JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Cancer Research

Langsiktig Live-celle Imaging for å vurdere celle skjebne som svar på paklitaxel

Published: May 14, 2018
doi:
10.3791/57383
, ,
1Department of Pharmacology & Experimental Therapeutics,Boston University School of Medicine, 2Department of Medicine, Section of Hematology and Oncology,Boston University School of Medicine

Summary

Live-celle imaging gir et vell av informasjon på enkeltceller eller hele befolkninger som er uoppnåelig av fast celle imaging alene. Her beskrives live-celle tenkelig protokoller for å vurdere celle skjebne beslutninger etter behandling med anti-mitotisk stoffet paklitaxel.

Abstract

Live-celle imaging er en kraftfull teknikk som kan brukes direkte visualisere biologiske fenomener i enkeltceller over lengre tid. Det siste tiåret, har nye og innovative teknologier kraftig forbedret praktisk bruk av live-celle bildebehandling. Celler kan nå holdes i fokus og kontinuerlig avbildes over flere dager mens opprettholdes under 37 °C og 5% CO2 celle kultur forhold. Dessuten kan flere synsfelt som representerer ulike eksperimentelle forhold skaffes samtidig gir høy gjennomstrømming eksperimentelle data. Live-celle imaging gir en betydelig fordel over fast-celle bildebehandling ved at for direkte visualisering og tidsmessige kvantifisering av dynamiske mobilnettet hendelser. Live-celle bildebehandling kan også identifisere variasjon i virkemåten for enkeltceller som ville ellers mangler ved hjelp av befolkningen-baserte analyser. Her beskriver vi live-celle tenkelig protokoller for å vurdere celle skjebne beslutninger etter behandling med anti-mitotisk stoffet paklitaxel. Vi viser metoder å visualisere om mitotically arrestert celler dør direkte fra mitose eller gli tilbake i interphase. Vi beskriver også hvordan fluorescerende ubiquitination-baserte celle syklus indikator (FUCCI) systemet kan brukes til å vurdere brøkdel av interphase celler født fra mitotisk glidning som er i stand til å skrive inn celle syklus. Til slutt, beskriver vi en live-celle bildebehandling metode for å identifisere kjernefysiske konvolutten ruptur hendelser.

Introduction

Anti-mitotisk narkotika har lenge vært brukt i de chemotherapeutic regimer av ulike typer solide svulster og ofte viser stor effekt1,2,3. Mechanistically, disse stoffene forstyrre normal mitotisk progresjon og fremme mitotisk arrestasjon i raskt voksende kreftceller. Men cellen skjebne svar mitotisk arrestasjonen er svært variabel: mens en brøkdel av cellene gjennomgår celledød direkte fra mitose, andre avslutte mitose og gå tilbake til interphase som tetraploid celler (en prosess kalt mitotisk glidning)4, 5,6,7,8. Disse interphase cellene kan utføre apoptose, gjennomgå permanente celle syklus arrestasjon eller selv re-Enter celle syklus4,5,6,7,8,9 ,10,11. Celler som unngå mitotisk celledød ved slipping i interphase, bare å skrive inn celle syklus etter narkotika, derfor bidra til re-fremveksten av kreft celle populasjoner. Videre tilbakefall celler at slip fra mitose er tetraploid, og tetraploidy er kjent for å fremme kromosom ustabilitet som driver svulst12,13,14,15. Definere faktorer som kontrollerer celle skjebne svar på anti-mitotisk medikamentelle behandlinger er derfor viktig å optimalisere gjeldende therapeutics.

I denne protokollen beskriver vi metoder for å direkte observere og studere skjebnen til celler som gjennomgår langvarig mitotisk arrestasjonen svar på anti-mitotisk stoffet paklitaxel. Paklitaxel er en etablert terapeutiske i klinikken og har vist seg svært effektiv i mange svulster typer, inkludert de av bryst, eggstokker og lungene16,17,18,19, 20. paklitaxel, som er en plante alkaloid fra Barken av barlind treet, stabiliserer piskehale som henger og dermed hindrer deres dynamicity21,22. Mens dempe av microtubule dynamikk av paklitaxel ikke påvirker cellen syklus progresjon fra G1 -G2, fører stoffet til vedvarende aktivering av spindelen montering sjekkpunkt under mitose ved å hindre kinetochore-microtubule vedlegg (omtalt i dybden her23,24)25. Som en konsekvens, deaktiveres anaphase utbruddet i paklitaxel-behandlet celler og resultater i en langvarig mitotisk arrestasjon.

Denne protokollen først beskrive tilnærminger identifisere mitotisk celler i live-celle tenkelig eksperimenter. Mitose kan visualiseres i tilhenger vev kultur celler på grunn av to merkbare celle biologiske endringer. Først bli kromosomene svært kondensert umiddelbart før kjernefysiske konvolutten sammenbrudd. Mens ofte oppdages av standard kontrast mikroskopi, kan kromosom kondens klarere oppdages bruke fluorescerende tags at etiketten kromosomene (f.eks fluorescently-merket histone proteiner). Andre, mitotisk celler kan også bli identifisert av de dramatiske morfologiske endringene som følge av cellen avrunding.

Denne protokollen vil deretter demonstrere hvordan bruke live-celle tenkelig tilnærminger følge skjebnene til celler opplever langvarig mitotisk arrestasjon. Celler arrestert i mitose gjennomgå en av tre forskjellige skjebne. Først kan celler gjennomgå celledød under mitose. Dette fenomenet er lett visualisert ved * lys, døende celler er observert å krympe, bleb, brudd. Andre celler kan avslutte mitose og tilbake tilbake til interphase uten kromosom segregering eller cytokinesis, en prosess kalt mitotisk glidning. Decondensation av kromosomer og/eller flatere mitotisk cellen lett identifiserer denne prosessen. Celler som sett fra mitose også ofte vise uregelmessig, multi lobed kjerner og ofte havn flere mikronuklei5. Tredje kan celler arrestert i mitose starte anaphase og Fortsett gjennom mitose etter forsinkelser. Mens uvanlig på høyere narkotika konsentrasjoner, antyder dette at de arresterte cellene kan har oppfylt spindelen montering sjekkpunkt, eller at spindelen montering kontrollpunktet er delvis svekket eller defekt. Anaphase utbruddet kan visualiseres kromosom segregering og påfølgende cytokinesis med live-celle imaging.

Live-celle tenkelig metoder for å spore skjebnen til celler som unngå mitotisk celledød ved gjennomgår mitotisk glidning også beskrives. Celler som gjennomgår mitotisk glidning enten dø i den påfølgende interphase, utløse en holdbar G1 celle syklus arrestasjon eller re-gå inn i cellen syklus for å starte en ny runde med celledeling4. En tilnærming som bruker FUCCI (fluorescerende ubiquitination-baserte celle syklus indikator) systemet til å bestemme brøkdel av celler som re-Enter cellen syklus etter mitotisk glidning vil bli beskrevet. FUCCI tillater direkte visualisering av G1/S overgangen og kan brukes sammen med langsiktige live-celle imaging både i vitro og vivo26,27. FUCCI systemet utnytter to fluorescently merket proteiner, avkortet former for hCdt1 (chromatin lisensiering og utryddelse faktor 1) og hGeminin, som nivåer svinge basert på celle syklus posisjon. hCdt1 (smeltet en rød fluorescerende protein) er tilstede på høye nivåer under G1 fase hvor det fungerer for å lisensiere DNA for replikering, men er ubiquitinated av E3 ubiquitin ligase SCFSkp2 og degradert S/G2/M faser å hindre Re replikering av DNA26. Derimot hGeminin (smeltet en grønn fluorescerende protein), er en inhibitor av hCdt1 hvis nivåer topp under S/G2/m, men er ubiquitinated av E3 ubiquitin ligase APCCdh1 og degradert på slutten av mitose og hele G1 26. derfor FUCCI leverer en grei fluorescens avlesning av cellen syklus fase, som cellene viser rød fluorescens under G1, og grønn fluorescens under S/G2/M. FUCCI systemet er en betydelig fordel over andre tilnærminger (for eksempel bromodeoxyuridine farging) til å identifisere proliferativ celler, fordi det krever ikke cellen fiksering og gir enkelt celle tenkelig uten behov for ekstra farmakologiske behandlinger for å synkronisere celle populasjoner. Om ikke omtalt i denne protokollen, har ekstra live-celle sensorer også blitt utviklet for å visualisere celle syklus progresjon, inkludert en helicase B sensor G128, DNA ligase-RFP29 og PCDNA-GFP30 sensorer S-fase, og siste FUCCI-4 sensoren, som oppdager alle stadier av celle syklus31.

Til slutt, en live-celle bildebehandling metode til å gjenkjenne kjernefysiske konvolutten ruptur beskrives. Nyere studier har avdekket at kjernefysisk konvoluttene av kreftceller er ustabil og utsatt for sprekker, og dermed slik at innholdet i nucleoplasm og cytoplasma å intermix. Dette fenomenet er kalt kjernefysiske brudd, kan fremme DNA skade og stimulering av medfødte immunforsvaret32,33,34,35,36,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. mens de underliggende årsakene til kjernefysiske ruptur fortsatt ufullstendig preget, det er kjent at deformasjoner kjernefysiske struktur korrelerer med økt forekomst av kjernefysiske ruptur42. En velkjent effekten av paklitaxel behandling er generasjon av påfallende unormal kjernefysiske strukturer etter mitose; slik beskrives metode ved hjelp av live-celle imaging for å kvantifisere kjernefysiske ruptur, mens også utforske paklitaxel behandling øker frekvensen av kjernefysiske ruptur hendelser. Kjernefysisk brudd kan oppdages av observerte lekkasje av et kjernefysisk målrettede fluorescerende protein i cytoplasma (f.eks en tandem dimer gjenta av RFP smeltet til et kjernefysisk lokalisering signal, TDRFP-NLS). Denne lekkasje er tydelig synlig av øyet, som muliggjør enkel kvantifisering av brudd hendelser.

Denne protokollen krever widefield epifluorescence mikroskop som er utstyrt med en kodet scenen og autofokusering programvare. Kodet scenen gir presis automatiserte bevegelsen til definerte X-og Y-koordinater, mens autofokus programvaren opprettholder celler i fokus for varigheten av tenkelig perioden. I tillegg denne protokollen krever utstyr å opprettholde fuktet cellene på 37 ° C med 5% CO2 atmosfære. Dette kan oppnås ved å sette hele mikroskopet innenfor en temperatur og atmosfære kontrollert kabinett, eller ved hjelp av scenen-top-enheter som lokalt opprettholder temperatur og miljø. Kontrast målet i denne protokollen er en plan fluor 10 x med en numerisk blenderåpning av 0,30. 20 X mål er imidlertid også nok til å identifisere både avrundet mitotisk og flat interphase celler i en enkelt fokalplanet. Hvis utfører kontrast kan imaging (som beskrevet i denne metoden), dekselet være enten glass eller plast. Hvis differensial forstyrrelser kontrast (DIC) mikroskopi brukes, er det viktig å bruke en glass cover for å hindre depolarization av lys.

Protocol

Denne protokollen fokuserer på bruk av ikke-transformert og chromosomally stabile retinal pigmentert epiteliale (RPE-1) cellen linjen for live-celle tenkelig eksperimenter. Men kan denne protokollen tilpasses alle tilhenger celle linje så lenge cellen oppdrettsforholdene justeres etter behov. Alle prosedyrer må overholde institusjonelle biosikkerhet og etiske retningslinjer og regler. 1. klargjør celler for Live-celle Imaging Bruke fersk tinte og tidlig passering RPE-1 c…

Representative Results

Ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor, ble RPE-1 celler uttrykke H2B-GFP behandlet med en anti-mitotisk eller kjøretøy kontroll (DMSO) og analysert av live-celle tenkelig. Analysen avdekket at 100% av kontroll mitotisk RPE-1 celler initiert anaphase gjennomsnittlig 22 min etter inn mitose (figur 1A, 1 D). I motsetning utstilt RPE-1-cellene behandles med paklitaxel en dyp mitotisk arrestasjonen varer flere timer (<strong class="x…

Discussion

Det viktigste aspektet av langsiktig live-celle imaging er å sikre helsen til cellene blir fotografert. Det er viktig at celler bli utsatt for minimalt overflødig miljø stressorer, som substandard forhold vedrørende temperatur, fuktighet eller CO2 -nivåer. Det er også viktig å begrense photodamage fra fluorescerende eksitasjon belysning, som imaging stress er kjent for å påvirke celle atferd50. Begrense photodamage kan oppnås på flere måter som beskrevet andre steder<sup cla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AFB, MAV og NJG ønsker å takke Ryan Quinton for kommentarer på manuskriptet og Adrian Saliske for den TDRFP-NLS-konstruksjonen. AFB og MAV er finansiert av NIGMS Biomolecular farmakologi trening Grant 5T32GM008541. NJG er medlem av Shamim og Ashraf Dahod Breast Cancer Research Laboratories og støttes av NIH tilskudd GM117150 og CA-154531, Karin Grunebaum Foundation, Smith familie Awards programmet, programmet Searle forskere og melanom forskning Alliansen.

Materials

phenol red-free, DMEM:F12 media Hyclone SH3027202
10% fetal bovine serum (FBS) Gibco 10438026
100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. Gibco 15070063
PBS Gibco 10010049
0.25% Trypsin/EDTA Gemini 50-753-3104
12-well glass bottomed imaging dish Cellvis P12-1.5H-N
Paclitaxel TSZ Chem RS036
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma NC0215085
Environmental Chamber In Vivo Scientific
5% CO2 Airgas Z03NI7432000201
15 mL Conical Tubes Fisherbrand 05-539-12
10 cm polystyrene tissue culture plates Falcon 08772E
10 mL Disposable Serological Pipette Fisherbrand 4488
5804R 15 amp Centrifuge Eppendorf 97007-370
1000 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
20 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
p1000 Pipette Tips Sharp p1126
p20 Pipette Tips Sharp P1121
RPE-1 Cells ATCC CRL-4000
Incubator Galaxy 170S Eppendorf CO17011005
Pipette Boy Integra 156401
Hemacytometer Fisher Scientific 0267110
Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging Micro Video Instruments, Inc. MEA53100
Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator Micro Video Instruments, Inc. 500-H117P1N4
Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders Micro Video Instruments, Inc. 500-H31XYZE
Andor Digital Camera Micro Video Instruments, Inc. D10NLC
Nikon NIS Elements AR Software Micro Video Instruments, Inc. MQS31000
SOLA LED Illuminator for Fluorescence Micro Video Instruments, Inc. SOLA-E
InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control Micro Video Instruments, Inc. Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece Micro Video Instruments, Inc. MEP59391
Ti-C System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL51000
Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL56200
Te-C LWD Ph1 Module Micro Video Instruments, Inc. MEH41100
CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm Micro Video Instruments, Inc. MRH10101
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective Micro Video Instruments, Inc. MRH48230
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1101-1112 (2015).
  2. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3, e411 (2012).
  3. Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents?. Nat Rev Cancer. 7 (2), 107-117 (2007).
  4. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  5. Rieder, C. L., Maiato, H. Stuck in division or passing through: what happens when cells cannot satisfy the spindle assembly checkpoint. Dev Cell. 7 (5), 637-651 (2004).
  6. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14 (2), 111-122 (2008).
  7. Huang, H. C., Mitchison, T. J., Shi, J. Stochastic competition between mechanistically independent slippage and death pathways determines cell fate during mitotic arrest. PLoS One. 5 (12), e15724 (2010).
  8. Shi, J., Orth, J. D., Mitchison, T. Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5. Cancer Res. 68 (9), 3269-3276 (2008).
  9. Ganem, N. J., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131 (3), 437-440 (2007).
  10. Ganem, N. J., Storchova, Z., Pellman, D. Tetraploidy, aneuploidy and cancer. Curr Opin Genet Dev. 17 (2), 157-162 (2007).
  11. Ganem, N. J., Pellman, D. Linking abnormal mitosis to the acquisition of DNA damage. J Cell Biol. 199 (6), 871-881 (2012).
  12. Sotillo, R., Schvartzman, J. M., Socci, N. D., Benezra, R. Mad2-induced chromosome instability leads to lung tumour relapse after oncogene withdrawal. Nature. 464 (7287), 436-440 (2010).
  13. Sotillo, R., et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice. Cancer Cell. 11 (1), 9-23 (2007).
  14. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
  15. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4 (8), e6564 (2009).
  16. McGuire, W. P., et al. Cyclophosphamide and Cisplatin Compared with Paclitaxel and Cisplatin in Patients with Stage III and Stage IV Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine. 334 (1), 1-6 (1996).
  17. McGuire, W. P., et al. Taxol: a unique antineoplastic agent with significant activity in advanced ovarian epithelial neoplasms. Ann Intern Med. 111 (4), 273-279 (1989).
  18. Ettinger, D. S. Taxol in the treatment of lung cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. (15), 177-179 (1993).
  19. Weaver, B. A. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 25 (18), 2677-2681 (2014).
  20. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  21. Wall, M. E., Wani, M. C. Camptothecin and Taxol: Discovery to Clinic-Thirteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture. Cancer Research. 55 (4), 753-760 (1995).
  22. Schiff, P. B., Horwitz, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (3), 1561-1565 (1980).
  23. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
  24. Musacchio, A. The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint Signaling Dynamics. Curr Biol. 25 (20), R1002-R1018 (2015).
  25. Uetake, Y., et al. Cell cycle progression and de novo centriole assembly after centrosomal removal in untransformed human cells. J Cell Biol. 176 (2), 173-182 (2007).
  26. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  27. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
  28. Gu, J., et al. Cell cycle-dependent regulation of a human DNA helicase that localizes in DNA damage foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).
  29. Easwaran, H. P., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Cell cycle markers for live cell analyses. Cell Cycle. 4 (3), 453-455 (2005).
  30. Hahn, A. T., Jones, J. T., Meyer, T. Quantitative analysis of cell cycle phase durations and PC12 differentiation using fluorescent biosensors. Cell Cycle. 8 (7), 1044-1052 (2009).
  31. Bajar, B. T., et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases. Nat Methods. 13 (12), 993-996 (2016).
  32. Gekara, N. O. DNA damage-induced immune response: Micronuclei provide key platform. J Cell Biol. 216 (10), 2999-3001 (2017).
  33. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
  34. Crasta, K., et al. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482 (7383), 53-58 (2012).
  35. Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J., Hetzer, M. W. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154 (1), 47-60 (2013).
  36. Maciejowski, J., Li, Y., Bosco, N., Campbell, P. J., de Lange, T. Chromothripsis and Kataegis Induced by Telomere Crisis. Cell. 163 (7), 1641-1654 (2015).
  37. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
  38. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  39. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  40. Bernhard, W., Granboulan, N. THE FINE STRUCTURE OF THE CANCER CELL NUCLEUS. Exp Cell Res. 24 (Suppl 9), 19-53 (1963).
  41. de Noronha, C. M., et al. Dynamic disruptions in nuclear envelope architecture and integrity induced by HIV-1 Vpr. Science. 294 (5544), 1105-1108 (2001).
  42. Vargas, J. D., Hatch, E. M., Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Transient nuclear envelope rupturing during interphase in human cancer cells. Nucleus. 3 (1), 88-100 (2012).
  43. Sieprath, T., Darwiche, R., De Vos, W. H. Lamins as mediators of oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun. 421 (4), 635-639 (2012).
  44. Mitchison, T. J., Pineda, J., Shi, J., Florian, S. Is inflammatory micronucleation the key to a successful anti-mitotic cancer drug?. Open Biol. 7 (11), (2017).
  45. Shenk, E. M., Ganem, N. J. Generation and Purification of Tetraploid Cells. Methods Mol Biol. 1413, 393-401 (2016).
  46. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J Vis Exp. (115), (2016).
  47. Salmon, E. D., Canman, J. C. Proper alignment and adjustment of the light microscope. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
  48. Cole, R. Live-cell imaging. Cell Adh Migr. 8 (5), 452-459 (2014).
  49. Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J Vis Exp. (111), (2016).
  50. Douthwright, S., Sluder, G. Live Cell Imaging: Assessing the Phototoxicity of 488 and 546 nm Light and Methods to Alleviate it. J Cell Physiol. 232 (9), 2461-2468 (2017).
  51. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  52. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  53. Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
  54. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nat Cell Biol. 5 (3), 255-260 (2003).
  55. Bekker-Jensen, S., Lukas, C., Melander, F., Bartek, J., Lukas, J. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1. J Cell Biol. 170 (2), 201-211 (2005).
  56. Loewer, A., Batchelor, E., Gaglia, G., Lahav, G. Basal dynamics of p53 reveal transcriptionally attenuated pulses in cycling cells. Cell. 142 (1), 89-100 (2010).
  57. Lekshmi, A., et al. A quantitative real-time approach for discriminating apoptosis and necrosis. Cell Death Discovery. 3, 16101 (2017).
  58. Jullien, D., Vagnarelli, P., Earnshaw, W. C., Adachi, Y. Kinetochore localisation of the DNA damage response component 53BP1 during mitosis. J Cell Sci. 115 (Pt 1), 71-79 (2002).

Tags

Live-cell ImagingCell FatePaclitaxelAnti-mitotic DrugMicroscopyKohler IlluminationAuto-focusTime-lapse ImagingCell Confluence

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bolgioni, A. F., Vittoria, M. A., Ganem, N. J. Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel. J. Vis. Exp. (135), e57383, doi:10.3791/57383 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image