollen vil deretter demonstrere hvordan bruke live-celle tenkelig tilnærminger følge skjebnene til celler opplever langvarig mitotisk arrestasjon. Celler arrestert i mitose gjennomgå en av tre forskjellige skjebne. Først kan celler gjennomgå celledød under mitose. Dette fenomenet er lett visualisert ved * lys, døende celler er observert å krympe, bleb, brudd. Andre celler kan avslutte mitose og tilbake tilbake til interphase uten kromosom segregering eller cytokinesis, en prosess kalt mitotisk glidning. Decondensation av kromosomer og/eller flatere mitotisk cellen lett identifiserer denne prosessen. Celler som sett fra mitose også ofte vise uregelmessig, multi lobed kjerner og ofte havn flere mikronuklei5. Tredje kan celler arrestert i mitose starte anaphase og Fortsett gjennom mitose etter forsinkelser. Mens uvanlig på høyere narkotika konsentrasjoner, antyder dette at de arresterte cellene kan har oppfylt spindelen montering sjekkpunkt, eller at spindelen montering kontrollpunktet er delvis svekket eller defekt. Anaphase utbruddet kan visualiseres kromosom segregering og påfølgende cytokinesis med live-celle imaging.

Live-celle tenkelig metoder for å spore skjebnen til celler som unngå mitotisk celledød ved gjennomgår mitotisk glidning også beskrives. Celler som gjennomgår mitotisk glidning enten dø i den påfølgende interphase, utløse en holdbar G1 celle syklus arrestasjon eller re-gå inn i cellen syklus for å starte en ny runde med celledeling4. En tilnærming som bruker FUCCI (fluorescerende ubiquitination-baserte celle syklus indikator) systemet til å bestemme brøkdel av celler som re-Enter cellen syklus etter mitotisk glidning vil bli beskrevet. FUCCI tillater direkte visualisering av G1/S overgangen og kan brukes sammen med langsiktige live-celle imaging både i vitro og vivo26,27. FUCCI systemet utnytter to fluorescently merket proteiner, avkortet former for hCdt1 (chromatin lisensiering og utryddelse faktor 1) og hGeminin, som nivåer svinge basert på celle syklus posisjon. hCdt1 (smeltet en rød fluorescerende protein) er tilstede på høye nivåer under G1 fase hvor det fungerer for å lisensiere DNA for replikering, men er ubiquitinated av E3 ubiquitin ligase SCFSkp2 og degradert S/G2/M faser å hindre Re replikering av DNA26. Derimot hGeminin (smeltet en grønn fluorescerende protein), er en inhibitor av hCdt1 hvis nivåer topp under S/G2/m, men er ubiquitinated av E3 ubiquitin ligase APCCdh1 og degradert på slutten av mitose og hele G1 26. derfor FUCCI leverer en grei fluorescens avlesning av cellen syklus fase, som cellene viser rød fluorescens under G1, og grønn fluorescens under S/G2/M. FUCCI systemet er en betydelig fordel over andre tilnærminger (for eksempel bromodeoxyuridine farging) til å identifisere proliferativ celler, fordi det krever ikke cellen fiksering og gir enkelt celle tenkelig uten behov for ekstra farmakologiske behandlinger for å synkronisere celle populasjoner. Om ikke omtalt i denne protokollen, har ekstra live-celle sensorer også blitt utviklet for å visualisere celle syklus progresjon, inkludert en helicase B sensor G128, DNA ligase-RFP29 og PCDNA-GFP30 sensorer S-fase, og siste FUCCI-4 sensoren, som oppdager alle stadier av celle syklus31.

Til slutt, en live-celle bildebehandling metode til å gjenkjenne kjernefysiske konvolutten ruptur beskrives. Nyere studier har avdekket at kjernefysisk konvoluttene av kreftceller er ustabil og utsatt for sprekker, og dermed slik at innholdet i nucleoplasm og cytoplasma å intermix. Dette fenomenet er kalt kjernefysiske brudd, kan fremme DNA skade og stimulering av medfødte immunforsvaret32,33,34,35,36,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. mens de underliggende årsakene til kjernefysiske ruptur fortsatt ufullstendig preget, det er kjent at deformasjoner kjernefysiske struktur korrelerer med økt forekomst av kjernefysiske ruptur42. En velkjent effekten av paklitaxel behandling er generasjon av påfallende unormal kjernefysiske strukturer etter mitose; slik beskrives metode ved hjelp av live-celle imaging for å kvantifisere kjernefysiske ruptur, mens også utforske paklitaxel behandling øker frekvensen av kjernefysiske ruptur hendelser. Kjernefysisk brudd kan oppdages av observerte lekkasje av et kjernefysisk målrettede fluorescerende protein i cytoplasma (f.eks en tandem dimer gjenta av RFP smeltet til et kjernefysisk lokalisering signal, TDRFP-NLS). Denne lekkasje er tydelig synlig av øyet, som muliggjør enkel kvantifisering av brudd hendelser.

Denne protokollen krever widefield epifluorescence mikroskop som er utstyrt med en kodet scenen og autofokusering programvare. Kodet scenen gir presis automatiserte bevegelsen til definerte X-og Y-koordinater, mens autofokus programvaren opprettholder celler i fokus for varigheten av tenkelig perioden. I tillegg denne protokollen krever utstyr å opprettholde fuktet cellene på 37 ° C med 5% CO2 atmosfære. Dette kan oppnås ved å sette hele mikroskopet innenfor en temperatur og atmosfære kontrollert kabinett, eller ved hjelp av scenen-top-enheter som lokalt opprettholder temperatur og miljø. Kontrast målet i denne protokollen er en plan fluor 10 x med en numerisk blenderåpning av 0,30. 20 X mål er imidlertid også nok til å identifisere både avrundet mitotisk og flat interphase celler i en enkelt fokalplanet. Hvis utfører kontrast kan imaging (som beskrevet i denne metoden), dekselet være enten glass eller plast. Hvis differensial forstyrrelser kontrast (DIC) mikroskopi brukes, er det viktig å bruke en glass cover for å hindre depolarization av lys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen fokuserer på bruk av ikke-transformert og chromosomally stabile retinal pigmentert epiteliale (RPE-1) cellen linjen for live-celle tenkelig eksperimenter. Men kan denne protokollen tilpasses alle tilhenger celle linje så lenge cellen oppdrettsforholdene justeres etter behov. Alle prosedyrer må overholde institusjonelle biosikkerhet og etiske retningslinjer og regler.

1. klargjør celler for Live-celle Imaging

  1. Bruke fersk tinte og tidlig passering RPE-1 celler uttrykke menneskelige histone H2B smeltet til et fluorescerende protein (f.eks H2B-GFP), eller FUCCI systemet (en detaljert protokollen på hvordan å generere FUCCI-uttrykke celler finnes i referanse45) å vurdere mitotisk celle skjebne.
    1. For å måle frekvensen av kjernefysiske brudd, kan du bruke RPE-1 celler uttrykke både H2B-GFP og en tandem dimer av røde fluorescerende protein smeltet sammen til en enkelt kjernefysiske lokalisering signal (TDRFP-NLS).
      Merk: Konstruksjoner av tre grønne fluorescerende proteiner smeltet sammen til en enkelt kjernefysiske lokalisering signal (GFP3- NLS) har også blitt brukt til å demonstrere ruptur (som referanse42).
    2. Vedlikeholde celler på 10 cm vev kultur plater i riktig vekst medium. RPE-1 celler blir vedlikeholdt i fenol red-fri, Dulbeccos endret Eagle Medium/næringsstoff blanding F-12 (DMEM:F12) supplert med 10% fosterets bovin serum (FBS), 100 IU/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin.
  2. Sug opp mediet cellene, vask vev kultur parabol med 10 mL steril, romtemperatur fosfat bufret saltoppløsning (PBS) for å fjerne gjenværende medium og deretter Sug opp PBS.
    1. Legge til 2 mL 0,25% Trypsin med ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) til cellene og Inkuber på 37 ° C i 3 minutter eller til fleste cellene har løsrevet fra platen.
      Merk: Ikke holde celler i trypsin lengre enn nødvendig.
  3. Legge til 10 mL av komplett medium å samle trypsinized cellene med en 10 mL serologisk stripette og dispensere i et 15 mL konisk rør.
    1. Pellets cellene med sentrifugering 180 x g for 3 min ved romtemperatur.
  4. Sug opp nedbryting, pass på ikke å forstyrre pellets, og deretter grundig resuspend pellet i 10 mL av fersk medium ved forsiktig pipettering mediet opp og ned i serologisk stripette.
  5. Bruk en hemocytometer eller automatisert celle telling maskin for å telle celler46.
    1. Fortynne celler i en ny konisk tube til 30.000 celler/mL av komplett medium.
    2. Plate 30.000 RPE-1 celler (1 mL volum) per brønn av en 12-vel glass bottomed (#1.5 tykkelse) imaging parabolen for å oppnå nødvendig mobilnettet tetthet neste dag (30-50% confluent).
      Merk: Alltid håndtere platen med hansker og være forsiktig med å ta glass-bunnen.
  6. Tillate at celler vokse i en 37 ° C vev kultur inkubator før de fullt fester og flat på glassbunn tenkelig tallerkenen. Mens celler kan knytte i så lite som 4 h, anbefales det at celler ikke er behandlet med narkotika og fotografert til det fulgte dag.
  7. Legg til paklitaxel (oppløst i dimethyl sulfoxide (DMSO)) til ønsket endelige konsentrasjonen i fullstendig medium og bland godt.
    1. Forberede komplett medium med en lik mengde DMSO alene for å bruke som en kontroll.
    2. Varm mediet inneholder stoff eller DMSO til 37 ° C før du legger til celler. Dette hindrer fokal drift på grunn av plutselige temperatur endring.
    3. Legg 1 mL av mediet som inneholder paklitaxel eller DMSO alene individuelle brønner på 12-vel tenkelig parabolen.

2. opprette mikroskop for Live-celle Imaging

  1. Rengjør glasset-nederst tenkelig parabolen med optisk renere å fjerne fingeravtrykk eller støv som kan forstyrre bildebehandling. Bruk tilstrekkelig optisk når våt hele glassplaten.
  2. Plasser glass-bottom rett på mikroskopet scenen i tenkelig parabolen adapteren, Fjern plastdekselet fra retten og dekke parabolen med en glass-toppet kammer. Sikre kammeret har en ventil som tillater en jevn flyt av luft som består av 5% CO2.
    Merk: Til humidify 5% CO2, gassen er strømmet gjennom slangen settes inn i et sterilt vann bad hus. Dette gir gassen til bli equilibrated til 95% luftfuktighet.
  3. Start/kalibrere kodet scenen bruke programmet kontrollere mikroskopet. Dette vil sikre nøyaktige X-og Y-koordinater og hindre fokal drift.
  4. Fokus på cellene med kontrast optikk og utføre Kohler belysning (beskrevet i detalj i referanse47) å fokusere lys og gir optimal kontrast.
  5. Bruk oppkjøpet programvare for å fastslå de optimale eksponeringstider for hvitt lys og alle fluorescerende kanaler brukes (eksponeringer at gi 75% pixel metning på kameraet er ideell, forutsatt at denne mengden lys ikke er giftig celler).
    1. Bruk oppkjøpet programvare til å velge flere ikke-overlappende synsfelt fra hver brønn for bildebehandling. Velg imaging områdene der celler har overholdt godt glass-bunnen, og mellom 50% og 70% confluent. Unngå celleområder klumpet seg, da dette vil gjøre påfølgende analyse vanskelig.
      Merk: Det er viktig å ha ikke-overlappende synsfelt fra hver brønn for å unngå å spore de samme cellene to ganger. Hvis celler er svært motile, kan det være nødvendig å kjøpe flere bilder stråler ut fra et sentralt punkt og sy dem sammen igjen for å gjøre en stor synsfelt.
  6. Aktivere visningskroppen autofokus funksjon for å sikre at alle poengene blir vedlikeholdt i fokus for varigheten av eksperimentet.
  7. For å vurdere mitotisk celle skjebne, sette tenkelig programvare å samle bilder fra hver valgte synsfelt hvert 10 min opp til 96 h. Unperturbed mitose varer 20-40 minutter, og dermed 10 min intervaller vil gi nok prøve å identifisere når cellene deler. For å identifisere kjernefysiske brudd, som er en forbigående hendelse, hente bilder hver 5 min.
    Merk: Sørg for at datamaskinen kjører image oppkjøpet programvare har automatisk oppdatering, skjermsparere og energibesparende moduser deaktivert, som disse kan ofte forstyrre bildeopptak over lang eksperimenter.
  8. Starte tenkelig eksperimentet. Regelmessig Bekreft at bildeopptak kjører jevnt i løpet av videoen.

3. video analyse å identifisere celle skjebne som svar på paklitaxel

  1. Bekreft at fotografert celler er friske i løpet av tenkelig eksperimentet. Kontroll-cellene behandlet med DMSO bør være levedyktig og aktivt voksende.
    Merk: Hvis cellene viser tegn på stress, ikke quantitate videoen og i stedet fokusere på å optimalisere imaging forhold48. Tegn Imaging stress inkludere blebbing/døende celler, celler som ikke klarer å knytte/spredning på tallerkenen, og celler som viser en lav mitotisk indeks og/eller langvarig mitose. Mulige kilder til stress inkludere svingninger i temperatur og CO2 nivåer innenfor tenkelig kammer eller Phototoksisitet48.
  2. Når imaging en hele synsfeltet med en 10 X eller 20 X mål, kan hundrevis av individuelle celler være tilstede. Derfor hjelp med kvantifisering, dele synsfelt i mindre kvadranter med tilgjengelig programvareverktøy. Score celler i hver kvadrant separat (som beskrevet i trinn 3.3.1–3.6.2).
  3. Når analysere video, spore hver celle i en flettet visning ved hjelp av fase kontrast og/eller fluorescerende bilder. Bruk programvareverktøy for å opprette flettede visningen.
    1. Starter i begynnelsen av videoen, identifisere en enkelt interphase celle og spore fremdriften gjennom cellen syklus med fase optikk. For å spore en enkeltcelle, observere cellen fra bilde til bilde av øyet. Identifisere interphase celler deres flat morfologi (som vurdert av fase kontrast) og deres mangel på DNA kondens (som vurdert av H2B-GFP) (figur 1A).
  4. Identifisere celler som angir mitose ved observasjon av cellen avrunding (bruker kontrast optikk) og/eller kromosom kondens (med H2B-GFP) (figur 1A-C). Både celle avrunding og kromosom kondens er lett å visualisere av øyet.
    1. Kommentere gangen når cellen mitose. Fortsette sporing cellen til den når dens skjebne (anaphase som trinn 3.5, celledød fra mitose som i trinn 3.6.1 eller mitotisk glidning som i trinn 3.6.2).
  5. Kontroll celler skal effektivt justere deres kromosomene og angi anaphase innen 1 h (figur 1 d). Visualisere anaphase ved kontrast optikk som cellen begynner å knipe inn to eller gjennom visualisering av poleward bevegelse kromosomene merket med H2B-GFP (figur 1A). Kommentere tiden når cellen gjennomgår anaphase.
  6. Derimot blir cellene behandles med paklitaxel avrundet med kondensert kromosomer i flere timer (3-40 h) (figur 1B-D).
    1. Identifisere mitotically arrestert cellene som gjennomgå celledød.
      Merk: Celler som dør under mitose er visualisert ved kontrast mikroskopi, som cellene vil bleb, krympe og/eller brudd (figur 1B). Hvis imaging H2B-GFP, vil også kromosomene fragmentere under celledød.
    2. Identifisere mitotically arrestert cellene som gjennomgå celle glidning.
      Merk: Celler som gjennomgår mitotisk glidning er observert av kontrast mikroskopi, som de flate tilbake til interphase og decondense kromosomene uten gjennomgår anaphase (figur 1 c). Celler som gjennomgå mitotisk glidning gi opphav til store tetraploid celler som er ofte multinucleated (figur 1 c).
  7. Fortsette spore celler fra opprinnelige synsfelt. Når en hel synsfelt spores, flytte til en egen synsfelt kjøpt fra samme godt og fortsette sporing celler.

4. video analyse å identifisere celle skjebne etter mitotisk glidning

  1. Vurdere celle skjebne etter mitotisk glidning (som beskrevet i trinn 3.6.2) ved hjelp av RPE-1 celler uttrykke FUCCI systemet. I tillegg kontrast avbildning, er det nødvendig å skaffe seg både rød fluorescens (indikativ G1 fase) og grønne fluorescens (indikativ av S/G2/M) bilder).
    1. Spore FUCCI RPE-1 celler som beskrevet i trinn 3.3 gjennom 3.7.
      1. For å bekrefte at FUCCI systemet fungerer, kan du validere at kontroll celler alternative uttrykk for røde og grønne fluorescerende proteiner riktig fra analyse av live-celle bildebehandling data. Kontroll celler bør overgangen fra utstilling helt kjernefysiske røde fluorescens til utstilling helt kjernefysiske grønne fluorescens under interphase som cellene fremgang fra G1 til S fase. Celler fortsatt viser grønne fluorescens gjennom mitose er fullført. Umiddelbart etter mitose, bør celler igjen viser helt rød fluorescens under interphase.
        Merk: Mens det finnes metoder for å kvantifisere både RFP og GFP fluorescens intensiteter fra FUCCI systemet i enkeltceller med fluorescerende spor49, dette er ofte ikke nødvendig fargeendring fluorescens er robust og synlig av øyet.
  2. Identifisere celler arrestert i mitose bruke kontrast mikroskopi og spore dem før de gjennomgå mitotisk glidning, som beskrevet i 3.4 og 3.6.2. Celler som slip fra mitose og tilbake til interphase endres fra utstilling grønne fluorescens under mitose til rød fluorescens under G1 fase (figur 2A- C).
    1. Spore disse gled celler ved hjelp av fase kontrast og epifluorescent imaging av øye å vurdere deres cellen skjebne (figur 2D).
      1. Identifisere celler som skriver du inn celle syklusen på nytt. Disse cellene er identifisert av rød til grønn endringer i fluorescens uttrykk bruker FUCCI system som angir G1/S overgang (figur 2A).
      2. Identifisere celler som gjennomgår G1 celle syklus arrestasjon. Disse cellene er identifisert av uttrykk for rød fluorescens som vedvarer > 24 h (figur 2B).
      3. Identifisere celler som dør i interphase. Disse cellene er identifisert av cellen ruptur/blebbing/krymper med kontrast imaging (figur 2C).

5. video analyse å identifisere frekvensen av kjernefysiske konvolutten brudd

  1. Bruk RPE-1 celler uttrykke H2B-GFP og TDRFP-NLS for å vurdere kjernefysiske konvolutten brudd. I tillegg til kontrast avbildning, kan du kjøpe både rød fluorescens (TRITC) og grønne fluorescens (FITC) bilder. Hente bilder hver 5 min for å visualisere brudd.
    Merk: Det er viktig å generere linjer der TDRFP-NLS effektivt importeres til kjernen med minimal cytoplasmatiske fluorescens.
  2. Bildet celler som beskrevet i trinn 3.3 gjennom 3.4. TDRFP-NLS fluorescens signalet og H2B-GFP bør co lokalisere under interphase. Ved mitose (som visualisert celle avrunding bruker fase optikk og/eller kromosom kondens ved H2B-GFP), den kjernefysiske konvolutten vil bryte ned og TDRFP-NLS signalet blir cytoplasmatiske (figur 3A). Etter mitose, den kjernefysiske konvolutten vil reformen i datter celler og TDRFP-NLS signalet blir kjernefysiske.
  3. Spore datter celler i hele det påfølgende interphase av live-celle tenkelig. Identifisere kjernefysiske ruptur hendelser ved å observere et forbigående utbrudd av kjernefysiske lokalisert TDRFP-NLS til omkringliggende cytoplasma. Innen minutter, den kjernefysiske konvolutten vil bli reparert og TDRFP-NLS vil bli relocalized til kjernen (figur 3A).
    Merk: Ofte kjernefysiske DNA, som visualisert ved H2B-GFP, vil bli sett til å stikke ruptur område som en liten bleb.
  4. Score brøkdel av kjerner som gjennomgå en ruptur hendelse under interphase. Å score denne fraksjonen, antall celler som gjennomgår en ruptur hendelse over det totale antallet celler sporet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor, ble RPE-1 celler uttrykke H2B-GFP behandlet med en anti-mitotisk eller kjøretøy kontroll (DMSO) og analysert av live-celle tenkelig. Analysen avdekket at 100% av kontroll mitotisk RPE-1 celler initiert anaphase gjennomsnittlig 22 min etter inn mitose (figur 1A, 1 D). I motsetning utstilt RPE-1-cellene behandles med paklitaxel en dyp mitotisk arrestasjonen varer flere timer (figur 1 d). Bildebehandling viste at 48% av disse mitotically arrestert cellene gjennomgikk mitotisk celledød (figur 1B, 1E), mens de resterende 52% gjennomgikk mitotisk glidning (figur 1 c, 1E).

For å vurdere skjebnen til RPE-1 celler som gjennomgikk mitotisk glidning, RPE-1 celler uttrykke FUCCI systemet ble behandlet med en lav dose 50 nM paklitaxel, høy dose 5 µM paklitaxel, eller kjøretøy kontroll (DMSO) og analysert av langsiktig live-celle tenkelig. Dataene viser at RPE-1-celler som gjennomgikk mitotisk forsinkelse etter behandling med 50 nM paklitaxel, 22% døde i påfølgende cellen syklus (figur 2C, 2D), 72% indusert celle syklus arrestasjon (figur 2B, 2D), og bare 5% nytt inn S-fase (figur 2A, 2D). I motsetning RPE-1 cellene behandlet med høy dose 5 µM paklitaxel som gjennomgikk mitotisk glidning, 35% døde i påfølgende cellen syklus, 65% indusert celle syklus arrestasjon, og re inn ingen S-fase (figur 2D).

Interessant, fremmer lav dose paklitaxel behandling kjernefysiske konvolutten brudd i RPE-1 celler etter mitose. Etter mitotisk var datter celler spores og scoret for noen kjernefysisk ruptur hendelser, avslører at bare ~ 4% av kontroll (DMSO-behandlet) RPE-1 datter celler sprukket, mens ~ 23% av datter-cellene behandlet med 10 nM paklitaxel utstilt ruptur ( Figur 3A, 3B).

Figure 1
Figur 1: mitotisk celle skjebne svar på anti-mitotisk behandling. RPE-1 celler uttrykke stabilt H2B-GFP ble behandlet med DMSO kjøretøy kontroll (A) eller 5 µM paklitaxel (B, C) og fotografert med time-lapse kontrast og widefield epifluorescence mikroskopi for å vurdere mitotisk celle skjebne. Interphase celler (venstre panel) ble sporet som de inn mitose (midten panel) og til de enten startet anaphase (A), gjennomgikk mitotisk celledød (B) eller gled fra mitose tilbake til interphase (C). Hvite pilene viser merkede celler. (D) tiden kontrollen celler (DMSO-behandlet) og anti-mitotic-behandlet celler brukt i mitose, som quantitated av live-celle tenkelig (n = 100 celler for hvert vilkår). (E) brøkdel av celler (n = 100) som gjennomgikk anaphase, mitotisk celledød eller mitotisk glidning i DMSO-behandlet celler eller celler som behandles med 5 µM paklitaxel. Tid, h:min. skala Bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjebnen til celler som gjennomgå mitotisk glidning. RPE-1 celler uttrykke stabilt FUCCI systemet ble behandlet med 50 nM paklitaxel eller 5 µM paklitaxel og fotografert med time-lapse kontrast og widefield fluorescens mikroskopi for å quantitate celle skjebne etter mitotisk glidning. Cellene ble scoret som enten kommer inn i cellen syklus, som dømmes av en rød til grønn fluorescens endring i FUCCI systemet (A); fengslende i G1 fase, som bedømmes av vedvarende røde fluorescens for > 24 h (B); eller døde under den påfølgende mitose, som dømmes av mobilnettet blebbing/brudd (C). Hvite pilene viser merkede celler. (D) brøkdel av celler (n = 100) som gjennomgikk hver skjebne. Feilfelt representerer standarden avvik fra gjennomsnittet fra to uavhengige eksperimenter. Tid, h:min. skala Bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: frekvens av kjernefysiske konvolutten brudd i paklitaxel-behandlet celler. RPE-1 celler uttrykke stabilt TDRFP-NLS og H2B-GFP ble behandlet med 10 nM paklitaxel eller redskap kontroll (DMSO) og fotografert time-lapse kontrast og widefield epifluorescence mikroskopi (A). Under mitose (Metaphase/Anaphase) den kjernefysiske konvolutten brytes ned og TDRFP-NLS blir cytoplasmatiske. Etter mitose relocalizes TDRFP-NLS til kjernen av interphase celler (pre brudd). Kjernefysisk ruptur hendelser identifiseres av delocalization av TDRFP-NLS fra kjernen til cytoplasma i interphase celler (brudd), etterfulgt av relocalization av TDRFP-NLS til kjernen etter kjernefysiske konvolutten reparasjon (etter brudd). Hvite pilene viser merkede celler. (B) brøkdel av celler (n > 100 per betingelse) som viser kjernefysiske konvolutten ruptur etter mitose i nærvær av paklitaxel eller redskap kontroll. Tid, h:min. skala Bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det viktigste aspektet av langsiktig live-celle imaging er å sikre helsen til cellene blir fotografert. Det er viktig at celler bli utsatt for minimalt overflødig miljø stressorer, som substandard forhold vedrørende temperatur, fuktighet eller CO2 -nivåer. Det er også viktig å begrense photodamage fra fluorescerende eksitasjon belysning, som imaging stress er kjent for å påvirke celle atferd50. Begrense photodamage kan oppnås på flere måter som beskrevet andre steder48. Generelt, er det best å bruke den korteste eksponeringstiden som er nødvendig for å produsere et tilstrekkelig sterkt nok fluorescens signal å effektivt spore celler, og dermed begrense Phototoksisitet. Men hvis cellene er fotografert bare en gang hvert 10-20 min, han (som nærmer pixel metning) er vanligvis godt tolerert (selv om dette må avgjøres empirisk for hver fluorophore og celle). Fordi fotografert celler er følsomme for både miljø og tenkelig påkjenninger, er det viktig at kontroll celler er alltid inkludert i live-celle tenkelig eksperimenter og overvåkes for å bekrefte normal spredning.

En begrensning langsiktige live-celle bildebehandling er at det krever utstyre en eksisterende mikroskop med enten en miljømessig chamber som opprettholder temperatur og 5% fuktet CO2 atmosfære eller en scene-top kammer som også kan støtter riktig temperatur og atmosfære. Flytende CO2 er optimal, cellene også kan avbildes opptil 48 h bruker CO2-uavhengig medium hvis en miljømessig kammer med 5% fuktet CO2 er ikke tilgjengelig. Men mange celletyper er intolerante av slike medium, og dette må avgjøres empirisk ved å måle cellevekst og levedyktighet. Overliggende cellene med mineralolje kan også brukes til å hindre middels fordampning.

En andre stor begrensning til denne metoden er at manuelt sporing celle skjebne er svært arbeidskrevende og tidkrevende. Men cellen-sporing programmer er tilgjengelige og kan optimaliseres for å automatisere bilde analyse51,52,53. En ytterligere begrensning med denne metoden er at svært motile celler er ofte vanskelig å spore over lengre tid. Hvis dette utgjør et betydelig problem, hele også kan avbildes og bilder stitched sammen for å danne en stor synsfelt. Mange programmer støtter denne metoden.

Autofluorescence er en annen betingelse som må tas med denne protokollen. Fenol red fri medium reduserer bakgrunn autofluorescence under levende celle bildebehandling. Det har også vist at to vitaminer ofte funnet i vekst medium, riboflavin og pyridoxal, kan redusere photostability fluorescerende proteiner. Dermed kan medium mangler disse vitaminer også brukes under fluorescens imaging for å forbedre signal til støy rasjoner. Mens plast nederst retter er billigere og gir tilstrekkelig imaging resultater, produserer de også en større mengde autofluorescence som negativt påvirker signal-til-støy-forhold. I tillegg har plast nederst retter større variasjon i tykkelse, som kan forstyrre funksjonen autofokus av mange mikroskop. Tykkelsen på glass bunn tenkelig parabol på denne protokollen er 0,17 mm, som er ideelt glasset for bruk med moderne mikroskop.

Endelig, langsiktig filmer omfatter flere synsfelt og skaffe flere fluorescens kanaler produserer massive datafiler (spent av gigabytes selv terabyte hver), som utgjør et problem for datalagring og sikkerhetskopiering. For å løse dette problemet, anbefales det at alle bilder anskaffes ved hjelp av 2 x 2 eller 4 x 4 binning, den resulterende tap i oppløsning er akseptabelt. Binning begrenser ikke bare eksponeringstider (i.e. celler uttrykke stabilt H2B-GFP eller FUCCI systemet bør ha eksponeringer mindre enn 500 ms), men også drastisk reduserer størrelsen på datafiler (et bilde som er binned 2 x 2 er en fjerdedel filstørrelsen på en ikke-binned bilde).

Til tross for disse begrensningene representerer langsiktig live-celle imaging den beste måten å spore enkeltcelle skjebne fra hele befolkninger, spesielt når cellen skjebne er svært heterogen. Som mer live-celle fluorescerende markører og sensorer blir tilgjengelig, live-celle vil imaging tilnærminger bli utvidet til å visualisere og quantitate flere flere aspekter av cellebiologi. For eksempel finnes live-celle sensorer for å quantitate DNA skade foci, p53 nivåer, celle syklus posisjon og apoptose26,54,55,56,57,58 . Dermed har tenkelig eksperimenter kapasitet til å avsløre underliggende mobilnettet egenskapene som styrer hvordan og hvorfor enkeltceller svare ulik chemotherapeutic agenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

AFB, MAV og NJG ønsker å takke Ryan Quinton for kommentarer på manuskriptet og Adrian Saliske for den TDRFP-NLS-konstruksjonen. AFB og MAV er finansiert av NIGMS Biomolecular farmakologi trening Grant 5T32GM008541. NJG er medlem av Shamim og Ashraf Dahod Breast Cancer Research Laboratories og støttes av NIH tilskudd GM117150 og CA-154531, Karin Grunebaum Foundation, Smith familie Awards programmet, programmet Searle forskere og melanom forskning Alliansen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
phenol red-free, DMEM:F12 media Hyclone SH3027202
10% fetal bovine serum (FBS) Gibco 10438026
100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. Gibco 15070063
PBS Gibco 10010049
0.25% Trypsin/EDTA Gemini 50-753-3104
12-well glass bottomed imaging dish Cellvis P12-1.5H-N
Paclitaxel TSZ Chem RS036
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma NC0215085
Environmental Chamber In Vivo Scientific
5% CO2 Airgas Z03NI7432000201
15 mL Conical Tubes Fisherbrand 05-539-12
10 cm polystyrene tissue culture plates Falcon 08772E
10 mL Disposable Serological Pipette Fisherbrand 4488
5804R 15 amp Centrifuge Eppendorf 97007-370
1000 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
20 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
p1000 Pipette Tips Sharp p1126
p20 Pipette Tips Sharp P1121
RPE-1 Cells ATCC CRL-4000
Incubator Galaxy 170S Eppendorf CO17011005
Pipette Boy Integra 156401
Hemacytometer Fisher Scientific 0267110
Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging Micro Video Instruments, Inc. MEA53100
Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator Micro Video Instruments, Inc. 500-H117P1N4
Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders Micro Video Instruments, Inc. 500-H31XYZE
Andor Digital Camera Micro Video Instruments, Inc. D10NLC
Nikon NIS Elements AR Software Micro Video Instruments, Inc. MQS31000
SOLA LED Illuminator for Fluorescence Micro Video Instruments, Inc. SOLA-E
InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control Micro Video Instruments, Inc. Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece Micro Video Instruments, Inc. MEP59391
Ti-C System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL51000
Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL56200
Te-C LWD Ph1 Module Micro Video Instruments, Inc. MEH41100
CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm Micro Video Instruments, Inc. MRH10101
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective Micro Video Instruments, Inc. MRH48230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76, (6), 1101-1112 (2015).
  2. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3, e411 (2012).
  3. Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents? Nat Rev Cancer. 7, (2), 107-117 (2007).
  4. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122, (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  5. Rieder, C. L., Maiato, H. Stuck in division or passing through: what happens when cells cannot satisfy the spindle assembly checkpoint. Dev Cell. 7, (5), 637-651 (2004).
  6. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, (2), 111-122 (2008).
  7. Huang, H. C., Mitchison, T. J., Shi, J. Stochastic competition between mechanistically independent slippage and death pathways determines cell fate during mitotic arrest. PLoS One. 5, (12), e15724 (2010).
  8. Shi, J., Orth, J. D., Mitchison, T. Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5. Cancer Res. 68, (9), 3269-3276 (2008).
  9. Ganem, N. J., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131, (3), 437-440 (2007).
  10. Ganem, N. J., Storchova, Z., Pellman, D. Tetraploidy, aneuploidy and cancer. Curr Opin Genet Dev. 17, (2), 157-162 (2007).
  11. Ganem, N. J., Pellman, D. Linking abnormal mitosis to the acquisition of DNA damage. J Cell Biol. 199, (6), 871-881 (2012).
  12. Sotillo, R., Schvartzman, J. M., Socci, N. D., Benezra, R. Mad2-induced chromosome instability leads to lung tumour relapse after oncogene withdrawal. Nature. 464, (7287), 436-440 (2010).
  13. Sotillo, R., et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice. Cancer Cell. 11, (1), 9-23 (2007).
  14. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, (7252), 278-282 (2009).
  15. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, (8), e6564 (2009).
  16. McGuire, W. P., et al. Cyclophosphamide and Cisplatin Compared with Paclitaxel and Cisplatin in Patients with Stage III and Stage IV Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine. 334, (1), 1-6 (1996).
  17. McGuire, W. P., et al. Taxol: a unique antineoplastic agent with significant activity in advanced ovarian epithelial neoplasms. Ann Intern Med. 111, (4), 273-279 (1989).
  18. Ettinger, D. S. Taxol in the treatment of lung cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. (15), 177-179 (1993).
  19. Weaver, B. A. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 25, (18), 2677-2681 (2014).
  20. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer. 4, (4), 253-265 (2004).
  21. Wall, M. E., Wani, M. C. Camptothecin and Taxol: Discovery to Clinic-Thirteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture. Cancer Research. 55, (4), 753-760 (1995).
  22. Schiff, P. B., Horwitz, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, (3), 1561-1565 (1980).
  23. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22, (22), R966-R980 (2012).
  24. Musacchio, A. The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint Signaling Dynamics. Curr Biol. 25, (20), R1002-R1018 (2015).
  25. Uetake, Y., et al. Cell cycle progression and de novo centriole assembly after centrosomal removal in untransformed human cells. J Cell Biol. 176, (2), 173-182 (2007).
  26. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, (3), 487-498 (2008).
  27. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, (6), 577-585 (2015).
  28. Gu, J., et al. Cell cycle-dependent regulation of a human DNA helicase that localizes in DNA damage foci. Mol Biol Cell. 15, (7), 3320-3332 (2004).
  29. Easwaran, H. P., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Cell cycle markers for live cell analyses. Cell Cycle. 4, (3), 453-455 (2005).
  30. Hahn, A. T., Jones, J. T., Meyer, T. Quantitative analysis of cell cycle phase durations and PC12 differentiation using fluorescent biosensors. Cell Cycle. 8, (7), 1044-1052 (2009).
  31. Bajar, B. T., et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases. Nat Methods. 13, (12), 993-996 (2016).
  32. Gekara, N. O. DNA damage-induced immune response: Micronuclei provide key platform. J Cell Biol. 216, (10), 2999-3001 (2017).
  33. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12, (3), 196-209 (2012).
  34. Crasta, K., et al. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482, (7383), 53-58 (2012).
  35. Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J., Hetzer, M. W. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154, (1), 47-60 (2013).
  36. Maciejowski, J., Li, Y., Bosco, N., Campbell, P. J., de Lange, T. Chromothripsis and Kataegis Induced by Telomere Crisis. Cell. 163, (7), 1641-1654 (2015).
  37. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, (7555), 179-184 (2015).
  38. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352, (6283), 353-358 (2016).
  39. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352, (6283), 359-362 (2016).
  40. Bernhard, W., Granboulan, N. THE FINE STRUCTURE OF THE CANCER CELL NUCLEUS. Exp Cell Res. 24, (Suppl 9), 19-53 (1963).
  41. de Noronha, C. M., et al. Dynamic disruptions in nuclear envelope architecture and integrity induced by HIV-1 Vpr. Science. 294, (5544), 1105-1108 (2001).
  42. Vargas, J. D., Hatch, E. M., Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Transient nuclear envelope rupturing during interphase in human cancer cells. Nucleus. 3, (1), 88-100 (2012).
  43. Sieprath, T., Darwiche, R., De Vos, W. H. Lamins as mediators of oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun. 421, (4), 635-639 (2012).
  44. Mitchison, T. J., Pineda, J., Shi, J., Florian, S. Is inflammatory micronucleation the key to a successful anti-mitotic cancer drug? Open Biol. 7, (11), (2017).
  45. Shenk, E. M., Ganem, N. J. Generation and Purification of Tetraploid Cells. Methods Mol Biol. 1413, 393-401 (2016).
  46. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J Vis Exp. (115), (2016).
  47. Salmon, E. D., Canman, J. C. Proper alignment and adjustment of the light microscope. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 Unit 4 1 (2001).
  48. Cole, R. Live-cell imaging. Cell Adh Migr. 8, (5), 452-459 (2014).
  49. Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J Vis Exp. (111), (2016).
  50. Douthwright, S., Sluder, G. Live Cell Imaging: Assessing the Phototoxicity of 488 and 546 nm Light and Methods to Alleviate it. J Cell Physiol. 232, (9), 2461-2468 (2017).
  51. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34, (7), 703-706 (2016).
  52. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34, (11), 1137-1144 (2016).
  53. Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (6), 1826-1831 (2009).
  54. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nat Cell Biol. 5, (3), 255-260 (2003).
  55. Bekker-Jensen, S., Lukas, C., Melander, F., Bartek, J., Lukas, J. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1. J Cell Biol. 170, (2), 201-211 (2005).
  56. Loewer, A., Batchelor, E., Gaglia, G., Lahav, G. Basal dynamics of p53 reveal transcriptionally attenuated pulses in cycling cells. Cell. 142, (1), 89-100 (2010).
  57. Lekshmi, A., et al. A quantitative real-time approach for discriminating apoptosis and necrosis. Cell Death Discovery. 3, 16101 (2017).
  58. Jullien, D., Vagnarelli, P., Earnshaw, W. C., Adachi, Y. Kinetochore localisation of the DNA damage response component 53BP1 during mitosis. J Cell Sci. 115, (Pt 1), 71-79 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics