Chemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
זיהוי סטנדרטי של מבנה מורכב ברפואה הטיבטית באמצעות ספקטרומטריית מסה של מלכודת יונים וניתוח פיצול רב-שלבי
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול כללי ועיצוב שניתן ליישם כדי לזהות כמויות זעירות ומרכיבים קטנים בפורמולציות המוצר הטבעי המורכב (מטריצות) ברפואה הטיבטית.
Transcript
שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים לנתח את המבנים של תרכובות הרפואה הטיבטית, במיוחד את מרכיבי העץ. זה יכול לספק תובנה למחקר איכותני של תוכן התרכובת ברפואה הטבעית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי הדיוק של המבנה המורכב המתקבל במקרה זה גבוה מזה של מסד הנתונים.
טכניקה זו יכולה לשמש בניתוח המבנה של מתווכים מטבוליים בשלפוחית השתן או בשתן. כדי להתחיל, התרופה הטיבטית Abelmoschus manihot של זרעים הדגימה הכנה. שקלו במדויק גרם אחד של AMS והניחו אותו בבקבוק חרוטי המכיל 30 מיליליטר של 80% מתנול.
באמצעות סולקטור אמבטיה אולטרסאונד ב 40 קילוהרץ, לבצע מיצוי על התערובת במשך 30 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב 14, 000g במשך חמש דקות. מכינים מזרק הזרקה ומסנן קרום מיקרו-נקבובי אורגני של 0.22 מיקרון, ומסננים את הסופרנאטנט לבקבוק דגימה של שני מיליליטר.
לאחר הפעלת המתג של משאבת הוואקום, פתח את השסתום הראשי של גליל הארגון יחד עם שסתום הלחץ החלקי והתאם את הלחץ לכ -0.3 מגה-פסקל. לאחר מכן, פתח את שסתום החנקן. הפעל את ספקטרומטריית המסות, או MS, תוכנת בקרה.
לחץ על מקור ESI מחומם בלוח התוכנה והגדר את הפרמטרים של MS, כולל טמפרטורת המחמם, קצבי זרימת גז, מתח ריסוס למצבים חיוביים ושליליים וטמפרטורת נימים. לחץ על כפתור החל כדי להפעיל את מקור היונים לכרומטוגרפיה נוזלית או LC.Prepare Mobile phases A ו- B באמצעות 0.1% חומצה פורמית בתמיסה מימית באצטוניטריל טהור בהתאמה. דגה אותם בסולקטור אמבט אולטרסאונד ב 40 קילוהרץ למשך 15 דקות לפחות לפני חיבור התמיסות למעברי נוזל A ו- B בהתאמה.
הכינו תמיסת מתנול מים ביחס של 1:9 לפי נפח, ולאחר מכן מלאו אותה ידנית בבקבוקי הנוזלים הנקיים של המשאבה והמזרק. לאחר הפעלת תוכנת הבקרה LC-MS, לחץ על Direct Control כדי לפתוח את לוח הבקרה של LC. פתח את שסתום הטיהור נגד כיוון השעון במודול המשאבה.
לחץ על אפשרות נוספת כדי לפתוח את הגדרת המשאבה ולהגדיר את פרמטרי הטיהור על חמישה מיליליטר לדקה למשך שלוש דקות. לחץ על טיהור כדי להתחיל בהסרת הבועה. לאחר שתסיים, סגור את שסתום הטיהור.
לאחר מכן, לחץ על מזרק Prime כדי לשטוף את המזרק במשך שלושה מחזורים, Wash Buffer Loop כדי לשטוף את הלולאה במשך מחזור אחד, ועל Wash Needle Externally כדי לשטוף את המחט במשך מחזור אחד. הניחו את בקבוק הדגימה בדוגם. לחץ על Instrument Setup כדי לפתוח את Method Editing Window ולחץ על New כדי ליצור שיטת מכשיר LC-MS חדשה.
קבע זמן ריצה כולל עבור השיטה והגדר את מגבלת הלחץ. קצב זרימה כולל, שיפוע זרימה, טמפרטורת דגימה, טמפרטורת עמודה ודלתא של טמפרטורה מוכנה בחלון עריכת שיטות. עבור שיטת MS, בחר את סוג הניסוי MS כללי או MSN.
הזן ערכים של זמן הרכישה, קוטביות, טווח מסה, מספר ערך הסטה ומשך. לחץ על שמור כדי להגדיר את ההגדרות כשיטת מכשיר. לחץ על הגדרת רצף כדי לפתוח את טבלת הרצפים, שבה הזן את המידע על סוג הדגימה, קובץ, שם, נתיב, מזהה דגימה, שיטת מכשיר, מיקום ונפח הזרקה.
הקלט את טבלת הרצף על ידי לחיצה על שמור, ולאחר מכן יישם את ההגדרות והתחל את רכישת MS. כדי לטעון את נתוני MS לתוכנת עיבוד הנתונים, לחץ פעמיים על הקובץ הגולמי ב- Explorer. בכרומטוגרמה של שיא הבסיס BPI, בחר את האזור המרבי מתחת לעקומה או AUC על-ידי לחיצה וגרירה של העכבר.
ספקטרום MS המתאים יוצג באותו חלון. בחר יון יעד לניתוח MS/MS הבא. פתח מחדש את החלון עריכת שיטות, ובטבלת ההגדרות MSn, הגדר את m/z של יון היעד למקום עשרוני אחד בעמודה מסת אב.
לאחר מכן, בחר מצב התנגשות והזן את אנרגיית ההתנגשות, או ערך CE. הגדר את טווח הסריקה של MS/MS. לחץ על שמור כדי להקליט את שיטת MS ולהזין שם קובץ חדש בטבלת הרצף.
לחץ על לחצן התחל כדי ליזום את רכישת MS/MS. לאחר השלמת הרכישה, לחץ פעמיים על הקובץ הגולמי ב- Explorer כדי לטעון את הקובץ הגולמי MS/MS לתוכנת עיבוד הנתונים. זהה את יון המקטע החזק ביותר בספקטרום והזן את ערך m/z שלו ברשימת שיטות MSn.
בטבלת ההגדרות של MSn, הגדר את פרמטרי MS3, כולל מצב התנגשות, ערך CE וטווח סריקה. שוב, לחץ להציל כדי להקליט את שיטת MS ולהזין שם קובץ חדש בטבלת הרצף. לחץ על התחל כדי להתחיל את רכישת MS3.
כפי שהודגם בעבר, לחץ פעמיים על הקובץ הגולמי בסייר כדי לטעון את קובץ MS3 raw לתוכנת עיבוד הנתונים, וחזור על השלבים כדי להשיג את ספקטרום MS4. כדי לנתח את הנתונים, לחץ פעמיים על הקבצים הגולמיים כדי לפתוח את כל ספקטרום המסה מ- MS ל- MSn. חשב ידנית את ערכי ההפרש m/z בין יוני היון לבין יוני המקטע המתאימים.
לאחר מכן, צייר ידנית את מבנה הליבה בהתאם לתוצאות MS4 וגזור את המבנה המקורי באמצעות קבוצות פונקציונליות או מקטעים מולקולריים בהתבסס על ערך ההפרש m/z. צייר ידנית את נתיבי המחשוף המולקולרי בהתאם לכל מבנה מולקולרי ב- MSn. ה- ESI-MS של מודל הצלוליוז של פחמימות ייצר את המולקולה החלבונית M H ב- m/z 365 במצב חיובי.
סריקת יוני המוצר, או CID MS/MS הביאה ליון שבר שני ב- m/z 305. יתר על כן, ניתוח MS3 ו- MS4 הביא ברצף את יוני השבר השלישי והרביעי ב- m/z 254 ו- m/z 185, בהתאמה. ניתוח MS/MS חשף את רצף פיצולי היונים, כלומר הידרוליזה של פתיחת טבעת, מחשוף CC והתייבשות.
לכן, שיטה זו נמצאה מתאימה לפחמימות. הניתוח האיכותני הראשוני של AMS באמצעות LC Q-TOF MS חשף את נוכחותן של תרכובות לא ידועות רבות. ניתוח MSN שלילי של יון M H ב- m/z 617 הפיק יון שבר שני ב- m/z 571.
ניתוח MS3 של יון שבר זה יצר יון שבר שלישי ב- m/z 525 על ידי אובדן הידרוקסיאתיל כמתנול המתאים ל- 32 דלתון והידרוקסיל כמים, שהוא 18 דלטון. ניתוח MS4 הפיק יוני פרגמנט רביעי ב-m/z 344 ו-273. זיהוי ידני של מבנה הליבה חשף את המבנה המולקולרי של התרכובת ב-m/z 617 ואת נתיבי המחשוף שלה ב-MSn.
בוצעה סריקת יוני תוצר של יון M H של תרכובת לא ידועה אחרת, וכן נחשפו המבנה המולקולרי ומנגנון המחשוף שלו. לאחר הפעלת משאבת הוואקום, המתינו לפחות חמש שעות כדי להבטיח מידת ואקום מספקת לתנאי הניסוי. ניתוח סטטיסטי יכול לשמש כדי לאסוף את השברים בעלי יחס מסה למטען זהה או דומה.
עם הגדלת פתרון ספקטרומטריית המסות, טכניקה זו יכולה לסייע לחוקרים להשיג תרכובות חדשות יותר בתרופות טבעיות.
Tags
החודש ב-JoVE גיליון 193 ספקטרומטריית מסות מלכודת יונים ספקטרומטריית מסות רב-שלבית MSn רפואה טיבטית TCMRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
