단일 셀 정량 mRNA와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 CD4에 표면 단백질 표정+ T 세포 격리에서 붉은 털 원숭이

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

설명한 quantitate 96 유전자의 표현 하는 방법론 이며 단일 셀 전 비보, 차동의 식별을 위해 허용 하 여 18 표면 단백질 유전자와 감염 되지 않은 세포에 상대적으로 바이러스에 감염 된 세포에 있는 단백질을 표현. 우리는 접근 연구 SIV에 감염 된 CD4+ T 적용 붉은 털 원숭이에서 분리 하는 세포.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tokarev, A., Creegan, M., Eller, M. A., Roederer, M., Bolton, D. L. Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques. J. Vis. Exp. (139), e57776, doi:10.3791/57776 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

단일 세포 분석은 세포의 이종 인구를 해 부하는 중요 한 도구 이다. 식별 및 희귀 세포의 격리 어려울 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 방법론 결합 인덱스 cytometry 고 높은 처리량 다중화 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 개발 되었다. 목표를 식별 하 여 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV)의 특성은-붉은 털 원숭이 내의 세포를 감염. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)에 의해 표면 단백질의 정량에 의해 mRNA 정량를 통해 바이러스에 감염 된 세포는 다차원 프로필을 만들 호스트 유전자와 단백질 측정 함께 바이러스 성 유전자 발현에 의해 식별 됩니다. . 우리 용어 접근, 타겟된 단일 셀 Proteo transcriptional 평가, 또는 tSCEPTRE. 메서드를 수행 하기 위해 실행 가능한 세포 표면 마커 FACS 절연 셀 집합 또는 다운스트림 phenotypic 분석의 사용에 대 한 특정 형광 항 체와 스테인드는. 단일 셀 뒤에 즉시 세포, 다중 반전 녹음 방송 (실시간), PCR 사전 확대, 및 최대 96 성적 높은 처리량 정량 정렬 됩니다. FACS 측정 정렬의 시간에서 기록 하 고 이후 transcriptional 프로필 및 결합된 단백질을 만드는 좋은 위치에 의해 유전자 표현 데이터에 연결 됩니다. SIV에 감염 연구를 직접 ex vivo세포, 세포는 여러 바이러스 RNA의 정량 검출에 의해 확인 되었다. 바이러스 성 성적표의 조합과 각 양의 바이러스 성 수명 주기 (예를 들어, 비 생산적 대 생산)의 단계로으로 세포를 분류 하기 위한 프레임 워크를 제공 합니다. 또한, SIV+ 세포의 tSCEPTRE 감염에 비해 셀 차동 표현된 호스트 유전자와 단백질을 평가 하기 위해 동일한 견본에서 고립 되었다. 분석 감염 된 세포 뿐만 아니라 vivo에서 단일 셀 해상도 post-transcriptional 유전자 SIV 중재 규정 중 이전 진가 바이러스 성 RNA 식이 밝혔다. TSCEPTRE 메서드는 의무가 표면 단백질 marker(s), 호스트 또는 병원 체 gene(s), 또는 그것으로 조합 식으로 식별 된 셀 인구의 분석입니다.

Introduction

종종 호스트 세포 생물학 변경 또는 전파의 그들의 기회를 극대화 하기 위해 호스트 세포의 매우 구체적인 부분 모집단을 대상으로 많은 세포내 병원 체 복제 호스트 셀 기계에 의존 합니다. 그 결과, 세포 생물학 프로세스는 일반적으로 중단, 호스트의 전반적인 건강에 해로운 결과. 바이러스 및 그들은 복제 하는 있는 호스트 세포 사이 상호 작용 이해 감염을 방지 하기 위해 향상 된 치료 및 전략의 개발에 도움이 있습니다 질병 메커니즘 명료 하 게 됩니다. 호스트 병원 체 상호 작용의 연구를 직접 분석 도구는이 필수적입니다. 단일 세포 분석은 명확 하 게 특정 유전자 형 또는 감염 상태1세포 표현 형을 특성에 유일한 수단을 제공 합니다. 예를 들어 병원 성 감염 자주 호스트 세포에서 둘 다 직접 및 간접 변화 유도. 따라서, 구별 그들의 감염에서 감염 된 세포는 직접 감염 또는 보조 효과 특성 호스트 셀 변경 하는 데 필요한 같은 일반화 된 염증. 또한, 많은 병원 체, SIV와 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 같은 일찍, 늦게, 호스트 세포 감염 같은 여러 단계를 통해 진행 또는 숨겨진, 각각의 특징 수 있습니다 고유한 유전자와 단백질 표정 단면도2 , 3 , 4 , 5. 세포 혼합물의 대량 분석이이6을 잡으려고 실패 합니다. 대조적으로, 매우 둘 다 바이러스의 식 계량 수 단일 세포 분석 다중화 하 고 감염 관련 세포 섭, 감염 단계에 걸쳐 변화를 포함 하 여 해결 하는 수단을 제공 하는 호스트 유전자. 또한, 순수에 호스트 병원 체 상호 작용 분석 관련 설정을 감염 된 유기 체에서 발생 하는 이벤트의 식별을 위해 중요 합니다. 따라서, vivo ex vivo에서 최고의 가능성이 캡처는 직접 적용할 수 있는 방법을 처리 합니다.

SIV와 HIV CD4 대상+ T는 그들이 중화 호스트 항 바이러스 "제한" 요소와 downregulate 항 원 제시 하는 생산적인 감염 고 방지 면역 감시7,8, 분자 세포 9,,1011. 치료를 하지 않으면 감염 c d 4의 대규모 손실에 결과+ T 세포, 궁극적으로에 culminating 획득 면역 결핍 증후군 (에이즈)12. 투여 요법의 설정에서 latently 감염된 세포 저수지 치료 전략에 강한 장벽 포즈, 수십 년 동안 지속. Vivo에서 HIV/SIV에 감염 된 세포의 속성을 이해 pathogenesis 및 지 속성에 호스트 세포 기능을 가능성이 있다. 그러나, 이것은 매우 도전, 감염 된 세포의 low frequency 그리고 그들을 쉽게 식별할 수 시 약의 부족 때문에 주로. 바이러스 성 RNA 녹음 셀 0.01-1에 있기 위하여 견적 된다 CD4의 %+ T 세포가 혈액과 림프 조직13,,1415에. 진압 치료에서 latently 감염 된 세포는 10-3– 10-7- 16,,1718도 덜 자주. 체 외에 감염, 같은 세포내 개 그 공부 잘 작동 배경 0.01-0.1의 얼룩 때문에 차선은 분석 실험 바이러스 성 단백질 얼룩 %, 감염 된 세포13의 주파수 보다 작거나 비슷합니다 14. 잘 특징이 SIV/에이즈 환경을 특정 단일 클론 항 체를 사용 하 여 환경 단백질에 대 한 표면 얼룩 또한 입증 되었다 어려울, 아마 유사한 이유를 위해. 최근, 새로운 도구 중 개 그를 표현 하는 세포의 탐지를 향상을 목표로 통합 개 그 RNA 또는 대체 이미징 기술14,,1519를 사용 하 여 특정 분석 실험. 그러나, 이러한 접근 제한 남아 양적 측정 수에서 각 셀에서 수행.

여기, 우리 (1) 직접 비보 전 과민 하 고 특정 바이러스 성 유전자 정량 정량 및 (2) 각 감염에 대 한 최대 18 표면 단백질 및 96 유전자의 식을 단정 단일 바이러스에 감염 된 세포를 식별 하는 방법 설명 (그리고 감염 되지 않은) 셀입니다. 이 방법론은 FACS 즉시 세포 세포의 용 해에 의해 다음에 의해 단일 세포 표면 단백질 측정 그리고 Biomark 시스템에 대상으로 정량 멀티플렉스 유전자 표정 분석 사용 하 여. 통합된 유체 회로 (IFC) 기술 수 있습니다 96 샘플에서 96 유전자의 멀티플렉스 정량을 동시에 개별 정량 Pcr 반응을 수행 됩니다 9,216 챔버의 매트릭스에 의해 수행. 즉시 수행 분석에 대 한 전체 transcriptome 보존 하는 동안이 콘텐츠 단백질 풍부한 측정 기록 라이브 셀 FACS 정렬 다운스트림. 바이러스에 감염 된 세포를 식별, 양자 택일로 접합 하 고 unspliced 바이러스 성 RNAs (vRNA)에 대 한 분석 실험 관련 최대 96 유전자, 현재에 수용 하는 분석 실험의 최대 수를 총 사용자 정의 분석 실험의 패널 함께 정량 분석에 포함 IFC입니다. 유전자 발현 및 단백질 정보 각 셀에 대 한 좋은 위치에 의해 연결 됩니다. 우리는 이전20이 분석을 다른 곳에서 결과 보고 했다. 여기, 우리는 자세한 SIV에 감염 된 CD4의 추가 설명 형질으로 서 방법론 지침 제공+ T 세포.

우리 tSCEPTRE 기간,이 접근의 어떤 가능한 셀 붙일 레이블된 항 체를 표현 transcriptome 호환 가능한 정량 분석 실험 반응 정지에 적용할 수 있습니다. 예를 들어 그것은 차동 유전자와 단백질 표정 희귀 세포 또는 세포 표면 단백질 마커에 의해 쉽게 구별 특성화에 대 한 사용할 수 있습니다. 샘플 준비는 상업적으로 사용할 수 있는 항 체를 사용 하는 프로토콜을 얼룩이 지는 표준에 의존 합니다. 단일 셀 정렬 기능 Cytometers 또한 상업적으로 사용할 수 있습니다, 하지만 추가 biosafety 예방 감염 라이브 셀을 처리 하는 데 필요한. 여기 라고 잘 위치 하 여 각 셀에 대 한 단일-셀 단백질 식 프로필 기록 분류, 색인으로 정렬 소프트웨어 상용 FACS의 일반적인 기능입니다. 관심의 셀 인구 가운데 차동 표현된 호스트 유전자의 전산 분석, 설명 되지 않은 하지만 참조는 이전에 게시 방법에 제공 됩니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

참고: 프로토콜 워크플로의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 그것은 세 가지 주요 단계로 구성 됩니다: FACS, RT 및 cDNA 사전 증폭, 및 최대 96 유전자에 대 한 정량 동시에. 프로토콜, 희석을 제한 하 고 단일 셀 정렬 셀 정렬의 두 가지 버전 5 단계 및 6 단계에서 자세히 각각 설명 되어 있습니다. 이러한 전략 다른 연구 질문 하지만 유사한 절차.

1. 필수 또는 이전 분석

  1. 앞에서 설명한6으로 사용할 모든 유전자 표현 분석을 확인 합니다.
    참고:이 단계는 실험 날짜 임박 이루어집니다. 모든 분석을 확인, 상업 및 사용자 정의 단일 셀 수준까지 관련 RNA의 효율적이 고 선형 증폭을 보장 하는 데 필요한입니다. 많은 상업적으로 사용 가능 하 고 사용자 정의 분석 이러한 사양을 충족 하지. 추가 코딩 파일 1-5, 처리 및 최대 96 유전자의 분석 실험 식의 동시 자격에 대 한 자동화 곡선 맞춤 제공 됩니다 하지만 개별 분석 실험은 R2 와 선형 적합의 기울기를 사용 하 여 한정할 수 있습니다. 대표적인 성공 및 실패 분석 결과 자격 플롯은 그림 2에 표시 됩니다.
  2. 항 체의 세포 표면 마커 얼룩의 흐름 cytometric 패널을 개발 합니다.
    1. 각 항 체와 항 체 관련 샘플, 예를 들어 붉은 털 주변 혈액 단 세포 (PBMCs), 얼룩에 의해 적정. 100 µ L에서 테스트 당 항 체의 20 µ L로 시작 반응 얼룩이 지 고 8 개의 두 배 직렬 희석을 만들. 부정적이 고 긍정적인 인구 사이 명확한 분리를 유지 하면서 강도 얼룩 최대 전시 최적 농도 식별 합니다.
    2. 평가 단계 1.2.1에서 최적의 농도에서 모든 항 체의 혼합물을 사용 하 여 추가 셀 sample(s)에 결합 된 얼룩. 얼룩이 지는 개별 항 체 얼룩에 대 한 관찰과 비슷한 인지 확인 합니다. 얼룩 때 어떤 항 체 분리에 사용 된 관찰은 무엇 보다 작은 경우, 대체 형광 색소 변화 같은 항 체를 대체 하는 것이 좋습니다.

2. 진 식 시험 준비

  1. 1-15 mL 튜브에는 RNase/DNase-무료 분석 실험 결합 96 유전자 발현 (크기는 정렬 번호판의 번호와 다를 수 있습니다). 이 연구에 사용 된 분석 실험의 패널은 표 1 표 2에 지정 됩니다. 결과 자료를 "분석 결과 믹스" 라고 합니다. 각 분석 결과 180의 최종 농도에 추가 정방향 및 역방향 뇌관의 nM. DNA 분석 결과 혼합의 적절 한 희석을 달성 하기 위해 서 스 펜 션 버퍼를 추가 합니다.
    참고: 실용적인 목적을 위해 사용자 정의 (사용자 생성) 분석 결과 주식 수 있습니다 준비 18 µ M 상용 "20 x" 진 식 정량 분석 (자료 테이블)의 농도와 일치 하도록. 각 유전자에 대 한 사용자 정의 앞으로 역 뇌관의 18 µ M 믹스 DNA 정지 버퍼 재고 솔루션에서 만들어집니다. 상업적으로 이용 가능한 분석 (자료 테이블) 프로브 포함 하지만 프로브 RT 또는 cDNA 사전 증폭 및 수 필요 하지 않습니다. 따라서 사용자 정의 분석 실험에 대 한 생략. 하나를 포함 하는 것이 좋습니다 또는 정렬, 셀 복구 및 cDNA 합성의 효율성을 평가 하기 위한 품질 관리에 대 한 더 많은 내부 관리 유전자 사용. CDNA를 생성 하기 위해 임의의 뇌관의 사용 결정 되지 않았습니다, 하지만 유전자 특정 뇌관 보다 덜 효율적일 것으로 예상 된다.
  2. 분석 결과 판 x 2 단계 7.1 (다중 정량)에 사용 하기 위해 준비. 예상 각 96 x 96 칩 배열, 96-잘 PCR 접시의 지정 각 각 분석 결과의 6 µ L 플라스틱. 예를 들어 5 칩, 각 분석 결과의 30 µ L 96 잘 접시에 단일 잘을 차지할 것입니다. 96 분석 실험을 사용 하 여, 96 잘 접시의 각 잘 분석 결과 포함 됩니다. 접착제 인감과 접시를 봉인.
    참고: 이상적으로, 단계 2.1과 2.2 수행 됩니다, 동시에 유전자 표현 분석에 대 한 여러 freeze-thaw 주기를 피하기 위해. 분석 결과 배지 내의 모든 유전자도 되어 있어야 분석 결과 믹스 (2.1 단계)에. 분석 결과 믹스와 분석 결과 플레이트 모두 저장할 수 있습니다 장기 또는 단기적인 사용, 4 ° C 또는-20 ° C에 각각.

3. 표면 얼룩 가능한 셀

참고: 세포내 얼룩, permeabilization, 및 고정 호환 되지 않습니다이 방법으로 그들은 RNA 타협.

  1. 셀 얼룩을 위해 사용 하는 것 2.5-fold 높은 농도에서 보상 구슬의 40 µ L에 재료의 테이블에 에서 나열 된 각 항 체를 추가 하 여 보상 샘플을 준비 합니다. 빛에서 보호 하는 25 ° C에서 20 분 동안 품 어. 구슬 및 25 ° c.에 3 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기에 PBS의 3 mL를 추가 PBS를 발음 하 고 ~ 300 µ L의 PBS에 구슬 resuspend.
  2. 흐름 cytometric 셀 정렬 샘플 처리에 대 한 준비: 보상 튜브 확보, 보상 행렬, 만들고 실험 표본에 대 한 수집 파일에 행렬을 적용.
  3. 테이블의 재료, 스테인드 될 모든 샘플에 대 한 호박 1.5 mL 튜브에 지정 된 대로 각 항 체의 적절 한 볼륨을 결합 하 여 형광 항 체 칵테일의 마스터 믹스를 준비 합니다. 소용돌이 원심 분리기 21000 x g 작은 항 체를 25 ° C에서 2 분 동안에 칵테일 집계 합니다.
    참고: 여기에 사용 되는 항 체 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.
  4. 12 mL PBS의 15 mL 튜브, 25 ° c, 3 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기에 세포 현 탁 액의 2 분 추가 0.5-2 mL에 대 한 37 ° C 물 욕조에 cryopreserved 세포를 해 동 하 고 PBS 발음. 3 ml PBS와 5 mL 폴리스 티 렌 튜브에 resuspend. 위와 같이 원심 고 ~ 20 µ L 잔여 PBS를 떠나 PBS 발음.
    참고: 착 온도 따뜻한 또는 추운 온도에 따라 조건 얼룩 (단계 1.2 참조) 항 체 적정을 수정 하 여 특정 응용 프로그램에 대 한 필요에 따라 적응 수 있습니다.
  5. Resuspend 2 x 10까지7 칵테일 항 체의 80 µ L에서 세포를 씻어 하 고 빛 으로부터 보호 하는 25 ° C에서 20 분 동안 품 어. 샘플 2 x 107 셀을 초과 증가 착 반응 볼륨 따라 유지 위해 < 2 x 107 셀/100 µ L.
  6. PBS의 3 mL를 추가 하 여 셀을 씻어 3 분, 500 x g 에서 centrifuging와 발음은 상쾌한.
  7. 철저 하 게 35 µ m 나일론 셀 스 트레이너 모자를 통해 pipetting으로 300-500 µ L의 PBS와 필터 셀 resuspend. 얼음에 세포를 유지 하 고 정렬까지 빛 으로부터 보호.

4. 준비 셀 컬렉션 접시, FACS 정렬 수행 및 생성 cDNA

  1. RT-앰프 반응 혼합 부품 (표 3)를 결합 하 여 단일 RNAse/DNAse 없는 무 균 튜브에 pipetting으로.
    참고: 이전에 또는 3 단계에서 착 색 하는 동안이 단계를 수행할 수 있습니다. RT 효소 정량 신호에 DNA 템플렛의 기여를 확인 하려면 여기 생략할 수 있습니다.
  2. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 실시간 앰프 반응 혼합의 10 µ L 96 잘 PCR 정렬 컬렉션 번호판의 원하는 수로 분배. 접착제 필름, 접시를 봉인 하 고 미리 냉장된 96 잘 알루미늄 블록에 접시를 놓습니다.
  3. 얼룩진된 샘플의 약 20000 셀에서 데이터를 획득 하 여 교류 cytometer에 제어 체계를 정렬 셀을 설정 합니다. 보상 매트릭스 수집 된 데이터에 적용 됩니다 확인 하십시오. 그리기 문 고 격리 유전자 표정 분석에 대 한 관심의 셀 population(s)을 나타내는 제어 트리를 정의 합니다.
    참고: 잠재적인 SIV vRNA+ 셀의 컬렉션에 대 한 사용 제어 트리는 그림 3에 표시 됩니다.
  4. 각 잘으로 분류 될 수와 셀의 하위 집합을 지정 하려면 적절 한 악기 설정을 입력 하십시오. 정렬 중 하나에 대 한 자세한 지침을 추가 제한 셀 희석 시리즈 또는 단일 셀에에서 제공 됩니다 단계 5와 6, 각각.
  5. FACS 준비 96 잘 PCR 컬렉션 접시로 셀을 정렬 합니다. 정렬 전에 접착 씰을 제거 하 고 신선한 물개 종류를 다음으로 바꿉니다.
    참고: 항상, 정렬 하는 동안 포함 하 여 미리 냉장된 알루미늄 블록 플레이트를 유지.
  6. 정렬, 소용돌이 및 원심 분리기 직후 컬렉션 접시 2000 x g 4 ° c.에 1 분에서
  7. Thermocycle 따뜻한 뚜껑 다음 조건을 사용 하 여 PCR 기계에 접시: 15 분 (RT), 2 분 동안 95 ° C 50 ° C 95 ° C의 18 주기 다음 15 s 및 4 분 (사전 증폭) 60 ° C.
  8. 새로운 96-잘 PCR 접시에 DNA 정지 버퍼의 20 µ L에 cDNA의 5 μ를 전송 하 여 cDNA 1: 5을 희석. 희석된 cDNA 저장할 수 있습니다 4 ° C 또는-20 ° C에 무기한이 시점에서. cDNA를 정량 (단계 5.2, 7.4)에 대 한 서식 파일로 사용할 수 지금 이다.
    참고:이 희석 하면 RT preamp 반응에 뇌관 다운스트림 정량에 기여 하지 않습니다.

5. 변형 a: FACS 정렬 셀 시리즈로 제한 희석 vRNA+ 의 주파수를 결정 하기 위해 셀 또는 실험 품질 관리 수행

참고: 단일 셀 정렬을 수행 하기 전에 그것은 복제에 직렬 희석으로 셀을 정렬 하 여 관심의 세포의 주파수를 결정 하는 사용의 있을 수 있습니다. 이 단계 또한 제공 한다 귀중 한 품질 관리 정렬 효율, 세포 세포의 용 해, RNA 복구 및 cDNA 합성 단계 5.3에서에서 설명한 대로. VRNA+ 셀 주파수의 이전 결정은 적절 하 게 구동된 vRNA+ 세포 유전자 표정 분석에 대 한 충분 한 샘플 크기를 달성 하기 위해 정렬 되어야 하는 단일 셀의 수의 더 정확한 견적에 대 한 수 있습니다.

  1. FACS 단계 4.1-4.2, 같이 준비 96 잘 접시에 셀을 정렬 하 고 여러 복제에 잘 당 1-1000 셀을 수집 합니다.
    참고: 각 셀 희석에 복제 우물의 수는 일반적으로 잘 당 세포 농도와 반비례 연결. 감염 된 세포 주파수 1% 아래 이면 셀 희석 잘 당 100-1000 셀에 집중 해야 한다. 예를 들어 정렬 판 지도 그림 1, 왼쪽 상단에에서 제공 됩니다. 잘 당 1000 셀 초과 결과 증가 때문에 피해 야 한다 반응 볼륨 및 다운스트림 cDNA 합성 및 정량화와 간섭.
  2. 표 4에서 마스터 믹스 솔루션에 정량 시 약을 결합 한다. 25 µ L 반응 볼륨, 마스터 믹스의 22.5 µ L 단계 3.9에서에서 희석된 cDNA 템플릿의 2.5 µ L와 결합 된다. 표준 자전거 상태를 사용 하 여 정량 Pcr을 수행 (예를 들어, 5 분, 94 ° C 94 ° C의 40 주기 다음 15 s를 1 분 동안 60 ° C).
    참고: Singleplex 정량 반응 기존의 실시간 정량 악기를 사용 하 여 하나 또는 몇 가지 분석 실험의 경제적인 예비 분석으로 효율적인 셀 정렬, RNA 복구 및 cDNA 합성 권장 됩니다. 그것은 또한 vRNA+ 세포의 주파수를 계산에 사용할 수 있습니다. Biomark를 사용 하 여 다중 정량 반응은 일반적으로 더 대규모 단일 세포 분석에 적합 합니다.
  3. 품질 관리에 대 한 플롯 외 값 (동부 표준시 = Ct최대 − Ct) 셀의 숫자 대 로그10 규모로 잘 당 정렬 하 고 선형 회귀 분석을 적용.
    참고: 일관성이 복제, 3.3 (± 0.3), 선형 회귀 기울기와 R2 > 0.9는 효율적인 실험의 지표. 최적의 차선 일종의 예, RT-앰프 실험 그림 4에 나와 있습니다.
  4. VRNA+ 세포의 주파수를 결정, 셀 숫자 x 축 (로그10 규모)의 분수에 잘 당 정렬 플롯 vRNA는 y 축에 각 셀 희석에 대 한 긍정적인 우물. 예를 들어, 그림 1 (더 낮은 왼쪽된, 포아송 분포)를 참조 하십시오. 항구의 한 긍정적인 셀 평균, 웰 스 포지티브 (y 축에 0.632)21의 63.2%에 해당 하는 셀의 수를 결정 하려면 데이터를 선형 회귀 모델을 적용 합니다. 이 셀 희석 수 (x 축 절편) 주파수 백분율 표현으로 변환 합니다. 예를 들어, 48 셀 당 하나의 vRNA+ 셀은 2.1%의 주파수.

6. 변형 b: FACS 정렬 세포를 단일 세포 분석

  1. 4.1-4.8, 단계 고 좋은 위치에 잘 교류 cytometer 인덱스 정렬 기능을 사용 하 여 정렬 하 고, 각 셀에 대 한 개별 FCS 파일을 만드는 당 정렬 한 셀을 지정 합니다.
    참고: 정렬 컬렉션 접시의 수는 사용 가능한 thermocyclers의 수를 초과 하면, 사이클링 역전사 비활성화 단계 (2 분 동안 95 ° C) 후 중지할 수 있습니다 및 thermocyclers 사용할 수 있습니다 때까지 4 ° C에서 cDNA를 저장할 수 있습니다. 이 경우에, 15 95 ° C의 첫 번째 사이클에서 사전 증폭 시작 s.
  2. 선택 사항: 만들 cDNA 잔여 undiluted cDNA를 사용 하 여 관심사의 희귀 셀에 대 한 화면에 단일 셀의 사용자 정의 된 일괄 처리에서 cDNA의 구성 된 "풀". 새로운 96 잘 접시에 멀티 채널 피 펫 2 µ L undiluted 단일 셀 미리 증폭 된 cDNA의 전송. 여 반복 지정 된 풀의 모든 추가 단일 셀에서 cDNA의 pipetting 2 µ L 동일한으로 잘 합니다. 관심 (예를 들어, vRNA) 기존의 정량 Pcr를 사용 하 여 긍정적인 셀을 포함 하는 그 결정의 gene(s)에 대 한 cDNA 풀 화면. 풀링 각 셀에서 cDNA의 작은 약 수만 필요, cDNA의 나머지 ~ 8 µ L 이므로 여전히 단일 세포 분석에 사용할 수 있습니다.
    참고: 풀링 전략은 리소스가 다중 정량에 의해 심문을 하는 단일 셀의 수를 줄이기 위해 노력에서 단일 셀 유전자 표정 분석을 수행 하기 전에 것이 좋습니다. 그것은 예비 단일-플렉스 정량 분석 결과 의해 관심사 (예를 들어, SIV mRNA +)의 세포 수 있습니다 식별 하는 경우에 적합 합니다. CDNA 풀 만들 간단 높은 처리량 전략 새로운 접시에 단일 잘으로 2 µ L 컬렉션 정렬 접시의 행 (즉, 모든 12 행 A에서 세포) 또는 열 (즉, 열 1에 있는 모든 8 셀), undiluted cDNA의 결합을 포함 됩니다. 전략을 풀링 하는 최고를 확인 하려면 단계 5.4에서 셀의 예상된 주파수를 고려 하십시오. 예를 들어 셀의 10%는 긍정적인 것으로 예상 된다, 6 단일 셀 cDNA 샘플 구성 풀 자주 음수가 될 것입니다 그리고 그 수영장에서 세포 따라서 다운스트림 단일 세포 분석에서 제외할 수 있습니다.

7. 다중 정량 Biomark 플랫폼에

참고:이 섹션은 버전 A 또는 B 위에서 설명한을 추적할 수도 있습니다. 여기서 설명 하는 연구에서 그것은 단일 세포 분석에 독점적으로 적용 했다.

  1. 분석 결과 각 잘에서 시 로드 4 µ L를 포함 하 새로운 96-잘 PCR 격판덮개로 분석 결과 플레이트 (준비 단계 2.2에서에서) x 2에서 각 분석 결과의 pipetting 4 µ L에 의해 정량 분석 결과 접시를 준비 합니다. 분석 결과 플레이트 4 ° c.에 유지
    참고: 분석 결과 접시와 한 달 동안-20 ° C에서 최대 1 주일까지 4 ° C에서 안정적입니다. 따라서, 그것은 여러 개의 칩에 대 한 충분 한 자료를 준비 하 고 적절 하 게 저장 하려면 유용할 수 있습니다.
  2. 칩의 2 개의 흡 기 밸브에 못쓰게 주사기에서 제어 라인 체액을 분배. 접시 아래 보호 플라스틱을 제거 합니다. A 1 위치에서 노치 면 IFC 컨트롤러에 칩을 놓습니다. 주 메뉴에서 "총리" 스크립트를 선택 합니다. 스크립트를 실행 합니다.
  3. 실시간 반응 혼합 시 약 각 미세 칩에 대 한 PCR 마스터 믹스 (자료 테이블)의 500 µ L 로드 하는 샘플의 50 µ L를 혼합 하 여 준비 합니다. 새로운 96-잘 PCR 접시 이제부터 "샘플 접시"로 지정의 각 음에 4.4 µ L 플라스틱.
  4. 4.8 실시간 반응 혼합을 포함 하는 샘플 접시에 단계에서 1:5 희석된 cDNA의 3.6 µ L 플라스틱
    참고: 경우 PCR 다운 선택 단계 6.2에서에서 설명한 것 처럼 희귀 (예를 들어, vRNA+)에 대 한 다운스트림 분석에 대 한 셀 화면, 긍정적인 풀에서 셀만 포함을 위해 수행 되었습니다.
  5. 칩 못쓰게 완료, 다음 로드는 칩의 노치 (시험) 측에 잘 해당 시험 접시에서 분배 5 µ L 및 5 µ L 칩 후미 샘플 접시에서 잘 (샘플) 반대편에는 칩의 해당. IFC 컨트롤러에 칩을 삽입 하 고 "로드 믹스" 스크립트를 실행 합니다.
  6. 멀티플렉스 정량 Pcr을 수행 하기 위해 Biomark 플랫폼에 칩을 전송. 악기 설정 및 다음 단계별 실시간 PCR 분석 소프트웨어에서 제공 하 고 PCR의 40 주기 함께 진 식 (GE) 96.96 표준 V.1 프로토콜을 사용 하 여 정량 프로그래밍을 진행. 지정 된 폴더에서 ChipRun 파일을 저장 합니다.
    참고: 여러 개의 칩 하루와 여러 일 동안 실행할 수 있습니다.
  7. 정량 데이터를 분석 합니다.
    1. 실시간 PCR 분석 소프트웨어를 엽니다. "ChipRun.bml" 파일은 "파일 | 열기"메뉴입니다.
    2. "칩 탐색기"와 "칩 실행 요약" 소프트웨어 윈도우의 상단 왼쪽된 모서리에 찾습니다. 칩 실행 요약의 세 가지 구성 요소를 식별: 분석 보기, 샘플 설치 및 감지기 설치.
    3. "감지기 설치"를 클릭 하십시오. "작업"에서 "새로 만들기"를 클릭 하 고 컨테이너 유형 "SBS 판", 및 컨테이너 형식 "SBS96"를 선택 합니다. "매핑"을 옆에 클릭은... "M96-분석 결과-SBS96.dsp"를 버튼을, 선택한.
      1. 선택 사항: 할당 각 검출기 (시험) 숫자 또는 각의 "이름" 섹션에서 이름 잘 1세인트 에 두 번 클릭 합니다. 잘 "F2"를 눌러 다음으로 이동 합니다.
    4. "샘플 설치"를 클릭 하십시오. "작업" 옆 "매핑"을 클릭 합니다는... "M96-샘플-SBS96.dsp"를 버튼을, 선택한.
    5. "분석 보기"를 클릭 하십시오. "정량" 탭에서 "작업", 선택 "선형 (파생)에 대 한 기준선 보정", 그리고 "사용자 (감지기)에 대 한 Ct 임계값 방법". "Ct 임계값" 탭에서 "자동 상자 초기화"를 확인 하십시오. 위의 "분석" 버튼을 클릭 합니다.
    6. "분석 보기"의 상단 오른쪽 사분면에서 두 번째 탭 "결과 표"를 클릭 합니다. 드롭 다운 메뉴에서 "열 지도 보기"를 선택 합니다. 열 지도 데이터와 함께 표시 됩니다.
      1. 선택 사항: 칩에 걸쳐 균일 한를 이용한 형광을 되도록 선택 "열 맵 보기" 대신 "이미지 보기" 같은 메뉴에서 합니다. 열 지도 위에 오른쪽 창에서 두 번째에 "를 이용한"을 선택 합니다. 오른쪽 창에서 첫 번째, 1-40 주기 중 하나를 선택 합니다. 이용한 형광의 흑백 디스플레이를 전환 오른쪽 창에서 4를 클릭 하십시오. 이미지를 알리는 뿌려 놓은 것 요, 입자, 또는 칩에 결함이 표시 됩니다. 이용한 균일 가려진 조잡 한 경우 다시 칩을 실행 합니다.
    7. 열 지도 아래 "임계값" 및 "로그 그래프"를 클릭 합니다. 지 수 단계에 증폭 곡선을 교차 하는 데 필요한 임계값 분석 (열의 열 지도)에 클릭 하 여 수동으로 각 검출기에 대 한 Ct 임계값을 조정 합니다. 완료 되 면, "분석"을 클릭 합니다.
  8. 정량 데이터를.csv 파일로 내보냅니다. 스프레드시트 또는 통계 분석 소프트웨어 (예를 들어, JMP)로 데이터를 가져올 하 고 칩 샘플 및 분석 결과 위치로 결과. 새 열을 만들고 조건부 수식을 사용 하 여 바이러스 성 유전자의 표현에 따라 그룹으로 셀을 구성 합니다. "분석"에서 "맞는 Y에서 X", 선택 하 고 그룹 대 유전자 발현을 플롯 합니다. 통계 분석을 적용 합니다.
    참고: 4 개의 SIV RNA 종의 대표 단일 셀 양적 표현 그림 5A에서 이항 플롯에 그려져 있습니다. SIV RNA+ 세포에 양적 호스트 유전자 발현은 그림 5B에 표시 됩니다.
  9. 단일 셀 FACS 데이터에서 정량적 단백질 식 값을 추출 합니다.
    1. .fcs를 열고는 FACS에서 파일 정렬 (단계 6.1) 96 잘 접시 FlowJo 버전 9 사용 하 여 해당. 선택 강조 표시 파일 이름으로 "플랫폼 | 이벤트 번호 게이트 | 만들 인덱스 정렬 게이츠 ". 개별 셀 행에 의해 표시 된 표시 됩니다.
    2. 모든 96 셀 (안 행)를 선택 하 고 선택 "작업 영역 | 수출 | 선택 모든 보상된 fluors ". "데이터 형식"에서 "FCS 파일"을 선택 하 고 "내보내기"를 클릭 하 고 지정 된 폴더를 선택.
    3. 새로운 FlowJo 작업 영역으로 개별 셀에 대 한 새로운.fcs 파일을 끕니다. 모든 셀을 강조, "통계 추가" (왼쪽된 상단에 있는 "Σ" 버튼)을 클릭 합니다 "| 의미 | 모든 fluor 매개 변수 "입니다.
    4. 왼쪽된 상단에 있는 왼쪽에서 4 번째 버튼을 클릭 하 여 "테이블 편집기"를 엽니다. 첫 번째 셀의 모든 fluores를 선택 하 고 테이블 편집기 창으로 끕니다. 테이블 편집기 창에서 "만들기 및 보기 테이블" 맨 같은 단추를 클릭 합니다. 이것은 96 셀의 각 형 석에 대 한 숫자 매개 변수 테이블을 만듭니다.
    5. 출력 데이터베이스 소프트웨어 (예를 들어, MS Excel, JMP)에 두 복사/붙여넣기 또는 "저장 하 고 시작 응용 프로그램"을 클릭 하 여 (4에서 복사 테이블 위의 왼쪽된 버튼).
      참고:이 절차는 FlowJo 버전 9에 대 한 특정. FlowJo 버전 10 인덱싱된 데이터를 가져올 다른 절차를 사용 합니다. 인덱싱된 흐름 데이터 복사/붙여 JMP 셀 정렬에서 만든.csv 파일에서 직접 하실 수 있습니다.
  10. 단일 셀 FACS 데이터 및 번호에 의해 정량 데이터를 병합 하 고 잘 위치. 결합 된 단일 셀 유전자 (정량)에 그래픽 및 통계 분석을 수행 하 고 단백질 식 (FACS) 데이터.
    참고: 단일 셀의 예 결합 정량 및 FACS 데이터는 그림 6 에 나와 있습니다 (호스트 SIV에 감염, 접합 vRNA+ 붉은 털 원숭이 세포 표면 단백질 식 프로필), 그림 7 (c d 4 유전자 발현 표면 대 CD4 단백질 식 접합된 vRNA+ 붉은 털 원숭이 세포에서), 그리고 이전20출판. 차동 식별 하 셀 population(s) 관심 있는 유전자 표현, 단일 세포 분석 방법에서 설명한 권장된20,22,,2324, 차지 하는 연속 유전자 식 값으로 유전자에 대 한 긍정적인 셀의 비율.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

전체 프로토콜에 대 한 워크플로 그림 1에 묘사 된다. 그것은 이루어져 있다 2 개의 유사 콘텐츠를 정렬 하는 셀의 수에 의해 정의: 어느 제한 희석 또는 텍스트에 설명 된 대로 셀, 싱글로. 2-fold 직렬 RNA 희석에 뇌관 프로브 자격 분석의 예는 그림 2에 표시 됩니다. 잠재적인 SIV+ 셀을 식별 하는 제어 전략은 그림 3에 표시 됩니다. 하우스키핑 유전자 GAPDH FACS 정렬 셀 제한 희석에 대 한 성공, 차선 및 실패 한 품질 관리 정량은 그림 4에 나와 있습니다. 단일 셀 양적 유전자의 표현은 4 SIV RNA 종과 붉은 털 원숭이 차동 감염 된 세포에 표현 된 그림 5에 나와 있습니다. 대표 이항, 히스토그램, 및 scatterplots+ T SIV RNA+ CD4의 표면 단백질 식 프로필 묘사 셀 cytometry 그림 6에 의해 측정. Trivariate 거품 플롯 (그림 7) 표면 CD3 또는 CD4 단백질, CD3 또는 CD4 mRNA 및 양적 바이러스 유전자 사이의 관계를 표시 (문신/레 브) 단일 셀에 식.

Figure 1
그림 1 : 실험 워크플로의 회로도에서는 세 가지 주요 구성 요소: cytometric 정렬, 반전 녹음 방송 플러스 cDNA의 사전 증폭 PCR 기반 흐름 (RT, 프리 앰프), 고 정량. 정렬 제한 한 희석 (A, 녹색 배경) 또는 단일 셀 (B, 주황색 배경)으로 수행할 수 있습니다. FACS 정렬에는 즉시 다음 셀 lysed 고 RNA cDNA와 미리 증폭된 (RT, 프리 앰프 PCR) 정량 템플릿을 준비 하로 베낀 반전은. 제한 희석 종류 실험 효율성과 푸아송 분포 통계를 사용 하 여 바이러스 성 RNA에 대 한 긍정적인 세포의 주파수를 결정 고 복구. 녹색 화살표 머리 셀의 예상된 수, (긍정적인 유전자를 되 고 같은 우물의 63.2% 확률에 해당) 바이러스 성 유전자에 대 한 긍정적인 잘 포함 한 셀 당 정렬 셀 주파수로 개조 되는 나타냅니다. 주파수 견적 후속 정렬 (B)에서 수집 된 단일 셀의 수를 사용할 수 있습니다. 인덱싱된 단일 셀 FACS 정렬 예금 하나 잘 당 세포 고 96 잘 접시 내 좋은 위치에 의해 주석이 각 셀에 대 한 데이터 파일을 생성 합니다. 단일 셀 정량 96 유전자에 대 한 멀티플렉스에서 동시에 수행 됩니다. 표면 단백질 (FACS)와 mRNA 식 개별 셀 (오른쪽 열)의 프로 파일링 할 수 있습니다. 바이러스 유전자에 대 한 선택적 정량 Pcr을 수행할 수 있습니다 사전 증폭 PCR 및 다중화 정량 (B, 중간) 화면 단일 셀 또는 풀 다운 선택 바이러스 성 RNA+ 셀을 단일 셀 cDNA의 또는 다중 정량 분석에 대 한 풀 사이. 열 지도 96 분석 (열)에 대 한 유전자 발현 (Ct 값) 및 96 단일 셀 (행)를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 뇌관 자격 실험에서 대표 정량 데이터에 대 한 표시 됩니다 성공 (왼쪽 및 가운데) (오른쪽) 상용 분석 실험 실패 (CD6, SIV 문신/회전, TLR3, 각각). CD6TLR3, RNA 106 FACS 정렬 붉은 털 원숭이 PBMC CD4에서 추출 된에 대 한+ 상업 키트를 사용 하 여 T-셀. 8 12 포인트 RNA 2 배 희석 시리즈의 복제 (0.023-48 ng RNA, 가정 20 세 RNA CD4 당 1.2-2400 셀을 해당+ T-세포) RT-앰프 및 정량을. SIV 문신/레 브에 대 한 RNA 감염 PBMCs에서 생체 외에서 SIVmac239와 붉은 털 원숭이에서 추출 했다. RNA 희석에는 6-12, 000 셀의 스패닝 RNA 등가물 준비가 되어 있었다. 동부 표준시 (40-Ct) 값, 유전자 발현, 증가 예상된 핸드폰 번호 대 그려집니다. 희석 시리즈 R2 전시 > 0.97 3.32 ± 0.3의 슬로프 성공적인 뇌관 자격을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 이항 FACS 게이팅 붉은 털 원숭이 세포 SIV에 의해 잠재적으로 감염의 격리에 대 한 체계와 플롯. 메모리 (CD95 +)을 선택 하기 위한 순차적 게이츠 CD4+ T 세포는 각 인구 이름이 표시 된 오른쪽을 낮은 왼쪽 상단에서 표시 됩니다. 각 게이트 내 부모 플롯의 % 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : FACS 정렬 셀 희석 사용 하 여 제한에 정량의 대표적인 실험 검증 수행 GAPDH 3 개의 독립적인 실험에 대 한 내부 관리 유전자: 성공 (왼쪽), 차선 (가운데), 실패 (오른쪽). 더 이상 2 Ets와 300-1000 셀 웰 스 1에서 잘 당 10-100 셀의 복제 걸쳐 동부 표준시. 선형 회귀 기울기 3.32 ± 0.3, R2 이어야 한다 > 0.95. 이러한 사양을 달성 하는 실패는 단계 1, 2, 3, 또는 조합에서에서 기술적인 어려움을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 단일 셀 양적 바이러스와 호스트 유전자 발현 FACS 정렬 붉은 털 원숭이 CD4에+ Mesenteric 림프 노드 10 일 게시물 SIVmac251 감염에서 T 셀. (A) 바이러스 성 유전자 발현 이항 곱하기 접합의 플롯 (문신/레 브) 그리고 단일 접합 (env) 단일에 의해 SIV mRNA 세포 (왼쪽). 문신/+환경- 셀 (빛 녹색 x 축 따라) 익스프레스 문신의 적은 복사본 /레 브 RNA는 초기와 일치 환경+ 셀 (짙은 녹색), 보다 감염의 고 계 단백질 중재 및 환경을 등 부분적으로 접합된 vRNAs의 핵 수출 이전 단계. 접합된 바이러스 성 RNA를 표현 하지 않는 셀은 회색 (바이러스 성 RNA), 브라운 (+ 개 그LTR+), 또는 (+ 개 그또는 LTR+) 탄에 묘사 된다. (개 그+) unspliced와 총 (LTR+) SIV mRNA 식 (오른쪽) 같은 셀에 표시 됩니다. Unspliced 개 그 RNA 문신에 높은 풍부 /++ 환경을 셀은 늦은 단계 생산적인 감염 기간 동안 풍부한 게놈 RNA 신진으로 포장에 대 한 표현으로 일관 virions입니다. (B) 바이올린 플롯의 붉은 털 원숭이 유전자 차동 감염 되지 않은 세포 (회색)에 비해 SIV에 감염 된 세포의 하나 이상의 하위 집합에 표시 합니다. 앞에서 설명한20,22,,2324통계 분석 수행 되었다. 별표는 감염 되지 않은 세포에 상대적인 결합된 가능성 비율 시험 비교에서 false 검색 속도 < 10%를 나타냅니다. 선 각 유전자에 대 한 셀 그룹에서 평균 값을 연결합니다. 이 그림에서 볼튼 수정 되었습니다. 20 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 대표 호스트 붉은 털 원숭이 mesenteric 림프 노드 10 일 게시물 SIVmac251 감염에서 FACS 정렬 세포의 표면 단백질 식 프로필. (A) Scatterplot CD3, CD4, 그리고 ICOS 표면 단백질 표정에 감염 되지 않은 (회색)+ 개 그문신/계- (갈색), 그리고문신/계+ + 개 그셀 (녹색)의 표시. 형광 강도 각 셀 (점)에 대 한 플롯 됩니다. 국외 자 상자 플롯 묘사 interquartile 범위 (IQR) 및 중간 (상자), 1.5에서 먼 포인트 상자 (수염), 및 잠재적인 outliers (분리 점)에서 x IQR. 상단에 가로 막대 표시 중요 한 차이 (p < 0.05, 비패라메트릭 Wilcoxon 순위 테스트). (B) Bivariate 및 히스토그램 표시 (A)에 표시 된 셀에 대 한 표면 CD3, CD4 단백질 표정. 도트 그림 (왼쪽)는 사분면 내에서 각 셀의 비율을 나타냅니다. CD3, CD4 히스토그램 (가운데, 오른쪽)는 감염 되지 않은 상대문신/계++ 개 그+ 개 그문신/계- 세포 표면 단백질 downregulation를 묘사. (C) 12 대표적인 문신/계+ (A-B)에서 단일 셀 (왼쪽) CD3/CD4, CD69/CD38 (가운데)과 ICOS/HLA-DR (오른쪽)의 표면 표현에 대 한 3 개의 이항 플롯에 걸쳐 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7 : Trivariate 플롯 표시 단일 셀 바이러스 성 유전자 (문신/레 브), 호스트 유전자 (CD3 , CD4)와 SIV에 감염 된 메모리 CD4 호스트 표면 단백질 CD3 (CD4) 식+ T 세포 mesenteric 림프절에서 10 일 포스트 SIVmac251 감염. 문신/회전 각 셀으로 표현의 금액은 점 크기에 의해 반영 하는 동안 CD4 단백질 식 (형광) CD4 mRNA (정량)에 대 한 플롯 됩니다. 문신에 / 셀레 브+ (녹색), 지속적인된 CD4 , CD3 녹취 록과 함께 표면 CD4, CD3 단백질 표정 각각 감소, 표면 단백질 표정 하류 변조 표시 진 식입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1: 뇌관 및 프로브 SIV 핵 산의 검출에 사용. 두 시퀀스는 뇌관 또는 프로브에 대 한 때, 두 시퀀스의 아데닌 금액 사용 되었다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

표 2: amplicons Biomark 악기에의 정량에 사용 되는 96-유전자 패널. 4 SIV 분석 파란색 배경으로 표시 됩니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

표 3: 반전 녹음 방송 및 사전 증폭에 사용 되는 반응 혼합. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

표 4: 정량 Pcr 반응 혼합 실시간 PCR에 사용 되는 양의 스튜디오 6 악기에 수행. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

추가 코딩 파일 1. 진 식 분석 자격에 대 한 지침. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

추가 코딩 파일 2: JMP 서식 파일 샘플 지도. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

추가 코딩 파일 3: JMP 서식 파일 조사 지도. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

추가 코딩 파일 4: JMP 뇌관 분석 스크립트. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

추가 코딩 파일 5. JMP 불연속 분석 스크립트. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

프로토콜 여기에 설명 된, tSCEPTRE 되 나, 높은 다중화 실시간 정량 Pcr에 의해 양적 단일 셀 mRNA 식 multiparameter cytometry에 의해 통합 하는 단일 세포 표면 단백질 정량. 이 두 기술의 조합 transcriptional는 결합의 높은 콘텐츠 스냅샷 및 높은 처리량 형식에서 단일 세포의 단백질 프로필 수 있습니다. 우리는 메서드를 사용 하 여 지금까지 애매 셀 SIV에서 vivo에서, 감염을 식별 하 고 차동 표현된 호스트 유전자와 단백질을 설명. 프로토콜 표면 protein(s), mRNA, 또는 조합을의 식에서 구별할 수의 어떤 셀의 연구에 대 한 적용할 수 있습니다. 설명된 방법 정확한 단일 셀 정렬에 의존 및 cytometry에 의해 기록 데이터와 상용 정량 시 약 실시간 PCR 계측 다중화. 출력은 단일 셀 결합된 단백질 및 유전자 표현 데이터의 구분, 양적 평가 이다.

다른 접근을 연결 하는 단일 세포에서 단백질 및 유전자 표현 되었습니다1,25,,2627설명. 인덱싱된 FACS 정렬 뒤에 RNAseq, 조 혈 줄기 세포의 특성에 성공적으로 적용 된 특히 유망한 접근28을 나타냅니다. 그러나, RNAseq는 몇몇 이점이 타겟된 유전자 표정 분석, 즉 편견된 전체 transcriptome 분석, 그것는 높은 여러 비교 통계 비용 및 낮은 복사의 정량화에 대 한 덜 민감한 있을 수 있습니다. 성적 증명서입니다. 또한, 그것은 현재 주파수에서 현재 희귀 감염 된 세포를 찾아 셀의 수천에 RNAseq를 수행 하기 위해 경제적으로 가능한 < 1% (예를 들면, HIV, SIV). 다른 신흥 단일 셀 기술 즉, FACS 또는 PCR, 단백질 및 핵 산 같은 셀의 검출을 위한 단일 판독을 생성 하고자 합니다. 형광 항 체에 의해 단백질의 mRNA FACS 분석 (mRNA-흐름-물고기)14,15,,2930다음 형광 oligonucleotide 조사에 의해 검출 포함 됩니다. 또한, 단백질 정량 반대로 베낀된 mRNA31,32,,3334 병행에서 하 여 검색 된 oligonucleotide 항 체 어원이 같은 말의 쌍에 의해 검출 될 수 있다 . 이러한 "" 하이브리드 접근 제공 동시 핵 산 및 단백질 측정 단일 셀 해상도 유사한 tSCEPTRE, 하지만 그들은 제한 된 어디 하거나 하지 양적 (mRNA-흐름-물고기) 또는 해야 할 수도 있습니다 사용자 지정 된 항 체 또는 mRNA 조사 합니다. 우리의 tSCEPTRE 접근 mRNA와 단백질 측정을 위한 양적 이며 모든 시 약은 상업적으로 사용할 수, 병원 체 관련 분석 실험의 가능한 예외와 함께.

특별 한 주의 실험 샘플의 분석에 앞서 프로토콜의 여러 단계에 적용 되어야 한다. 첫째, 높은 매개 변수 cytometry 민감한 감지 및 해결35되도록 형광 항 체의 패널의 주의 최적화 필요 합니다. 각 항 체를 달성할 최적의 분리 및 최소한의 배경 얼룩, 얼룩 모든 항 체 어원이 같은 말에에서 사용 하는 경우의 평가 다음 농도 식별 하기 위해 개별적으로 적정 한다. 관심사의 각 유전자를 측정 하는 적절 한 정량 유전자 식 분석 결과의 두 번째, 실험 결정은 필수적 이다. 여러 상용 분석 각 유전자에 대 한 일반적으로 사용할 수 있지만 우리의 경험에서는, 많은 단일 셀 레벨6에서 양적. 따라서, 모든 제안 된 분석 정량 유전자 발현에 대 한 사용 하 여 순차적으로 희석된 RNA 사전에 자격을 중요 하다. 이 시 약의 최적화는 시간이 걸리는, 하지만 시간을 투자를 정당화 하는 관심의 모든 분자의 과민 한 탐지를 허용 하는 항 체 어원이 같은 말 및 유전자 표정 분석 실험의 신뢰할 수 있는 패널의 값. 또한, 우선 순위는 엑손 exon 접합 (지정 접미사 "m1") mRNA에 대 한 특이성을 개선 하기 위해 대체 분석 실험 (접미사 "s1" 또는 "g1" 게놈 DNA를 감지 할 수 있지만 프로브를 포함 분석 하는 상용 실험에 주어져야 한다 ) 진 식 결과 각 셀에서 해당 염색체 복사본에 영향을 미칠 가능성이 있는 것으로 간주 됩니다. RT의 상류 RNA의 보존 중요 한 이며 프로토콜에 걸쳐 설명한 것 처럼 샘플, 냉장을 유지 하 여 이루어집니다. 마찬가지로, FACS 정렬 및 정렬 사이 간격의 기간 및 RT-프리 앰프는 최소한으로 유지 되어야 한다. 모두 제한 희석 및 단일 셀 정렬, cDNA 분석할 수 있습니다 먼저 기존의 정량 평가의 RNA 복구 하 여 높은 내부 관리 유전자 표현. 관찰 된 식의 핸드폰 번호, 같은 복제 또는 제한 희석 실패 유효성 검사에 대 한 선형 적합의 슬로프 중 균일 하지 않으면 문제 해결 셀 정렬 및 다운스트림 절차에서 수행 되어야 합니다.

여기서 설명 하는 접근의 잠재적인 한계 (1) 특히 mRNA 결합 접속점, 그리고 표면 단백질 및 유전자 측정 (2) 제한 수에 대 한 특정 분석 실험에 대 한 뿐만 아니라 RNA, DNA의 탐지를 포함 합니다. 그러나, DNA 검출 위에서 언급 한 이유로 차동 호스트 유전자 표정 분석에 실질적으로 기여할 가능성이 크다. 또한, 직접 우리는 DNA는 두 가지 방법으로이 프로토콜에서 정량 신호에 기여 하는 정도 측정: a) 역전사를 제외 하 고 b) 수정 세포 세포의 용 해 프로토콜 핵 막 세포를 강화 하. 하지만 역전사의 부재, 둘 다 접합 및 unspliced 바이러스 성 유전자 검색 여전히 훨씬 저렴 역전사 존재 보다 주파수 (~ 6-fold와 2-fold 감소, 각각)20. 따라서, 바이러스 성 유전자 표정 분석 실험과 대 평가 하는 셀 셀 관련 바이러스 성 DNA의 존재 때문에 바이러스 성 RNA의 양을 수 있습니다. 우리는 들어오는 virions36에서 발생 하는 접합 및 unspliced SIV/HIV RNA 발생 알려진 호스트 세포 감염 시 생성 되는 세포질 RT 제품을이 찾는 특성. 따라서, 그것은 일부 응용 프로그램에 대 한 서식 파일 DNA 파생을 quantitate를 역전사 부족 조건에 실험의 한 부분 사용 하는 것이 좋습니다 있을 수 있습니다. 그것은 들어오는 바이러스에서 파생 된 unspliced SIV/HIV RNA 합성 드 노 보 바이러스 성 RNA에서 구분할 수 없습니다 주목 해야한다. 둘째, 우리 RT preamp 프로토콜에 핵 세포 단계를 통합 하 고 통합된 SIV DNA (Alu LTR) 복사본에 있는 지 수 증가 관찰 (볼튼의그림 S3 그 외 여러분) 20. 게놈 DNA는 따라서 여기에 사용 된 세포 세포의 용 해 방법에서 추출한 핵 산 서식 파일에 실질적으로 기여할 가능성이. 메모의, 핵 세포 단계 추가 SIV latently 감염 된 세포를 포함 하 여 다른 바이러스 DNA 양성 세포를 조사 하고자 하는 유용한 미래에 단일 셀 연구 수 있습니다.

표면 단백질 분석 수 흐름 cytometric 셀 정렬의 기능에 의해 결정 됩니다. 현재 상업적으로 이용 가능한 악기 30 매개 변수를 초과 하지 마십시오. 고급 cytometry 채용 미래 연구 단백질 프로 파일링이 접근의 기능을 확대 추가 됩니다. 장비 및 계측 성적 증명서의 수 또한 96, 제공 된 지원 시 약(예를 들어, 높은 농도의 프라이 머)를 넘어 확장할 수 있습니다. 궁극적으로, 신기술 단일 셀 프로테옴 (질량 분석)의 분석을 결합 하는, transcriptome (RNAseq), 및 게놈 (DNAseq) 보다 우선 합니다 발견 연구31,37, 에 대 한 타겟된 접근 38 , 그러나 39., 타겟된 정량 가능성이 남아 있을 것 이다 같은 "omics" 접근으로 금 표준 양적 표현 분석에 대 한 유효성을 검사 하기 위한 유용한 도구.

TSCEPTRE에 의해 결합 된 단백질 및 전사 분석 또는 그 병원 체를 품고, oncogenes, 포함 된 또는 그렇지 않으면 탈 형을 전시 등 셀을 식별 하기 어려운 희귀 조사를 위한 강력한 도구입니다. 이러한 방법으로, 이러한 바이러스 성 감염의 병 인에 관련 된 새로운 메커니즘의 발견에서 transcriptionally 활성 SIV/에이즈에 감염 된 세포에 대 한 새로운 표시를 식별 수 있습니다. Latently 감염 된 세포의 식별은 엉덩이 바이러스 성 DNA 주인 게놈에 통합 하는 프로토콜의 추가 개발이 필요 합니다. 메모의 HIV/SIV에 감염 된 세포의 주파수는 상당히 낮은 만성 viremic 또는 치료 감염,이 설정에서 파생 된 공부 감염 된 세포에서 실용적인 과제를 발표할 예정 이다. 우리의 접근 이전 다루기 힘든 메커니즘을 평가 하기 위한 기초 낳는다: 단일 세포 수준에서 post-transcriptional 규칙의 호스트 병원 체 상호 작용 뿐만 아니라 좀 더 일반적인 세포질 과정의 광범위 한 적용을 있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

이 작품은 헨리 M. 잭슨 기초 군사 의학 발전, inc., 그리고 국방 미국 부서 (국방부) 사이 협력 계약 (W81XWH-07-2-0067)에 의해 지원 되었다. 표현 그 저자 고 미 육군 또는 국방부의 위치를 나타내는 해석 되어서는 안 됩니다. 연구 동물 복지 행위 및 다른 연방 법령 및 동물에 관련 된 규정 준수 AAALACi 공인 시설에서 승인 된 동물 사용 의정서 실시와 관련 된 동물 실험 원칙을 준수 관리 및 실험 동물의 사용, NRC 게시, 2011 년 판에 대 한 가이드에 명시 된.

Acknowledgments

저자는 NIAID VRC Flow Cytometry 코어와 MHRP Flow Cytometry 핵심 시설 유지 보수 및 FACS 악기와 정렬 장비 운영에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 마리아 몬테, Vishakha Sharma, Kaimei 노래 전문가 기술 지원; 마이클 Piatak, 주니어 (고 인)를 통해 SIV 정량 분석 결과 디자인; 브랜든 킬와 SIV에 대 한 매튜 Scarlotta 시퀀스를 분리 하 고. 표현 그 저자 고 미 육군 또는 국방부의 위치를 나타내는 해석 되어서는 안 됩니다. 연구 동물 복지 행위 및 다른 연방 법령 및 동물에 관련 된 규정 준수는 AAALAC 공인 시설에서 승인 된 동물 사용 의정서 실시와 관련 된 동물 실험 원칙을 준수 관리 및 실험 동물의 사용, NRC 게시, 2011 년 판에 대 한 가이드에 명시 된.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

RNA extraction and PCR reagents and consumables

Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate

BioExpress/VWR

T-3060-1

Adhesive PCR Plate Seals

ThermoFisher

AB0558

Armadillo 384-well PCR Plate

ThermoFisher

AB2384

MicroAmp Optical Adhesive Film

Applied Biosystems/ThermoFisher

4311971

DEPC Water

Quality Biological

351-068-101

Glass Distilled Water

Teknova

W3345

Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit

Invitrogen/ThermoFisher

11732088

SUPERase-In Rnase Inhibitor

Invitrogen/ThermoFisher

AM2696

Platinum Taq

Invitrogen/ThermoFisher

10966034

dNTP Mix

Invitrogen/ThermoFisher

18427088

ROX Reference Dye (if separate from kit)

Invitrogen/ThermoFisher

12223012

DNA Suspension Buffer

Teknova

T0223

RNAqueous kit

Invitrogen/ThermoFisher

AM1931

TaqMan gene expression assays not listed in Table 2

CD6

Applied Biosystems/ThermoFisher

Hs00198752_m1

TLR3

Applied Biosystems/ThermoFisher

Hs1551078_m1

Biomark reagents

Control Line Fluid Kit

Fluidigm

89000021

TaqMan Universal PCR Mix

Applied Biosystems/ThermoFisher

4304437

Assay Loading Reagent

Fluidigm

85000736

Sample Loading Reagent

Fluidigm

85000735

Dynamic Array 96.96 (chip)

Fluidigm

BMK-M-96.96

FACS reagents

SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)

Spherotech Inc.

CMIgP-30-5H

CompBeads Anti-Mouse Ig,k

BD Biosciences

51-90-9001229

5 ml Polystyrene tube with strainer cap

FALCON

352235

Aqua Live/Dead stain

Invitrogen/ThermoFisher

L34976

dilute 1:800

Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2

BD Biosciences

563916

dilute 1:40

Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200

BD Biosciences

563914

dilute 1:20

Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8

BD Biosciences

564804

dilute 1:10

Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2

Biolegend

302948

dilute 1:20

Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2

BD Biosciences

564710

dilute 1:10

Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2

Biolegend

301842

dilute 1:83

Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8

Biolegend

302048

dilute 1:167

Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7

Biolegend

302340

dilute 1:37

Anti-CD38-R PE clone OKT10

NHP reagent recource

N/A

dilute 1:100

Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50

BD Biosciences

564364

dilute 1:10

Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6

BD Biosciences

561358

dilute 1:20

Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A

Biolegend

313528

dilute 1:80

Instruments

BioPrptect Containment Enclosure

Baker

BD FACS Aria

BD Biosciences

ProtoFlex Dual 96-well PCR system

Applied Biosystems/ThermoFisher

4484076

Quant Studio 6 qPCR instrument

Applied Biosystems/ThermoFisher

4485694

IFC controller HX

Fluidigm

IFC-HX

Biomark HD

Fluidigm

BMKHD-BMKHD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends Genet. 33, (2), 155-168 (2017).
  2. Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence. Retrovirology. 10, 41 (2013).
  3. Mailler, E., et al. The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex. Viruses. 8, (9), (2016).
  4. Varmus, H. Retroviruses. Science. 240, (4858), 1427-1435 (1988).
  5. Frankel, A. D., Young, J. A. HIV-1: fifteen proteins and an RNA. Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).
  6. Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, (1-2), 133-145 (2013).
  7. Tokarev, A., Guatelli, J. Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence. Cell Logist. 1, (3), 90-102 (2011).
  8. Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (5), a006940 (2012).
  9. Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence. Viruses. 8, (3), 67 (2016).
  10. Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape. Nat Immunol. 16, (6), 546-553 (2015).
  11. Kirchhoff, F. Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses. Cell Host Microbe. 8, (1), 55-67 (2010).
  12. Wigzell, H. Immunopathogenesis of HIV infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 1, (6), 559-565 (1988).
  13. Reynolds, M. R., et al. Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry. Cytometry A. 77, (11), 1059-1066 (2010).
  14. Baxter, A. E., et al. Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals. Cell Host Microbe. 20, (3), 368-380 (2016).
  15. Grau-Exposito, J., et al. A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients. MBio. 8, (4), (2017).
  16. Eriksson, S., et al. Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies. PLoS Pathog. 9, (2), e1003174 (2013).
  17. Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278, (5341), 1295-1300 (1997).
  18. Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nat Med. 15, (8), 893-900 (2009).
  19. DeMaster, L. K., et al. A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy. J Virol. 90, (5), 2165-2179 (2015).
  20. Bolton, D. L., et al. Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells. PLoS Pathog. 13, (6), e1006445 (2017).
  21. Quintans, J., Lefkovits, I. Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system. Eur J Immunol. 3, (7), 392-397 (1973).
  22. Finak, G., et al. MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data. Genome Biol. 16, 278 (2015).
  23. McDavid, A., et al. Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells. PLoS Comput Biol. 10, (7), e1003696 (2014).
  24. McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data. Nat Biotechnol. 34, (6), 591-593 (2016).
  25. Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time. Trends Microbiol. (2017).
  26. Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. Exploring viral infection using single-cell sequencing. Virus Res. 239, 55-68 (2017).
  27. Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics. Nat Biotechnol. 34, (11), 1145-1160 (2016).
  28. Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128, (8), e20-e31 (2016).
  29. Soh, K. T., et al. Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins. Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).
  30. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, (4), 209-212 (2015).
  31. Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell. Clin Chem. 58, (12), 1682-1691 (2012).
  32. Assarsson, E., et al. Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability. PLoS One. 9, (4), e95192 (2014).
  33. Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20, (5), 473-477 (2002).
  34. Genshaft, A. S., et al. targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction. Genome Biol. 17, (1), 188 (2016).
  35. Mahnke, Y. D., Roederer, M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin Lab Med. 27, (3), 469-485 (2007).
  36. Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 20, (2), 203-211 (2004).
  37. Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nat Rev Genet. 16, (3), 133-145 (2015).
  38. Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Curr Opin Biotechnol. 23, (1), 83-88 (2012).
  39. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med. 9, (1), 75 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics