Murino colostomia distale, un nuovo modello di colite di diversione in topi C57BL/6

Medicine

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Summary

Murino colostomia distale fornisce un modello murino per colite di diversione umana, una colite linfocitaria prevalentemente nel segmento del colon escluso dal flusso fecale.

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Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Patrzyk, M., Heidecke, C. D., Schulze, T. Murine Distal Colostomy, A Novel Model of Diversion Colitis in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (137), e57616, doi:10.3791/57616 (2018).

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Abstract

Colite di diversione (DC) è una condizione clinica frequente che si verificano in pazienti con segmenti intestinali esclusi dal flusso a seguito di un'enterostomia diversione fecale. L'eziologia di questa malattia rimane mal definita, ma sembra differire da quello di malattie intestinali infiammatorie classica come il morbo di Crohn e colite ulcerosa. Ricerca finalizzata a decifrare i meccanismi fisiopatologici che portano allo sviluppo di questa malattia è stata gravemente ostacolata dalla mancanza di un appropriato modello murino. Questo protocollo genera un modello murino di DC che facilita lo studio del ruolo del sistema immunitario e la sua interazione con il microbioma nello sviluppo della DC. In questo modello utilizzando animali C57BL/6, parti distali del colon sono esclusi dal flusso fecale creando un colostomy distale, innescare lo sviluppo di delicato per moderare l'infiammazione nei segmenti intestinali esclusi e riproducendo le lesioni di segno distintivo dell'essere umano DC con una risposta infiammatoria sistemica moderata. Contrariamente al modello di ratto, un gran numero di modelli murini geneticamente modificati sullo sfondo C57BL/6 è disponibile. La combinazione di questi animali con il nostro modello consente i possibili ruoli di diverse citochine, chemochine o recettori di molecole bioattive (ad es., interleuchina (IL) -17; IL-10, chemokine CXCL13, recettori per le chemochine CXCR5 e CCR7 e il recettore della sfingosina-1-fosfato 4) deve essere valutata nella patogenesi della DC. La disponibilità di diversi ceppi di topi Congenici sullo sfondo C57BL/6 facilita in gran parte gli esperimenti di trasferimento per stabilire i ruoli dei tipi cellulari coinvolti nell'eziologia della DC. Infine, il modello offre l'opportunità di valutare le influenze di interventi locali (ad esempio, modifica del microbioma locale o terapia antinfiammatoria locale) su immunità mucosale nei segmenti intestinali affetti e non affetti e il su omeostasi immunitaria sistemica.

Introduction

Negli ultimi anni, un numero sostanza di colite non infettive entità diverse da malattie intestinali infiammatorie classica (IBDs; i. e., ulcerosa o colite di Crohn) sono stati caratterizzati clinicamente e histopathologically in esseri umani. I meccanismi fisiopatologici che portano allo sviluppo di queste forme di colite completamente non sono capiti parzialmente perché appropriati modelli animali sono scarse. Colite di diversione è un'entità recentemente descritta. Anche se il termine è stato coniato nel 1980 da Glotzer1, la prima descrizione di un simile fenotipo è stato dato nel 1972 da Morson2. La malattia si sviluppa in 50%-91% dei pazienti con deviazione enterostomia e la sua intensità clinica varia3,4. Data l'incidenza annuale di circa 120.000 pazienti colostomia in Stati Uniti d'America, questa entità di malattia costituisce un problema sanitario importante.

L'obiettivo generale di sviluppare questo protocollo era di fornire un modello murino di DC che si basa su un trigger di colite simile a quello veduto in DC umana e che riproduce le caratteristiche istopatologiche primarie della malattia umana. A differenza di altri modelli di colite murina, induzione di colite nel nostro modello non necessita di animali geneticamente modificati (per esempio, topi transgenici IL-7, N-caderina dominante negativi topi o topi TGFβ- / - ), l'applicazione di chimicamente irritante sostanze (ad es., colite indotta del sodio (DSS) - colite indotta, o acido solfonico del trinitrobenzene (TNBS) - solfato di destrano), o il trasferimento di popolazioni di cellule specifiche in topi carenti immuni (come il trasferimentoad alta CD45RB modello di colite) (per una rassegna, Vedi5). A differenza di altri modelli, il sistema immunitario intatto del nostro modello DC consente la valutazione del meccanismo immunologico coinvolti nello sviluppo del DC. La limitazione della infiammazione delle mucose al segmento di intestino escluso consente la valutazione della sua ripercussione su immunità mucosale in altre parti del tratto gastrointestinale, sull'omeostasi immunitaria in altri scompartimenti immuni del tratto intestinale (per esempio. , Patch di Peyer ed i linfonodi di Intestinum) e sull'omeostasi immunitaria dell'intero organismo. Infine, il nostro modello costituisce uno strumento appropriato per indagare i meccanismi di controllo stimoli infiammatori locali provenienti da cambiamenti nell'ambiente locale normale per entrambi il microbioma locale come pure gli antigeni alimentari.

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Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dall'autorità di governo veterinaria (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern, (LALLF M-V)).

1. cura preoperatoria e la preparazione dell'animale

  1. All'arrivo nella struttura degli animali, animali (C57Bl/6) si divide in gruppi di dimensioni simili, ogni gruppo della gabbia insieme e mantenere gruppi costante durante gli esperimenti.
    Nota: Utilizzare animali dello stesso sesso. I risultati descritti sono stati ottenuti con topi maschi.
    Nota: Se vengono utilizzati gli animali maschii, gruppi gabbia insieme a partire da quando sono 7 settimane di età in modo che possa essere stabilita una gerarchia, minimizzando così il rischio di comportamento aggressivo durante gli esperimenti.
  2. Almeno una settimana prima dell'intervento chirurgico, passare a un'ad alta energia (> 14 MJ/kg) e ad alta percentuale proteica (> 20%) alimentazione contenente tutti gli oligoelementi essenziali e vitamine (per informazioni dettagliate, vedere elenco dei materiali).
    Nota: Assicurare tutti i topi pesare almeno 25 g quando l'ambulatorio è effettuato.
  3. Indurre l'anestesia e analgesia tramite l'iniezione intraperitoneale di ketamina (87 mg/kg i.p.) e xilazina cloridrato (13 mg/kg i.p.). Attendere fino a quando il mouse tollera lo stimolo meccanico, per esempio punta passo, senza risposta motoria.
  4. Fissare il mouse narcotizzato con nastri in posizione supina su un sottofondo di calore posizionato presso il banco di funzionamento, garantendo stabile posizionamento durante il funzionamento ed evitare un'enorme perdita di calore corporeo.
    Nota: Il sottoposto di calore deve avere una temperatura di 36 ° C a 40 ° C; la temperatura ambiente di funzionamento dovrebbe essere 21 ° C.

2. operazione distale colostomia

  1. Radersi i capelli addominali. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, disinfettare il campo di funzionamento tre volte utilizzando alcol 70% e un iodophor. Drappo il campo di funzionamento per garantire condizioni di asepsi.
  2. Per eseguire una laparotomia mediana di 15 mm, incidendo i muscoli addominali ed il peritoneum lungo la linea alba, riducendo così al minimo la perdita di sangue.
  3. Utilizzare due DeBakey atraumatica, estrarre con cautela l'intestino cieco, ileo terminale e ascendente e colon trasverso dalla cavità peritoneale.
    Nota: Fare attenzione a limitare rigorosamente la manipolazione meccanica dell'intestino per evitare lesioni alle strutture mesenteriche.
  4. Identificare il Polo cecal, il colon ascendente e piccolo intestino (figure 1a e 1b).
    Nota: La corretta identificazione del colon ascendente è fondamentale per il corretto posizionamento del colostomy. Nei casi in cui l'anatomia della regione ileocecal è ambigua, la presenza di placche di Peyer identifica l'intestino tenue e la presenza di feci formate caratterizza il colon.
  5. Usare un righello per determinare la posizione del colostomy futuri. Esso va posizionata a 20 mm distale alla valvola ileocecal per una colostomia distale.
  6. Praticare una seconda incisione di 3 mm nella parete addominale nel quadrante superiore destro. Tirare il segmento del colon precedentemente identificato attraverso questa incisione per formare un anello, facendo attenzione a non distorcere il ciclo.
  7. Passare accuratamente una cannula 22 calibri flessibili i.v. attraverso il mesocolon. Fare attenzione a non per danneggiare le strutture vascolari mesenteriche.
  8. Restituire l'intestino nella cavità peritoneale.
  9. Difficoltà entrambe le estremità del tubo flessibile alla cute tramite semplici punti di sutura e una sutura riassorbibile (ad es., polyglactin 910 o polyfil 4-0 1/2 c).
  10. Prima di chiudere la laparotomia, eseguire la rianimazione fluida usando un'iniezione intraperitoneale di 0,5 mL di soluzione fisiologica 0,9%.
  11. Chiudere il peritoneo e lo strato del muscolo con una sutura continua utilizzando una sutura riassorbibile (ad es., polyglactin 910 o polyfil 4-0 1/2 c). Chiudere la pelle con una sutura continua utilizzando una sutura riassorbibile (ad es., polyglactin 910 o polyfil 4-0 1 / 2c).
  12. Aprire il ciclo colon esteriorizzato eseguendo un transection subtotale utilizzando una forbice bene. Evitare tutte le lesioni al mesentery. Transetto non colon completamente.
  13. Difficoltà ogni apertura di colostomia con tre punti di pieno-spessore singoli al peritoneo e della pelle utilizzando un monofilo, suturare assorbibile (ad es., polidioxanone o monofilo 6-0 3/8s). Ciclo afferente, che è un colostomy dell'estremità-funzionale, e il ciclo efferente, che è una fistola mucosa, sono chiaramente separati a questo punto (Figura 1C).
    Nota: Tempo di funzionamento deve essere meno di 20 minuti per limitare le perdite di fluido e termiche.
  14. Dopo chirurgia, di finitura disinfettare strumenti utilizzando una soluzione di disinfezione senza aldeide in bagno ad ultrasuoni secondo le istruzioni del produttore.

3. sham operazione (Colotomy)

  1. Eseguire i passaggi 1.1. attraverso 2.4.
  2. Usare un righello per determinare la posizione di futuri colotomy. Il colotomy deve essere posizionato alla stessa distanza dalla valvola ileocecal come la colostomia nel gruppo sperimentale.
  3. Aprire i due punti almeno due terzi utilizzando forbici bene la sua circonferenza.
  4. Nelle vicinanze il colotomy con un singolo strato, pieno-spessore interrotta sutura utilizzando un monofilo, suturare assorbibile (ad es., polidioxanone, monofilo 6-0 3/8s).
    Nota: Tempo di funzionamento deve essere meno di 20 minuti per un chirurgo sperimentato, limitando le perdite di fluido e termiche.
  5. Eseguire i passaggi 2.10. , 2.11. e 2.14.

4. postoperatoria

  1. Restituire gli animali nelle loro gabbie. Offrono un'atmosfera ben temperata di 37 ° C (ad es., con una lampada a raggi infrarossi) fino a quando i topi sono completamente svegli. Quindi, tenere topi in un ambiente di temperatura e umidità regolata (21 ° C, umidità relativa 30% ± 10%). Consentire il libero accesso a cibo e acqua potabile. Per facilitare l'assorbimento fluido, fornire ulteriori mangimi impregnati d'acqua.
  2. Iniziare l'analgesia postoperatoria iniettando 0,1 mg/kg corpo peso buprenorfina s.c. quando animali mostrano risposta alla stimolazione meccanica. Fare attenzione a evitare la depressione respiratoria.
  3. Supplemento acqua potabile con 1 mg/mL tramadol per analgesia continua durante la prima settimana postoperatoria.
  4. Per compensare la diminuita assunzione di liquidi causa di ridotta mobilità, fornire un solido Pad bere nella gabbia durante la prima settimana postoperatoria.
  5. Pesare gli animali e comportamento animale punteggio al giorno durante la prima settimana, ogni due giorni durante il resto del primo mese e ogni terzo giorno durante il secondo mese utilizzando il Punteggio di severità di malattia descritto in Kleinwort et al. 6.

