Kwantificeren van de kolonisatie van Vibrio cholerae en diarree in het volwassen Zebrafish Model

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Zebravis zijn een natuurlijke Vibrio cholerae host en kan worden gebruikt om te recapituleren en de studie van de gehele besmettelijke cyclus van kolonisatie tot transmissie. Hier laten we zien hoe V. cholerae kolonisatie niveaus beoordelen en kwantificeren van diarree in zebrafish.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Nag, D., Mitchell, K., Breen, P., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model. J. Vis. Exp. (137), e57767, doi:10.3791/57767 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vibrio cholerae is het best bekend als het infectieuze agens dat ervoor zorgt dat de cholera van ziekten bij de mens. Buiten de menselijke gastheer bestaat V. cholerae hoofdzakelijk in het aquatisch milieu, waar deze met een scala aan hogere aquatische soorten samenwerkt. Gewervelde vis bekend is dat ze een milieu host en een potentiële V. cholerae reservoir in de natuur zijn. Zowel V. cholerae en de teleost vissoorten Danio rerio, kortweg zebrafish, zijn afkomstig uit het Indiase subcontinent, suggereren een langdurige interactie in aquatische milieus. Zebravis zijn een ideale modelorganisme voor het bestuderen van vele aspecten van de biologie, met inbegrip van besmettelijke ziekten. Zebrafish kan worden gemakkelijk en snel gekoloniseerd door V. cholerae na blootstelling in water. Intestinale kolonisatie door V. cholerae leidt tot de productie van diarree en de uitscheiding van gerepliceerde V. cholerae. Deze bacteriën kunnen uitgescheiden dan gaan koloniseren nieuwe vis hosts. Hier, laten we zien hoe te beoordelen V. cholerae-intestinale kolonisatie in zebrafish en hoe te kwantificeren V. cholerae-geïnduceerde zebrafish diarree. De kolonisatie-model moet zinvol zijn voor onderzoekers die studeren of genen van belang belangrijk voor de kolonisatie van de gastheer en/of milieu overleven zijn kunnen. De kwantificering van de zebravis diarree moet zinvol zijn voor onderzoekers bestuderen van een intestinale pathogenen die geïnteresseerd zijn in het verkennen van de zebravis als modelsysteem.

Introduction

Vibrio cholerae is een aquatische, gram-negatieve bacterie, waardoor de cholera van ziekten bij de mens, alsmede de sporadische diarree1,2. V. cholerae wordt gevonden in het milieu in veel gebieden van de wereld, vaak geassocieerd met andere aquatische organismen. Deze associëren organismen bevatten plankton, insecten ei massa's, schelpdieren en vis van de gewervelde soorten3,4,5,6,7. Verschillende studies hebben geïsoleerd V. cholerae uit de intestinale stukken vis in verschillende geografische gebieden7,8,9,10. De aanwezigheid van V. cholerae in vis geeft aan dat de vis als een milieu reservoir optreden kan. Vis kan ook betrokken worden in het overbrengen van de ziekten bij de mens en in de geografische verspreiding van V. cholerae stammen6.

Om beter te begrijpen hoe V. cholerae samenwerkt met vis, werd Danio rerio, beter bekend als zebrafish, ontwikkeld als een modelsysteem voor het bestuderen van V. cholerae11. Zebravis zijn inheems in Zuid-Azië, met inbegrip van de Golf van Bengalen regio, die wordt beschouwd als de vroegste reservoir van V. cholerae. Vóór de eerste cholera pandemie begin in 1817, had niet cholera gemeld buiten wat nu India en Bangladesh. Daarom, zebravis en V. cholerae vrijwel zeker in verband met elkaar over evolutionaire tijdschema's, suggereren dat zebrafish zijn een V. cholerae host in de natuurlijke omgeving12.

De zebravis model voor V. cholerae is eenvoudig uit te voeren en kan worden gebruikt voor het bestuderen van de gehele pathogene V. cholerae levenscyclus. Vissen worden aan V. cholerae door zwemmen in water dat heeft zijn geënt met een bekend aantal V. choleraeblootgesteld. Binnen een paar uur plaatsvindt intestinale kolonisatie, gevolgd door de productie van diarree. Diarree bestaat uit mucin, eiwitten, uitgescheiden bacteriën en andere intestinale inhoud. De mate van diarree kan worden gekwantificeerd aan de hand van een paar eenvoudige metingen13. V. cholerae die heeft zijn uitgescheiden door besmette vis kan vervolgens verder te infecteren naïef vis, completeren de besmettelijke cyclus. Daarom is het model van de zebravis recapituleert de V. cholerae ziekten bij de mens proces12,14.

De meest gebruikte V. cholerae diermodellen geweest historisch muizen en konijnen14,15,16,17,18. Deze modellen hebben bijgedragen in toe te voegen aan onze kennis van V. cholerae pathogenese. Echter omdat muizen en konijnen niet natuurlijke V. cholerae zijn gastheren, er zijn beperkingen aan welke aspecten van de levenscyclus V. cholerae kunnen worden bestudeerd. De kolonisatie V. cholerae van muizen en konijnen vereist normaliter de afwezigheid van intestinale microbiota of een voorbehandeling met antibiotica om schade van de intestinale microbiota. Beide modellen vereisen maagsonde in te voeren van de bacteriën om het spijsverteringskanaal of chirurgische manipulatie om direct het injecteren van de bacteriën in de darmen. Zebravis hebben een voordeel in dat volwassen vis met een intact intestinale microbiota gemakkelijk zijn gekoloniseerd en het besmettelijke proces gebeurt natuurlijk zonder iedere manipulatie vereist.

Het huidige werk demonstreert het gebruik van de zebravis als model in V. cholerae infectie. De infectie, dissectie, opsomming van kolonisatie V. choleraeen de kwantificering van diarree veroorzaakt door V. cholerae zullen beschreven12,,13. Dit model is waarschijnlijk nuttig voor wetenschappers geïnteresseerd in het ziekteproces V. cholerae zowel in de ecologische levensstijl V. cholerae .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Wayne State University. Deze methode werd voor het eerst beschreven in Runft et al. 12

1. bepaling van de niveaus van de intestinale kolonisatie

Opmerking: Intestinale kolonisatie is het nuttigste statistiek in het model van de zebravis als het kan worden gebruikt om de relatieve geschiktheid van verschillende V. cholerae stammen of de gevolgen van mutaties of gene uitsparingen te vergelijken.

  1. Inoculatie van zebravis door onderdompeling
    Opmerking: Dit betekent van blootstelling lijkt op het natuurlijke verloop van de ziekte.
    1. Voorbereiding van V. cholerae
      1. Inoculeer 5 mL van lysogenie Bouillon (LB) met een geïsoleerde V. cholerae kolonie van een LB plaat en het Incubeer bij 37 ° C met schudden (180 rpm) gedurende 6-8 uur ('s nachts cultuur).
      2. Beënt 25 mL vers gesteriliseerde met autoclaaf LB voedingsbodem in een conische kolf van 250 mL met 50 µL van de bovenstaande overnachting cultuur. Incubeer het gedurende 16 tot 18 uur bij 37 ° C met schudden (150 rpm).
      3. Lees de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van een verdunning van 1/10 van de overnachting cultuur te schatten het aantal bacteriën per mL (de OD600 = 1 is ~ 109 CFU/mL.)
      4. Oogsten van de cellen door centrifugeren bij 6.000 g gedurende 10 min. verwijderen de media met een pipet of giet het af in een desinfecterende oplossing. Resuspendeer de cellen in steriel PBS tot de gewenste concentratie, meestal tussen 1 x 10,7 tot en met 1 x 1010 per ml PBS.
        Opmerking: Hier, verwijzen we naar gesteriliseerde met autoclaaf omgekeerde-osmose water met 60 mg/L zee zouten als steriele infectie water.
    2. Inoculatie en incubatie
      1. Plaats vier of vijf zebrafish in een bekerglas van 400 mL met 200 mL steriele infectie water.
      2. Voeg 1 mL van V. cholerae (uit stap 1.1.1.4.) om de gewenste infectie concentratie (meestal 5 x 10,4 tot 5 x 107 CFU/mL) in 200 mL water van de infectie.
      3. Dek het bekerglas af met een geperforeerde deksel om te voorkomen dat de vissen springen; de bovenkant van een doos van 200 µL tip werkt goed voor dit.
      4. Label elk bekerglas en plaats ze in een glas-front incubator ingesteld bij 28 ° C voor de duur van het experiment.
    3. Procedure voor kortstondige blootstelling
      Opmerking: Een kortstondige blootstelling aan V. cholerae (meestal 6 h) gevolgd door het verwijderen van de inoculating bacteriën is handig voor het bestuderen van de overdracht en voor meer nauwkeurige kwantificering van uitgescheiden bacteriën.
      1. Na 6 uur van de blootstelling, uitstorten het bekerglas water door een visnet aan het verzamelen van de vis. Gooi het besmette water in een container van bleekmiddel te doden de V. cholerae.
      2. Plaats de verwijderde vis in een bekerglas van 200 mL steriele infectie water. Laat de vis om te zwemmen in dit schoon water gedurende 5 minuten om de oppervlakte bacteriën van de vis.
      3. Herhaal de netto procedure (stap 1.2.2) en plaats de vis in een nieuw bekerglas van 200 mL steriele infectie water. De vis in deze bekerglas houden voor de duur van het experiment.
  2. Euthanasie
    1. Wanneer het experiment het gewenste eindpunt bereikt heeft, neemt een monster van de infectie water (15 mL is meestal voldoende) te voorzien van uitgescheiden bacteriële graven en het meten van diarree (zoals mucin assay, gehalte aan andere melkeiwitten, en/of OD), indien gewenst (sectie 2).
    2. Giet uit de rest van het water door een fishnet (voor het verzamelen van de vis) in bleekmiddel te doden de V. cholerae in het water.
    3. Plaats de vis in een bekerglas met infectie water plus 336 µg/mL Ethyl 3-aminobenzoaat methanesulfonate (tricaïne) en Incubeer de vis in deze tricaïne oplossing voor 20 min op RT.
      Opmerking: De fishnets werden gesteriliseerd met een 10% bleekwater oplossing.
  3. Dissectie
    1. Voorbereiding van vis
      1. Schep een vis uit de tricaïne oplossing met een disposable plastic lepel en plaats deze op het ontleden oppervlak.
      2. Standpunt de vis met de ventrale zijde naar boven gericht en de PIN-code door middel van de onderkaak, met het botte uiteinde van de pin schuin weg van het midden van het lichaam. Plaats een andere pin gewoon posterieure aan de anus, ook schuin van het lichaam.
    2. Blootstelling van het darmkanaal
      1. Swab het ventrale oppervlak van de vis met een pluisvrije doekje gedoopt in 70% ethanol.
      2. Steriliseren een scalpel en Vannas schaar door dompelen hen in 70% ethanol en flaming hen.
      3. Maken een kleine snede in de buik, net onder de huid in de lengte door doordringing van de schalen en het gebruik van de scalpel. Wees voorzichtig niet te snijden te diep, aangezien het darmkanaal net onder de huid ligt.
      4. Met de schaar, uitbreiden de incisie zorgvuldig langs de lengte van het lichaam, snijden niet dieper dan de huid niveau en het vermijden van de anus.
      5. Bezuinigen twee zijdelingse met de schaar naar het hoofd van de vis om een opening van de incisie.
      6. PIN de huid aan elke kant van de zijdelingse insnijdingen aan de ontleden oppervlakte, vissen de pinnen, afstand van het lichaam.
        Opmerking: De toppen van de pinnen waren eerder gesteriliseerd door flamberen ze met alcohol.
    3. Verwijdering van darmkanaal
      Opmerking: Het darmkanaal moet zichtbaar als een bleke, zeer dunne buis bovenop de andere organen.
      1. Vlam-Steriliseer de pincet en deze vervolgens gebruiken voor het verwijderen van het gehele darmkanaal (meestal 12 tot 15 mm in lengte). Plaats de darm in een buis van de homogenisering met glazen kralen (Zie stappen 1.4.1–1.4.2) en 1 mL 1 x PBS of LB, op ijs.
  4. Homogenisering
    1. Bereiden de homogenisering buizen door gieten ~1.5 g van 1 mm glaskralen in 2 mL schroefdop buizen (vul ze ongeveer halverwege) en ze dan te steriliseren in autoclaaf.
    2. Voeg 1 mL steriele LB of 1 x PBS.
    3. Zodra de zebravis darmen heb toegevoegd (stap 1.3.3.1) de buizen, schroef de doppen op zeer strak, en beveiligt u de buizen in de vortex homogenizer.
    4. Meng de monsters voor 1 min op de maximale instelling, cool ze op het ijs voor 1-2 min. en herhaal vervolgens deze cyclus van homogenisering nogmaals voor een volledige homogenisering.
      Opmerking: Verschillende alternatieve methoden voor homogenisering werkt ook.
  5. Kwantificeren van de intestinale kolonisatie niveaus
    1. Buizen (kleine glazen reageerbuizen of 1,5 mL microcentrifuge buizen) voorbereiden op de seriële verdunning van het homogenaat door 900 µL van LB of 1 x PBS aan elke buis toe te voegen. Voor elke vis, bereiden 5 – 6 buizen en 10-fold seriële verdunningen van de intestinale homogenaat door 100 µL van homogenaat toe te voegen aan de eerste buis, vortexing het te mengen, en vervolgens toe te voegen 100 µL van de eerste buis aan de tweede buis.
    2. Herhaal deze procedure totdat alle verdunningen zijn opgesteld.
    3. Plaat 100-200 µL van elke verdunning op LB agar platen met 100 µg/mL streptomycine (als streptomycine resistente stammen) en 40 µg/mL X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 16 tot 18 h.
    4. Na de overnachting incubatie, tellen V. cholerae kolonies op de platen, met behulp van een geautomatiseerde Kolonieteller of handmatig tellen de kolonies; het is nuttig ter gelegenheid van de getelde kolonies met een marker-tip.
    5. De kve per vis darm bepalen door te vermenigvuldigen met het kiemgetal de verdunningsfactor van de schorsing, rekening houdend met het volume dat was verguld.

2. meting van de vis diarree

Opmerking: Vier verschillende statistieken werden gebruikt om te beoordelen van vis diarree: de niveaus van de mucin in het water, de algemene uitgescheiden eiwitniveaus in het water, de OD600 van het water en de V. cholerae CFU in de water-13. Diarree normaal wordt visueel duidelijk ongeveer 6 uur na de blootstelling van de zebravis aan V. cholerae zoals hierboven beschreven.

  1. Mucin niveaus bepalen
    Opmerking: Mucin afscheiding wordt veroorzaakt tijdens de kolonisatie V. cholerae en is een goede maat van uitscheiding niveaus, vooral vroeg in de infectie13. De bepaling van de mucin is een variatie op de microtiterplaat Periodieke Zure Schiff assay19.
    1. Voorbereiding van de volgende materialen: 50% (m/v) periodieke zuur stockoplossing en 0,1% periodieke zuur werkoplossing (10 µL van de 50% periodieke zuur voorraad toegevoegd aan 5 mL azijnzuur 7% — gebruik onmiddellijk na maken), mucin normen, 96-wells microtiterplaat platen, Schiff reagens.
      1. Mucin normen door schorsing van de volgende bedragen van de mucin (van een varkens maag type III) in een natrium acetaat buffer (100 mM natrium acetaat, 5mM EDTA, pH 5.5 met ijsazijn) bereiden: 400 µg/mL, 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150 µg Mo/mL , 100 µg/mL, 75 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg Mo/mL en 10 µg Fe/mL.
        Voorbereiden van de plaat door toevoeging van 100 µL van infectie water aan elk putje die zal worden gebruikt in de test als volgt: 1 x PBS; leeg mucin normen zoals hierboven beschreven, of een watermonster van de vis-infectie. Doe elk monster in drievoud.
    2. Voeg 50 µL van verse 0,1% periodieke zure oplossing voor elk goed met een meerkanaalspipet en meng het door pipetteren op en neer meerdere malen.
    3. De plaat strak omslag in plastic omslag en het incuberen bij 37 ° C gedurende 1-1,5 uur.
    4. Koel de plaat tot kamertemperatuur voor 5-10 min. Voeg 100 µL van Fuchsine oplossing (Schiff van reagens) voor elk goed, en Pipetteer omhoog en omlaag te mengen.
    5. De plaat omslag in plastic omslag en het uit te broeden bij kamertemperatuur op een rockende platform totdat kleur heeft ontwikkeld; de kleur is over het algemeen ontwikkeld binnen 20 min. Lees de absorptie bij 560 nm met behulp van een afleesapparaat.
    6. Plot een mucin standaard curve (OD560vs. µg/mL mucin standaard). Bepaal de niveaus van de mucin van de onbekenden door te identificeren waar de OD560 van elke onbekende valt op de standaard curve en het lezen van de overeenkomstige concentraties van de mucin voor die waarde.
  2. Eiwitniveaus bepalen
    Opmerking: Naast mucin, algemene eiwitniveaus in het water zijn andere zaakgelastigde voor de niveaus van diarree (bewolkt, vloeibare ontlasting) geproduceerd door de vis. Deze procedure wordt een standaard analyse van Bradford gebruikt om te schatten eiwitniveaus. Eiwitniveaus worden geschat op basis van een standaard curve bovien serumalbumine (BSA).
    1. Meng 100 µL van een van de BSA-normen (zie hieronder nota) of 100 µL van infectie water (water uit het bekerglas van de besmette vis) met 900 µL van Bradford assay reagens (de Pierce eiwitreagens assay werkt goed voor dit) in een wegwerp cuvette. Incubeer alle monsters bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
      Opmerking: De volgende BSA normen werden gebruikt: 1800 µg/mL, 1000 µg Mn/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 50 µg/mL, en 25 µg Mo/mL. De BSA normen waren verdund in gesteriliseerde met autoclaaf gedestilleerd water.
    2. Lees de OD660 van elke standaard of proeven ze met behulp van een spectrofotometer.
    3. Uitzetten van de BSA standaard curve (OD660vs. µg/mL). De eiwitniveaus voor de onbekenden door te identificeren waar de OD660 van elke onbekende valt op de BSA standaard curve en lees de bijbehorende mucin concentratie voor die waarde te bepalen.
  3. Maatregel OD600
    Opmerking: De aanwezigheid van diarree (bewolkt, vloeibare ontlasting) blijkt zichtbaar nadat verschillende h en een eenvoudige OD600 bepaling kunnen worden gebruikt om dit te kwantificeren.
    1. Omkeren van de buis met de infectie water meerdere malen gelijkmatig verdelen de inhoud. 1 mL van het watermonster toevoegen aan een wegwerp cuvette. 1 mL steriele infectie water gebruiken als de negatieve controle.
    2. Uitvoeren van een "lege" meting met behulp van de spectrofotometer bij 600 nm met behulp van het voorbeeld van de negatieve controle. Lees elke watermonster op 600 nm en record de resultaten.
  4. Bepaling van uitgescheiden V. cholerae CFU/mL na infectie
    Opmerking: Een belangrijk onderdeel van de diarree geproduceerd door de zebravis wordt uitgescheiden V. cholerae. De bepaling van de CFU/mL kan worden gebruikt voor doeleinden zoals het schatten van de bacteriële replicatie in het darmkanaal van de vis en als een maatregel van een infectieuze dosis in transmissie-experimenten. Deze maatregel is het beste gebeuren wanneer een voorbijgaande infectie heeft plaatsgevonden. Als een infectie van de 24 h wordt gebruikt, dan meet deze test de gecombineerde entmateriaal plus de uitgescheiden V. cholerae.
    1. Neem een watermonster op het gewenste tijdstip en serieel Verdun het, zoals eerder is beschreven.
    2. Plaat van de seriële verdunningen op selectieve media (LB agar bevattende streptomycine of een andere geschikte antibioticum of DCL's) en ze uit te broeden bij 30 ° C gedurende 24 uur.
    3. De kolonies te tellen. Bereken de kve per mL water zoals beschreven in stap 1.5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

V. cholerae kolonisatie van zebravis intestinale traktaten

Om een voorbeeld van de niveaus van de typische kolonisatie die we observeren, geënt wij 5 x 106 CFU van de pandemische EL Tor V. cholerae stam N16961 in 200 mL water in een bekerglas van verschillende zebrafish. Na 6 h van besmetting, waren de vissen in zoet water gewassen en overgebracht in een bekerglas van 200 mL gesteriliseerde met autoclaaf infectie water zoals beschreven in het protocol. 18 h na de transfer (of 24 h na de primaire infectie), de vissen waren euthanized, en hun darmen werden genomen om te bepalen van de kolonisatie-niveaus. Ongeveer 105 tot 106 V. cholerae cellen per vis darm werden meestal waargenomen in het darmkanaal 24u na infectie (hpi) (Figuur 1) met de 5 x 106 entmateriaal grootte.

Kwantificering van vis diarree

Diarree is gekwantificeerd aan de hand van de vier eenvoudige testen hierboven beschreven. De eerste bepaling, de CFU van uitgescheiden V. cholerae, is afgebeeld in Figuur 1. Seriële verdunningen van het water 24 hpi waren om te tellen de V. cholerae CFU verguld. Relatief hoge niveaus van uitgescheiden V. cholerae zijn meestal waargenomen; in dit voorbeeld, ongeveer 105 V. cholerae per mL water werden ontdekt. Niet-geïnfecteerde vis produceren geen waarneembare V. cholerae (gegevens niet worden weergegeven).

De tweede test bij de berekening van diarree is uitgescheiden mucin. Figuur 2 toont de gevolgen van drie verschillende V. cholerae infectieuze doses op de niveaus van de mucin in water 24 hpi. Een hogere infectieuze dosis is gecorreleerd met een hogere uitscheiding van mucin in het water. Als een besturingselement, vier vissen werden geplaatst in een identieke bekerglas van water, maar PBS is toegevoegd in plaats van de suspensie V. cholerae . De controle-vis uitgescheiden weinig mucin.

De derde diarree kwantificering bepaling is de OD-600 voor het water 24 hpi. Zoals blijkt uit Figuur 3, lag de OD600 van dit water in het bekerglas van de zebravis besmet met V. cholerae dan in het bekerglas van niet geïnfecteerde zebrafish beduidend hoger.

Tot slot, de totale proteïne niveaus werden gemeten in het water. Water met de besmette vis bevatte totale eiwitniveaus bijna tweemaal die is waargenomen in het water met de niet-geïnfecteerde vis (Figuur 4). Collectief, illustreren deze vier tests de effecten V. cholerae infectie op de zebravis uitscheiding heeft.

Figure 1
Figuur 1: Intestinale kolonisatie van zebravis door V. cholerae. De vissen waren besmet voor 6 h, dan gewassen en een totaal van 24 uur ge¨ uncubeerd. De linkerkant van de figuur illustreert de totale kve per darm van vier vissen (zwarte puntjes). De rechterkant van de figuur geeft de V. cholerae CFU / mL gemeten in water 24 hpi (zwarte vierkantjes.) De middelen van beide gegevensverzamelingen worden weergegeven met een grote horizontale lijn en de standaardafwijking worden aangeduid met foutbalken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Mucin assay. Drie verschillende V. cholerae infectieuze doses werden gebruikt, samen met een niet-geïnfecteerde controle, zoals aangegeven onder de x-as. De gemiddelde waarden van de mucin gedetecteerd in het water door de gewijzigde Periodieke Zure Schiff (BK) assay worden aangeduid met de zwarte balken boven elke infectieuze dosis. De foutbalken geven de standaarddeviatie. De sterretjes geven p < 0.05 zoals bepaald door de Student t-test de ongepaarde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: OD600 assay als een proxy voor diarree. De OD-600 1 ml water uit de bekerglazen met beide V. cholerae besmet of niet geïnfecteerde vis werd gemeten. De zwarte balken geven de gemiddelde waarde en de foutbalken geven de standaarddeviatie. De sterretjes geven p < 0.05 zoals bepaald door de Student t-test de ongepaarde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Total eiwitniveaus in water. De totale proteïne werd geschat door een analyse van Bradford zoals beschreven. De zwarte balken geven de gemiddelde waarden en de foutbalken geven de standaarddeviatie. De sterretjes geven p < 0.05 zoals bepaald door de Student t-test de ongepaarde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De zebravis is een relatief nieuw model voor het bestuderen van V. cholerae maar houdt veel belofte voor de toekomstige ontdekking van voorheen onbekende aspecten van V. cholerae biologie en pathogenese11,12,13 . De volwassen zebrafish model heeft de voordelen van beide een natuurlijke V. cholerae host die intact, volwassen intestinale microbiota en een milieu-model bevat. Nadelen van het model zijn dat de twee grote menselijke virulentiefactoren, cholera-toxine en toxine-coregulated pilus, zijn niet vereist voor zebrafish kolonisatie of pathogenese12. Echter dit kan als alternatief worden gezien als een ander voordeel, waardoor de identificatie van nieuwe V. cholerae kolonisatie factoren en de studie van andere toxinen V. cholerae te vergemakkelijken. Dit is vooral relevant voor de overgrote meerderheid van de niet-O1/O139 "milieu" V. cholerae stammen, waarvan de meeste doen niet produceren cholera-toxine of toxine-coregulated pilus en nog kan nog steeds leiden tot ziekte20,21.

De meest waarschijnlijke ontstaan met behulp van dit model problemen zijn gerelateerd aan de overvloedige intestinale microbiota. Plating op opvangfaciliteiten media maakt dit model in wezen onbruikbaar als het onmogelijk zijn zal te identificeren van de kolonies V. cholerae . Zelfs met behulp van selectieve of gedeeltelijk selectieve media zoals LB plus streptomycine of DCL's, zal een achtergrond van kolonies van intestinale microbiota aanwezig zijn. Het is essentieel om te verifiëren dat de koloniën die wordt geteld bonafide V. cholerae zijn door het patchen van de kolonies geproduceerd door de beplating op minder selectieve media op een zeer selectief medium zoals TCBS. Anderzijds zou het inbrengen van een beter selectieve markering in het genoom van een stam van belang sterk vereenvoudigen de identificatie van V. cholerae van intestinale homogenates.

Het voordeel van de tests bij de berekening van de zebravis diarree is dat ze zijn eenvoudig en goedkoop uit te voeren van13. Het nadeel is dat deze onderzoeken grotendeels niet-specifieke zijn, afgezien van tellen uitgescheiden V. cholerae CFU direct, en het kan moeilijk zijn om te bepalen als de diarree rechtstreeks te wijten aan V. cholerae pathogenese, of sommige andere stressor is geworden . De ontwikkeling van variaties van deze of andere tests te verbeteren hun specificiteit zal waarschijnlijk steun voortaan metingen van V. cholerae pathogenese in zebrafish.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dankzij het Melody Neely, Jon Allen, Basel Abuaita en Donna Runft voor hun inspanningen bij het ontwikkelen van de zebravis model. Het onderzoek hier gemeld werd gesteund door de National Institute of Allergy and Infectious Diseases van de National Institutes of Health onder award nummers R21AI095520 en R01AI127390 (voor Jeffrey H. Withey). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instrument
Shaker incubator New Brunswick Scientific, Edison, NJ Excella E25
Incubator NUAIRE, Plymouth, MN Auto Flow
Spectrophotometer Thermo, Waltham, MA Geaesys 6
Vortex homogenizer Minibeadbeater24 112011
Weighing Machine Ohaus, Columbia, MD Adventurer Pro
Heat Stirer Corning, Corning, NY PC-420D
Burner
automated colony counter REVSCI 120417B
Materials
400 ml glass beakers Pyrex
perforated lids Microtip holder with holes from tip box
disposable plastic spoons Office Depot, Boca Raton, FL D15-25-7008
Fish Tank System Aquaneering, San Diego, CA
RO Water Purifier Aqua FX TK001
Fish net Marina
fish food Tetra fin
Brine Shrimp Red jungle brand O.S.I. pro 80
Styrofoam board
Pins
Scalpels Fine Scientific tools, Foster City, CA 10000-10
Forceps Fine Scientific tools, Foster City, CA 11223-20
Vannas scissors Fine Scientific tools, Foster City, CA 15000-11
2 ml screw cap tubes Fisher Scientific, Hampton, NH 02-681-375
1 mm glass beads Bio Spec 11079110
Glass beads for spreading Sigma, St. Louis, MO 18406-500G
Petri plate Fisher Brand, Hampton, NH FB0875713
1.5 ml centrifuge tube Midsci, Valley Park, MO AVSS1700
50 ml centrifuge tube Corning Falcon, Corning, NY 352098
Test tubes Pyrex 9820
Glass Pipette Fisher Brand, Hampton, NH 13675K
Micro pipettes Sartorius Biohit, Göttingen, Germany m1000/m200/m20
Tips Genesee Scientific, San Diego, CA 24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered saline VWR Life Science, Radnor, PA K813-500ml
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma, St. Louis, MO A5040
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Sigma, St. Louis, MO 10651745001
Schiff’s reagent Sigma, St. Louis, MO 84655-250 mL
periodic acid Fisher Scientific, Hampton, NH 10450-60-9
Mucin from porcine stomach Sigma, St. Louis, MO M2378-100G
Bovine serum albumin Fisher Scientific, Hampton, NH 9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay Reagent Thermo, Waltham, MA 22660
LB medium
Trypton BD Biosciences, San Jose, CA 211705
Teast Extract BD Biosciences, San Jose, CA 212750
NACL Fisher Scientific, Hampton, NH BP358-212
Agar BD Biosciences, San Jose, CA 214010
TCBS Agar BD Biosciences, San Jose, CA 265020
DCLS Agar Sigma, St. Louis, MO 70135-500gm
Software
Microsoft office
Prism 5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379, (9835), 2466-2476 (2012).
  2. Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19, (3), 464-467 (2013).
  3. Huq, A., et al. Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods. Applied and Environmental Microbiology. 45, (1), 275-283 (1983).
  4. Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population. Microbial Ecology. 53, (2), 285-293 (2007).
  5. Broza, M., Halpern, M. Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae. Nature. 412, (6842), 40 (2001).
  6. Halpern, M., Izhaki, I. Fish as hosts of Vibrio cholerae. Frontiers in Microbiology. 8, (282), (2017).
  7. Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae. PLoS ONE. 5, (1), e8607 (2010).
  8. Traore, O., et al. Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso. The Journal of Infection in Developing Countries. 8, (10), 1334-1338 (2014).
  9. Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank. Journal of Infection. 20, (1), 55-57 (1990).
  10. Torres-Vitela, M. A., et al. Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico. Journal of Food Protection. 60, (3), 237-241 (1997).
  11. Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens. Developmental & Comparative Immunology. 46, (1), 96-107 (2014).
  12. Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80, (5), 1710-1717 (2014).
  13. Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. (2017).
  14. Klose, K. E. The suckling mouse model of cholera. Trends in Microbiology. 8, (4), 189-191 (2000).
  15. Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn,, Sprinz, H. Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine. British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).
  16. Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment. The Journal of Infectious Diseases. 120, (6), 645-651 (1969).
  17. Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea. Infection and Immunity. 32, (2), 739-747 (1981).
  18. Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits. mBio. 1, (1), (2010).
  19. Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. Periodic acid-Schiff's reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format. Analytical Biochemistry. 416, (1), 18-26 (2011).
  20. Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India. Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).
  21. Hasan, N. A., et al. Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast. Journal of Clinical Microbiology. 53, (1), 9-14 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics