레이저 캡처 서 유전자 표정 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 배수 채널의

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Biology

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Summary

여기, 우리 다운스트림 RNA 분석에 대 한 배수 채널 (TM)를 격리 하기 위한 재현성 레이저 캡처 기정 (LCM)에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. TM에 유전자 발현에 변화를 분석 하는 능력은 TM 관련 눈 질병의 근본적인 분자 메커니즘을 이해에 도움이 됩니다.

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Sutherland, C., Wang, Y., Brown, R. V., Foley, J., Mahler, B., Janardhan, K. S., Kovi, R. C., Jetten, A. M. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57576, doi:10.3791/57576 (2018).

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Abstract

레이저 캡처 기정 (LCM)는 단일 세포의 유전자 표정 분석을 허용 하 고 조직 섹션에서 세포 인구를 풍성 하 게. LCM 기본 세포 분화와 개발 및 녹 내장을 포함 하 여 다양 한 질병의 진행 하는 분자 메커니즘의 연구에 대 한 훌륭한 도구입니다. 녹 내장, 진보적인 광섬유 neuropathies의 가족 구성, 전세계 돌이킬 수 없는 실명의 가장 흔한 원인입니다. 녹 내장을 개발 하기 위한 주요 위험 요소 증가 안구 내부 압력 (IOP), 구조 변경 및 배수 채널 (TM) 내에서 손상 발생할 수 있습니다. 그러나, 관련 된 정확한 분자 메커니즘이 아직도 제대로 이해 하 고. 유전자 표정 분석을 수행 하는 기능 추가 이러한 셀 및 IOP와 녹 내장 개발의 규칙에 있는 그것의 역할의 기능에 대 한 통찰력을 얻기에 중요 한 될 것입니다. 이를 위해, 높은 격리에 대 한 재현 방법 실시간 정량 및 RNA-Seq 필요와 같은 마우스 눈 및 다운스트림 유전자 표정 분석 방법의 냉동된 섹션에서 TM 농축. 여기에 설명 된 메서드는 다운스트림 디지털 PCR 및 microarray 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 TM을 개발 된다. 또한,이 기술은 다른 매우 풍부한 눈 세포 및 마우스 눈에서 분리 하기 어려운 세포 구획의 격리에 대 한 쉽게 적용할 수 있습니다. LCM 및 RNA 분석의 조합을 녹 내장 기본 셀룰러 이벤트의 보다 포괄적인 이해에 기여할 수 있다.

Introduction

녹 내장 질병 광섬유 신경 및 망막 궁극적으로 돌이킬 수 없는 실명1,2리드 특징의 그룹입니다. 2020 이상에 의해 70 백만 명 세계적으로 살게 될 것입니다 질병3,,45,,67의 일종으로 추정 된다. 기본 개방 각 녹 내장 (POAG), 녹 내장, 가장 널리 퍼진 유형의 액 (AH) 유출 증가 안구 내부 압력 (IOP)8,,910, 선도 저하에 의해 특징입니다. 11,12,13,143,15,,1617,18. 왼쪽된 치료, 만성 높은 IOP 망막 및 시 신경 머리 방사형 실명1,2,19를 일으키는 진보적이 고 돌이킬 수 없는 손상으로 이어집니다. Ciliary 바디 아의 생산의 속도 감소 또는 그것의 유출1,,89, 를 강화 하 여 IOP를 감소에 녹 내장의 진행을 둔화에 대 한 모든 현재 메서드 10 , 11 , 12 , 13 , 14. 주 아 유출 통로 적극적으로 조절에 중요 한 역할을 담당 하는 배수 채널 (TM)의 부적절 한 함수 이며 고혈압 녹 내장1,,219에 대 한 원인이 되는 요소. 그러나, TM 부전와 어떻게 그것은 아 배수 조절 관련 분자 메커니즘 아직 완전히 이해 되지 않는다 며 현재 녹 내장 연구1,2,19, 의 주요 초점 20. 여러 게놈 넓은 협회 연구 결과 (GWAS)는 녹 내장 및 TM에서 아 유출 시설에 증가 저항 유전자의 수를 연결 하 고, 하는 동안 질병으로 이어질 하지 않은 정확한 분자 메커니즘이 아직 완전히 이해21 , 22 , 23 , 24 , 25.

동물 모델 크게3,15,16,26,,2728, (광범위 하 게 검토 하는 녹 내장에 질병 진행의 우리의 현재 지식 향상 29,,3031,,3233). 몇 가지 선구적인 방법은 TM34,,3536 연구 개발 되었습니다 고 정상과 병에 걸리는 직물의 우리의 현재 이해를 사전에 이러한 방법을 널리 사용 되었습니다. 하나의 영역을 광범위 하 게 탐험 되지 않은 TM 실패의 분자 메커니즘 연구를 유전자 변형된 마우스 모델의 사용 이다. 유전자 변형 노크에 Myocilin (Myoc)37,38Cyp1b139, TM 관련 유전자의 녹아웃 마우스 연구 되었습니다 공부 TM의 분자 메커니즘을 위한 기본 도구 기능입니다. 당연 하 게도, 작은 크기의 마우스에서 TM이이 조직 공부를 시작 하기 위하여 극복 되어야 하는 심각한 장애물이 나타냅니다. 마우스 모델 LCM 기술에서 가장 작고 가장 섬세 한 조직, TM 등의 연구 능력을 필요한 도구를 제공 하는 동안 유전학 및 질병의 분자 메커니즘을 공부를 위한 강력한 도구를 나타냅니다.

이 보고서에는 강력 하 고 재현 방법 후속 RNA 격리 및 다운스트림 식 분석에 대 한 증폭 마우스 눈에서 높은 농축된 TM의 LCM에 대 한 설명 되어 있습니다. 유사한 방법에서에서 사용 된 성공적으로 쥐 눈 조직40,41,42,,4344의 분리, 다른 여기 보고 방법론을 적용할 수 있습니다. RNA, 예측에 관한, DNA, 단백질 공부 하 고 눈의 개별 조직. 중요 한 것은,이 기술은 유전자 변형된 쥐 녹 내장과 눈 질병3,,1516,17 TM 장애의 분자 병 인을 이해를 사용할 수 있습니다. ,18,26,31,,4546. LCM에 의해 마우스 눈의 TM을 능력 추가 여러 눈 질환의 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 얻기에 있는 유용한 기술 될 것입니다.

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Protocol

국립 환경 건강 과학 연구소 (NIEHS) 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) NIEHS 동물 연구 제안 IIDL 05-46에서이 연구의 모든 방법론을 승인 했다.

1. 최적의 조직 컬렉션 레이저 기정에 대 한

  1. 2, 3 개월 된 생쥐를 얻을 남성 또는 여성 C57BL/6. 최소 1 분 또는 호흡 정지 했습니다 때까지 CO2 를 안락사. 감 금에서 동물을 제거 하 고 자 궁 경관 탈 구, 잘린, 또는 thoracotomy 죽음을 보장.
  2. 해 부를 하기 전에 모든 해 부 도구는 깨끗 하 고 소독 확인.
    참고: 눈의 제거를 위한 곡선가 위 및 톱니 모양의 팁으로 겸 (선호 하는 팁 크기: 0.5 x 0.4 m m) 필요 하 게 됩니다.
  3. 누워 마우스 옆에 평평한 표면에 눈은 쉽게 접근할 수 있도록. 안구는 소켓에서 쉽게 반입할 수 있습니다 때까지 가이드로 눈 소켓을 사용 하 여 눈 주위를 잘라 눈에서 곡선에 직면 하 고, 곡선된가 위를 사용 하 여 다음 마우스를 안정화 하기 위해 집게와 법 (눈의 모서리)에 파악 (커브를 사용 하 여 하지는 가 위의 팁)입니다.
  4. 부드럽게 당겨 그리고, 궤도 소켓에서 눈을 해제 시 신경 절단 곡선된가 위를 사용 하 여. 조심 스럽게 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1에 씻어 고 눈에서 비 눈 조직 제거. 1.3-1.4 contralateral 눈에 대 한 반복 합니다.
  5. 포함 하기 전에 모든 습기를 제거 하는 조직 삭제 기능으로 눈을 가릴. 화살 섹션을 얻기 위하여 렌즈와 시 신경은 벤치 탑에 평행 되도록 표본 몰드 (25 x 20 x 5 m m3)로 눈을 놓습니다. 눈에 최적의 절삭 온도 (O.C.T.) 화합물을 포함 하 고 동결을 드라이 아이스에 놓습니다. 즉, 일단 저장-80 ° c.에 블록

2. 냉동된 섹션 준비 레이저 기정

  1. 전에 사용 하 여 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물)를 품 어 막 45 분에 대 한 최대 전력에서 UV cross-linker에 슬라이드.
  2. 스프레이 브러시, 집게, 항아리, 커플링 및 척 장착에 RNase 오염 솔루션. 철저 하 게 닦아. Nuclease 무료 물으로 헹 구 고 건조. 100% 에탄올을 교차 오염을 피하기 위해 cryostat 아래로 닦으십시오.
  3. -18 ° c cryostat 조정 한 번에 한 냉동된 블록-80 ° C 냉장고에서 제거 하 고 드라이 아이스와 함께 cryostat 제공. 10 분의 최소 cryostat의 온도와 equilibrate 냉동된 블록을 허용 합니다.
  4. 장착 덩어리 (그림 1A)에 O.C.T.의 작은 금액을 짜 내 고 형에서 조직 블록을 제거 하 고 신중 하 게 장착 척 (그림 1B)에 블록을 배치. 일단 장착 척에 조직 블록 고체 동결, cryostat (그림 2A)의 견본 홀더에 삽입 합니다.
  5. 8 µ m 섹션을 잘라내어 신중 하 게 조직 샘플을 도달 하는 O.C.T. 블록을 통해 섹션 cryostat을 조정 합니다. 일단 조직 관찰 단면 중지 하 고 깨끗 한 면도날을 사용 하 여 모든 면에서 냉동된 블록 트림 한 페인트 브러시 (그림 2B)와 함께 처리 수 있도록 주변 조직 O.C.T.의 3-4 mm를 두고. 새로운 깨끗 한 페인트 브러시를 사용 하 여 샘플 교차 오염을 피하기 위해 각 샘플 변경 사이 롤 접시 대신.
  6. 섹션을 신속 하 게 작업 하는 눈을 통해입니다. 빠른 단계 hematoxylin와 오신 (H & E) 슬라이드 범람 하 여 모든 제 3 섹션 60에 대 한 얼룩 얼룩 s, 수돗물으로 씻어, 건조, 개간 에이전트에 분명 공기와 coverslip로 충전된 유리 슬라이드에 탑재. 현미경 아래 보기 및 단면 컷된 섹션에 TM 분명 때까지 계속.
  7. 일단 TM 표시를 시작, 2 섹션을 잘라내어 H & E LCM와 절삭에 대 한 지도를 얼룩 루틴에 대 한 청구 유리 슬라이드에 탑재.
    참고: 지도 및 얼룩 세부 사항에 대 한 섹션 3 참조.
  8. 후 첫 번째 H & E 슬라이드 지도, 및 줄은 cryostat에 6 직렬 8 µ m 두꺼운 부분을 잘라내어 애완 동물 멤브레인 슬라이드 (그림 3A, B)에 동시에 탑재. 짧게 막의 뒤로 따라 gloved 손가락을 슬라이딩 하 여 조직을 준수 합니다. 장착 후 드라이 아이스에 슬라이드 상자에 애완 동물 멤브레인 슬라이드를 즉시 놓습니다.
    그러나 참고: 적은 부분에 탑재 될 수 있습니다, 그리고, 각 섹션은 실내 온도 공기에 노출 되는 시간의 양을 제한 하 여 RNA 저하를 줄이기 위해 권장은 슬라이드에 여러 섹션을 한 번에 장착.
  9. 계속 6 섹션 마다 두 애완 동물 멤브레인 슬라이드 후 눈, 섹션, H & E 염색에 대 한 다른 지도 슬라이드를 만드는 충전된 유리 슬라이드에 두 개의 섹션을 수집 합니다. 단면, 약 100 직렬 8 µ m 두꺼운 부분, TM은 더 이상 표시 될 때까지 계속 합니다. 신속 하 게 충전된 유리 슬라이드 (2.6 참조)에 대 한 섹션을 착 색 하 여 확인 합니다.
  10. 나중에 LCM 사용-80 ° C에서 모든 애완 동물 멤브레인 슬라이드를 저장 합니다.

3. H & E 지도 슬라이드 얼룩 프로토콜 및 형태 검토

  1. 시각화 하 고 충전된 유리 슬라이드에 지도 슬라이드를 검토, 수정 얼룩 항아리에 즉시 전송 하 여 조직의 가득 급속 한 고정 솔루션의 100 mL 7 미 린스 슬라이드에 그것을 찍기 하 여 증류수 10-20 회 다음 깨끗 한 증류수와 커플링 항아리를 슬라이드를 전송.
  2. 물에서 슬라이드를 제거 하 고 조직 닦아 건조 가장자리를 되 리. 피펫은 200 µ L 수정 해리스 되며 각 섹션에 필터링 및 30에 대 한 품 어 실 온에서 s. 조심 스럽게 씻어 물 실행 취소 될 때까지 수돗물을 실행 하는 아래의 슬라이드. 과잉 액체를 제거 하려면 각 단계 (3.2-3.5에서 각 단계 사이 오 점) 사이 조직 삭제 기능으로 슬라이드의 끝을 오 점.
  3. 1 x 30에 대 한 실 온에서 PBS에 장소 슬라이드 s. 그럼, 신중 하 게 씻어 30 수돗물 실행 하는 아래의 슬라이드 s.
  4. 3-4 회 95% 에탄올 목욕으로 슬라이드를 찍어. 슬라이드에 티슈 커버 15 알을 품을 정도로 오신 Y 염료 솔루션 적용 실 온에서 s.
  5. 두 번을 10-20 빠른 딥 각 95% 에타 놀 목욕에서 슬라이드를 씻어. 100% 에탄올 욕실 두 번 10-20 빠른 딥 각에서 슬라이드를 씻어. 그런 다음 슬라이드 두 번에에서 린스 크 실 렌 목욕 (10-20 빠른 딥 각).
  6. 수 지 장착 매체 조직에 적용 하 여 탑재, 신중 하 게을 피하기 위해 공기 방울 후드에 하룻밤 말리 coverslip 추가.
  7. 시각적으로 또는 디지털 슬라이드 스캐너를 사용 하 여 H & E 슬라이드를 검토 합니다. TM 명확 하 게 표시 하 고 절단에 대 한 접근으로 지도 슬라이드를 식별 합니다. 애완 동물을 사용 하 여 이들 사이 막 슬라이드는 LCM에 대 한 슬라이드를 지도.

4. 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물) 막 슬라이드 처리 및 얼룩 프로토콜

  1. 냉동 고에서 제거 애완 동물 슬라이드 먼저 0.3 g cresyl 바이올렛 아세테이트 75% 에탄올 20 mL에 용 해 하 여 cresyl 바이올렛 재고 솔루션을 준비 하 고에 배치 하기 전에 6 월 보다 2 h. 필터 0.22 μ m 살 균 필터 단위와 4 ° C에서 더 이상 저장소 솔루션에 대 한 셰이 커 ths입니다.
  2. 1:4 비율로 신선한 75% 에탄올 오신 Y 알코올 솔루션을 준비 합니다. 얼음에 깨끗 한, nuclease 무료, 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 고정 (75% 에탄올) 및 탈수 솔루션 (75%, 95%, 및 100% 에탄올)를 준비 합니다. 각 솔루션에 RNase 억제제를 추가 합니다.
  3. -80 ° C 냉동 고에서 언된 조직 단면도 포함 하는 슬라이드 상자를 제거 하 고 드라이 아이스에 배치. 번에 하나의 슬라이드를 처리 합니다. 30에 대 한 차가운 75% 에탄올으로 즉시 슬라이드를 삽입 하 여 슬라이드를 수정 s.
  4. 부드럽게 슬라이드에 대 한 10-15 O.C.T. 조직 섹션을 방해 하지 않고 해산 nuclease 무료 물에 담근 다.
  5. 신중 하 게 1.5 %cresyl 바이올렛 아세테이트 솔루션 섹션에 직접의 300 µ L 플라스틱 및 45 품 어 실 온에서 s. 다음, 30 미 피 펫 200 µ L 오신 Y 솔루션 섹션에 대 한 75% 에탄올 욕조에 그것을 배치 하 여 한 번 세척 하 고 3-5에 대 한 품 어.
  6. 75% 에탄올, 95% 에탄올, 및 마지막으로, 100% 에탄올 30에 이후에 슬라이드를 삽입 하 여 조직을 탈수 s 각. 과잉 액체를 제거 하려면 모든 단계 사이 조직 삭제 기능으로 슬라이드의 끝을 오 점. 슬라이드 어 후드 5 분 동안 완전히 건조 보자. 일단 건조, LCM 즉시 그 후 수행 합니다.
    참고: 것이 좋습니다이 단계에 대 한 크 실 렌의 사용을 피하기 위해, 그것은 inadequately 막 슬라이드에 결합 조직 섹션을 발생할 수 있습니다 조직 캡처의 효율성을 감소 시킨다.

5. 레이저 서 UV 레이저

  1. 컴퓨터를 켜고 부팅을 허용. 현미경 흰색 빛 전원 공급 장치를 켭니다. 설정 UV 레이저 키와 노란색 led가 켜 집니다. LCM 소프트웨어를 시작, 그것은 완벽 하 게 로드 하 고 라이브 비디오 표시 됩니다 수 있습니다. 컨트롤러 상자에 레이저 버튼을 누르고 녹색 LED가 켜 집니다.
  2. 현미경 단계에 새로운 유리 슬라이드 로드 다음 직접 유리 슬라이드 위에 얼룩진된 조직 면 애완 동물 멤브레인 슬라이드를 장소. 멤브레인 및 유리 슬라이드는 현미경 스테이지에 단단히 짝는 다는 것을 확인 하십시오.
  3. 첫 번째 슬라이드 제한을 설정 하 여 LCM을 시작입니다. 최저 4 배속 선택 객관적인 패널 (그림 4)에 확대. 금속와 막 만나는 왼쪽된 상단에 라이브 비디오 피드, 보도 "제한 1" 버튼 빨간색 사각형도로 지도에 표시 됩니다 표시 됩니다 때까지 현미경 xy 스테이지를 이동 하 여 막 슬라이드의 작업 영역을 정의 합니다. 다음, 반대 코너를 xy 스테이지를 이동 하 고 "제한 2" 버튼을 누릅니다. 설정된 한계 사이 조직과 막의 로드맵 이미지를 만드는 "스캔" 버튼을 누릅니다.
  4. 더블 클릭 로드맵 내 눈 섹션 중 하나의 TM 근처, TM iridocorneal 각도 (그림 5A)의 꼭대기 근처에 있을 수 있습니다. TM 식별 되 면 10 배와 수동으로 TM 배율을 늘립니다. 20 X 40 X 목적과 함께 반복 합니다. TM 40 X 목표 (그림 5B)와 초점에 있을 때 근처의 빈 영역으로 이동 (초점 약간 조정 해야 합니다), "프리 핸드 그리기 도구"를 선택 하 고 조직의 빈 영역에 긴 줄을 그립니다.
  5. "컷" 속도가 34%, "초점"은 58%, 그리고 "파워" 70% (그림 4), "잘라내기" 버튼을 누르면 레이저 매개 변수를 설정 합니다. 조정을 잘 레이저 속도, 포커스, 그리고 파워 매개 변수를 명확 하 고 정밀한 커팅 라인 (참조 그림 5C) 관찰 때까지. 정확한 절단, 절삭 그려진된 라인을 다음과 같이 확인 합니다.
  6. 절연 튜브 뚜껑 캡 홀더를 로드 하 고 튜브를 엽니다. 모자-리프트에 뚜껑 홀더를 부착 하 고 튜브 반전 다는 것을 확인. 접착제 모자 소재 원하는 조직을 제대로 캡처 되도록 뚜껑의 끝 넘어 돌출을 확신 합니다.
  7. 소프트웨어 패널에서 "수동" 해 부 모드를 선택 합니다. (그림 5B) TM 절연 튜브 바로 아래에 주의 깊게 검토. 화이트 밸런스를 설정 하 고 최적의 이미지 품질 (그림 4)을 취득 하는 밝기를 조정 합니다.
  8. 절단을 시작, 수동으로 초점을 조정 및 자유형 도구를 사용 하 여 선 그리기, 컬렉션 모자 아직 막 만지고 위쪽 위치에 남아 해야 합니다. TM sclera (그림 5C), 만나는 근처 그리기 부분 동그라미 누릅니다 "잘라." 첫 번째 컷 일단 뚜껑 아래 위치에 위치에 초점을 다시 조정 그리고 언론 "잘라내기" 그리고 조직 섹션에서 수집 TM, 주위에 동그라미를 완료 하는 두 개의 부분 동그라미를 연결할 오픈 또는 자유 공간에서 두 줄을 그립니다 확인 TM 서 모자 (그림 5 D-F)에 의해 포착 되었다.
  9. 위쪽에 다시 모자를 위치 하 고 나머지 부분에 (5.2-5.8)를 반복 합니다. 약간 모든 격리 샘플 뚜껑에 적합 하 고 (그림 5G)를 덮지 캡 위치를 조정 합니다. 일관성을 위해 시간 창 한 슬라이드에 대 일 분 사용 애완 동물 당 적은 부분 슬라이드 모든 섹션에서 TM을 분리 하는 데 더 많은 시간이 필요 하는 경우입니다. 다음 애완 동물 멤브레인에 대 한 새로운 절연 튜브를 삽입 하 고 섹션 5를 반복 합니다.

6입니다. Microdissected TM 조직 세포

  1. 갓 LCM 절연 조직 lyse RNA 세포의 용 해 버퍼를 준비 합니다. 세포의 용 해 버퍼의 각 1 mL에 10 µ L β-mercaptoethanol을 추가 합니다. 1 개월 이상에 대 한 실 온에서 β-mercaptoethanol와 세포의 용 해 버퍼를 저장 합니다.
  2. 캡 홀더는 서의 시작부터 20 분 이내에서 절연 튜브를 제거 합니다. TM의 캡처 수 있도록 눈으로 뚜껑 표면 시각화.
  3. 신중 하 게 세포의 용 해 버퍼 완전히 커버 microdissected TM 보장 컬렉션 튜브의 뚜껑에 10 µ L 세포의 용 해 버퍼 플라스틱. 부드럽게 접착제 뚜껑 닫고 컬렉션 튜브 거꾸로 10 분 동안 실 온에서 품 어. 부 화, 이후 2 분 동안 800 x g에서 원심 하 고 드라이 아이스에 lysate 놓습니다. 이후 정화 및 분석-80 ° C에서 lysates를 저장 합니다.

7. RNA 격리 및 품질 분석

  1. 샘플 실 온에서 해 동 하 여 RNA 품질을 분석. 수영장 함께 모든 샘플 한 RNase 무료 1.5 mL microfuge 관으로 단일 마우스에서 고립.
    참고: 예를 들어 각 생물 복제에 대 한 10-12 튜브 microdissected 모자 10 µ L lysate에서 생성 된 그리고 모든 lysates 각 생물 복제 (100-120 µ L lysate)에 대 한 단일 관으로 옮겨 졌다.
  2. 각 lysate 솔루션 (RNase 무료 물으로 만든) 갓된 70% 에탄올에의 한 볼륨을 추가 합니다. 그런 다음 RNA 격리 키트 사용자 지침에 따라 총 RNA 정화. 각 RNA 샘플에서 게놈 DNA의 제거를 확인 합니다.
    참고: 게놈 DNA 다운스트림 RNA 분석을 방해할 수 있습니다.
  3. 함께 각 마우스에서 샘플 풀링 하 고 (그림 6A) 리보솜 RNA 무결성을 분석 하 여 TM에서 격리 하는 RNA의 품질을 측정 합니다.
    참고: TM의 작은 크기로 인해 ribosomal RNA 봉우리 되지 않을 수 있습니다 관찰 (그림 6B) RNA 품질 프로 파일 ( 그림 6A, C1000-4000 bp 사이 관찰 하는 두 개의 봉우리)에 RNA 무결성 번호 (린) 계산에 사용 되 47.
    1. 막 슬라이드에 더 풍부한 나머지 조직에서 RNA를 분리 하 여 RNA 무결성의 더 정확한 측정을 얻을. 대표 린, pipetting 10 막 슬라이드에 안구 조직에서 격리 RNA를 µ L 세포 하나의 조직 섹션에 버퍼 고 RNA 격리를 수행 합니다. RNA 품질을 분석 하 고 린 (그림 6 c)를 계산 합니다.
  4. 다운스트림 RNA에 대 한 응용 프로그램에 대 한 재현를 시퀀싱 및 cDNA 라이브러리 생성을 위한 낮은 입력된 RNA 키트 LCM의 작은 80 섹션에서 결과 사용 하 여 TM 고립.

8입니다. 분석

  1. 수집 조직 TM 관련 된 유전자에 농축 사실 확인, microdissected 전체 눈, sclera, 홍 채, 망막, 각 막 및 렌즈 3 별도 마우스에서에서 여러 추가 RNA를 수집 합니다. LCM와 결합에서이 RNA에서 RNA를 수집 사용 고립 TM 및 ciliary 바디 4 별도 마우스에서 수집.
  2. Microdissected 샘플에서 RNA는 cDNA cDNA 역방향 전송 키트를 사용 하 여 변환 합니다. LCM 격리 샘플에서 RNA를 증폭 및 낮은 입력 RNA cDNA 키트를 사용 하 여 cDNA를 변환.
  3. 배수 채널 유전자, myocilin (MYOC)와 알파 걸 2 (ACTA2), 표현에 대 한 모든 RNA를 분석 하 고 디지털 PCR (그림 7A-B), HSP90a1 내부 관리 유전자를 사용 하 여 정상화.

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Representative Results

LCM TM에서 RNA를 수집 및 4 다른 마우스에서 모양 몸은 유전자 발현을 분석 하 고 비교 전체 눈, sclera, 홍 채, 망막, 각 막, 및 렌즈 3 별도 쥐에서 고립에서 그 식 수 절연. TM 유전자 표현, MYOC48ACTA249 격리 TM 샘플 TM에 농축 실제로 높게 했다 확인 모든 수집 된 조직에서 분석 되었다. LCM 샘플에서 cDNA의 매우 낮은 수량에 따라 디지털 PCR 사용 되었다는 입증 된 더 적은 소재50재현할 수 있습니다. MYOCACTA2 의 식 HSP90a1 내부 관리 유전자를 사용 하 여 정규화 되었는지 다음 각 조직 전체 눈의 비교 되었다. 이러한 결과 MYOC (그림 7A) 및 ACTA2 (그림 7B) 높은 표현 됩니다 TM 샘플에서 다운스트림 RNA에 대 한 높은 품질 높은 농축된 TM 샘플에서 RNA의 성공적인 격리 확인 분석입니다. 개념의 증거로,이 기술은 TM 절연 RNA WT 쥐 및 쥐 높은 IOP 표현 형으로의 변형 준비 및 microarray 분석에 적용 되었습니다. 이 분석 TM의 WT 쥐 녹 내장 형 (그림 ℃)와 쥐의 그 사이 차동 표현 된다 많은 유전자 녹 내장에 연루 확인.

Figure 1
그림 1: 냉동된 조직의 배치는 cryostat 블록. (A) O.C.T 장착 매체 cryostat 장착 덩어리에 적용 됩니다. (B) 냉동 표본을 블록 장착 척에 균등 하 게 배치 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 절차는 cryostat에 얼어붙은 눈 조직의 단면. 눈 조직에 도달 절단 표면 (A) 준비 합니다. (B) 레이저 기정에 대 한 섹션을 수집 하기 전에 언된 블록의 O.C.T.를 트리밍. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 준비는 cryostat 냉동된 섹션의. (A) 6 직렬 8 µ m 두꺼운 부분에는 cryostat 줄지어 있다. (B) 섹션 동시에 애완 동물 멤브레인 슬라이드에 거치 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 중요 한 기능을 강조 하는 레이저 서 소프트웨어의 스크린샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 배수 채널 및 배수 채널의 적절 한 격리에 대 한 UV 레이저 매개 변수 설정의 위치. (A) 레이저 기정에 대 한 배수 채널을 강조 하는 애완 동물 멤브레인에 단일 섹션의 낮은 (4 배속) 확대. (B) 높은 (40 X) 확대 배수 채널 및 인접 한 조직. (C) 위쪽에 모자 scleral 지역 근처 TM의 첫 번째 부분 원 인하. (D) 최종 완료는 아래 위치에 모자와 TM 원을 여유 공간에 잘라냅니다. (E) TM 섹션 및 (F) 뚜껑에 연결 된에서 제거. (G) 여러 컷된 섹션 잘라 하지 중복 같은 애완 동물 멤브레인에서 준수는 모자. S (Sclera), 사우스 캐롤라이나 (Schlemm의 운하), TM (배수 채널), AC (앞쪽 챔버). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 총 RNA 수율과 품질 평가 microdissected 배수 채널 조직에서 얻은. (A) 배수 채널의 80 섹션에서 총 RNA (근접된 영역 크기는 0.8 m m2). (B) 의 배수 채널 20 섹션에서 총 RNA (근접된 영역 크기는 0.2 m m2). (C) 레이저 서 후 나머지 눈 조직에서 총 RNA. 린, RNA 무결성 번호; bp, 기본적인 쌍 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: LCM의 다운스트림 RNA 분석 배수 채널 절연. LCM에 의해 분리 하는 TM에 TM 관련 유전자의 양적 디지털 PCR 분석. TM 관련 유전자 (A) MYOC (B) ACTA2 높은 LCM에 표현 다른 눈 조직에 비해 TM 샘플을 캡처한. (C) Heatmap 배수 채널 RNA의 microarray 분석에서 얻은 데이터에서 생성 된 격리 WT 쥐와 코에서 높은 IOP 표현 형을 가진 쥐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: 조직 준비 최적화 전후 비교. 섹션을 잘라 눈에 귀 여 워 막 슬라이드 (A) (B) 표준 95% 에탄올 탈수 준비 또는 최적화 된 75% 에탄올 탈수 준비로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

TM는 중요 한 역할을 적극적으로 유지 하는 항상성 IOP와 그 장애는 널리 고혈압 녹 내장1,,219에 대 한 주요 원인이 되는 요소 하실. GWAS 분석에 의해 확인 된 여러 유전자에 있는 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 수 증가 녹 내장 위험 및 TM;에서 아 유출 시설에 증가 저항에 연결 된 그러나,이 질병을 정확한 분자 메커니즘은 아직 완전히 이해21,,2223,,2425. 유전 마우스 모델 녹 내장의 분자 메커니즘을 공부에 대 한 강력한 도구를 제공할 수 있습니다. 그러나, 마우스 TM 조직의 소형 마우스 눈 및 유전자 표정 분석에 대 한 고품질의 RNA에서 높은 농축 TM의 격리에 대 한 강력한 도전을 나타냅니다. LCM 셀의 단일 또는 낮은 수를 고립 시키기를 위한 귀중 한 기술 이며 특정 세포 유형에 대 한 농축 조직 샘플에서 유전자 발현을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다. 본이 연구에서는 강력 하 고 재현할 수 LCM 메서드 매우 풍부한 TM 및 TM에 신호 하는 세포 유전자 발현의 규칙을 공부 하는 데 사용할 수 있는 고품질 RNA 분리 설명 되어 있습니다. 또한, 설명된 LCM 메서드는 눈 내의 다른 조직에도 적용할 수 있습니다.

LCM 기술과 조직 처리의 최적화에 대 한 세부 사항에 높은 관심을이 방법의 성공적인 개발에 중요 한 역할을 했다. 조직 보존 및 절연의 방법론 유전자 식 프로 파일링에 대 한 높은 품질 RNA 분리에서 핵심 구성 요소입니다. LCM 얼룩, 탈수, 및 기간 품질 RNA51을 얻기에서 성공적 이기 위하여 레이저 서의 해 부, cryosectioning, 고정, 세부 사항에 매우 높은 관심을 필요 합니다. 조직 섹션 두께 증가 시킬 수 있다; 그러나, 두께 증가 그렇게 않습니다 UV 레이저 전원 필요한. 레이저 파워 결과 RNA 저하 될 수 있습니다 넓은 레이저 경로에 증가 했다. 8 µ m 섹션으로 레이저 경로 얇은 되었고 다운스트림 RNA 분석에 대 한 충분 한 조직 제공 발견. 그림 8 쇼 조직 준비의 최적화 크게 레이저 수를 변경할 수 있습니다 어떻게 해 눈에서 TM 부. 이 단계 (섹션에서에서 설명한 대로 4) 프로토콜의 최적화 단순히 조직의 탈수를 95% 에탄올 (그림 8A) 대신 75%를 사용 하 여 우수한 안구 조직 동원 정지 및 O.C.T. (그림 8B)의 완전 한 제거를 굴복 설치 미디어를 제거 하려면 RNase 무료 물 부 화 뒤. 더 탈수와 얼룩 알코올 기반 착 색 시 약을 사용 하 여 이루어집니다. 또한, 그것 그 알코올 기반의 얼룩 굴복 시 약 우수한 수성 착 색 시 약 (물 기반 cresyl 바이올렛 또는 hematoxylin)를 기준으로 결과 및 추가 RNA 무결성52를 보존 하는 데 도움이 발견 했다. 전반적으로, 알코올 기반의 얼룩 시 약 굴복 일관 된 안구 조직 섹션 완전히 애완 동물 멤브레인 슬라이드에 동원 되지 않은 최적화 된 프로토콜을 사용 하 여 눈 조직을 처리 합니다.

이 연구에 대 한 우리의 목표는 고품질 격리 하기 위한 강력 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 개발 했다 높은 IOP와 녹 내장의 기반이 되는 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 얻기 위하여 다운스트림 식 분석에 대 한 마우스 눈의 TM에서 mRNA. 그림 ℃에서 heatmap 같이 LCM에 의해 분리 TM의 설명된 프로토콜 TM에서 RNA를 분리 하 고 야생 유형 및 돌연변이 생쥐에서 TM에 유전자 발현의 차이 연구 하는 매우 신뢰할 수 있는 방법을 제공 합니다. 여기 설명 하는 방법을 조사자는 vivo에서 시스템은 상대적으로 간단 하 고 신뢰할 수 있는 녹 내장의 병 인을 중앙 조직에 분자 분석을 수행 하 고 유전자 표정 분석에 적용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) BioRad 10031252 FAM
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kit Agilent Technologies 5067-1513
BioRad QX200 Droplet Digital PCR System BioRad
Small Paint Brush
Charged Glass Microscope Slide Thermo scientific 4951PLUS-001
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich C5042
Curved Scissors
Eosin Y dye Thermo scientific 71204
Ethanol
Forceps Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)
HemaCen American MasterTech STHEM30
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) BioRad 10031255 VEX
Leica CM1850 Cryostat Leica
Millex-GS filter unit EMD Millipore SLGS033SB 0.22 µm
MMI CellCut UV Cutting Model Molecular Machines & Industries LCM intrument
MMI CellTools Software Molecular Machines & Industries 50202 LCM software
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection ASEE Products ST-LMD-M-500 Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) Molecular Machines & Industries
modified Harris Hematoxylin Thermo scientific 7211 FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) BioRad 10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase Free ASEE Products FS-LMD-M-50r Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) Molecular Machines & Industries 50102
Rapid Fix Thermo scientific 6764212 H&E staining
RLT Buffer Qiagen 79216 lysis bufffer used for LCM samples
RNAseZap Sigma R2020 RNase decontamination solution
Protect RNA RNAse Inhibitor Sigma Aldrich R7397
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA isolation kit
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit Takara Clontech 634888 low input RNA to cDNA kit for LCM samples
SuperMix (no dUTP) BioRad 1863023 digital PCR master mix
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) Sakura 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Stratalinker UV Crosslinker Stratagene 400075
Xylene Macron 8668

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References

  1. Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86, (2), 238-242 (2002).
  2. Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377, (9774), 1367-1377 (2011).
  3. Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32, (8), 486-487 (2016).
  4. Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80, (5), 389-393 (1996).
  5. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90, (3), 262-267 (2006).
  6. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82, (11), 844-851 (2004).
  7. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73, (1), 115-121 (1995).
  8. Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126, (4), 487-497 (1998).
  9. The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126, (4), 498-505 (1998).
  10. The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130, (4), 429-440 (2000).
  11. Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14, (2), 86-90 (2003).
  12. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120, (6), 701-713 (2002).
  13. Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120, (6), (2002).
  14. Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121, (1), 48-56 (2003).
  15. Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4, (4), 236-241 (2015).
  16. Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
  17. Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
  18. John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8, (6), 400-412 (1999).
  19. Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, (Pt B), 173-181 (2015).
  20. Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2, (16067), (2016).
  21. Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40, (4), 358-363 (2012).
  22. Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29, (10), 1285-1298 (2015).
  23. Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4, (7), (2014).
  24. Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11, (5), 727-731 (2012).
  25. Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
  26. Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12, (3), 1-10 (2017).
  27. Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57, (2), 77-86 (2016).
  28. Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
  29. Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
  30. Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
  31. Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
  32. Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
  33. Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 15, (3), 267-291 (2016).
  34. Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75, (3), 347-358 (2002).
  35. Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120, (6), 816-819 (2002).
  36. Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, (6), 2588-2596 (2003).
  37. Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21, (22), 7707-7713 (2001).
  38. Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24, (20), 9019-9025 (2004).
  39. Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52, (2), 397-403 (2015).
  40. Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
  41. Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
  42. Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28, (7), 3171-3182 (2014).
  43. Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183, (1), 35-48 (2013).
  44. Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, (15), 2469-2469 (2013).
  45. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91, (3), 415-424 (2010).
  46. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88, (4), 816-824 (2009).
  47. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, (3), (2006).
  48. Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280, (32), 28917-28926 (2005).
  49. Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30, (2-3), 254-266 (2014).
  50. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, (10), 1003-1005 (2013).
  51. Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10, (69), (2009).
  52. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416, (1), 123-125 (2011).

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