がんに関連した疲労におけるミトコンドリア機能の役割の評価

Cancer Research

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Summary

私たちの目標は、がん患者における倦怠に関連付けられているミトコンドリアの機能障害を評価する実用的なプロトコルを開発することでした。この革新的なプロトコルは、臨床使用を含む標準的な瀉血と基本的な検査に最適です。

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Feng, L. R., Nguyen, Q., Ross, A., Saligan, L. N. Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue. J. Vis. Exp. (135), e57736, doi:10.3791/57736 (2018).

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Abstract

疲労は共通、ほとんどの患者に影響を与える条件を衰弱させます。これまで疲労残る悪い特徴ないの診断を客観的に測定するこの条件の重大度をテストします。ここで疲れのがん患者から採取した PBMCs のミトコンドリアの機能を評価するための最適化手法について述べる.基底のミトコンドリア呼吸、呼吸の余力を記述するエネルギーの表現型を測定することによって PBMC ミトコンドリア機能状態を検討した小型細胞フラックス システムと呼吸阻害剤の連続注入を使用して、ストレスに反応する最寄りのエネルギー経路。新鮮な PBMCs は臨床設定で標準的な瀉血を使用して容易に利用できます。このプロトコルで記述されている全体の分析は、複雑な生化学的手法の関与なし 4 時間未満で完了ことができます。さらに、再現性のあるデータを取得する必要がある正規化手法について述べる。同じ患者および潜在的な治療効果を評価する時のポイント間で比較することができる再現性のあるデータの生成から繰り返しサンプル収集できる簡単な手順と正規化方法を提示します。

Introduction

疲労は、1がん患者の生活の質にマイナスの影響は、普及していると悲惨な状態です。これまで、ガン疲労定義が不十分なまま、患者2で主観的な報告だけに依存しています。したがって、臨床設定3,4で疲労を客観的に特徴付けるため簡単に適応可能な診断検査を識別するために緊急の必要性があります。

疲労5を原因とするミトコンドリアの機能不全を含む複数の基になるメカニズムを提案されています。ミトコンドリアの酸化的リン酸化を介した細胞のエネルギー需要の 95% を提供する発電所器官し、カルシウム シグナル伝達、アポトーシス、免疫シグナル伝達、他は細胞内のシグナル伝達イベント6の規制に重要な役割を果たす.したがって、障害ミトコンドリア生体エネルギーとエネルギー生産の欠陥に貢献するかもしれない疲労。この仮説をサポートするには、以前の研究は、慢性疲労症候群7患者におけるミトコンドリア DNA の変異を観察しています。疲労の病態生理学的起源は、中枢神経系や骨格筋8,9などの末梢組織内であるかどうかは不明のままがない現在を正確に評価する直接法ライブ、respiring 細胞の疲労に関連するミトコンドリアの機能障害。

末梢血単核球 (PBMCs) を使用して、ミトコンドリアの機能を研究するいくつかの利点を提供しています。まず、PBMCs は臨床設定で標準的な瀉血を使用してすぐに利用できる、基本的な実験技術を使用して迅速に分離することができます。第二に、採血は、筋生検等の組織を収集するよりも低侵襲です。したがって、血液サンプルを収集できます同じ患者から繰り返し治療効果の縦断的評価を容易にする時間をかけて。興味深いことに、PBMCs のミトコンドリアの機能は動物モデル10腎ミトコンドリアの状態とよく相関しているように見えた。さらに、免疫細胞のミトコンドリアは異なった病気の条件11,12の下での制度の変更を検出するためのプロキシとして使用されています。循環免疫細胞内のミトコンドリアは、特に免疫機能の変化に敏感と免疫シグナル分子サイトカイン13,14,15などです。たとえば、急性のリウマチ性の炎症性疾患患者から PBMCs が高いベースライン酸素消費量14を示すことが観察されています。対照的に、敗血症16を含む全身の炎症性疾患を持つ患者から分離された PBMCs の酸素消費量が減った。炎症性の条件の下で高い酸化ストレスと炎症17ミトコンドリアの機能不全によって生成されるフリーラジカルを貢献することかもしれないさらに。ミトコンドリア酸化ストレスと同様、エネルギー生産の中心的な役割は、がん患者13で疲労を勉強するためのプロキシとしてミトコンドリアの機能を使用しての潜在的な有用性を示唆しています。

ミトコンドリアの機能を調べる研究活用生化学的手法、ミトコンドリアの膜電位測定、または臨床設定5,に容易に適応できない可能性があります特定の細胞集団の分離14,18。近年、細胞外のフラックスの試金の開発研究者を簡単に許可しているし、正確に呼吸阻害剤19,20の自動注射に対する酸素消費量 (OCR) の変化を調べる,21,22します。 しかし、これらの研究のほとんどは、特定の細胞型の設計されています、高スループット大判を臨床場面に適用できない場合があります。本稿では臨床使用のためのミトコンドリアの機能を検査するための最適化されたプロトコルについて述べる。

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Protocol

(NCT00852111) の現在の研究は、制度レビュー委員会 (IRB) の国立研究所の健康 (NIH)、ベテスダ、メリーランド州で承認されました。参加者が本研究に登録された euthymic 男性 18 歳以上年齢の人は非転移性前立腺がん以前前立腺摘除術の有無と診断され、された外部ビーム放射線療法 (照射線量) を受信する予定します。彼らは大きな疲労を引き起こす可能性のある進行性の病気を持っていた場合、潜在的な参加者が除外された過去 5 年以内に精神疾患があった、あった裸眼甲状腺機能低下症や貧血、または 2 番目の悪性腫瘍があった。非ステロイド系抗炎症剤やステロイド、鎮静剤を使用される方はまた除かれました。健常者の血液サンプルは、IRB 承認プロトコル (NCT00001846) の下で健康なドナーから NIH 輸血科で得られました。すべての参加者は、NIH のマグナソン臨床研究センターで募集しています。研究への参加前に署名された書面によるインフォームド同意が得られました。

1. ミトコンドリア機能測定準備 (実験の 1 日)

  1. センサー カートリッジを水和物 (テーブルの材料のおおよその時間を参照してください: 5 分)。
    1. センサー カートリッジをパッケージから削除します。ユーティリティ プレートの各ウェルに 200 μ L Calibrant ソリューションを追加し、400 μ L Calibrant ソリューションで各堀を埋めます。
    2. センサー プレートを Calibrant のソリューションは、それ今ユーティリティ板に戻ります。非 CO2の 37 ° C の定温器でカートリッジを一晩メタンハイド レートします。
      注: センサー カートリッジは 4 h の最小値と最大 72 h の水和を受ける必要があります。

2. 臨床試料 (実験 2 日目)

  1. 13 項目機能評価の慢性的な病気の治療 - 疲労 (FACIT F)2,23,24 (気管支腔内照射の開始) の前にベースライン、中点、気管支腔内照射、および 1 年間ポスト気管支腔内照射を用いた疲労を測定します。
    1. 0 - を使用して各項目の応答、どこ 0「全然」を表し、4 は、申立人に関連している対応するステートメント「非常にします」を示します 4 スケール。合計スコアは、高疲労強度を反映して低いスコアを持つ範囲 16-53 でなければなりません。
    2. FACIT F スコアがなく臨床的に有意義な疲労2の有無を示す ≥43 の 43 より低い FACIT F スコアとして疲労を定義します。
      注: FACIT F スコア 43 最高の疲労度ががん患者の一般的な人口2で除算します。
    3. FACIT 疲労尺度で以下の 13 項目が含まれます: 1) 私は疲れがある;2) 気が弱い一面。3) 私は脱力感を覚える、(「洗浄」);4) 私は疲れた。5) 問題; 疲れたから始めることがあります。6) 仕上げ; 疲れたから問題があります。7) 私はエネルギーがあります。8) 私は私の通常の活動を行うことができます。9) 私は一日中にスリープする必要10) 私は疲れていたので食べる。11) 私は私の通常の活動をやって助けを必要12) 私のやりたい事をして疲れすぎていてイライラします。13) 私は疲れたため社会的活動を制限する必要があります。
  2. 新鮮血液サンプルから PBMC を分離 (おおよその期間: 1 h)。
    1. 単核細胞調製管に 8 mL の血液を収集 (材料の表を参照してください)。
      注: コレクションの 2 時間以内の血液サンプルに処理されます。血液サンプル サンプル採取後 2 h 以上で処理される場合、PBMCs の質が妥協されることがあります。
    2. 部屋の温度 (18-25 ° C) で 30 分間 1,750 × g で遠心分離機します。曇りの層を 15 mL の円錐管に転送します。最大 15 mL の PBS を追加し、5 回を反転します。
    3. 4 ° C で 15 分間 300 × g で遠心します。慎重に削除し、不穏なペレットなし上澄みを廃棄します。再 10 mL、PBS を追加することでペレットを中断し、5 回を反転します。
    4. 300 x g で 4 ° C で 10 分間遠心上澄み液を破棄し、再 1 mL の PBS のセルを中断します。1.5 mL および microfuge の管に、PBMCs を転送します。
    5. 610 x g で 10 分間遠心します。慎重に上清を除去し、完全な RPMI 1640 でペレットを再懸濁します (10% 添加 RPMI 1640 10 mM ペニシリン/ストレプトマイシン FBS)。
  3. 非付着性のセルのセル板をコート (おおよその時間: 30 分)。
    1. 細胞・組織の接着ソリューションを準備 (材料表参照) 0.1 M 炭酸水素ナトリウム pH 8.0 で原液を希釈することによって。作業ソリューションは、表面積の 3.5 μ g/cm2をする必要があります。
      注: このソリューションには、ムラサキイガイ、イガイから抽出されたポリフェノールのタンパク質が含まれています。これらのタンパク質は、表面に自分自身を固定するムール貝によって分泌される接着剤のキー コンポーネントです。我々 は、セル徳 PBMCs の最高の作品を見つけます。
    2. 各ウェルに希釈した接着剤溶液 100 μ L を追加し、室温で 20 分間インキュベートします。・ ディ ・水と空気で 3 回洗って乾燥。

3. ミトコンドリア機能測定

  1. アッセイ媒体の作製 (おおよその時間: 10 分)。
    注: 分析メディアは、新鮮な実験の日に準備されなければなりません。
    1. L-グルタミン、ピルビン酸、およびブドウ糖メディア (同じ成分ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) が、重炭酸ナトリウム、ブドウ糖、グルタミン、やピルビン酸ナトリウム) をベースにしてアッセイのメディアを追加します。メディアをウォーム アップ 37 ° c、7.4 に pH を調整します。
      メモ: グルコース、ピルビン酸、L-グルタミンの濃度は、通常、通常成長媒体中の濃度と同じが分析に基づいて調整することができます。
  2. 水戸ストレス テストに備えて PBMCs (おおよその時間: 2 時間)。
    1. 80-90% の confluency に到達する各ウェルにステップ 2 から十分な PBMCs をプレートします。我々 の経験では、105細胞/ウェル x 1.5 は、最も一貫性のある結果を得られました。
      注: 井戸 A と H は、背景井戸しかない細胞アッセイ メディアを含める必要があります。井戸 B G、外れ値を考慮するために患者のサンプルあたりの少なくとも 3-6 ウェルズをめっきすることをお勧めします。
    2. 井戸の底に付着する細胞を許可するように 2 分間 200 x g でプレートをスピンダウンします。アッセイのメディアで一度セルを洗浄します。この手順では、血清と炭酸水素ナトリウムが成長媒体から削除します。
      注: 我々 の経験で洗浄のステップ、通常細胞の 20-30% に削除します。
    3. 45-60 分の非 CO2の 37 ° C 定温器で背景井戸 A および h. 加温を含む、各ウェルに 180 μ L 測定メディアを追加します。
  3. 水戸のストレス テストを実行します。
    1. アッセイ メディアで水戸ストレス キットで薬をとおり再構築します。
      1. オリゴマイシン: 50 μ M で原液を生成するバイアルに 252 μ アッセイ メディアを追加します。
      2. FCCP: 50 μ M で原液を生成するバイアルにアッセイ メディアの 288 μ L を追加します。
      3. アンチマイシン A/ロテノン: 25 μ M で原液を生成するバイアルにアッセイ メディアの追加 216 μ L。
    2. 渦は、約 1 分の薬を再構成しました。作業ソリューションに希釈します。
      注: 作業ソリューションの濃度を滴定、細胞の種類に応じて実験前にあらかじめ決められました。PBMCs、我々 は見つけるのオリゴマイシンその 1 μ M、FCCP、1 μ M、0.5 μ M アンチマイシン A/ロテノンは最高の作品します。
    3. センサー カートリッジの各ポートに順番に薬をピペットします。
      1. ポート a: ピペット 20 μ 10 μ M の 1 μ M の各ウェルに最終濃度のオリゴマイシン。
      2. 1 μ M の各ウェルに最終濃度 10 μ M、FCCP のポート b: ピペット 22 μ L。
      3. ポート c: 5 μ M アンチマイシン A のピペット 25 μ L/0.5 μ M の各ウェルに最終濃度のロテノン。
  4. 細胞外フラックス計測器で「水戸ストレス テスト」を選択します。楽器のガイダンスに従うし、センサー カートリッジを挿入します。楽器は、センサーのキャリブレーションを自動的に実行されます。センサーの校正や計測器は、アッセイの残りの部分を終了後、セル板を挿入します。530 での酸素動態を測定 nm (励起)/650 nm (排出), 470 でプロトン濃度の測定と nm (励起)/530 nm (排出) します。

4 ミトコンドリアの機能データの正規化

  1. 細胞増殖試験ソリューションを準備 (おおよその時間: 5 分)。
    1. 11.7 mL PBS に 48 μ 核酸染色 (500 x) および 240 μ L 背景抑制を追加 (2 x)。核酸染色は細胞側の透過物 DNA 結合色素と背景抑制は死んだ細胞や染色されてから整合性が危険にさらされた細胞膜細胞をブロックするマスキング染料。DNA 結合色素と背景サプレッサーの組み合わせにより細胞のみが染色になります。
    2. 水戸のストレス テストが完了した後、各ウェル内の媒体に直接作業ソリューション (180 μ L) x 2 の等量を追加します。
  2. 45-60 分生きているセル (蛍光) 508 でプレート リーダーの数を定量化するための 37 ° C の定温器で細胞増殖アッセイ液の存在下で細胞をインキュベート nm (励起)/527 nm (排出) して OCR データを正規化する (おおよその時間: 10 分).
    注: 数の生きているセルに加えてユーザーことができますセルの合計数、核酸、タンパク質濃度などの量を使用してデータを正規化します。

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Representative Results

水戸のストレス テストは、完全なミトコンドリア プロファイルにマップする様々 な呼吸阻害剤の逐次投与後酸素消費量 (OCR) の測定に依存します。ミトコンドリアの健康に関連する各注入剤は、次のパラメーターを計算する使用ことができます後の OCR 測定:基底 OCRはまず安静時レベルの ATP 需要を満たすために必要な酸素消費量を評価するために任意の薬物投与前に、測定します。基底の呼吸はオリゴマイシン注入前に OCR のベースラインから非ミトコンドリア呼吸率を差し引いて計算されます。次に、ATP のシンターゼ (複雑な V) のプロトン チャネルを阻害するオリゴマイシンを注入します。OCR のオリゴマイシン注射後のそれに続く低下は、 ATP 生産関連の酸素消費量を表します。FCCP (カルボニル シアン 4-[フッ素系低分子] phenylhydrazone)、プロトンの勾配とミトコンドリア膜電位を混乱させるため、イオノフォア最大酸素消費量を引き出すために使用されます。最大呼吸は、FCCP 注射後最大の OCR から非ミトコンドリア呼吸を差し引いて計算されます。呼吸の予備容量は最大と基底の呼吸の違いです。最後に、アンチマイシン (複雑な III 阻害剤) とロテノン (複雑な私阻害剤) 電子輸送鎖を遮断する同時に注入されます。定義では、非ミトコンドリア呼吸は電子輸送鎖 (マクロファージ等の非ミトコンドリア NADPH オキシダーゼなど。) から独立して、アンチマイシン A 後 OCR 値として表される/ロテノン注入。結合効率ATP 合成に使用される基底のミトコンドリアの酸素消費量の割合を説明し、(ATP 生産関連 OCR) x 100% と計算されます/(basal respiration rate)。

各培養条件の細胞密度を最適化して、水戸のストレス テストを実行する前にください。私たちの経験では 80-90% の confluency は 1.5 倍の人間の血液 (図 1A) から新鮮単離 PBMCs の 10 の5細胞/ウェルをめっきによって実現されます。このめっきの密度は、3.2.3 の手順で洗浄のステップを占めています。最適なめっきの密度を決定する、に加えて最大 OCR を生成するために必要な濃度を決定する FCCP 滴定を実行する必要があります。FCCP で濃度のテスト - 0.125 μ M、0.25 μ M、0.5 μ M、1 μ M、2 μ M - OCR FCCP 濃度 1 μ M でプラトーに達することの増加は減少して 2 μ m (図 1B)。これは、1 μ M は PBMC ミトコンドリアの機能を調べるために使用する最適な FCCP 濃度を示します。

PBMC 分離後様々 な時点で健康なドナーから収集した同じ血液サンプルからの細胞の同じバッチのミトコンドリア機能をテストしました。最大 OCR と同様、基底の酸素消費減少 3 h は早くもと PBMC 分離 (図 2A) 後 5 と 8 h で減少が続いています。3 h 後 FCCP 注入 (タイム ポイント 7-9) によって誘発される最大呼吸も生きた細胞でミトコンドリア余裕時間をかけて急速に呼吸能力の低下を示唆している基底の OCR を超えていません。細胞の酸性化率 (ecar と) は、細胞外フラックス計測器で同時に測定しました。オリゴマイシン後 ecar との急激な増加によって示されるようにオリゴマイシンは、ミトコンドリアの ATP 合成酵素を阻害する、ので解糖系を数分のエネルギー需要を満たすために、酸化的リン酸化による ATP の生産の不足を補うために募集していますインジェクション。3 h PBMC 分離後に早くも ecar ととして OCR (図 2B) の減少があった。PBMC 分離後 1、3、5、および 8 h でセル実行可能性の任意の顕著な変化は見られなかった、ミトコンドリア機能低下急速にタイミングがライブ、respiring PBMCs のミトコンドリアのプロファイルをキャプチャするための鍵であることを示唆しています。

様々 な時に別の日に発生する傾向がある患者のサンプル コレクションしたがって、さまざまなサンプルと時点を比較するデータを正規化することが重要です。タンパク質など他の正規化方法を試金し、核酸の定量化を使用可能性がありますほうが DNA 結合色素と各ウェルで緑の蛍光細胞の定量の生細胞を染色、最も効率的かつ信頼性の高い正規化メソッドです。2 つの別の日に 2 つの異なる健康なドナーから収集した PBMCs の代表的なデータは、図 3のとおりです。インセットは総細胞 (位相差) と生きている細胞をよく示すセル板の代表的な画像と汚れる DNA 結合色素 (蛍光グリーン) 水戸ストレス テスト後。各注入剤が細胞は正規化後の酸素消費量と同様、基底の酸素消費速度、2 つ異なる疲労健常者 (図 3) に類似していた。

疲労の主題の代表的なミトコンドリア機能データ (FACIT F スコア < 43) 前立腺癌 (赤) と、年齢/性別/レース-一致非疲労健康なドナー (ブルー) は、図 4に示すが。基底の OCR (図 4B) の違いは見られなかった、展示疲れ件名減少制御 (図 4C, D) と比較して予備の呼吸能力と同様、最大酸素消費量。非ミトコンドリアの酸素消費量 (図 4E) ATP 関連の酸素消費量 (図 4F) の違いがあったので予備の呼吸能力の減少に関連する疲労が登場か結合効率 (図 4G)。(前に任意の薬物注入) ベースライン ・ データおよび最大呼吸のエネルギー表現型プロットは、最寄りの経路 (解糖系 ecar と対の OCR 酸化的リン酸化) を明らかにするを使用して視覚化できます FCCP 注入後増加エネルギー需要 (図 4H)。空の正方形は基底エネルギー表現型を示し、塗りつぶされた四角形を示す最大の ATP 需要に応えてエネルギー表現型。斜面解糖系と酸化的リン酸化の方の携帯電話の好みを示すに対し、基底 (空の四角形) と最大 (四角) 間の距離は予備容量を示します。図 4Hのように、余力低下疲労件名に比べて疲労健康管理。さらに、に対してエネルギー表現型は健常者 (図 4H) に比べて疲労の件名の糖代謝変化に向かって傾斜 ATP 需要を増加しました。

Figure 1
図 1:PBMC メッキ密度、FCCP 用量反応曲線(A)たて分離 PBMCs は 105細胞/ウェル CellTak 被覆細胞培養製ミニプレートの × 1.5 でメッキされました。洗浄後、メディアを変更、セルが 80-90% の confluency に均等に分散します。スケールバー = 100 μ m。(B) OCR は 0.125 μ M、0.25 μ M、0.5 μ M、1 μ m に達するピーク OCR FCCP の濃度の増加とともに増加しました。OCR は立ち寄った 2 μ、1 μ M が PBMCs.Error のバーで最大呼吸を引き出すために最適な投与量は初期の薬剤注入後 3 連続測定の標準偏差を示すを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

Figure 2
図 2:新鮮単離核の時間の経過とともに減少するミトコンドリア呼吸をします。Ecar と(B)と同様に、OCR (A)は PBMC 分離後時間の経過と共に急速に減少しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

Figure 3
図 3:代表的なミトコンドリア呼吸データの正規化と。水戸のストレス テストは、別の日に 2 つの異なる健康なボランティアから分離され、蛍光プレート リーダーの定量化蛍光核酸染色を使用して正規化した新鮮な PBMCs を用いて行われた.挿入: 生きているセル (緑) の代表的な画像と井戸の中 (位相) のセルを合計します。スケール バー = 1,000 μ mこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

Figure 4
図 4:健康な制御と比較して疲労の主題の代表的な分析。年齢/性別/レース-一致非疲労健康コントロールに比較して疲労の主題(A)代表的な水戸ストレス テスト OCR グラフ。基底 OCR (B)(C)、最大呼吸のバー グラフ、予備の呼吸容量(D)、非ミトコンドリアの酸素消費量(E)(F)、ATP の生産と結合効率(G)が表示されます。疲労の件名と健常者のエネルギー表現型プロットには、 (H)が表示されます。空の正方形を示すベースライン エネルギー表現型、塗りつぶされた四角形は、FCCP 注入後測定ストレス エネルギー表現型を表しています。誤差範囲は、各研究参加者 3 さまざまな坑井の標準偏差を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

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Discussion

がん患者における倦怠は、正しく定義されていませんまたは1を特徴と衰弱状態です。疲労の診断は全く主観的な報告に依存している、現在の診断基準や主にその競走2理解の欠如のため、この条件のための治療がないです。がん患者における倦怠の提案されたメカニズム、ミトコンドリアの機能障害が最も治療対象の経路の 1 つ。したがって、積極的に開発が早く疲労を含むがん治療関連毒性のリスクの高い患者を識別するために使用することができます臨床サンプルでミトコンドリアの機能を測定するための迅速かつ実用的な手法を開発しました。管理は提起することができます。

呼吸阻害剤の連続注入との組み合わせで細胞外のフラックス技術ミトコンドリア機能の状態の評価を可能にして両方生体外で使用されているし、体内モデル19, 20,21。仕事の既存のボディを拡大し、臨床サンプルにおけるミトコンドリア機能障害の検討用に最適化手法を開発しました。研究の利点は、コンパクトな細胞フラックス アナライザーの使用率です。実証してきた、実験のタイミング重要です新鮮な PBMCs の分離後ひと血液から。大きいフォーマット (24 ウェルや 96 ウェル フォーマット) は高スループット実験のための理想的な選択が、8 井戸を含む小型細胞フラックス システムは各患者サンプル19の個人別評価できます。このメソッドより実用的かつ費用対効果 (と両方で楽器自体に関して、分析を実行するために使用する試薬のこと) の異なる患者からのサンプル コレクションが別の日にさまざまな場面で発生する傾向があるため。

疲労患者におけるミトコンドリアの機能を評価するために PBMCs の利用はいくつかの利点: 1) 骨格筋などの組織の生検できない実用的な時;2) PBMCs は容易に入手され、簡単に分離できるセル準備チューブを使用して臨床の現場で実用的な利点を提供しています・ 3) 後数時間 (3 時間以上) は、通常、特定の細胞のタイプの特定と新鮮単離細胞文化 3 時間以上されているミトコンドリアの機能を減少させることができた。PBMCs は、ミトコンドリア機能のリアルタイム計測の精度を確保、1 時間以内に用意できます。以前未同定の患者集団で最初の臨床調査の PBMCs を使用してお勧めします、T リンパ球、血小板、好中球、単球など他の細胞型も使用できます現在のプロトコルの最適化後密度と呼吸阻害濃度15,25,26をめっき。

新しいシステムでミトコンドリアの機能をテストする前に、まず最適な細胞密度と FCCP 濃度を判断することが重要です。私たちの経験では 1.5 倍の井戸あたり 10 の5セルをめっきように細胞密度めっきおよび洗浄ステップのまま 80-90% 合流後。さらに、細胞の種類ごとに最適な FCCP 濃度を決定することが重要です。FCCP 範囲濃度をテストする必要があります、セルの健康を損なうことがなく最大の OCR を作り出す FCCP 濃度を使用する必要があります。テスト濃度、FCCP の 1 μ M は PBMCs の最大呼吸で起因しました。もう一つの重要なステップは、険しく PBMC 分離後 3 時間のミトコンドリア呼吸低下として実験のタイミングです。これは臨床サンプルではミトコンドリアの機能を正確にキャプチャする検体採取後 3 時間以内に水戸のストレス テストを実行することを意味します。多くの研究者にのみ凍結試料へのアクセスがあることを指摘して価値があります。我々 は以前、凍結融解後 PBMCs をテストし、これらの細胞のミトコンドリアの機能が大きく侵害されました。したがって、それは実現可能な臨床試験での PBMCs 分離した挽きたてを使用してをお勧めします。

再現性のあるデータを生成する別の重要な側面は、データの正規化の方法です。いくつかの研究所は、ミトコンドリアの呼吸データを正規化する BCA タンパク質定量を使用して成功を収めている、それはできないこと常に低細胞密度で特に見つけます。このプロトコルで記述されている正規化法は、細胞数と染料核酸酸錯体の蛍光性の放出の線形相関に依存し、10 に 50,000 セル27を定量化することができます正確に。さらに、正規化蛍光核酸染色と蛍光プレート リーダーの組み合わせを使用しては、実験終了後生きた細胞の急速な定量化のためことができます。さらに、このメソッドでは、付着性のセルまたはセルのスクレーパーを使用しての trypsinization は必要ありません。

プロトコルの注意点は、我々 は分離しない PBMCs 種類の特定の細胞にミトコンドリアの機能解析を実行する前に。実証してきた、ミトコンドリア呼吸は PBMC 分離後時間の経過と共に急速に減少します。これは通常数時間かかる、患者間違いが異なる細胞集団を切り分けたら、実験を行った場合に正確である可能性示唆します。PBMCs など混合集団を学ぶ重要なセル型に固有の情報を明らかにしません、にもかかわらず PBMCs を用いた実験から得られた情報は特定の細胞のタイプに焦点を当てたガイド将来解明研究を助けることができます。PBMCs はがん疲労10,28など全身性疾患に関連するである全身のミトコンドリア機能障害のためのプロキシとして機能します。現在の原稿で説明されたプロトコルはのみ、観察の原因を特定することがなくミトコンドリア機能障害の粗測定を提供します。したがって、この技術およびプロシージャを使用して結果は慎重に解釈する必要があります、疲労、その他の行動 (例えばうつ病、睡眠、認知障害) と共起などの多因子の性質を考慮する必要があり、条件 (例えば、心肺状態、ポリファーマシー)。将来の研究は、ミトコンドリアの機能 (例えば、ナチュラル キラー細胞、T リンパ球、単球) の特定の細胞型と様々 な臨床人口の変化を調べる必要があります (疲れ/非疲労癌患者など健康コントロール)。がん疲労重症度ミトコンドリア機能不全とミトコンドリアの機能測定と疲労などの物理的なテストとの相関関係を行いますそれは現在原稿の範囲外ですが、徒歩 6 分のテストでは、将来的に調査。さらに、将来の研究は様々 な癌の種類にわたって疲労がミトコンドリア機能障害に関連付けられているかどうかを決定するために他のがんの種類でミトコンドリアの機能不全を調べるもできます。結論としては、臨床試料を用いた一般的なミトコンドリア機能障害の迅速な評価のために最適化されたプロトコルを開発しました。さらに解明研究は、この衰弱状態で特定経路の関与を正確に実行できます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

本研究は、学内研究部門の国立看護学研究所 NIH は、ベテスダ、メリーランド州のによって完全にサポートされます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube  BD Biosciences 362761 For isolating PBMCs following phlebotomy
RPMI-1640  Corning 10-040 For making growth media for PBMCs
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV For making growth media for PBMCs
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher 15140122 For making growth media for PBMCs
Cell-Tak Corning 354240 Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface
Seahorse XF Calibrant Solution Agilent 103059-000 For hydrating cartridges
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) Agilent 103022-100 Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges
XF base media Agilent 103335-100 For making XF assay media
45% cell culture D-(+)-Glucose solution Corning 25-037-CI For making XF assay media
Sodium pyruvate solution Corning  25-000-CI For making XF assay media
L-glutamine solution ThermoFisher 25030081 For making XF assay media
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit Agilent 103010-100 Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay ThermoFisher C35011 For quantification of live cells and data normalization
Seahorse XFp Analyzer Agilent S7802AEA For measuring mitochondrial function in live cells
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) BioTek BTCYT5PV For quantification of live cells and data normalization

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References

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Comments

1 Comment

  1. Dear authors,

    I read this with a lot of interest as I work on PBMC mitochondrial function in neurodegeneration. I use the XFp and get good results but have had trouble with normalisation. I don't feel protein quantification is accurate. As such I've been trying to find a way to quantify DNA. I attempted the standard cyquant kit but on washing the media away I am sure cells are being detached from the cell tak. The direct kit seems to overcome this but I wanted to clarify a couple of things. In the text you say to add an equal volume of cyquant reagent mix (180ul) but you would have 247ul of media at the end of the run after addition of oligomycin, FCCP and rot/aa. Can you clarify how much reagent you added? Also, I would think that if 247ul was added to would overflow the XFp plate wells. You also state that cyquant is linear from 10-50,000 cells but you load 1.5x10^5 per well so do you find the relationship is still linear at such high cell numbers as I have had some problems non-linearity at high cell numbers with picogreen staining?

    Many thanks,

    Philip Campbell
    (MRC Fellow, UCL Queen Square Institute of neurology, London, UK)

    Reply
    Posted by: Philip C.
    October 11, 2018 - 3:20 PM

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