Neurodegeneration Ex Vivo 쥐 두뇌 분할 영역을 사용 하 여 기본 이벤트를 공부 하는 양자 택일 접근

Neuroscience

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Summary

선물이 추가 neurodegeneration 기본 초기 이벤트에 대 한 통찰력을 제공할 수 설립된 전 비보 두뇌 기술에 기반 한 메서드가 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험의 장점이 결합. 또한, 같은 해 부 비행기에서 치료 및 치료 그룹의 직접 비교를 위한 독특한 기회를 나타냅니다.

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Brai, E., Cogoni, A., Greenfield, S. A. An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices. J. Vis. Exp. (134), e57507, doi:10.3791/57507 (2018).

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Abstract

기본 neurodegeneration을 처리 하는 기본을 반영 하는 신뢰할 수 있는 동물 모델 개발을 시도 하는 수많은 연구에도 불구 하 고 거의 널리 허용 되었습니다. 여기, 우리는 유명한 비보 전 뇌 조각 기술는 가까이 vivo에서제공에서 적응 하는 새로운 절차 제안- 생체 외에서 준비로 세포 변성을 트리거링 초기 이벤트 조사에 대 한 보다 시나리오 처럼 Alzheimer의 질병 (광고)에서 관찰 됩니다. 선택 된 두뇌 지구 및 생리 적인 환경에서의 로컬 기능 해 부 cytoarchitecture의 보존을 가능 하 게 간단 하 고 쉽게 재현 가능한 단계,이 변이 의하여 이루어져 있다. 다른 해 부 지역 사이트-, 복용량-및 시간에 따른 방식으로 문제의 치료와 여러 실험을 수행할 수 있는 기회를 제공 하는 동일한 뇌에서 얻을 수 있습니다. 이 방법론에 관련 된 결과 영향을 미칠 수 있는 잠재적인 제한 조직, 즉, 자국과 인큐베이션 단계와 섹션 두께 동안 해부학의 무결성의 유지 관리의 보존에 관련 된 어떤 생화학 및 immunohistochemical 분석을 좌우할 수 있다. 이 방법은 생리 적 또는 병 적인 조건, 마약 검사, 또는 복용량 응답 분석 실험에 참여 하는 분자 메커니즘을 탐구 하는 등 다른 용도로 사용할 수 있습니다. 마지막으로,이 프로토콜 또한 동물 행동 연구에서의 수를 줄일 수 있습니다. 여기에서 보고 된 응용 프로그램은 최근 설명 되었고 슬라이스에 비보 전 쥐 뇌 기저 개 (BF)는 광고에 주로 영향을 대뇌 영역 중 하나를 포함 하는 처음으로 테스트. 특히, 그것은 입증 되었습니다 acetylcholinesterase (통증)의 C-말단에서 파생 된 독성 펩 티 드의 트리거링, BF의 antero 후부 축 차동 식의 광고와 같은 프로 파일을 프롬프트 수 있습니다. 단백질 alpha7 nicotinic 수용 체 (nAChR α7), 등의 광고에서 변경 phosphorylated (p-타우), 타우 및 아 밀 로이드 베타 (Aβ).

Introduction

광고는 점진적 신경 장애 entorhinal 외피 (EC), BF, 해 마 (HC), 및 후 각 전구 등의 서로 다른 뇌 영역에 영향을 미치는 만성 병 리 특징 (OB)1,2,3, 4,5. 광고 개발의 후반 단계에서 만드는이 질병 약 모든 경우6의 70%를 차지, 치 매의 가장 일반적인 형태는 진보적인 인식 쇠퇴에 리드. 광고에 발생 하는 초기 단계를 이해 하 광범위 한 시도도 불구 하 고 되지 않습니다 현재 그들 elucidating 정의 실험 표시. 또한, 가장 인기 있는 이론-"녹말 체 가설은"-점점 문제 시 된다 광고 pathobiology도 효과적인7,8 입증 제약 대상 설명에 완전 한 단면도 제공 하지 않기 때문 ,9.

증가 주목 받고 있는 대체 이론 neurodegeneration 중 발생 하는 초기 메커니즘 광고3,,1011 에 주로 감염 신경 클러스터에 관련 된 제안 , 12 , 13 , 14. EC, HC, 및 산부인과15,16등 여러 영역에 BF, midbrain, 및 brainstem, 프로젝트 내에서 포함 하 고이 다른 유형의 세포 허브. 신경 형태학 및 신경 전달 물질 합성에 그것의 다양성에도 불구 하 고 셀의이 핵심 표현 하는 통증 또한 비 효소 기능17,18을 가질 수 있는 일반적인 기능을 공유 합니다. 신호 분자 중재 Ca2 + 복용량, 가용성, 그리고 신경 나이17,18 에 관하여 영양 또는 독성 이벤트를 받을 수 있는 신경 세포로 칼슘 (캘리포니아2 +) 흐름 소설이 아닌 클래식 역할 , 19.

Neurodegeneration, 동안 관찰된 셀룰러 손실 수 있습니다 따라서 연결 될이 비 효소 기능17,,1820는 이다 30mer 펩타이드 (T30) 통증 C-말단은 에서 죽 습에 기인 20. 세포 배양 및 광학 이미징18,21 에 이전 결과 따라 우리 시연, ex vivo 쥐 뇌 조각 T30 유도 하는 BF 구조를 포함에 따라 새로운 접근 방식을 통해 광고 같은 프로필22. 특히,이 새로운 방법론까지 해부학에서 회로 보존, 이기는 하지만 시간의 시간 창 그대로 직물의 특성의 많은 유지 이후 세포 배양 보다 더 생리 적인 시나리오를 제공 합니다. 우리는 T30 응용 프로그램에 심각한 응답을 모니터링 neurodegeneration의 초기 단계에서 일어나는 이벤트를 탐험이 프로토콜을 적용 했다.

뇌를 사용 하 여 문학의 큰 신체에도 불구 하 고 분자 경로 조사 하는 조각 신경 손상에 대 한 묵시적인 또는 신생23,24이 프로토콜 보다 즉각적인 처음으로 제공 하 고 밖으로 읽기에 민감한 비교 organotypic 조각의 일반적인 사용 하. 그러나, 사건으로 organotypic에 대 한 뇌 섹션,이 심각한 슬라이스 절차 또한 채택 될 수 특정 프로세스에서 발생 하는 주요 분자 변화의 발견 신경 또는 신경 분자의 평가 등 여러 가지 목적 immunohistochemical 분석, 및 중앙 신경 조직에 대 한 약리학 적인 분석 실험 병 리 관련.

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Protocol

모든 동물 연구 승인된 프로토콜에서 수행 되었습니다.

참고:이 섹션에서는 실험 절차 동안 수행의 주요 단계 순서와 제안된 시간 간격 (그림 1)를 제공 됩니다. 또한, 프로토콜에 대 한 단계별 설명 (그림 2) 잠복기 후 조직 균질 뇌 제거에서까지 중요 한 작업을 보여주는 설명 패널에 의해 보충 된다. 재료 및 기구 및 WB 분석에 대 한 후속 단계 지침에 관한 내용은 앞에서 설명한22있습니다.

1. 수술 도구, Vibratome 설정 및 치료 준비

참고: 실험 절차를 시작 하기 전에 다음 단계를 실행:

  1. 두 다른 인공 뇌 척추 액체 (aCSFs), 뇌 조각화에 대 한 사용을 준비 하 고 인큐베이션 단계에 대 한 다른 이전29설명. 짧게, 두 aCSFs의 (mmol)에서 작업 농도 "슬라이스" 실제는: 120 NaCl, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 KH24및 10 포도 당; 6.7 HEPES 소금과 3.3 HEPES 산; pH: 7.1. "녹음" 실제 대: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1.3 KH24및 10 포도 당; pH: 7.1.
  2. 솔루션을 잘 섞어 다음 얼음에 넣어 하 고 두뇌와 후속 단면을 제거 하는 동안 감기를 가지기 위해 조각화 실제 산소. 녹음 실제를 실 온 (RT)와 공급 산소에서 유지.
  3. 잘린 및 뇌 제거, , 단두대, 수술 해 부 키트 (가 위, 집게, 블레이드), 및 주걱 절 개 후드 악기를 놓습니다.
  4. 슬라이스 두께 (이 준비에서 300 µ m)와 7에 주파수와 6 속도 선택 하 여 vibratome 매개 변수를 설정 합니다. Vibratome 챔버의 적절 한 공간에 삽입 하 고 그것을 포위 하는 얼음.
  5. "조각화" (실제) 뇌 단면 중 산소 carbogen (95% O2, 5% CO2) 밸브를 엽니다. 최소 유량 2 mL/min의 주위를 선택 합니다.
  6. 테스트 조건을 준비 하 두 15 mL 튜브를 가져가 라. "녹음" 실제의 10 mL T30 2 µ M (대우 그룹)의 농도에 농축 한 튜브는 "기록" 실제 혼자 (제어 그룹) 10 mL와 다른,를 추가 합니다. 와 동 모두 튜브와 설치 준비 단계 (제 3)에서 사용까지 얼음에 그들을 유지.

2입니다. 마 취, 뇌 추출 및 슬라이스

참고:이 연구에서 9 야생 타입 P14 남성 Wistar 쥐 사용 되었다. 뇌 추출 및 후속 슬라이스 이후 그들은 신속 하 게 수행 해야 (10 분) 이내 방지 하거나 적어도 조직 변성 과정 감속 프로토콜의 중요 한 부분을 구성 합니다.

  1. 유도 챔버로 면 레이어에 isoflurane의 100 %w / w 1.5 mL을 추가, 내부, 동물 놓고 뚜껑을 닫습니다. 동물 깊이 취 페달 반사의 부재를 확인 될 때까지 기다립니다 고 단두대를 사용 하 여 동물을 목을 벨.
  2. 계속 차가운 남 비를 포함 하는 내에서 동물의 머리 두뇌 제거 단계 동안 실제 조각화 (그림 2A -C).
  3. 외과 블레이드, 두개골을 통해 피부를 incise 다음 후부 부분에서 중간, 다음가 위를 사용 하 여 두개골을 잘라 고 anteriorly OBs (그림 2A) 위에 뼈를 도달할 때까지.
  4. 옆 뇌 (그림 2B)에 액세스할 수 있습니다 한 쌍의 집게를 사용 하 여 두개골의 두 측면을 당겨. 뇌에 ventrally 주걱을 삽입, 그것을 밖으로, 그리고 그것은 약 5 분 (그림 2C)에 대 한 차가운 "슬라이스" 실제에 충분 한지 체크 해 계속 부드럽게 푸.
  5. 필터 종이에 두뇌를 처분 하 고 (그림 2D) 블레이드를 사용 하 여 소 뇌를 잘라. Vibratome 디스크에 세로로 두뇌 접착제 및 단면 챔버 내부 삽입, 차가운 "슬라이스" 실제 그것을 채울 제공 되며 산소 (그림 2E).
  6. 절단 간격을 조정 하 고 뇌 단면 (그림 2F)와 함께 진행. 앞에서 설명한22로 중간 심장 (MS), Broca (DBB), 그리고 substantia innominata (SI)의 대각선 밴드 등 관심 영역을 포함 하는 섹션을 수집 합니다. 위에서 아래, 3 조각 rostral (R), 중급 (I), 그리고 BF (그림 2G)의 꼬리 (C) 부분을 포함합니다.
  7. 작은 위, 각 섹션 중간 선 따라 분할 취득 두 반사 hemislices (그림 2 H), 개별적으로 제어와 같은 해 부 비행기에서 대우 조건 사용.
  8. 5-10 분, vibratome 챔버에는 hemisections를 계속 한 다음 녹음 실제를 포함 하는 버블링 냄비에 유리 피 펫과 그들을 전송. 복구를 약 30 분 동안 RT에서 유지.
  9. 한편, 혼자 녹음 실제의 3 mL (이전 단계 컨트롤 그룹에 대 한 1.6에서에서 준비)와 함께 3 개의 유리 튜브와 실제 T30 (이전 단계 1.6에서에서 준비) 대우 그룹에 대 한 강화의 3 mL와 함께 3 개의 튜브 작성.

3. 설치 준비

  1. 제어 그룹 (녹색 프레임, 그림 2J) 3 연속 hemislices (rostral, 중간, 및 꼬리 BF 지역 포함) 순서는 hemisections 그들의 해당 유리 튜브 (그림 2I)로 전송 하 고 그들의 대우 그룹 (레드 프레임, 그림 2J)에 대 한 대응을 일치.
  2. 조건 사이 어떤 오염 든 지 방지 하기 위해 제어 hemislices 및 다른 처리 대응에 대 한 두 개의 다른 붓과 뇌 조직의 전송.
  3. 각 유리 유리병 oxygenating 바늘 (21 G) (그림 2J) 제시 해당 뚜껑을 봉인. Carbogen 소스 (그림 2 K) 기구의 주요 튜브를 연결 합니다. 실험 기간 동안 뇌 조직과 기계적 손상의 어떤 움직임을 피하기 위하여 2 mL/min의 최소 유량과 인큐베이션 기간 동안 hemislices에 산소를 제공 합니다. 5 h 부 화를 시작 합니다. 5 분 이내 3.1-3.3 단계를 실행 합니다.
    참고: 체크 자주 (매 15-20 분) 모든 튜브에 산소 제공 여부와 흐름 아래에서 조직을 이동 하지 않습니다.

4. 샘플 균질

  1. 부 화 후 산소 흐름을 중지 하 고 튜브에서 모든 뚜껑을 제거 합니다. Hemislices, 얼음 (그림 2 L)에 튜브를 유지 세포의 용 해 버퍼의 250 µ L을 포함 하는 1.5 mL 튜브에 적절 한 브러쉬를 사용 하 여 전송 합니다. 세포의 용 해 버퍼, PBS 1 인산 가수분해 효소와 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 모두에서 1: 100, 희석와 조직 샘플 중 오염을 방지 하기 위해 다른 pestles와 균질. 10-15 분 내에서 이러한 작업을 완료 합니다.
  2. 4 ° c.에서 5 분 동안 1000 x g에서 lysate 뇌 원심 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 샘플-80 ° c.에 유지

5. 단백질 농도 및 서쪽 오 점 분석의 읽기

  1. 각 샘플의 단백질 농도 확인 하 고 이후에 aliquots 앞에서 설명한22로 서쪽 오 점 분석을 위한 준비.
  2. 단백질 표정에 치료의 효과 평가 하기 위해 통계 분석을 수행 합니다.

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Representative Results

여기에 제시 된 프로토콜 나타냅니다 독성 펩 티 드, T30, 관리 사이트-종속 방식에서 p α7 nAChR의 표현을 변조-타우, 그리고 Aβ BF-포함 된 섹션 (그림 3A). Nicotinic 수용 체의 제어 대응에 비해 rostral 처리 hemislice에서는 크게 증가 (슬라이스 1, p = 0.0310) (그림 3B), 동안 중간 슬라이스 두 가지 조건 (사이 어떤 변화를 공개 하지 않습니다 슬라이스 2, p = 0.1195) (그림 3B). 후부 섹션에서 상당한 감소의 제어 측면에 T30 노출 부분에는 (슬라이스 3, p = 0.0476) (그림 3B). T30 응용 프로그램에 따라 p-타우 레벨은 측면을 일치 하는 컨트롤에 대 한 전방 지역에서 크게 증가 한다 (슬라이스 1, p = 0.0158) (그림 3C). 다른 한편으로, 다른 두 BF 포함 된 섹션 조건 사이 상당한 차이 표시 하지 않습니다 (슬라이스 2, p = 0.1014; 슬라이스 3, p = 0.6405) (그림 3C). T30 노출, Aβ는 크게 향상 된 rostral와 중간 hemisections 그들의 치료 contralateral 부분에 비교 될 때에 (슬라이스 1, p = 0.0136; 슬라이스 2, p = 0.0109) (그림 3D). 꼬리 조각에는 2 개의 처리 사이 변화가 없습니다 (슬라이스 3, p = 0.1231) (그림 3D). P-타우에 대 한 1 차적인 항 체 epitope phosphorylated Ser202 잔류물을 포함 하는 인식 합니다. Aβ에 대 한 1 차적인 항 체 여러 isoforms, Aβ37에서 Aβ42까지를 검색 합니다. 데이터는 2를 사용 하 여 앞에서 설명한22 쌍체 t검정으로 분석 되었다-테스트 및 SEM. N으로 표현 =은 (그룹 당 hemislices 쥐) (27, 9).

Figure 1
그림 1: 시퀀스 및 주요 단계를 나타내는 타이밍 실험 절차 동안 수행. 첫 번째 및 세 번째 단계를 완료 하는 시간 간격 연산자의 경험 수준에 관하여 달라질 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 프로토콜 진행을 보여주는 일련의 단계. (A-D) 두개골과 두뇌의 나머지에서 소 뇌의 분리에서 두뇌의 추출. Vibratome 디스크에 전송 해 부 챔버, 얼음으로 둘러싸인 고 가득 찬 실제 끊임없이 부 러 뜨 리는 하는 동안 산소에 두뇌의 (E) 첨부 합니다. (F) 코로나 뇌 단면입니다. (G) rostral (R), 중급 (), 그리고 기저 개의 꼬리 (C) 구조과는 조각의 컬렉션입니다. (H) 두 일치 hemislices에 섹션의 분리. () 각 hemisection는 해당 유리병에 배치 됩니다. (J) 튜브 지원 장치 상자 안쪽에 배치 하 고 별도로 폐쇄 합니다. (K) 인큐베이션 기간 산소 소스 (검은 원) 시스템의 연결 시. 치료 후 샘플 (L) 균질 이 그림22에서 수정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: T30 중재 p α7 nAChR의 특정 표현-타우, 그리고 BF rostro 꼬리 축 Aβ. (A) 뇌 코로나 조각 기저 개 핵 (흰색 점선), 두 개의 보완적인 부분에서 분할 하 고 서로 다른 조건에 노출 등의 표현입니다. (B) 후 T30 노출, nicotinic 수용 체 앞쪽 서브 (T30 1)와 하나 (T30 3) 해당 제어 측면 (ctrl 1 및 ctrl 3)에 비해 뒷부분에 표시 된 감소에 상당한 증가 보여줍니다. 중간 조각 팬 들은 두 가지 조건 (ctrl 2, T30 2) 사이의 변경의 정보를 표시 하지 않습니다. (C) p-타우 식이 끝났습니다 치료 rostral 부분 (T30 1)에 상당히 높은 제어 일치 대응 (ctrl 1), 반면 다른 두 조각 (슬라이스 2와 슬라이스 3) 두 그룹에 어떤 차이 공개 하지 않습니다. (D) Aβ는 앞쪽에 및 중간 처리 세분 (T30 1과 T30 2)의 해당 치료 면 (ctrl 1 및 2 ctrl)에 비해 크게 증가 표시 됩니다. 꼬리 부분에서는 두 그룹 사이의 아무 변화입니다. 오차 막대 표시 SEM. * p < 0.05.n =은 (그룹 당 hemislices 쥐) (27, 9). 눈금 막대는 1 m m 이다. 이 그림22에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

잘 설립 비보 전 뇌 기술에 따라,이 프로토콜의 주요 측면 동기적으로 특정의 신청 후에 그들의 응답을 모니터링 같은 해 부 비행기에서 얻은 두 개의 반사 hemislices 테스트를 수합니다 조건 제어 (치료를); 이 따라서 최대한으로 엄격 하 게 제어 하는 실험 패러다임을 제공 합니다. 시간-, 복용량-및 특정 방식으로 서로 다른 neurochemicals 신경 장애에 관련 된 신경 이벤트22, 동안 본 평가의 가능성 필수적인 기능을 나타냅니다. 이 방법론 그 시험관에서 준비, 관심 영역 및 이상적인 extracellular 컨텍스트를 만드는 정확도 등의 생체 내에서 생리 적 환경의 장점을 연결 합니다. 이 프로토콜 나타냅니다 비보 전 electrophysiological 녹음25,,2627 및 광학 이미징28, 널리 이용 되는 절차를 자르는 일반적인 뇌의 적응 29,30또는 생체 외에서 organotypic 조각, 둘 다 구조와 시 냅 스 조직23,24 의 보존 함으로써 가까이 vivo에서 상황을 시뮬레이션 하는 ,3132.

또한,이 절차는 vivo에서부분적으로 복제 하기 때문에 행동 연구에 사용 하는 동물의 수를 줄일 도울 수- 체 외에서 데이터, 세포 배양 등을 확인 하는 채택 했다 수 상태 처럼 고 immunohistochemical 분석 다음 vivo에서 실험을 기대 하 고.

제안 된 방법론 또한 몇 가지 제한 섹션 두께 하지 때 최종 결과 변경할 수 있습니다 무결성 등을 제공 합니다. 보육 시간 그것은 제어 그룹 및 대우 한 사이 비교에 영향을 줄 수 있기 때문에이 기술의 기본 구성 요소 이기도 합니다. 또한, 일련의 절차적 또는 기술적인 문제 발생할 수 있습니다 프로토콜의 모든 단계와 같은: 추출 또는 조직;의 정확 하 고 부드러운 처리에 의해 피할 수 있다 뇌 단면 (1) 기계적 손상 (에 따라서 그것의 무결성에 영향을 미치는 실제 침수 2) 때문에 의하여 바늘을 접촉 하는 경우는 조직 손상 기계적으로 할 수 있는 과도 한 산소 흐름, 외피 동안에 hemislices의 부동. 이 버블링; 최소 속도를 조정 하 여 방지 될 수 있다 (3) 부재 또는 변덕 스러운 산소 흐름, 어떤 관련이 있을 수 있습니다 빈 용기, 손상 또는 단절 튜브 시스템, oxygenating 바늘에 플러그 또는 때 그것은 하지 제대로 몰입에 실제. 이후 지속적인 산소와 절차를 통해 그것의 흐름이이 프로토콜의 가장 중요 한 측면 중 하나를 나타냅니다, 그것은 자주 조사 그룹 간의 균질 상태를 유지 하기 위해 이러한 모든 매개이 변수를 모니터링 하는 것이 중요.

다른 중요 한 단계는 프로토콜에 표시 되는 각 작업을 수행 하는 데 필요한 시간 창이 때 뒤 지 보존 가능한 무결성 및 조직의 기능 만큼. 또한, 이러한 매개 변수를 평가 하 immunohistochemical 분석 앞에서 설명한23,29신경 생존 및 electrophysiological 녹음에 관련 된 특정 마커 검출을 수행할 수 있습니다.

여기서 설명 하는 결과 넘어이 메서드는 디자인 임시 특정 조사에 대 한 될 수 있습니다. 예를 들어, 그것은에 적용 될 수 있습니다: (1) 모니터와 여러 다른 화합물의 활동 비교 뇌 영역, 선택한 솔루션의 실제 등 Neurobasal 매체; 잠복기 (2) 수행 연구에 저 산소 증, 산소 흐름을 각 hemisection;에 선택적으로 제어할 수 있기 때문 (3) 조사; 다른 질병의 유전자 변형 동물 모델에서 뇌 조직 속성 (4) 동시에 같은 해 부 수준에서 vivo에서 일방적인 뇌 주사의 영향을 탐구 하 고 제어 반구;와 그들을 비교합니다 (5) 다른 장기 또는 조직 속성, 따라서 잠재적으로 촉진 및 마약 재판 심사의 길이 줄이고 탐구.

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Disclosures

저자는 경쟁 금융 관심사를 선언합니다. 수잔 A. 그린 필드는 설립자 이자 신경-바이오 제한, 개인 소유의 회사, 및 보유 주식 회사의 사장. 에마누엘레 땋 고 Antonella Cogoni는 신경-바이오 회사의 직원

Acknowledgments

이 작품은 신경-바이오 회사에 의해 투자 되었다 우리는 그들의 의견 및 조언을 원고에 대 한 박사 조반니 Ferrati와 박사 세르지오로 톤도 (신경-바이오) 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich, Germany S7653 Reagent for aCSF preparation
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich, Germany P9333 Reagent for aCSF preparation
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich, Germany S5761 Reagent for aCSF preparation
Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) Sigma-Aldrich, Germany 63138 Reagent for aCSF preparation
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich, Germany P5655 Reagent for aCSF preparation
Hepes salt Sigma-Aldrich, Germany H7006 Reagent for aCSF preparation
Hepes acid Sigma-Aldrich, Germany H3375 Reagent for aCSF preparation
Glucose Sigma-Aldrich, Germany G7528 Reagent for aCSF preparation
Calcium chloride dehydrate Sigma-Aldrich, Germany 223506 Reagent for aCSF preparation
T30 peptide Genosphere Biotechnologies, France AChE-derived peptide tested
Surgical dissecting kit World Precision Instruments, USA Item #: MOUSEKIT Brain removal step
Surgical blades Swann-Morton, UK BS 2982 Brain removal step
Filter paper Fisher Scientific, USA 11566873 Brain preparation for slicing
Glue Brain preparation for slicing
Vibratome Leica, Germany VT1000 S Slicing
Brushes Tissue handling
Oxygen canister Sectioning and incubation phase
1x Phosphate buffer saline (PBS) Fisher Scientific, USA BP2438-4 Homogenization step
Phosphatase inhibitors Fisher Scientific, USA 1284-1650 Homogenization step
Protease inhibitors Roche complete PIC, USA 4693116001 Homogenization step
Pestles Starlab, UK I1415-5390 Homogenization step
Microcentrifuge
Pierce 660 nm Protein Assay Thermo Scientific, USA 22660 Protein concentration

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References

  1. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82, (4), 239-259 (1991).
  2. Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's disease--interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling. Neurochemical Research. 30, (6-7), 895-908 (2005).
  3. Schmitz, T. W., et al. Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer's pathology. Nature Communications. 7, 13249 (2016).
  4. Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative. What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer's disease on the cerebral cortex and the hippocampus. Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).
  5. Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. Olfactory centres in Alzheimer's disease: olfactory bulb is involved in early Braak's stages. Neuroreport. 12, (2), 285-288 (2001).
  6. Winblad, B., et al. Defeating Alzheimer's disease and other dementias: a priority for European science and society. The Lancet Neurology. 15, (5), 455-532 (2016).
  7. Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat Neurosci. 18, (6), 794-799 (2015).
  8. De Strooper, B., Karran, E. The Cellular Phase of Alzheimer's Disease. Cell. 164, (4), 603-615 (2016).
  9. Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388, (10043), 505-517 (2016).
  10. Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development-A study of molecular forms. Neurochemistry International. 21, (3), 381-396 (1992).
  11. Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Progress in Neurobiology. 68, (3), 209-245 (2002).
  12. Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. Early neurone loss in Alzheimer's disease: cortical or subcortical? Acta Neuropathol Commun. 3, 10 (2015).
  13. Mesulam, M. The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or Side Show? Learn Mem. 43-49 (2004).
  14. Schliebs, R., Arendt, T. The cholinergic system in aging and neuronal degeneration. Behavioural Brain Research. 221, (2), 555-563 (2011).
  15. Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6). Neuroscience. 10, (4), 1185-1201 (1983).
  16. Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 214, (2), 170-197 (1983).
  17. Greenfield, S. Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat. Chemico-Biological Interactions. 203, (3), 543-546 (2013).
  18. Garcia-Ratés, S., et al. (I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains. Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).
  19. Eimerl, S., Schramm, M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. Journal of neurochemistry. 62, (3), 1223-1226 (1994).
  20. Greenfield, S., Vaux, D. J. Commentary Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism. Science. 113, (3), 485-492 (2002).
  21. Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. (II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator. Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).
  22. Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -S., Greenfield, S. A. A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer's Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291 (2017).
  23. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current neuropharmacology. 5, (1), 19-33 (2007).
  24. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  25. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
  26. Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia. Brain Research. 554, (1-2), 166-175 (1991).
  27. Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).
  28. Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5, (11), 874-885 (2004).
  29. Badin, A. S., John, E., Susan, G. High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).
  30. Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function. Neurophotonics. 4, 31213 (2017).
  31. Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).
  32. Gong, C. -X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain. Brain Research Protocols. 6, (3), 134-140 (2001).

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