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Representative Results

Chirurgia è ben tollerato sia nei gruppi di sham (colotomy) e sperimentale (colostomia). Mortalità perioperatoria non deve superare il 10% quando la chirurgia e perioperative management viene eseguita correttamente. Nella prima settimana postoperatoria, perdita di peso significativa è visto in entrambi i gruppi sperimentali e sham. Gli animali del gruppo finto raggiungono loro nadir di peso solitamente verso il quarto giorno postoperatorio, ma si verifica un giorno più tardi nel gruppo sperimentale. Perdita di peso è più pronunciato nel gruppo sperimentale, raggiungendo il 21,7% del peso corporeo iniziale. Al contrario, gli animali sham perdono 10,8% del loro corpo iniziale peso (Figura 2)6. Dopo il nadir di peso nella prima settimana postoperatoria, il peso corporeo aumenta continuamente in entrambi i gruppi sperimentali, ma con una pendenza più lenta nel gruppo sperimentale. Segni e sintomi di grave infiammazione intestinale (cioè, scarico sanguinante o liquidi movimenti intestinali si verificano né sperimentale né il finto gruppo6). Mortalità totale durante i primi 60 giorni postoperatorio è di circa il 40% nel gruppo di colostomia e circa il 10% nel gruppo del colotomy. Maggior parte dei decessi si verificano durante la prima settimana postoperatoria (61% nel gruppo sperimentale, 66% nel gruppo finto). Cause di morte sono mostrate in Figura 3.

Colostomia distale nei topi provoca lo sviluppo di colite principalmente linfocitaria che riproduce le caratteristiche istologiche di segno distintivo di DC umana. Queste alterazioni aumentano con la durata dell'esclusione intestinale. Lunghezza della cripta è accorciata significativamente nei segmenti intestinali esclusi. Questo accorciamento raggiunge la significatività statistica dopo 14 giorni di diversione fecale (Figura 3a). La lunghezza di cripta delle cellule di calice-cuscinetto è ridotta dopo 30 giorni in segmenti intestinali esclusi (Figura 3b). I numeri assoluti delle cellule di calice in cripte nel segmento delle viscere escluso si riducono anche notevolmente dopo 14 giorni postoperatori (Figura 3C). La lesione caratteristica della DC, lo sviluppo di follicoli linfoidi nella mucosa, richiede una durata più lunga della deviazione di sgabello. Anche se un numero maggiore di follicoli linfoidi possa essere osservato più presto due settimane, le differenze diventano significative dopo due mesi (figure 5a-c). Tutti i cambiamenti istopatologici descritti prima sono più pronunciati distale rispetto a regioni prossimali dei segmenti intestinali esclusi. Un tipico neutrophilic si infiltra in come un segno di infiammazione acuta non è di solito osservato (figure 5 d-e).

Come segno di una ripercussione sistemica di infiammazione intestinale locale, una conta dei neutrofili è significativamente aumentata negli animali di colostomia più presto 14 giorni dopo l'intervento chirurgico. Questa differenza viene mantenuta fino alla fine del periodo di osservazione (60 giorni). Conteggi delle piastrine sono leggermente aumentati negli animali con la diversione colica dopo 60 giorni (Figura 6). Livello dell'emoglobina e dell'ematocrito sono ridotti a 14 giorni dopo l'operazione del gruppo di colostomia rispetto al gruppo finto.

È stato indicato che la carenza vitaminica in cause di roditori ridotto volume corpuscolare medio (MCH) e significa che i valori di emoglobina corpuscolare medio (MCV)7. Nel nostro modello, vediamo iniziali aumenti in entrambi questi parametri dopo 14 e 30 giorni. MCH e MCV ritorno ai valori normali dopo il follow-up più lungo (Figura 7). Questo dimostra che colostomia distale non comporta la carenza vitaminica clinicamente significativo durante il follow-up a lungo termine.

Figure 1
Figura 1: anatomia della regione cecal e la procedura chirurgica. (a) rappresentazione dell'anatomia postoperatoria. (b) topografia del pol cecal e reperi anatomici. (c) grafica rappresentazione delle aperture colostomia. Figura 1a è stato modificato da Kleinwort et al.6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: sviluppo di peso del corpo. Peso corporeo è indicato come percentuale del peso corporeo preoperatoria. Il corpo peso curve di colostomia e sham (colotomy) animali rivelano che la perdita di peso postoperatoria iniziale era significativamente più alta nel gruppo della colostomia confrontato al gruppo finto (p < 0,001). I valori sono mezzi ± errori standard della media tra 21-26 animali per gruppo (21 animali hanno ricevuto colostomie; 26 animali erano nel gruppo finto). Questa figura è stata modificata da Kleinwort et al.6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: cause di morte. Le complicazioni sono rappresentate come percentuali di mortalità per qualsiasi causa e sono illustrate in un grafico a torta (gruppo di colostomia (a), gruppo (b) finto). Le complicazioni postoperatorie sono state determinate tramite l'autopsia. Sindrome da deperimento è stata definita come perdita di peso continua supera al 33% del peso corporeo iniziale e nessun altro risultato all'autopsia. Ileo e anastomotiche sono state diagnosticate all'autopsia. Le complicazioni dello stoma sono state definite come ascessi peristomal e separazioni mucocutanee. Altre complicazioni compreso la deiscenza della ferita della laparotomia, l'ischemia dell'intestino cieco, e casi non è chiaro all'autopsia. Differenze significative nella distribuzione delle complicazioni postoperatorie sono state vedute fra i gruppi (p = 0,021, analizzati utilizzando il test esatto di Fisher per retro analisi di tabelle di contingenza fino a 6 × 6). C'erano 39 animali nel gruppo di colostomia e 29 nel gruppo finto. Questa figura è stata modificata da Kleinwort et al.6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: popolazione di lunghezza e delle cellule di calice di cripta. Numeri di lunghezza e delle cellule di calice cripta sono stati determinati utilizzando sezioni di paraffina del retto dopo colorazione acido-Schiff periodico. (a) lunghezza cripta è stato diminuito significativamente nel retto di animali con colite di diversione (DC). (b) la lunghezza della regione delle cellule di calice-cuscinetto della cripta è stata misurata e impostata come un rapporto sulla cripta piena lunghezza. Trenta e sessanta giorni postoperatorio, la percentuale di cellule caliciformi cripta-lunghezza-cuscinetto è stata diminuita nel gruppo DC. i numeri delle cellule di calice (c) sono stati ridotti significativamente in animali DC rispetto al gruppo finto. I grafici in (a) a (c) mostrano mezzi ed errori standard attraverso animali da 5 a 9 per ogni gruppo (giorni di colostomia 14 e 30, sham 14 giorni: n = 8; colostomia 60 giorni: n = 5; 30 e 60 giorni di sham: n = 9); ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01. Questa figura è stata modificata da Kleinwort et al.6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: follicoli linfoidi e infiltrati infiammatori. (a) linfoidi follicoli di punti e deviate e sham animali sono stati contati sulle sezioni della paraffina del retto colorate con ematossilina eosina. Il grafico mostra mezzi ed errori standard attraverso animali da 5 a 9 per ogni gruppo (giorni di colostomia 14 e 30, sham 14 giorni: n = 8; colostomia 60 giorni: n = 5; 30 e 60 giorni di controllo: n = 9), ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01. (b) e (c) rappresentante esempi di sezioni del retto di colostomia (b) e animali sham (c) 60 giorni postoperatorio colorate con ematossilina eosina. Un follicolo linfoide prominente (∗) era presente nella mucosa di un mouse di colostomia. Barre della scala rappresentano 100 µm. (d) ed (e) la macchiatura con cloroacetato esterasi reazione sulle sezioni della paraffina è stata effettuata per rilevare i granulocytes del neutrofilo. Sezioni trasversali del retto deviata, un'infiltrazione neutrofila infiammatoria acuta è stata osservata nel gruppo di colostomia (d), né negli animali sham (e) fino a 60 giorni postoperatorio. Barre della scala rappresentano 100 µm. Questa figura è stata modificata da Kleinwort et al.6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: conta dei neutrofili e delle piastrine. I conteggi di anima di campioni di sangue venosi sono stati determinati mediante un analizzatore di ematologia veterinaria. (a) dei neutrofili sono stati aumentati significativamente nel gruppo di colostomia rispetto agli animali di sham fino a 60 giorni postoperatorio. (b) conta piastrinica sono stati leggermente elevata nel gruppo di colostomia 60 giorni postoperatorio. Il grafico mostra mezzi ed errori standard attraverso animali da 5 a 9 per ogni gruppo (giorni di colostomia 14 e 30, sham 14 giorni: n = 8; colostomia 60 giorni: n = 5; 30 e 60 giorni di sham: n = 9), ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: parametri eritrocitari. I conteggi di anima di campioni di sangue venosi sono stati determinati mediante un analizzatore di ematologia veterinaria. (a) di emoglobina e di ematocrito (b) sono stati diminuiti significativamente nel gruppo della colostomia confrontato al gruppo finto. (c) volume corpuscolare medio (MCH) è stato significativamente elevato 14 e 30 giorni postoperatorio nel gruppo colostomia rispetto al gruppo finto ma rinviato al normale dopo 60 giorni. (d) significa che i valori di emoglobina corpuscolare medio (MCV) sono stati elevati dopo 30 giorni, ma non più dopo 60 giorni postoperatorio nel gruppo colostomia rispetto al sham animali. Il grafico mostra mezzi ed errori standard attraverso animali da 5 a 9 per ogni gruppo (giorni di colostomia 14 e 30, sham 14 giorni: n = 8; colostomia 60 giorni: n = 5; 30 e 60 giorni di sham: n = 9), ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il modello murino di DC ha presentato in questo protocollo affidabile riproduce le caratteristiche istopatologiche del DC umana (ad es., lo sviluppo del de novo di follicoli linfoidi nel submucosa dei segmenti dell'intestino infiammato, cripta accorciamento e riduzioni in numeri delle cellule di calice). Oltre a questo vantaggio, questo modello è indotta da un fattore scatenante molto simile e presenta con un decorso clinico di moderata gravità lieve, come è il caso in esseri umani più colpiti.

Per ottenere risultati riproducibili e mortalità perioperatoria accettabile, è necessario qualche pratica in tecniche microchirurgiche. Tuttavia, sia la colostomia e sham operazione (colotomy) può essere eseguita con mortalità perioperatoria molto basso (< 10%). Alcune fasi operative sono di grande importanza: 1) identificare positivamente l'ileo colon e terminal. In casi dove non è chiaro l'anatomia della regione ileocecale, il colon può essere identificato dalla presenza di feci formate e ileo terminale dalla presenza di placche di Peyer. 2) quando manifestare il ciclo di colostomia, assicurare che il mesentere non è contorto, evitando così l'ischemia mesenterica e ileo meccanico. 3) quando perforando il mesentere con il tubo flessibile, assicurare che un settore privo di nave viene scelto, impedendo così l'ischemia mesenterica e sanguinamento. 4) quando si crea la piccola incisione nella parete addominale, verifica per emostasi sufficiente. Se necessario, è possibile utilizzare termo-coagulazione per fermare l'emorragia dai vasi del muscolo. 5) assicurare la colica loop è aperta almeno a due terzi della relativa circonferenza e che la parete posteriore è sufficientemente esteriorizzata, garantendo così una completa ostruzione del passaggio di feci ai segmenti dell'intestino distale. 6) garantire che entrambe le estremità del colostomy siano ben fissate alla pelle per evitare un passaggio aperto alla cavità peritoneale, con conseguente più alti rischi di infezione o un ileo meccanico perché il flusso fecale non è possibile uscire. Normalmente, tutte le procedure chirurgiche possono essere eseguite senza lenti di ingrandimento e microscopi chirurgici. In generale, l'utilizzo di questi dispositivi richiede ulteriore addestramento.

Anche quando la complessità delle procedure chirurgiche è solo moderata, ci sono molte questioni operative e perioperatoria essenziali da considerare per terminare con successo l'esperimento con risultati riproducibili.

È essenziale per la sopravvivenza a lungo termine con una colostomia permanente che i topi hanno un intestino cieco intatto. Un gruppo sperimentale con colostomie prossimale adiacente alla valvola ileocecal ha mostrato un tasso di mortalità del 100% nella prima settimana postoperatoria a causa di perdita di peso irreversibile (dati non mostrati). Di conseguenza, è della massima importanza per scegliere il sito di colostomia distale di almeno 20 mm dalla valvola di Bauhin. Questa osservazione può essere dovuto la fisiologia della digestione del roditore. Trasporto retrogrado dal colon prossimale al cieco si verifica in queste specie. L'intestino cieco è dove la sintesi delle sostanze nutritive da occurs8 la microflora batterica. I valori MCH e di MCV normale durante il follow-up a lungo termine indicano che gli animali con colostomie distale non soffrono di carenze vitaminiche significativo. Inoltre, la coprofagia è una parte essenziale del comportamento nutrizionale di roditori nei loro ambienti naturali. Quando si stabilisce il modello, eravamo molto preoccupati che perturbare la coprofagia come conseguenza della presenza di una colostomia permanente potrebbe provocare carenze nutrizionali, (ad es., vitamina B). Tuttavia, anche se è un problema in condizioni dove l'accesso alle sostanze nutrienti è limitato, precedentemente è stato indicato che coprofagia perde il suo significato nutrizionale in condizioni sperimentali con libero eccesso di acqua e cibo nutrizionalmente bilanciato9 . Nelle nostre condizioni sperimentali, è fondamentale per ottimizzare le condizioni di assunzione nutrizionale postoperatorio. Abbiamo usato mangimi che avevano un alto contenuto proteico, ottimizzate la qualità delle proteine e ha aumentato la densità di energia. Gli animali sono stati acclimatati a questa dieta almeno due settimane prima dell'intervento. Postoperatorio, imbevuto di acqua di alimentazione è stato offerto ad libidum faciliate cibo e assunzione di liquidi.

È fondamentale utilizzare topi dello stesso sesso in entrambi i gruppi sperimentali e sham. Sesso è stato indicato per avere un impatto significativo il corso non solo di infiammazione sistemica, ma anche della infiammazione intestinale nella colite indotta chimicamente di vari modelli10,11,12. In generale, gli animali maschii svilupperà la malattia più pronunciata con maggiore infiammazione, più danni di cripta, meno rigenerazione, i livelli elevati di citochine pro-infiammatorie e recuperi più lenti dal peso perdita10. Un ulteriore vantaggio dell'utilizzo di animali maschi è meglio pesi pari età preoperatoria corpo, portando a una migliore compensazione del periodo di perdita di peso postoperatoria iniziale. Tuttavia, i topi femminili possono essere utilizzati nel protocollo se specifiche domande (ad es., l'influenza del sesso ormoni sulla manifestazione di DC sono da affrontare. Utilizzando topi maschi richiede uno sforzo maggiore nel mantenere condizioni abitative stabili. Topi maschi sono più inclini a interazioni aggressive che portano a lesioni e morte. Topi maschi vivono nelle gerarchie stabilite con un maschio dominante. Una volta stabilita la gerarchia nel gruppo, continui combattimenti è meno comune13,14. Per questo motivo, abbiamo formato i gruppi sperimentali all'arrivo dei topi nella nostra struttura animale almeno due settimane prima dell'intervento e mantenuto questi gruppi fino al termine di esperimenti. In generale, gruppi sperimentali di 5 a 7 animali erano tenuti in una gabbia. Mantenimento della stabilità sociale e condizioni di alloggio era della massima importanza non solo per ridurre al minimo i comportamenti aggressivi degli animali da esperimento. Condizioni abitative hanno dimostrate di influenzare l'aumento di peso, nonché parametri immunologici15,16,17.

Suscettibilità ai modelli di colite indotta chimicamente e geneticamente varia considerevolmente tra mouse ceppi18,19,20. Il presente protocollo è stato stabilito in topi C57Bl/6, un ceppo di topo con un background genetico ben definito e un sistema immunitario ben caratterizzati21,22,23 che mostra intermedia a forte infiammatoria risposta al Destrano solfato colite indotta da sodio modello20 ed è considerato un prototipo di ceppo di Th123. L'uso di altri ceppi di topi può essere considerato quando è richiesto un ambiente Th2 o attività di malattie più gravi.

In sintesi, il nostro protocollo costituisce uno strumento prezioso per valutare il ruolo dei vari tipi di cellule immunitarie, citochine, chemochine e altre molecole nella patogenesi della DC. Un gran numero di modelli di topi geneticamente modificati sono disponibile con lo sfondo di C57BL/6 e può essere combinato con il nostro modello (ad esempio, topi carenti di IL-17, IL-10, chemokine CXCL13, recettori per le chemochine CXCR5 e CCR7 e sfingosina-1-fosfato recettore 4). La disponibilità di diversi ceppi di topi Congenici sullo sfondo C57BL/6 in gran parte facilitare esperimenti di trasferimento per stabilire il ruolo di tipi cellulari coinvolti nell'eziologia della DC. Infine, il modello offre l'opportunità di valutare l'influenza degli interventi locali (ad esempio, modifica del microbioma locale e terapia antinfiammatoria locale) su immunità mucosale nei segmenti intestinali affetti e non affetti e sistemica omeostasi immunitaria.

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Disclosures

Tutti gli autori dichiarano di non avere nessun interessi concorrenti.

Acknowledgments

Nessuno

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operation material
heat underlay, 6 watt ThermoLux, Witte + Sutor GmbH 461265
Ethanol 70% (with methylethylketon) Pharmacie of the University Hospital Greifswald
Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length Centramed GmbH, Germany 8308370 for disinfection of operation field
Scissor Aesculap (BRAUN) BC064R
Atraumatic DeBakey forceps Aesculap (BRAUN) OC021R
Needle holder Aesculap (BRAUN) BM012R
Vasofix Safety i.v. cannula 22G Braun Melsungen AG, Germany 4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm ETHICON, Inc. VCP994H
PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm ETHICON, Inc. Z991H
BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior) BD Medical 305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin) ANTISEPTICA, Germany 18824-01 disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 9089.01.00 87 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 400300.00.00 13 mg/kg i.p.
NaCl 0.9% Braun Melsungen AG, Germany 6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine) Bayer, Germany PZN: 01498870 0.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride) Grünenthal GmbH, Germany 10116838 1 mg/mL drinking water
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)  Cephasaar GmbH, Germany PZN: 08844252 25 mg/kg body weight i.p.
metronidazole 5 mg/mL Braun Melsungen AG, Germany PZN: 05543515 12.5 mg/kg body weight i.p.
Food
ssniff M-Z Ereich ssniff, Germany  V1184-3
Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches TripleATrading, the Netherlands SDSHPV-75
Equipment
Nikon Eclipse Ci-L Nikon Instruments Europe BV, Germany light microscopy
VetScan HM 5  Abaxis, USA 770-9000 Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood
Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath) Bandelin electronics, Germany RK 100 H disinfection of surgical instruments
Software
NIS-Element BR4 software Nikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6 GraphPad Software, Inc.

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References

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