Långsiktiga Live-cell Imaging att bedöma Cell öde i svar till paklitaxel

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Live-cell imaging ger mängder av information på enstaka celler eller hela befolkningar som är ouppnåelig genom fasta cell imaging ensam. Här beskrivs live-cell imaging protokoll att bedöma cell öde beslut efter behandling med anti mitotiska drog paklitaxel.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bolgioni, A. F., Vittoria, M. A., Ganem, N. J. Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel. J. Vis. Exp. (135), e57383, doi:10.3791/57383 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Live-cell bildbehandling är en kraftfull teknik som kan användas för att direkt visualisera biologiska fenomen i enstaka celler över längre tidsperioder. Under det senaste årtiondet, har ny och innovativ teknik förbättras avsevärt praktiskhet i live-cell imaging. Celler kan nu hållas i fokus och kontinuerligt avbildas under flera dagar medan underhållna under 37 °C och 5% CO2 cell odlingsbetingelser. Flera synfält som representerar olika experimentella förhållanden kan dessutom förvärvas samtidigt, vilket ger hög genomströmning experimentella data. Live-cell imaging ger en betydande fördel över fast-cell imaging genom att tillåta för direkt visualisering och temporal kvantitering av dynamiska cellulära händelser. Live-cell imaging kan också identifiera variation i beteende av enstaka celler som skulle annars ha missats använder populationsbaserade analyser. Här beskriver vi live-cell imaging protokoll för att bedöma cell öde beslut efter behandling med anti mitotiska drog paklitaxel. Vi demonstrera metoder för att visualisera om mitotiskt arresterade celler dör direkt från Mitos eller glida tillbaka in i interphasen. Vi beskriver också hur det fluorescerande ubikvitinering-baserade cellcykeln-indikatorsystemet (FUCCI) kan användas för att bedöma andelen interphase celler född från mitotiska slirning som klarar av att återinträda på cellcykeln. Slutligen beskriver vi en live-cell bildgivande metod för att identifiera kärn kuvert bristning händelser.

Introduction

Anti mitotiska droger har länge använts i kemoterapiregimer av olika typer av solida tumörer och visar ofta bra effekt1,2,3. Slentrianmässigt, dessa läkemedel störa normala mitotiska progression och främja mitotiska gripandet i snabbt sprider sig cancerceller. Cell öde svar på mitotiska gripandet är dock mycket varierande: medan en bråkdel av celler genomgår celldöd direkt från Mitos, andra exit ur Mitos och återgå till interphase som gräsart celler (en process som kallas mitotiska slirning)4, 5,6,7,8. Dessa interphase celler kan köra apoptos, genomgå permanent cellcykelarrest eller ens åter in i cellcykeln4,5,6,7,8,9 ,10,11. Celler som undgå mitotiska celldöd genom glida ned i interphasen, bara för att återinträda på cellcykeln efter drogen borttagning, kan därför bidra till re-uppkomsten av cancer cellpopulationer. Dessutom återfall celler att glida från Mitos är gräsart, och tetraploidy är kända för att främja kromosom instabilitet som driver tumör12,13,14,15. Definiera de faktorer som styr cellen öde svar på anti mitotiska läkemedelsbehandlingar är därför avgörande att optimera aktuella therapeutics.

I detta protokoll beskriver vi metoder för att direkt observera och studera celler som genomgår långvarig mitotiska gripandet svar på anti mitotiska drog paklitaxel öde. Paklitaxel är en etablerad terapeutisk på kliniken och har visat sig vara mycket effektiv i många typer av tumörer, inklusive de av bröst, äggstockar och lungorna16,17,18,19, 20. paklitaxel, som är en växt alkaloid härrör från barken av trädet idegran, stabiliserar mikrotubuli och därmed hindrar deras dynamicity21,22. Medan dämpning av mikrotubuli dynamics av paklitaxel inte påverkar cellcykelns förlopp från G1 G2, leder drogen till ihållande aktivering av spindel montering checkpoint under Mitos av hindrar Kinetochor-mikrotubulära fastsättning (granskas på djupet här23,24)25. Följaktligen hindras Anaphasen debut i paklitaxel-behandlade celler och resulterar i en långvarig mitotiska gripandet.

Detta protokoll kommer först att beskriva metoder för att identifiera mitotiska celler i live-cell imaging experiment. Mitos kan visualiseras i vidhäftande vävnadsodling celler på grund av två märkbara cell biologiska förändringar. Först, kromosomer blir mycket kondenserat omedelbart före kärn kuvert uppdelning. Medan ofta upptäckas av standard fas-kontrast mikroskopi, kan kromosom kondens tydligare upptäckas med hjälp av fluorescerande Taggar att etiketten kromosomer (t.ex. fluorescently-märkt Histon proteiner). Andra, mitotiska celler kan också identifieras genom de dramatiska morfologiska förändringar som resulterar från cell avrundning.

Detta protokoll kommer sedan visar hur du använder live-cell bildgivande metoder för att spåra celler som upplever långvarig mitotiska gripande öden. Celler i Mitos genomgå en av tre skilda öden. Celler kan först genomgå celldöd under Mitos. Detta fenomen är lätt visualiseras genom ljusmikroskop, som döende celler observeras krympa, blåsa eller bristning. Andra celler kan avsluta från Mitos och återvända tillbaka till interphase utan kromosomsegregering eller cytokines, en process som kallas mitotiska slirning. Decondensation kromosomer eller en flackare mitotiska cellen lätt identifierar denna process. Celler som glida från Mitos visar också ofta oregelbundna, flera flikiga kärnor och ofta hyser flera mikrokärnor5. Det tredje kan celler greps i Mitos initiera Anaphasen och Fortsätt genom Mitos efter en lång fördröjning. Samtidigt ovanligt på högre läkemedelskoncentrationen, föreslår detta beteende att de arresterade cellerna kan ha nöjda spindel montering checkpoint, eller att spindel montering checkpoint är försvagad eller delvis defekt. Anaphasen debut kan visualiseras genom kromosomsegregering och efterföljande cytokines med hjälp av live-cell imaging.

Live-cell bildmedicinska metoder att spåra celler som kringgår mitotiska celldöd genom att genomgå mitotiska slirning öde kommer också att beskrivas. Celler som genomgår mitotiska slirning antingen dö i efterföljande interphasen, utlösa en slitstark G1 cellcykelarrest eller återinträda cellcykeln för att inleda en ny runda av cell division4. En metod som använder FUCCI (fluorescerande ubikvitinering-baserade cellcykeln indikator) systemet för att bestämma andelen av celler som återinträda cellcykeln efter mitotiska slirning kommer att beskrivas. FUCCI möjliggör direkt visualisering av G1/S övergången och kan användas i samband med långsiktiga live-cell imaging både in vitro- och in-vivo26,27. FUCCI systemet utnyttjar två fluorescently märkta proteiner, stympade former av hCdt1 (kromatin licensiering och DNA-replikation faktor 1) och hGeminin, vars nivåer pendlar baserat på cellcykelns position. hCdt1 (smält till en röd fluorescerande protein) är närvarande på höga nivåer under G1 fas där det agerar för att licensiera DNA för replikering, men är ubiquitineras av den E3 ubiquitin ligase SCFSkp2 och försämras under S/G2/M faser att förhindra Re replikering av DNA26. Däremot hGeminin (smält till ett grönt fluorescerande protein), är en hämmare av hCdt1 vars nivåer topp under S/G2/m, men är ubiquitineras av den E3 ubiquitin ligase APCCdh1 och försämras i slutet av Mitos och hela G1 26. Följaktligen FUCCI levererar en okomplicerad fluorescens avläsning av cellcykeln fas, som celler uppvisar röd fluorescens under G1, och grön fluorescens under S/G2/m. Systemets FUCCI är ett betydelsefullt framsteg över andra metoder (till exempel Bromdeoxiuridin färgning) att identifiera proliferativ celler, eftersom det kräver inte cell fixering och låter för enstaka cell avbildning utan behov av ytterligare farmakologiska behandlingar för att synkronisera cellpopulationer. Även om inte diskuteras i detta protokoll, har ytterligare live-cell sensorer också utvecklats för att visualisera cellcykelns förlopp, inklusive en helicase B sensor för G128, DNA-ligase Armeringsputs29 och PCDNA-GFP30 sensorer för S-fas, och nyligen FUCCI-4 sensorn, som identifierar alla faser av cellcykeln31.

Slutligen, en live-cell bildgivande metod att upptäcka kärn kuvert bristning kommer att beskrivas. Nyligen genomförda studier har visat att kärn kuverten av cancerceller är instabil och benägna att spricker, vilket innebär att innehållet i de nukleoplasman och cytoplasman att blanda. Detta fenomen kallas kärn bristning, kan främja DNA-skador och stimulering av medfödda immunsvar32,33,34,35,36,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. medan de bakomliggande orsakerna till nukleära bristning förbli ofullständigt kännetecknas, det är känt att deformationer i nukleära struktur korrelerar med en ökad incidens av nukleära bristning42. En välkänd effekt av paklitaxel behandling är generation av påfallande avvikande nukleära strukturer efter Mitos; som sådan, kommer en metod där live-cell imaging för att kvantifiera nukleära bristning att beskrivas, samtidigt också undersöka om paklitaxel behandling ökar frekvensen av nukleära bristning händelser. Nukleära bristning kan upptäckas av observerade läckage av ett kärn-riktade fluorescerande protein in i cytoplasman (t.ex. en tandem dimer upprepa av RFP smält till en cellkärnelokalisering signal, TDRFP-NLS). Detta läckage är tydligt synliga för ögat, som möjliggör enkel kvantitering av bristning händelser.

Detta protokoll kräver en widefield epifluorescensmikroskop som är utrustad med en kodad scen och autofokusering programvara. Kodade scenen möjliggör exakta automatiserade rörelser till definierade X-Y-koordinater, medan autofokus programvara bibehåller celler i fokus under hela perioden imaging. Detta protokoll kräver dessutom utrustning för att upprätthålla celler vid 37 ° C med fuktad 5% CO2 atmosfär. Detta kan uppnås genom att bifoga hela mikroskopet inom en temperatur och atmosfär kontrollerade inhägnad, eller genom att använda scenen-top-enheter som lokalt upprätthåller temperatur och miljö. Faskontrast målet används i detta protokoll är en plan fluor 10 x med en numerisk bländare 0,30. 20 X mål är dock också tillräcklig för att identifiera både rundade mitotiska och tillplattad interphase celler i en enda fokalplan. Om utför faskontrast kan imaging (som beskrivs i denna metod), locket vara antingen glas eller plast. Om differential störningar kontrast (DIC) mikroskopi används, är det viktigt att använda en glaskupa för att förhindra depolarisation av ljus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll fokuserar på att använda icke-omvandlad och kromosomalt stabil retinal pigmenterade epitelceller (RPE-1) cell linjen för live-cell imaging experiment. Detta protokoll kan dock anpassas till eventuella vidhäftande cellinje så länge cellen odlingsbetingelser justeras vid behov. Alla förfaranden måste följa institutionella biosäkerhet och etiska riktlinjer och bestämmelser.

1. förbereda celler för Live-cell Imaging

  1. Använd färska tinade och tidig passage RPE-1 celler som uttrycker människors Histon H2B smält till en fluorescerande protein (t.ex. H2B-GFP) eller FUCCI systemet (ett detaljerat protokoll på hur till generera FUCCI-uttryckande celler kan hittas i referens45) att bedöma mitotiska cell öde.
    1. För att mäta frekvensen av nukleära bristning, Använd RPE-1-celler som uttrycker både H2B-GFP och en tandem dimer av röd fluorescerande protein smält till en enda cellkärnelokalisering signal (TDRFP-NLS).
      Obs: Konstruktioner av tre grön fluorescerande proteiner smält parallellt till en enda cellkärnelokalisering signal (GFP3- NLS) har också använts för att demonstrera bristning (som i referens42).
    2. Upprätthålla celler på 10 cm vävnadsodling tallrikar i lämpligt odlingsmedium. RPE-1 celler underhålls i fenolrött-fri, Dulbeccos modifierade Eagle Medium/näringsämne blandning F-12 (DMEM:F12) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 IE/mL penicillin och 100 μg/mL streptomycin.
  2. Aspirera medium från cellerna, tvätta vävnadsodling skålen med 10 mL sterilt, rumstemperatur fosfatbuffrad saltlösning (PBS) ta bort återstående medium och sedan aspirera PBS.
    1. Tillsätt 2 mL av 0,25% Trypsin med etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) till cellerna och inkubera vid 37 ° C i 3 min eller tills flertalet celler har lossnat från plattan.
      Obs: Håll inte celler i trypsin längre än nödvändigt.
  3. Tillsätt 10 mL av komplett medium att samla trypsinized cellerna med en 10 mL serologiska stripette och fördela i en 15 mL koniska rör.
    1. Pellet cellerna genom centrifugering vid 180 x g i 3 min i rumstemperatur.
  4. Aspirera supernatanten, vara noga med att inte störa pelleten, och sedan grundligt återsuspendera pelleten i 10 mL färsk medium av försiktigt pipettering mediet upp och ner i det serologiska stripette.
  5. Använd en hemocytometer eller automatiserade cell räknar maskin för att räkna celler46.
    1. Späd cellerna i en ny konisk tub 30 000 celler/ml av komplett medium.
    2. Tallrik 30.000 RPE-1 celler (1 mL volym) per väl av ett 12-väl glas botten (nr 1.5 tjocklek) imaging maträtt för att uppnå nödvändiga cellulära tätheten nästa dag (30 – 50% konfluenta).
      Obs: Alltid hantera plattan med handskar och vara noga med att inte vidröra glasbotten.
  6. Tillåta celler att växa i en 37 ° C vävnadsodling inkubator tills de helt bifoga och platta på glasbotten bildbehandling plattan. Medan celler kan bifoga i så lite som 4 h, är det rekommenderat att cellerna inte behandlas med läkemedel och avbildas förrän följande dag.
  7. Lägg till paklitaxel (upplöst i dimetyl sulfoxid (DMSO)) till önskad slutliga koncentration i komplett medium och blanda noggrant.
    1. Förbereda komplett medium med en lika stor volym av DMSO ensam för att använda som kontroll.
    2. Varma mediet som innehåller narkotika eller DMSO till 37 ° C innan du lägger till celler. Detta förhindrar fokal drift på grund av en plötslig temperaturförändring.
    3. Tillsätt 1 mL medium som innehåller antingen paklitaxel eller DMSO ensam till enskilda brunnar i 12-väl tänkbar skålen.

2. ställa in mikroskopet för Live-cell Imaging

  1. Ren glaset-botten av imaging skålen med optiska renare att ta bort fingeravtryck och damm som kan interferera med imaging. Använd tillräckligt optiska rengöringsmedel till våt hela glasytan.
  2. Placera glasbotten skålen på Mikroskop scenen i imaging maträtt adaptern, ta bort plastskyddet från skålen och täck skålen med en glas-topped kammare. Se till att kammaren har en ventil att tillåta ett stadigt flöde av luft bestående av 5% CO2.
    Obs: För att fukta den 5% CO2, gasen flödas igenom slangen in i ett sterilt vatten bad hölje. Detta gör att gas som ska bli utjämnad till 95% luftfuktighet.
  3. Initiera/kalibrera kodade scenen med den programvara som styr mikroskopet. Detta kommer att säkerställa korrekt X-Y-koordinater och förhindra fokal drift.
  4. Fokusera på de celler som använder faskontrast optik och utföra Kohler belysning (beskrivs i detalj i referens47) för att fokusera ljuset och ger optimal kontrast.
  5. Använda förvärv programvara för att bestämma optimal exponeringstider för vitt ljus och alla fluorescerande kanaler används (exponeringar att ge 75% pixel mättnad på kameran är perfekt, förutsatt att detta belopp av ljus inte är giftigt för celler).
    1. Använd förvärv programvaran för att välja flera, icke-överlappande synfält från varje brunn för avbildning. Välj imaging regioner där cellerna har väl följt glas-botten och är mellan 50% och 70% konfluenta. Undvik områden av sammanklibbade celler, eftersom detta gör efterföljande analys svårt.
      Obs: Det är viktigt att ha icke-överlappande synfält från varje brunn för att undvika spårning samma celler två gånger. Om cellerna är mycket rörliga, kan det vara nödvändigt att förvärva flera bilder som strålar ut från en central punkt och sy dem tillsammans igen för att göra ett stort synfält.
  6. Aktivera mikroskopets autofokus funktionen för att säkerställa alla punkter bibehålls i fokus under hela försöket.
  7. För att bedöma mitotiska cell öde, ange avbildningsprogrammet att samla bilder från varje valda synfält varje 10 min för upp till 96 h. Unperturbed Mitos varar 20-40 min, och således 10 min intervaller kommer ger tillräckligt provtagning att identifiera när celler delar. För att identifiera kärn bristning, som är en övergående händelse, förvärva bilder var 5 minut.
    Obs: Kontrollera att datorn kör programvaran bild förvärv har automatisk uppdatering, skärmsläckare och energibesparingar lägen inaktiveras, eftersom dessa ofta kan störa bilden förvärv över långa experiment.
  8. Initiera imaging experimentet. Regelbundet kontrollera att bild förvärvandet körs smidigt under loppet av videon.

3. video analys identifiera Cell öde i svar till paklitaxel

  1. Bekräfta att avbildas celler är friska under hela imaging experimentet. Kontroll celler behandlas med DMSO bör vara livskraftig och aktivt prolifererande.
    Obs: Om celler uppvisar tecken på stress, inte kvantifiera videon och istället fokusera på att optimera imaging villkoren48. Tecken på imaging stress inkluderar blebbing/döende celler, celler som misslyckas med att bifoga/spread på plattan och celler som visar en låg mitotiskt index och/eller långvarig Mitos. Möjliga källor till stress är fluktuationer i temperatur eller CO2 nivåer inuti imaging kammare eller fototoxicitet48.
  2. När imaging ett hela synfältet med en 10 X eller 20 X-objektiv, kan hundratals enskilda celler förekomma. Därför, för att bistå med kvantifiering, dela synfältet i mindre kvadranter med tillgänglig programvaruverktyg. Poäng celler inom varje kvadrant separat (som beskrivs i steg 3.3.1–3.6.2).
  3. När analysera videon, spåra varje cell i en sammanslagen vy med faskontrast och/eller fluorescerande bilder. Använda programvara analysverktyg för att skapa den sammanslagna vyn.
    1. Start i början av videon, identifiera en enda interphase cell och spåra dess framsteg genom cellcykeln använder fas optik. För att spåra en enskild cell, respektera cellen från ram till ram genom ögat. Identifiera interphase celler på grund av deras tillplattade morfologi (bedömdes av fas-kontrast) och deras DNA kondens (enligt bedömning av H2B-GFP) (figur 1A).
  4. Identifiera celler som anger Mitos genom observation av cell avrundning (med faskontrast optik) och/eller kromosom kondens (med H2B-GFP) (figur 1A-C). Båda cell avrundning och kromosom kondens är lätt visualiseras genom ögat.
    1. Kommentera den tidpunkt när cellen träder Mitos. Fortsätta spåra cellen tills den når sitt öde (Anaphasen som i steg 3.5, celldöd från Mitos som i steg 3.6.1 eller mitotiska slirning som i steg 3.6.2).
  5. Kontroll celler bör effektivt anpassa deras kromosomer och ange Anaphasen inom 1 h (figur 1 d). Visualisera Anaphasen faskontrast optik som cellen börjar att nypa i två eller genom visualisering av poleward-flyttar kromosomer märkt med H2B-GFP (figur 1A). Anteckna tiden när cellen genomgår Anaphasen.
  6. Däremot förblir celler behandlas med paklitaxel rundade med kondenserade kromosomer i flera timmar (3-40 h) (figur 1B-D).
    1. Identifiera mitotiskt arresterade celler som genomgår programmerad celldöd.
      Obs: Celler som dör under Mitos visualiseras av faskontrast mikroskopi, som celler kommer blåsa, krympa eller brista (figur 1B). Om imaging H2B-GFP, fragmenterar också kromosomerna under celldöd.
    2. Identifiera mitotiskt arresterade celler som genomgår cellen slirning.
      Obs: Celler som genomgår mitotiska slirning observeras av faskontrast mikroskopi, som de plattar tillbaka ut till interphase och decondense kromosomer utan att genomgå Anaphasen (figur 1 c). Celler som genomgår mitotiska slirning ger upphov till stora gräsart celler som är ofta Multinucleära (figur 1 c).
  7. Fortsätta spåra celler från det ursprungliga synfältet. När en hela synfältet spåras, flytta till en separat synfält som förvärvats från samma väl och fortsätta spåra celler.

4. video analys identifiera Cell öde efter mitotiska slirning

  1. Bedöma cell öde efter mitotiska slirning (enligt beskrivningen i steg 3.6.2) använder RPE-1-celler som uttrycker FUCCI systemet. Förutom faskontrast imaging, är det nödvändigt att förvärva både röd fluorescens (vägledande av G1 fas) och grön fluorescens (vägledande S/G2/M) bilder).
    1. Spåra FUCCI RPE-1 celler som beskrivs i steg 3.3 genom 3,7.
      1. För att bekräfta att FUCCI systemet fungerar, validera att kontroll celler alternativa uttryck av röd och grön fluorescerande proteiner på lämpligt sätt från analys av live-imaging celldata. Kontroll celler bör övergången från uppvisar helt nukleära röd fluorescens till uppvisar helt nuclear grön fluorescens under interphasen som celler framsteg från G1 till S-fas. Cellerna bör fortsätta uppvisar grön fluorescens i hela slutförandet av Mitos. Omedelbart efter Mitos, bör celler återigen uppvisar helt röd fluorescens under interfasen.
        Obs: Medan det finns metoder för att kvantifiera både RFP och god Jordbrukarsed fluorescens intensiteter från FUCCI systemet i enstaka celler med hjälp av fluorescerande spår49, detta är ofta inte nödvändigt eftersom fluorescens färg förändringen är robust och synliga för ögat.
  2. Identifiera celler greps i Mitos med faskontrast mikroskopi och spåra dem tills de genomgår mitotiska slirning, vilket beskrivs i 3.4 och 3.6.2. Celler som halka ur Mitos och tillbaka in i interphasen ändras från uppvisar grön fluorescens under Mitos till röd fluorescens under G1 fas (figur 2A- C).
    1. Spåra dessa gled celler med faskontrast och epifluorescerande avbildning av ögat för att bedöma deras cell öde (figur 2D).
      1. Identifiera celler som återinträda cellcykeln. Dessa celler är identifierade av röd-till-grön fluorescens uttryck använder FUCCI systemet som indikerar G1/S övergången (figur 2A).
      2. Identifiera celler som genomgår G1 cellcykelarrest. Dessa celler är identifierade av uttryck av röd fluorescens som kvarstår i > 24 h (figur 2B).
      3. Identifiera celler som dör i interphasen. Dessa celler är identifierade genom cell bristning/blebbing/krymper med faskontrast imaging (figur 2 c).

5. video analys identifiera frekvensen av kärn kuvert bristning

  1. Använda RPE-1-celler som uttrycker H2B-GFP och TDRFP-NLS för att bedöma kärn kuvert bristning. Utöver faskontrast imaging, förvärva både röd fluorescens (TRITC) och grön fluorescens (FITC) bilder. Skaffa bilder varje 5 min för att visualisera bristning.
    Obs: Det är viktigt att generera cellinjer som TDRFP-Lantmäteriverket effektivt importeras till kärnan med minimal cytoplasmisk fluorescens.
  2. Bildceller som beskrivs i steg 3.3 genom 3.4. TDRFP-NLS fluorescens signalen och H2B-GFP bör samtidig lokalisera under interfasen. Vid Mitos (som visualiseras av cell avrundning med fas optik eller kromosom kondensation av H2B-GFP), kärn kuvertet kommer att bryta ner och TDRFP-NLS signalen blir cytoplasma (figur 3A). Efter Mitos, kärn kuvertet kommer att reformera i dottercellerna och TDRFP-NLS signalen blir kärn.
  3. Spåra dotter celler i hela efterföljande interphasen genom live-cell imaging. Identifiera kärn bristning händelser genom att observera en övergående explosion av kärn-lokaliserad TDRFP-NLS i omgivande cytoplasman. Inom minuter, kärn kuvertet kommer att repareras och TDRFP-Lantmäteriverket kommer att vara relocalized till kärnan (figur 3A).
    Obs: Ofta, nuclear DNA, som visualiseras genom H2B-GFP, kommer att ses att sticka ut utanför webbplatsen bristning som en liten blåsa.
  4. Poäng fraktionen av kärnor som genomgår en bristning händelse under interfasen. Poäng denna fraktion, räkna antalet celler som genomgår en bristning händelse över det totala antalet celler spåras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med hjälp av protokollet som beskrivs ovan, RPE-1-celler som uttrycker H2B-GFP behandlades med en anti mitotiska eller fordon kontroll (DMSO) och analyseras av live-cell imaging. Analysen visade att 100% av kontroll mitotiska RPE-1 celler inlett Anaphasen genomsnitt 22 min efter inresan Mitos (figur 1A, 1 D). RPE-1 celler behandlas med paklitaxel uppvisade däremot en djupgående mitotiska arresteringsorder som varar flera timmar (figur 1 d). Imaging visade att 48 procent av dessa mitotiskt arresterade celler genomgick mitotiska celldöd (figur 1B, 1E), medan resterande 52% genomgick mitotiska slirning (figur 1 c, 1E).

För att bedöma ödet av RPE-1 celler som genomgick mitotiska slirning, RPE-1-celler som uttrycker FUCCI systemet behandlades med antingen lågdos-50 nM paklitaxel, hög dos 5 µM paklitaxel, eller fordon kontroll (DMSO) och analyseras av långsiktiga live-cell imaging. Data visade att 22% av de RPE-1-celler som genomgick mitotiska slirning efter behandling med 50 nM paklitaxel, dog i efterföljande cellcykeln (figur 2 c, 2D), 72% inducerad cellcykelarrest (figur 2B, 2D), och endast 5% återinträdde S-fas (figur 2A, 2D). Däremot av RPE-1 celler behandlas med hög dos 5 µM paklitaxel som genomgick mitotiska slirning, 35% dog i efterföljande cellcykeln, 65% inducerad cellcykelarrest och återinträdde ingen S-fas (figur 2D).

Intressant, främjar låg dos paklitaxel-behandling kärn kuvert bristning i RPE-1 celler efter Mitos. Efter mitotiska avslutning var dottercellerna spåras och gjorde för nukleära bristning händelser, avslöjar att endast ~ 4% av kontroll (DMSO-behandlade) RPE-1 dottercellerna spruckit, medan ~ 23% av dotter celler behandlas med 10 nM paklitaxel uppvisade bristning ( Figur 3A, 3B).

Figure 1
Figur 1: mitotiska cell öde i anti mitotiska behandlingssvaret. RPE-1-celler som uttrycker stabilt H2B-GFP behandlades med DMSO fordonskontroll (A) eller 5 µM paklitaxel (B, C) och avbildas med time-lapse fas-kontrast och widefield epifluorescence mikroskopi för att bedöma mitotiska cell öde. Interphase celler (vänster paneler) spårades när de kom in Mitos (mellersta paneler) och tills de antingen initierade Anaphasen (A), genomgick mitotiska celldöd (B) eller gled från Mitos tillbaka till interphase (C). Vita pilar visar spårade celler. (D), mängden tid som styr cellerna (DMSO-behandlade) och anti-mitotic-behandlade celler tillbringade i Mitos, som quantitated av live-cell imaging (n = 100 celler för varje villkor). (E), fraktionen av celler (n = 100) som genomgick Anaphasen, mitotiska celldöd eller mitotiska slirning i DMSO-behandlade celler eller celler som behandlades med 5 µM paklitaxel. Tid, h:min. skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: ödet för celler som genomgår mitotiska slirning. RPE-1-celler som uttrycker stabilt FUCCI systemet behandlades med 50 nM paklitaxel eller 5 µM paklitaxel och avbildas med time-lapse fas-kontrast och widefield fluorescensmikroskopi för att kvantifiera cell öde efter mitotiska slirning. Cellerna var gjorde som antingen återinträder cellcykeln, som bedöms av en röd-till-grön fluorescens förändring i FUCCI systemet (A). gripa i G1 fas, som bedöms av ihållande röd fluorescens för > 24 h (B). eller dör under den efterföljande Mitosen, som bedöms av cellulära blebbing/ruptur (C). Vita pilar visar spårade celler. (D) andelen av celler (n = 100) som genomgick varje öde. Felstaplar representera standardavvikelsen från medelvärdet från två oberoende experiment. Tid, h:min. skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: frekvensen av kärn kuvert bristning i paklitaxel-behandlade celler. RPE-1 celler som stabilt uttrycker TDRFP-NLS och H2B-GFP behandlades med 10 nM paklitaxel eller fordon kontroll (DMSO) och avbildas med time-lapse fas-kontrast och widefield epifluorescence mikroskopi (A). Under Mitos (metafas/Anaphasen) kärn kuvertet bryts ned och TDRFP-NLS blir cytoplasmiska. Efter Mitos relocalizes TDRFP-Lantmäteriverket att kärnan av interphase celler (före bristning). Nukleära bristning händelser identifieras av utlokaliseringarna för TDRFP-NLS från kärnan till cytoplasman i interphasen celler (bristning), följt av relocalization för TDRFP-NLS till kärnan efter kärn kuvert reparation (efter ruptur). Vita pilar visar spårade celler. (B) del av celler (n > 100 per tillstånd) som visar kärn kuvert bristning efter Mitos i närvaro av paklitaxel eller fordon kontroll. Tid, h:min. skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mest kritiska aspekten av långsiktiga live-cell imaging är att säkerställa hälsan hos de celler som avbildas. Det är viktigt att cellerna utsättas för minimal yttre miljöfaktorer, såsom undermåliga förhållanden gällande temperatur, luftfuktighet, eller CO2 nivåer. Det är också viktigt att begränsa photodamage från fluorescerande excitation belysning, som imaging stress är kända för att påverka cell beteende50. Att begränsa photodamage kan uppnås på flera sätt som närmare någon annanstans48. I allmänhet är det bäst att använda den kortaste exponeringstiden som behövs för att producera en tillräckligt tillräckligt ljust fluorescens signal att effektivt spåra celler, vilket begränsar fototoxicitet. Dock om celler är avbildade först när varje 10 – 20 min, längre exponeringar (det närma pixel mättnad) är vanligtvis väl tolereras (även om detta måste bestämmas empiriskt för varje fluorophore och cell typ). Eftersom avbildad celler är känsliga för både miljö och imaging påfrestningar, är det absolut nödvändigt att kontroll celler alltid ingår i live-cell imaging experiment och övervakas för att bekräfta normal spridning.

En begränsning till långsiktiga live-cell imaging är att den kräver att utrusta en befintlig Mikroskop med antingen en klimatkammare som underhåller både temperatur och 5% tilluften CO2 atmosfär eller en scen-top kammare som också kan stöd till lämplig temperatur och atmosfär. Flödande CO2 är optimal, celler också kan avbildas för upp till 48 h användning av CO2-oberoende medium om en klimatkammare med 5% tilluften CO2 inte är tillgänglig. Men många celltyper är intoleranta mot sådant medium, och detta måste fastställas empiriskt genom att mäta cellernas tillväxt och lönsamhet. Överliggande cellerna med mineralolja kan också användas för att förhindra medium avdunstning.

En andra stor begränsning med denna metod är att manuellt spåra cell öden är mycket mödosam och tidskrävande. Men cell-tracking program finns tillgängliga och kan optimeras för att automatisera bild analys51,52,53. En ytterligare begränsning med denna metod är att mycket motila celler är ofta svårt att spåra över längre tidsperioder. Om detta innebär ett betydande problem, hela väl kan avbildas och bilderna sys ihop för att bilda ett stort synfält. Många program stöder denna metod.

Autofluorescens är ett annat villkor som måste hanteras med detta protokoll. Fenolrött gratis medium minskar bakgrund autofluorescens under levande cell imaging. Det har också visats att två vitaminer förekommer allmänt i odlingsmedium, riboflavin och pyridoxal, kan minska photostability av fluorescerande proteiner. Medium som saknar dessa vitaminer kan således även användas under fluorescens imaging för att förbättra signal-brus ransoner. Även plast botten rätter är billigare och kan tillhandahålla adekvat bildbehandling resultat, producerar de också en större mängd autofluorescens som negativt påverkar signal-brus-förhållanden. Plastbotten rätter har dessutom större variation i tjocklek, vilket kan störa funktionen autofokus av många Mikroskop. Tjockleken på glaset bottnat imaging skålen i detta protokoll är 0.17 mm, vilket är det idealiska glaset för användning med moderna Mikroskop.

Slutligen, långsiktiga filmer som omfattar flera synfält och förvärva flera fluorescens kanaler producerar massiva datafiler (tiotals gigabyte att ens terabyte varje), som utgör ett problem för datalagring och säkerhetskopiering. För att minska problemet, det rekommenderas att alla bilder kan förvärvas med 2 x 2 eller 4 x 4 binning, förutsatt förlusten i resolution är acceptabelt. Binning inte bara begränsar exponering gånger (dvs celler som uttrycker stabilt H2B-GFP eller FUCCI systemet bör ha exponeringar mindre än 500 ms), men också drastiskt minskar storleken på datafiler (en bild som är binned 2 x 2 är en fjärde filstorleken för en icke-kastas i papperskorgen bild).

Trots dessa begränsningar representerar långsiktiga live-cell imaging den bästa metoden att spåra enskilda cellen öden från hela befolkningar, särskilt när cellen öden är mycket heterogena. Som mer live-cell fluorescerande markörer och sensorer blir tillgängligt, live-cell kommer imaging metoder att utökas för att visualisera och kvantifiera flera ytterligare aspekter av cellbiologi. Till exempel finns live-cell sensorer för närvarande för att kvantifiera DNA skador foci, p53 nivåer, cellcykeln position och apoptos26,54,55,56,57,58 . Således, imaging experiment har kapacitet att avslöja underliggande cellulära egenskaper som dikterar hur och varför enstaka celler steglöst bemöta kemoterapeutika.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

AFB, MAV och NJG vill tacka Ryan Quinton för synpunkter på manuskriptet och Adrian Salic för den TDRFP-NLS konstruktion. AFB och MAV finansieras av den NIGMS Biomolekylär farmakologi utbildning Grant 5T32GM008541. NJG är medlem av Shamim och Ashraf Dahod Breast Cancer Research Laboratories och stöds av NIH grants GM117150 och CA-154531, Karin Grunebaum Foundation, Smith familj utmärkelser programmet, till Searle Scholars-programmet och melanom forskningen Alliance.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
phenol red-free, DMEM:F12 media Hyclone SH3027202
10% fetal bovine serum (FBS) Gibco 10438026
100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. Gibco 15070063
PBS Gibco 10010049
0.25% Trypsin/EDTA Gemini 50-753-3104
12-well glass bottomed imaging dish Cellvis P12-1.5H-N
Paclitaxel TSZ Chem RS036
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma NC0215085
Environmental Chamber In Vivo Scientific
5% CO2 Airgas Z03NI7432000201
15 mL Conical Tubes Fisherbrand 05-539-12
10 cm polystyrene tissue culture plates Falcon 08772E
10 mL Disposable Serological Pipette Fisherbrand 4488
5804R 15 amp Centrifuge Eppendorf 97007-370
1000 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
20 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
p1000 Pipette Tips Sharp p1126
p20 Pipette Tips Sharp P1121
RPE-1 Cells ATCC CRL-4000
Incubator Galaxy 170S Eppendorf CO17011005
Pipette Boy Integra 156401
Hemacytometer Fisher Scientific 0267110
Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging Micro Video Instruments, Inc. MEA53100
Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator Micro Video Instruments, Inc. 500-H117P1N4
Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders Micro Video Instruments, Inc. 500-H31XYZE
Andor Digital Camera Micro Video Instruments, Inc. D10NLC
Nikon NIS Elements AR Software Micro Video Instruments, Inc. MQS31000
SOLA LED Illuminator for Fluorescence Micro Video Instruments, Inc. SOLA-E
InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control Micro Video Instruments, Inc. Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece Micro Video Instruments, Inc. MEP59391
Ti-C System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL51000
Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL56200
Te-C LWD Ph1 Module Micro Video Instruments, Inc. MEH41100
CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm Micro Video Instruments, Inc. MRH10101
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective Micro Video Instruments, Inc. MRH48230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76, (6), 1101-1112 (2015).
  2. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3, e411 (2012).
  3. Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents? Nat Rev Cancer. 7, (2), 107-117 (2007).
  4. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122, (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  5. Rieder, C. L., Maiato, H. Stuck in division or passing through: what happens when cells cannot satisfy the spindle assembly checkpoint. Dev Cell. 7, (5), 637-651 (2004).
  6. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, (2), 111-122 (2008).
  7. Huang, H. C., Mitchison, T. J., Shi, J. Stochastic competition between mechanistically independent slippage and death pathways determines cell fate during mitotic arrest. PLoS One. 5, (12), e15724 (2010).
  8. Shi, J., Orth, J. D., Mitchison, T. Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5. Cancer Res. 68, (9), 3269-3276 (2008).
  9. Ganem, N. J., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131, (3), 437-440 (2007).
  10. Ganem, N. J., Storchova, Z., Pellman, D. Tetraploidy, aneuploidy and cancer. Curr Opin Genet Dev. 17, (2), 157-162 (2007).
  11. Ganem, N. J., Pellman, D. Linking abnormal mitosis to the acquisition of DNA damage. J Cell Biol. 199, (6), 871-881 (2012).
  12. Sotillo, R., Schvartzman, J. M., Socci, N. D., Benezra, R. Mad2-induced chromosome instability leads to lung tumour relapse after oncogene withdrawal. Nature. 464, (7287), 436-440 (2010).
  13. Sotillo, R., et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice. Cancer Cell. 11, (1), 9-23 (2007).
  14. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, (7252), 278-282 (2009).
  15. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, (8), e6564 (2009).
  16. McGuire, W. P., et al. Cyclophosphamide and Cisplatin Compared with Paclitaxel and Cisplatin in Patients with Stage III and Stage IV Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine. 334, (1), 1-6 (1996).
  17. McGuire, W. P., et al. Taxol: a unique antineoplastic agent with significant activity in advanced ovarian epithelial neoplasms. Ann Intern Med. 111, (4), 273-279 (1989).
  18. Ettinger, D. S. Taxol in the treatment of lung cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. (15), 177-179 (1993).
  19. Weaver, B. A. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 25, (18), 2677-2681 (2014).
  20. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer. 4, (4), 253-265 (2004).
  21. Wall, M. E., Wani, M. C. Camptothecin and Taxol: Discovery to Clinic-Thirteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture. Cancer Research. 55, (4), 753-760 (1995).
  22. Schiff, P. B., Horwitz, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, (3), 1561-1565 (1980).
  23. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22, (22), R966-R980 (2012).
  24. Musacchio, A. The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint Signaling Dynamics. Curr Biol. 25, (20), R1002-R1018 (2015).
  25. Uetake, Y., et al. Cell cycle progression and de novo centriole assembly after centrosomal removal in untransformed human cells. J Cell Biol. 176, (2), 173-182 (2007).
  26. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, (3), 487-498 (2008).
  27. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, (6), 577-585 (2015).
  28. Gu, J., et al. Cell cycle-dependent regulation of a human DNA helicase that localizes in DNA damage foci. Mol Biol Cell. 15, (7), 3320-3332 (2004).
  29. Easwaran, H. P., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Cell cycle markers for live cell analyses. Cell Cycle. 4, (3), 453-455 (2005).
  30. Hahn, A. T., Jones, J. T., Meyer, T. Quantitative analysis of cell cycle phase durations and PC12 differentiation using fluorescent biosensors. Cell Cycle. 8, (7), 1044-1052 (2009).
  31. Bajar, B. T., et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases. Nat Methods. 13, (12), 993-996 (2016).
  32. Gekara, N. O. DNA damage-induced immune response: Micronuclei provide key platform. J Cell Biol. 216, (10), 2999-3001 (2017).
  33. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12, (3), 196-209 (2012).
  34. Crasta, K., et al. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482, (7383), 53-58 (2012).
  35. Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J., Hetzer, M. W. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154, (1), 47-60 (2013).
  36. Maciejowski, J., Li, Y., Bosco, N., Campbell, P. J., de Lange, T. Chromothripsis and Kataegis Induced by Telomere Crisis. Cell. 163, (7), 1641-1654 (2015).
  37. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, (7555), 179-184 (2015).
  38. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352, (6283), 353-358 (2016).
  39. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352, (6283), 359-362 (2016).
  40. Bernhard, W., Granboulan, N. THE FINE STRUCTURE OF THE CANCER CELL NUCLEUS. Exp Cell Res. 24, (Suppl 9), 19-53 (1963).
  41. de Noronha, C. M., et al. Dynamic disruptions in nuclear envelope architecture and integrity induced by HIV-1 Vpr. Science. 294, (5544), 1105-1108 (2001).
  42. Vargas, J. D., Hatch, E. M., Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Transient nuclear envelope rupturing during interphase in human cancer cells. Nucleus. 3, (1), 88-100 (2012).
  43. Sieprath, T., Darwiche, R., De Vos, W. H. Lamins as mediators of oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun. 421, (4), 635-639 (2012).
  44. Mitchison, T. J., Pineda, J., Shi, J., Florian, S. Is inflammatory micronucleation the key to a successful anti-mitotic cancer drug? Open Biol. 7, (11), (2017).
  45. Shenk, E. M., Ganem, N. J. Generation and Purification of Tetraploid Cells. Methods Mol Biol. 1413, 393-401 (2016).
  46. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J Vis Exp. (115), (2016).
  47. Salmon, E. D., Canman, J. C. Proper alignment and adjustment of the light microscope. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 Unit 4 1 (2001).
  48. Cole, R. Live-cell imaging. Cell Adh Migr. 8, (5), 452-459 (2014).
  49. Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J Vis Exp. (111), (2016).
  50. Douthwright, S., Sluder, G. Live Cell Imaging: Assessing the Phototoxicity of 488 and 546 nm Light and Methods to Alleviate it. J Cell Physiol. 232, (9), 2461-2468 (2017).
  51. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34, (7), 703-706 (2016).
  52. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34, (11), 1137-1144 (2016).
  53. Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (6), 1826-1831 (2009).
  54. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nat Cell Biol. 5, (3), 255-260 (2003).
  55. Bekker-Jensen, S., Lukas, C., Melander, F., Bartek, J., Lukas, J. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1. J Cell Biol. 170, (2), 201-211 (2005).
  56. Loewer, A., Batchelor, E., Gaglia, G., Lahav, G. Basal dynamics of p53 reveal transcriptionally attenuated pulses in cycling cells. Cell. 142, (1), 89-100 (2010).
  57. Lekshmi, A., et al. A quantitative real-time approach for discriminating apoptosis and necrosis. Cell Death Discovery. 3, 16101 (2017).
  58. Jullien, D., Vagnarelli, P., Earnshaw, W. C., Adachi, Y. Kinetochore localisation of the DNA damage response component 53BP1 during mitosis. J Cell Sci. 115, (Pt 1), 71-79 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics