שיטת הכנה מדגם יעיל לשיפור אותות יון פחמימות לייזר בסיוע מטריקס Desorption/יינון ספקטרומטריית

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

פרוטוקול לשיפור אותות יון פחמימות ספקטרומטריית MALDI על ידי מבנים גבישיים רפורמה במהלך תהליכי הכנה מדגם הוא הפגין.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ou, Y. M., Kuo, S. Y., Lee, H., Chang, H. T., Wang, Y. S. An Efficient Sample Preparation Method to Enhance Carbohydrate Ion Signals in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (137), e57660, doi:10.3791/57660 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הכנת הדוגמא היא תהליך קריטי בניתוח ספקטרומטר מסה (MS) של פחמימות. למרות לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון (MALDI) MS הוא שיטת הבחירה בניתוח פחמימות, יון המסכן הפארמצבטית אותות ונתונים של פחמימות דגימות ממשיכות להיות בעיות קשות. לניתוח כמותי של פחמימות, פרוטוקול אנליטי יעיל לספק איכות מעולה הנתונים יש צורך. וידאו זה מדגים דוגמת פרוטוקולים הכנה כדי לשפר את עוצמת האות ולצמצם את הנתונים וריאציה של פחמימות MALDI-MS. לאחר ייבוש, התגבשות של מדגם טיפות, המורפולוגיה קריסטל תוקן על ידי מתנול לפני ניתוח המוני spectrometric. שיפור פחמימות אות נבדק עם MALDI הדמיה ספקטרומטר מסה (IMS). תוצאות ניסויית להראות כי קריסטל הרפורמציה התאמת מבנים גבישיים, מפזרת מחדש פחמימות analytes. לעומת שיטת הכנה droplet יבשים MALDI קונבנציונלי-MS, רפורמה מורפולוגיות קריסטל פחמימות עם מתנול מראה עוצמת האות טוב יותר באופן משמעותי, יון התמונה התפלגות נתוני יציבות. מאז הפרוטוקולים הפגינו בזאת אינן כוללות שינויים בהרכב לדוגמה, הם חלים באופן כללי על פחמימות שונים, מטריצות.

Introduction

ניתוח פחמימות הוא נושא חשוב ומאתגר. פחמימות ונגזרותיהם תפקיד חשוב לחיות אורגניזמים1,2,3. מולקולות אלה סיבכו מבנים, נוטים מתפרקים. רבים מהם לא יכול להיות ברור מאופיין בשל קשיים הפרדה וזיהוי. למרות לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון (MALDI) ספקטרומטר מסה (MS) הוחלה על ניתוח של מגוון רחב של מולקולות, בשל הרגישות שלה תוצאות מובנים4, ניתוח פחמימות באמצעות MALDI-MS ממשיכה להיות אתגר גדול בשל היעילות יינון נמוכה של מולקולות כאלה5. Derivatization כימית היא דרך נפוצה כדי לשפר את יעילות יינון של פחמימות6,7, אבל הליכים כאלה הם לדוגמה לצרוך וזמן. חוץ מזה, היעילות יינון של פחמימות derivatized הוא עדיין נמוך מזה של חלבונים. לפיכך, בפיתוח שיטות לשיפור האות פחמימות MALDI-MS ללא פרוצדורות מסובכות הכרחי.

היישום של MALDI-MS כדי ניתוח כמותי הוא נושא מאתגר אחר. אחת הבעיות המרכזיות של MALDI-MS היא כי שלה הפארמצבטית רגישות ונתונים מסתמך באופן ביקורתי על מדגם הכנת פרוטוקולים ופרמטרים ניסיוני. במקרים רבים, ניתוח כמותי על-ידי MALDI-MS הוא לא אמין עקב מדגם הטרוגנית מורפולוגיות והפצה analyte. דוגמה ידועה היא דגימות המוכנים מטריצה (DHB) MALDI 2, 5-dihydroxybenzoic חומצה. כאשר DHB הוא גיבש אט-אט תחת סביבת אמביינט, מידת השתלבות analyte מטריקס קריסטלים הוא בלתי צפוי, כי תוצאות דגימות הראו מורפולוגיות לא סדיר. דוגמאות כאלה בדרך כלל מורכב גבישים גדולים בצורת מחט, בסדר. כאשר DHB מוכנה תוך שימוש של ממס נדיף ו/או צלחת המדגם מחומם, תהליך ייבוש מהיר התוצאה קריסטלים בסדר הומוגנית יותר תוצאות כמותיות8,9,10. טכניקה זו ידועה בשם "recrystallization" של דגימות MALDI. השיפור מיוחס יותר תיאגוד analytes לתוך מטריצה בסדר קריסטלים במהלך תהליך התגבשות מהר. גם הראו כי התאמת הסביבה הכנה מדגם צמצם את הטרוגניות של פחמימות אות ושיפור תוצאות כמותיות11,12. הממצאים בעבודות אלה מראים כי מדגם המורפולוגיה היא גורם קריטי בקביעת איכות אות פחמימות. כדי לפתח אסטרטגיה כללית לניתוח יומי, שיטה הרפורמציה מדגם יעיל במתן פחמימות משופרת רגישות נדרש.

בחנו באופן שיטתי המתאם בין מדגם מורפולוגיה, פחמימות רגישות ב MALDI-MS דו ח זה התבצעה13. התוצאות שהושגו באמצעות כמה פחמימות חשובה, הצג מטריצות שיפור האות הטוב ביותר מתגשמת מאת recrystallizing מיובשים MALDI דגימות. המורפולוגיה של דגימות שהוכנו בשיטת רביב מיובשות קונבנציונליות (DD) תוקן על ידי recrystallization מהיר עם מתנול (MeOH). הפרוטוקולים הכנה מפורטת מדגם מודגמות כאן. הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים, כולל מדגם פלייט preconditioning, דוגמת התצהיר, recrystallization, וניתוח ספקטרומטר מסה. הפחמימות שימוש כוללים sialyl-לואיס (מירה כהןA), maltoheptaose (MH). DHB משמש מודל מטריצה. התוצאות מציגות עוצמת האות פחמימות והפצה המרחבי השתפר בצורה ניכרת אחרי recrystallization. השיטה ניתן ליישם דגימות עם מטריצות פופולריים אחרים, כולל 2,4,6-trihydroxyacetophenone (תאפ) וα- cyano-4-hydroxycinnamic חומצה. שיטה זו משמשת בגישה כללית אשר ניתן לשלב בקלות בתוך השגרה מעבדה לניתוח פחמימות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מדגם פלייט Preconditioning

  1. ניקוי של צלחת מדגם
    1. ללבוש nitrile כפפות כדי למנוע זיהום של צלחת מדגם במהלך הניקוי.
    2. יד-לשטוף הצלחת מדגם עם mL 100.0 בפתרון דטרגנט (1.0 mg/mL).
    3. יד-לשטוף הצלחת מדגם במים מזוקקים-יונים (DDW).
    4. לשטוף את המשטח צלחת מדגם mL 30.0 של MeOH.
    5. לשים. את הצלחת מדגם גביע 600 מ ל, מילוי עם DDW עד לצלחת מדגם מלא שקועה בתוך המים.
    6. לשים את הספל אולטרה סאונד אמבטיה (ראה טבלה של חומרים), sonicate את הצלחת מדגם למשך 15 דקות (200 W, 40 קילו-הרץ).
    7. להוציא לצלחת לדוגמה, לפוצץ את טיפות המים באמצעות חנקן בלחץ.
    8. להפקיד 0.2 µL של MeOH על הצלחת לדוגמה כדי לבדוק אם MeOH מתפשטת למקומות אחרים.
      הערה: אם MeOH מתמזג עם מקומות אחרים, חזור על השלבים 1.1.3-1.1.5; אם לא, המשך לשלב הבא.
  2. רגולציה של ייבוש קאמרית טמפרטורה
    1. השתמש תא ייבוש בתנאים יציב להתייבש טיפות, כפי שתואר לעיל11,12,13. בפרט, השתמש בהליך מפורט שתואר בשלבים 2.1-2.5 של Ou, י'-מ'. et al. 201612. בקצרה:
      1. לטהר את החדר הייבוש על-ידי חנקן בטמפרטורת החדר בספיקה קבועה כדי לשמור על סביבת לחות יחסית נמוך.
      2. לשמור על מדגם פלייט טמפרטורה קבועה רגיל - (25 ° C) או תנאים ייבוש מהיר (50 ° C), מוסדר על ידי גוש נחושת מבוקרי טמפרטורה בחדר הייבוש.
  3. אופן ההכנה של פתרונות מטריקס ו- analyte
    1. הכנה של מטריקס פתרונות
      1. להמיס DHB ב- 50% acetonitrile (לחצן מצוקה): 50% DDW להכין פתרון 0.1 M.
    2. הכנת analytes פחמימות
      1. להמיס מירה כהןA ב DDW להכין 10-4 פתרון מ'.
      2. להמיס MH ב DDW להכין ז 10-4 פתרון.

2. לטעום התצהיר ו- Recrystallization

הערה: ההליכים ממוטב עבור ניתוח קטן ורגיל כמויות של דגימות מתוארים כאן. ודא כי הטמפרטורה צלחת מדגם הוא התייצב על הטמפרטורה הרצויה לפני הפקדת את הפתרונות. אם המדגם משתרעת שטח גדול כדי לכסות במקומות אחרים דוגמת במהלך recrystallization, להכין מדגם חדש או חזור על שלב 1.1.

  1. לניתוח של כמות קטנה (0.1 µL) של מדגם
    הערה:
    השלבים הבאים פותחו עבור משימותינו דוגמה והשעה. היא מתאימה לניתוח כמותי של דוגמאות אמיתיות עם כמות מוגבלת או IMS מהיר עבור ניתוח כימות.
    1. Premix µL 0.25 DHB פתרון ו 0.25 µL של מירה כהןA או פתרון MH צינור microcentrifuge.
    2. מערבולת הפתרון מעורבת באמצעות מערבל מערבולת 3 s.
    3. ספין למטה הפתרון מעורב ומפרידה מיני עבור 2 s (2000 x g).
    4. השתמש פיפטה כדי למשוך µL 0.1 של הפתרון מעורבבים מראש מיד להפקיד אותו בצלחת מדגם.
      הערה: בעת הפקדת כמות קטנה של דגימה, לא שים הפתרון מעורבבים מראש קצה פיפטה עבור למעלה מ- 10 s.
    5. המתן המדגם להתייבש. ייבוש פעמים טיפוסי מוצגים בטבלה 1.
    6. השתמש פיפטה להפקיד 0.2 µL של MeOH ימינה אל המקום דגימת יבשים. המדגם יהיה רטוב ויבש מיד.
      הערה: להבטיח כי התצהיר כשההליך יסתיים ב- 3 s כדי למנוע אידוי משמעותית אובדן MeOH.
    7. לבחון את הדגימה באמצעות מיקרוסקופ. אם מורפולוגיות קריסטל אינם כמו שציפיתי (ראה איור 1 לדוגמה של התוצאות הרצויות), חזור על השלבים 2.1.1-2.1.6 להכין מדגם חדש.
    8. ללבוש את הכפפות nitrile, להוציא בזהירות את הצלחת דגימה מן החדר הייבוש.
  2. לניתוח כמות רגילה (1 µL) של מדגם
    הערה: השלבים הבאים מפותחים עבור למקסם ההומוגניות של פחמימות דגימות עם שימוש בדרך כלל כמות מדגם MALDI. התהליך מתאים שגרתית ו כמותני. תהליך recrystallization מפזרת מחדש מטריצות באופן שווה על אזורים גדולים יותר ודוגמאות.
    1. Premix 2.5 µL של פתרון DHB ו 2.5 µL מורן סלםA או פתרון MH צינור microcentrifuge.
    2. מערבולת הפתרון מעורבבים מראש עם מערבל מערבולת עבור 5 s.
    3. ספין למטה הפתרון מעורב ומפרידה מיני עבור 2 s (2000 x g).
    4. השתמש פיפטה כדי למשוך µL 1.0 של הפתרון מעורבבים מראש מיד להפקיד אותו בצלחת מדגם.
      הערה: לא להשתמש הנותרים premixed פתרון שוב לאחר הפקדת את הדגימות.
    5. המתן המדגם להתייבש. ייבוש פעמים טיפוסי מוצגים בטבלה 1.
    6. השתמש פיפטה להפקיד µL 1.5 של MeOH ימינה אל המקום דגימת יבשים. המדגם יהיה רטוב ויבש מיד.
      הערה: במקרים עם טמפרטורה צלחת מדגם גבוה (50 ° C), השלב recrystallization צריך להיעשות בתוך 5 s כדי למזער את אידוי MeOH בעצת פיפטה.
    7. לבחון את הדגימה באמצעות מיקרוסקופ. אם מורפולוגיות קריסטל אינם כמו שציפיתי (ראה איור 1 לדוגמה של התוצאות הרצויות), חזור על השלבים 2.2.1-2.2.6 להכין מדגם חדש.
    8. ללבוש את הכפפות nitrile, להוציא בזהירות את הצלחת דגימה מן החדר הייבוש.

3. מסה ספקטרומטר נתוני הרכישה וניתוח

הערה: הניתוח מתבצע באמצעות מסחרית זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (טבלה של חומרים) מצוידים עם מקור יון MALDI. המכשיר מופעל על ידי תוכנת שליטה ספציפי (טבלה של חומרים) עם עיכוב מיצוי מיטבי מראש ואנרגיה לייזר. ספקטרה נרשמים במצב לינארי עם מגוון מסה m/z = 0 – 1500. הצלחת מדגם פוטנציאלי הוא ±25 קוו וכל ספקטרום חישוב ממוצע 10 יריות לייזר. המשתמשים צריכים לנהל כלי אופטימיזציה וניתוח מדגם באמצעות תוכנה תואם ובצע את ההוראות של יצרן כלי.

  1. פתח את תוכנת בקרת מכשיר (ראה טבלה של חומרים).
  2. הכנס את הצלחת מדגם ספקטרומטר מסה.
  3. בחר את שיטת רכישת נתונים ממוטבת מראש בתוכנה.
  4. להירשם האזור כל מדגם IMS שימוש בתוכנת הדמיה (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: דלג על שלב זה אם לא עושה IMS.
  5. התחל הנתונים במצב אצווה של תוכנת שליטה.
  6. להתוות את התמונות יון שימוש בתוכנת הדמיה לאחר השלמת רכישת נתונים.
  7. נתח ספקטרום המונית באמצעות ניתוח תוכנה (ראה טבלה של חומרים) אם הנתונים מתועד ללא תמונה יון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תמונות SEM נציג של מירה כהןA מעורבב עם DHB המוכנים DD, שיטות recrystallization מוצגים באיור1. מורפולוגיה DHB טיפוסי כפי שהוכנו על ידי שיטת DD הוא גבישים גדולים בצורת מחט, rim, מבנים גבישיים בסדר במרכז נקודות דגימה. טיפוסי אורך כזה בגביש בצורת מחט הם ~ 100 מיקרומטר. אחרי recrystallization על ידי MeOH, הדגימה יש אזור גדול יותר אחיד מכוסה גבישי בשבב אבן דמוי משובחים. אורך הקריסטלים "פתית" הם בערך 20-50 מיקרומטר. Recrystallized דגימות לספק שטחים משטח יעיל גדולים יותר מאלה שהופק באמצעות דגימות DD קונבנציונלי.

התוצאות IMS מציינים כי גבישי בשבב אבן דמוי בדרך כלל תוצאה של פחמימות אות בעוצמה גבוהה יותר, התפלגות מרחבית הומוגנית. בדגימות DD קונבנציונאלי, פחמימות יון אותות מופצים בעיקר בפריפריה של נקודות דגימה. איור 2 מציג תוצאות IMS מירה כהןA ו- MH עם או בלי MeOH recrystallization. לאחר recrystallization, לטעום ההפצה של מירה כהןA ומתאימים MH אותות היטב עם הדימוי החיובי-שדה של כתמים. כמו כן, כל דוגמאות פחמימות recrystallized להציג שיפורים משמעותיים בעוצמת האות על פני אלה התוצאות המתקבלות מדגימות DD. בגלל עוצמת האות גבוה יותר הומוגניות, recrystallization משפר בצורה ניכרת איכות הנתונים באנליזה כמותית.

שיפור עוצמת האות פחמימות מאת recrystallization יעיל עבור שני המצבים יונים חיוביים ושליליים. איור 3 משווה את עוצמת האות sodiated (מצב יון חיובי) ופחמימות (מצב יון שלילי) deprotonated של דגימות recrystallized ביחס של דגימות DD. בממוצע, recrystallization של מירה כהןA ודוגמאות MH מגדילה sodiated אותות על ידי גורמים של ציונים של 3.3, בהתאמה. עבור deprotonated מורן סלםא, אות יון בדרך כלל משתפרת בפקטור של בערך 4.7 לאחר recrystallization.

Figure 1
איור 1. תמונות SEM של מירה כהןA המוכנים DHB מטריקס. הדגימות מוכנות תוך droplet מיובשים ושיטות recrystallization. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. התוצאות נציג של התמונה ספקטרומטר מסה של מירה כהן ו- MH המוכנים מיובשים droplet ושיטות recrystallization. יון תמונות מייצגות הפצות של analytes sodiated או deprotonated. כל התמונות בהיר-שדה ויון מוצגים באותו הסולם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. עוצמות האות פחמימות שהושג עם שיטות הכנה דגימה שונים. שחור ברים: sodiated מורן סלםA (m/z: 843); ברים אדומה: deprotonated מורן סלםA (m/z: 819); כחול ברים: sodiated MH (m/z: 1175). קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מדגם מדגם פלייט
טמפרטורה (° C)
כמות הדגימה
(ΜL)
לדוגמה ייבוש
הזמן (s)
MeOH ייבוש
הזמן (s)
דוגמה נאותה באזור
הרחבת לאחר
recrystallization (%)
מירה כהןא 25 0.1 100-150 < 5 0-200
1 300-350 < 10
MH 0.1 100-150 < 5
1 200-350 < 10
מירה כהןא 50 0.1 < 5 < 5
1 < 10 < 10
MH 0.1 < 5 < 5
1 < 10 < 10

טבלה 1- ניסיוני פרמטרים ותנאים ייבוש תחת דגימה שונים צלחת temperatures.x

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לדוגמה הטרוגניות היא שבעיה מכרעת בדמוקרטיה. גברת MALDI הוא הכי נפוץ שיטת הכנה דגימה, אך הקריסטלים תוצאות מאוד הטרוגנית. דוגמאות כאלה מציגות הפארמצבטית נמוכה של אות ירה--ירייה, לדוגמה-כדי-sample. לכן, בחיפוש אחר "מתוק כתמים" באזורים דוגמת במהלך איסוף הנתונים הוא הליך נפוץ בניסויים MALDI. . הדגימות הטרוגנית כזה ומבניות על כימות בניתוח שגרתי

במחקר הנוכחי, מורפולוגיה מדגם MALDI ממוטבת על-ידי recrystallization. השיפור פחמימות אות עוצמה ויציבות נתונים על-ידי recrystallization מיוחס התאגדות משופרת בין פחמימות מטריצות. בשל הידרופילית מאפייני רוב הפחמימות, מטריצות, MeOH מתפוגגת ביעילות MALDI קריסטלים ופחמימות. תצפית מראה כי התצהיר, אידוי מהיר של MeOH רפורמות גבישים DHB גדולים בצורת מחט לתוך מבנים גבישיים קטנים כמו פתית. תהליך זה גם ממזערת את הדגימה סגרגציה, מגדילה את פני השטח. על פי נתוני IMS, מספקים הקריסטלים שחזר בתשובה microenvironment טוב יותר ליוניזציית פחמימות. ראוי לציין, ניצול של תא ייבוש נועד לספק תנאי הפניה בדיוק פרמטרים ניסוי מבוקר. לבדיקה שגרתית, משתמשי MS כללי יכול לעקוב אחר הפרוטוקולים תחת סביבה הסביבה כדי להשיג שיפור תוצאות דומות.

שיפור האות מאת recrystallization יכול להיות גם מגידול שטח יעיל, מאז MALDI נשלטת על ידי משטח תגובות כימיות14,15. הקשר בין עוצמת האות לבין שטח אפקטיבי של גבישים MALDI נחקרה על-ידי הכנת דוגמאות תחת דגימה שונים צלחת טמפרטורות11,12. לעומת שינוי גדול גודל הקריסטל בשיטת recrystallization, התאמת משובח של גודל הקריסטל יכולה להיות מושגת על ידי ויסות טמפרטורה צלחת מדגם במהלך ה-droplet ייבוש תהליך. בעת שימוש תאפ כמו מטריצה, הגודל הממוצע של גבישים בצורת מחט של תאפ מפחית 10-fold כאשר הטמפרטורה צלחת מדגם מפחית 40 ° C. תצפיות מראים כי עוצמת האות פחמימות מגביר כפי גודל הקריסטל מקטין13. הפחתת דגימה צלחת טמפרטורה זאת, שאינם מתאימים לניתוח שגרתי כי הוא אינו יכול להשתנות המורפולוגיה של DHB ביעילות וזה דורש זמן הכנה פעמים.

כדי להבטיח את התוצאה הטובה ביותר recrystallization, תהליכי הכנה צריכה להתבצע בזהירות. ראשית, תערובות מדגם טריים לספק שיפור האות הטוב ביותר בשיטת recrystallization. ברגע מעורבבים מראש פתרונות חשופים לסביבה אמביינט, טרום התגבשות מתרחשת בפתרון, אשר תשנה את גודל הקריסטל הסופי מורפולוגיה. בשינוי כזה מורפולוגיה נובעת ככל הנראה בשינוי היחס מטריקס/analyte. תצפיות להראות את recrystallization על כך דגימות לא יכולה לספק שיפור האות הטוב ביותר. לכן, צריך להיות מופעל ההליך pipetting עם יעילות גבוהה להגן על ה-droplet מדגם טרום התגבשות בתוך הטיפ פיפטה. שנית, כמות מתאימה של MeOH צריך להיות מוחל על דגימות הרפורמה לחלוטין. במהלך תהליך recrystallization, MeOH צריך להפקיד השטח מדגם במהירות האפשרית כדי למנוע אובדן התאדות ניכרת. MALDI מדגם קריסטלים אינם מתמוססים לחלוטין אם הנפח של MeOH הפקיד אינו מספיק. לעומת זאת, כמויות גדולות של MeOH פרושים ולהפחית הצפיפות של הדגימות. מומלץ להתבונן מורפולוגיות הדגימה במיקרוסקופ כדי להבטיח כי מורפולוגיות קריסטל הם רפורמה כראוי לפני ניתוח MS. אם מורפולוגיות קריסטל לא מלא ישונה (ראה איור 1 ו לטבלה 1 לעיון), זה הכרחי להכין דוגמא חדשה עם אותם הליכים.

הגישה הטובה ביותר אנליזה כמותית ב MALDI-MS הוא ניתוח דגימות רפורמי עם IMS. למרות הרפורמציה מצמצם באופן משמעותי הדגימה הטרוגניות, עוצמת אות analytes באזורים שונים עשויים להשתנות עדיין (איור 2). לעומת בדיקה ידנית של עמדות הדגימה שנבחרה, ניתוח של כל העדים אזורים עם IMS הממוצע את הוודאות ואת הנתונים וריאציה. תצפיות להראות את recrystallization דוגמאות המוכנים קבוע של כמות (פתרון מדגם µL 1.0) מספק פחמימות מעולה מדגם עניי ניתוח כמותי (שלב 2.2). עם זאת, IMS ניתוח דוגמאות כאלה צורכת יותר זמן ניתוח בשיטת בדיקה ידנית. כדי להשיג שניתוח IMS מהיר, הכנת דוגמאות שימוש בפתרונות מדגם µL 0.1 (שלב 2.1) ניתן לייצר אזורים מדגם קטן, לצמצם את זמן הניתוח.

Recrystallization של דגימות MALDI מספק דוגמה מעולה מורפולוגיה רגיש וניתוח כמותי ב MALDI-MS. העיקרון הבסיסי מאחורי שיטה זו עולה בבירור מדבריו. התהליכים הניסיוניים שפותחה בעבודה זו הם נוחים ויעילים עבור תנאים כלליים ניסיוני. תהליכים אלה ניסיוני ניתן להחיל בקלות על ניתוח שגרתי ללא תוספת עלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים לא תודות לך

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Detergent powder Alconox 242985
Methanol Merck 106009
Acetonitrile Merck 100003
2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) Alfa Aesar A11459
sialyl-lewis A (SLeA) Sigma-Aldrich S1782
Maltoheptaose Sigma-Aldrich M7753
Pipette tips Mettler Toledo 17005091
Microcentrifuge tube Axygen MCT-150-C
Equipment
Milli-Q water purification system Millipore ZMQS6VFT1
Powder-free nitrile gloves Microflex SU-690
600 mL beaker Duran 2110648
Ultrasonic cleaner Delta DC300H
Hygrometer Wisewind 5330
Nitrogen gas flowmeter Dwyer RMA-6-SSV
K-type thermocouples Digitron 311-1670
Vortex mixer Scientific Industries  SI-0236
Mini centrifuge Select BioProducts Force Mini 
Pipette Rainin pipet-lite XLS
Stereomicroscope Olympus SZX16
Temperature controllable drying chamber This lab
Ultraflex II TOF/TOF mass spectrometer Bruker Daltonics
MTP 384 target plate polished steel BC Bruker Daltonics 8280781
Flexcontrol Version 3.4 Bruker Daltonics Control software
Fleximaging Version 2.1 Bruker Daltonics Imaging software
Flexanalysis Version 3.4 Bruker Daltonics Analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holme, D. J., Peck, H. Analytical Biochemistry. 3rd edn, Addison Wesley Longman Limited. (1998).
  2. Costello, C. E. Time, life ... and mass spectrometry - New techniques to address biological questions. Biophysical Chemistry. 68, (1-3), 173-188 (1997).
  3. Caroff, M., Karibian, D. Structure of bacterial lipopolysaccharides. Carbohydrate Research. 338, (23), 2431-2447 (2003).
  4. Marvin, L. F., Roberts, M. A., Fay, L. B. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical chemistry. Clinica Chimica Acta. 337, (1), 11-21 (2003).
  5. Harvey, D. J. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates. Mass Spectrometry Reviews. 18, (6), 349-450 (1999).
  6. Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydrate Research. 131, (2), 209-217 (1984).
  7. Lamari, F. N., Kuhn, R., Karamanos, N. K. Derivatization of carbohydrates for chromatographic, electrophoretic and mass spectrometric structure analysis. Journal of Chromatography B. 793, (1), 15-36 (2003).
  8. Nishikaze, T., Amano, J. Reverse thin layer method for enhanced ion yield of oligosaccharides in matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23, (23), 3787-3794 (2009).
  9. Williams, T. I., Saggese, D. A., Wilcox, R. J., Martin, J. D., Muddiman, D. C. Effect of matrix crystal structure on ion abundance of carbohydrates by matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, (5), 807-811 (2007).
  10. Nicola, A. J., Gusev, A. I., Proctor, A., Jackson, E. K., Hercules, D. M. Application of the fast-evaporation sample preparation method for improving quantification of angiotensin II by matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9, (12), 1164-1171 (1995).
  11. Lai, Y. H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27, (8), 1314-1321 (2016).
  12. Ou, Y. -M., et al. Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications. Journal of Visualized Experiments. (116), e54409 (2016).
  13. Lee, H., et al. Enhancing carbohydrate ion yield by controlling crystalline structures in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 49-55 (2017).
  14. Allwood, D. A., Perera, I. K., Perkins, J., Dyer, P. E., Oldershaw, G. A. Preparation of 'near' homogeneous samples for the analysis of matrix-assisted laser desorption/ionisation processes. Applied Surface Science. 103, (3), 231-244 (1996).
  15. Sadeghi, M., Vertes, A. Crystallite size dependence of volatilization in matrix-assisted laser desorption ionization. Applied Surface Science. 127, (Supplement C), 226-234 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics