その場でパラフィン埋め込まれた大人サンゴの標本の交配の技術

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Summary

このプロトコルの目標はパラフィンに埋め込まれているされていると、スライド ガラス上に断面採取したサンゴ大人上の in situハイブリダイゼーションを行うことです。これはパラフィン包埋組織の RNA アンチセンス プローブの空間表現を視覚化するために使用する質的研究法です。

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Traylor-Knowles, N. In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples. J. Vis. Exp. (138), e57853, doi:10.3791/57853 (2018).

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Abstract

サンゴは海の全体的な健康だけでなく、人間の健康に欠かせない重要な海洋無脊椎動物です。海水の温度上昇や海洋酸性化など人間活動の影響、ためサンゴが、ますます脅威にさらされています。これらの課題に取り組む、細胞および分子生物学の進歩は、サンゴの健康を診断するために重要であると証明しています。人間の薬でよく使用される技術のいくつかを変更すると、サンゴを付けて治療する研究者の能力が大幅に向上。これに対処するため人間の医学と進化発生生物学で主に使用されるその場で交配のためのプロトコルは、ストレスの下で大人のサンゴで使用に適応されています。

このメソッドの目的は、パラフィンに埋め込まれているされており、スライド ガラス上に断面を有する成人のサンゴ組織における RNA プローブの空間表現を視覚化することです。このメソッドは、サンプルの退避とパラフィンの除去、サンプル、前ハイブリダイゼーション インキュベーション、RNA プローブの可視化と RNA のプローブの交配の透過性を確保するためのサンプルの前処理について説明します。これは、場所特定の遺伝子の表現し、プロトコルは他の非モデル生物のために容易に適応することができますを発見する非モデル生物を用いた強力な方法です。ただし、メソッドは限られた表現強度可視化ステップとプローブの濃度の間に使用されている時間の量によって異なるため、それが主に質的です。さらに、忍耐が必要、このプロトコルは、最大 5 日 (および多くの場合より長い) によって使用されているプローブを取ることができます。最後に、非特異染色が一般的でが、この制限を克服することができます。

Introduction

サンゴが重要な生態系のビルダーと海洋と人間の健康1,2,3における生物多様性のために重要です。彼らの気候変動とその他の人為的ストレスの脅威の下で、多くのサンゴ種が絶滅危惧と見なされます。したがって、ストレス下でのサンゴを診断する細胞・分子ツールの重要な必要性があります。また、そこは少しについて理解される大人のサンゴの組織とほとんど理解したがってこれらの遺伝子の機能の内にある遺伝子。この問題を解決するには、我々 はその場で交配 (っぽい)、一般的に使用するプロトコル人間の医学と進化発生生物学、大人のサンゴのパラフィン埋め込まれた組織サンプルでの使用のために適応しています。この手法は、最も強力な熱ストレスへの暴露などのストレスの多いイベントを受けている大人のサンゴで使用した場合です。ただし、この手法は組織やサンゴのライフ ステージの広い範囲で使用することができ、だけ熱重点を置かれたサンゴ4,6,7に制限されていません。また、cDNA シーケンス情報がある限り、この方法を組織または任意の後生動物の細胞に使用できます。

このメソッドの目的と保存にし、パラフィンに埋め込まれたスライド上に断面大人のサンゴの組織内 RNA プローブを視覚化することです。このメソッドは、大人のサンゴの組織内にある核酸を可視化できる強力な診断ツールです。最初このメソッドは、医療診断のため開発された、発生生物学、進化発生生物学8,9,10等の分野で人気のツールとなっています。ISH はまた非モデル システム、ゲノムで特に重要なメソッドとトランスクリプトーム シーケンス データがありますが、空間の遺伝子発現パターンが知られています。それは興味の遺伝子を表現する細胞や組織と詳細ターゲットを絞った治療アプローチ8,9,10につながることができますを示すことができるための非モデル系診断仕事のためこの手法は強力です 11,12。最後に、この手法は定性的および定量的遺伝子発現データ11と組み合わせればより強力です。

ジゴキシゲニン (DIG) を設計しているすでに研究者の関心のこのペーパーで説明するアプローチになります-標識 RNA プローブ (センスとアンチセンス プローブ) とは今その場でサンプルをプローブの交配を実行する準備ができています。このメソッドを実行するには、対象の各プローブ パラフィンティッシュ サンゴの 2 つの連続切片を必要となります。1 つのセクションは、意味プローブとアンチセンス プローブ使用されます。センス プローブは、非特異的結合を示すコントロールになります。染色センス プローブで観察される場合、は、アンチセンス プローブは興味の RNA に固有ではありません。プローブは、任意の遺伝子の表現を設計できます。このプロトコルでは熱ストレス下のサンゴの中に表現される検出された以前のいくつかの例が使用される: FBJ マウス骨肉腫ウイルス遺伝子相同物 B (Fos B)、活性化タンパク質 (AP1) と腫瘍壊死因子受容体 41 (TNFR 41)11。DIG 標識 RNA プローブを用いた ISH は取り扱いが多くのより安全な10 のため放射性プローブの使用より優先されます。さらに、この手法は、機密性が高いと組織と熱ストレス アダルト サンゴ13,14,15,16を超えて胚の広い範囲で実行することができます。

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Protocol

1. パラフィンの除去

注意: は、ヒューム フードの下で次の手順を実行します。

  1. 100% キシレン 10 分ガラス Coplin jar のボンネットの下に薄切切パラフィン埋め込まれたスライドを dewax します。キシレン溶けるプラスチック プラスチックの Coplin jar ファイルは使用しないでください。Coplin jar ファイルは使用する前にオートクレーブで滅菌します。
  2. 次のように 4 つの滅菌ガラス Coplin jar を準備: エタノール 60%、70% エタノール 80% エタノール 100% エタノール。RNase フリー水とエタノールで希釈します。
    1. 100% エタノールで滅菌ガラス Coplin jar ファイルにスライドをコピーして 10 分間浸します。10 分後ガラス Coplin jar を空にして新しい 100% エタノールに置換します。10 分のために再度スライドを浸します。
    2. 1 分 80% エタノールで滅菌ガラス Coplin jar ファイルにスライドをコピーします。
    3. 1 分の 70% エタノールで滅菌ガラス Coplin jar ファイルにスライドをコピーします。
    4. 1 分 60% エタノールで滅菌ガラス Coplin jar ファイルにスライドをコピーします。

2. RNA プローブの交配の準備のためのスライドの前処理

  1. 指定がなければ、常温で次の洗浄を実行します。低速で軌道シェーカーで常温洗浄を実行します。最大 5 つのスライドのための部屋とスライドの洗浄用滅菌スライド メーラーを使用します。
  2. スライドをリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 18 ml 滅菌スライド メーラーに転送します。室温で 5 分間洗浄します。
  3. 1 × PBS を注ぐし、すぐにプロティナーゼ K 組織の浸透をプローブを有効にするとスライド上組織を扱います。プロテイナーゼ K 溶液約 18 mL を加えるスライド メーラー (溶液濃度を操作するためのテーブル 1を参照)。37 ° c 15 分間インキュベートします。手ふれしません。
    1. スライドをインキュベートすると、prehybridization (Prehybe バッファー) を準備します。10 分間、沸騰水浴中 Prehybe バッファーを配置し、5 分の氷浴で冷却します。Prehybe バッファーのレシピ、表 1を参照してください。
    2. プロティナーゼ K ソリューションを注ぐことによってプロティナーゼ K 反応の消化を停止し、すぐにスライド メーラーに 0.2% グリシン PBS 溶液 18 mL を追加します。室温で 5 分間座ってスライド メーラーをしましょう。
    3. 0.2% グリシン PBS 溶液を注ぐ、2 x 生理食塩水クエン酸ナトリウム (SSC) 液 18 mL を各スライドのメーラーに追加します。2 スライドを洗う 100 150 rpm で振とうしながら室温で 10 分間 x SSC。

3. RNA プローブの交配の準備でスライドの prehybridization

  1. 2 スライドを水洗い、x SSC、新しい滅菌スライド メーラーを取得、約 18 mL の Prehybe バッファーを入れてスライド メーラー。交配温ハイブリダイゼーション オーブンにスライド メーラーを配置します。
    注: 通常 50-60 ° c. の範囲が使用されているプローブの交配温度が異なります
  2. 2 × SSC と場所を注ぐ 2 x SSC 洗浄が完了すると、1 h のハイブリダイゼーション オーブンで Prehybe バッファー内スライド メーラー内のスライド。

4. RNA プローブの交配

  1. スライドは、ハイブリダイゼーション オーブンで Prehybe バッファーとインキュベートは、交配のプローブ ソリューションを準備します。
    1. 各プローブの交配バッファー (0.5 μ L プローブの交配バッファーの 24.5 μ L) で希釈します。
      注: 交配バッファーのためのレシピは、表 1にあります。トレーラー ・ ノウルズのプローブの準備と濃度の例を見つけることができます。11
    2. 12 分、86-90 ° C 熱ブロックに希薄化後のプローブを配置し、氷の上の 1 分のクールな。
  2. ハイブリダイゼーション オーブンからスライド メーラーを削除し、個別に滅菌ピンセットを使用してスライドのメーラーからスライドを削除します。ペーパー タオルの上に平らのスライドを置き、慎重に組織サンプルの周囲に余分な Prehybe バッファーを拭き取る。サンプルに触れないように気をつけて、ティッシュ サンプルの乾燥を防ぐためにすぐに仕事。
  3. PAP ペンで組織を取り囲みます。ピペット希釈プローブ溶液の 25 μ L を適用し、プラスチック coverslip のサンプルをカバーします。
    1. 4 x SSC + チャンバーの底に 50% ホルムアミド ソリューションとスライドの水分室にサンプルを配置します。
    2. プローブは、すべてのスライドに追加されている、一度交配温度 50-60 ° C で 24 時間少なくともハイブリダイゼーション オーブンにスライドの水分室を配置します。インキュベーション時間プローブの濃度によって異なりますが、24 時間以上にする必要があります。
  4. 希薄化後のプローブで一晩インキュベートした後に、ハイブリダイゼーション オーブンからスライドの水分室を削除します。
    1. それぞれの組織がずれないように注意しながら、スライドから coverslips を削除します。1000 μ L ピペットで 2 x SSC ソリューションの 1000 μ L を追加し、スライドを優しく洗い流してください。
    2. 2 x SSC 溶液室温で 5 分間の 18 ml 滅菌スライド メーラーにスライドを配置します。ソリューションを注ぐし、新鮮な 2 の 18 mL 交換 x SSC。穏やかな揺れで部屋の温度で 5 分間インキュベーションを繰り返します。
    3. 2 x SSC ソリューションを注ぐ。室温で 18 mL 1 x SSC ソリューションと 5 分間洗浄を追加します。1 の x SSC ソリューションを注ぐし、新鮮な 1 の 18 mL 交換 x SSC。穏やかな揺れで部屋の温度で 5 分間インキュベーションを繰り返します。
    4. 1 を注ぐ x SSC。振ることがなく 42 ° C で 18 mL 0.5 x SSC と 10 分の洗浄を追加します。SSC と置換 x 0.5 を注ぐそれ新鮮な 0.5 ml の 18 x SSC。振ることがなく 42 ° C で 10 分間のために再度洗ってください。

5. RNA プローブの可視化

注: プローブを視覚化、BM 紫は開発プロセス中に使用されます。ただし、この手順の前に、いくつかの洗浄は汚損のためにサンプルを準備する必要。

  1. 1 分 MgCl2 MgCl2、ap 通信バッファーを注ぐし、1 x ベーリンガーインゲルハイム マンハイムでマレイン酸バッファーで希釈バッファーの妨害の 18 mL を追加せず、18 ml のバッファー アルカリフォスファターゼ (ap 通信バッファー) のスライドを洗ってください。穏やかな揺れでスライド メーラーに室温で少なくとも 1 時間インキュベートします。
    注: ベーリンガーインゲルハイム マンハイム ブロック バッファーとマレイン酸バッファー使用された既成し、掘る洗浄やブロック バッファー設定で購入 (利用可能な商業的)。
    1. また、4 ° C で一晩培養が行えます。もはやブロック期間は非特異的結合の外観を軽減します。
  2. 20 ml 希釈掘るアンチ ジゴキシゲニン AP Fab 断片の (抗 DIG 抗体 = 抗 DIG 抗体 + 20 mL 1 ベーリンガーインゲルハイム マンハイム ブロック バッファー x 2 μ L)。これは、1 プラスチック製のスライド メーラーでの使用に十分です。このソリューションの詳細は、1 つ以上のスライド メーラーを使用する場合に準備されなければなりません。
  3. 新しい滅菌スライド メーラーに抗 DIG 抗体を追加し、スライドを抗 DIG 抗体溶液をスライド メーラーに転送します。穏やかな揺れで 3 時間室温で孵化させなさい。
  4. インキュベーション後、抗 DIG 抗体を注ぐし、穏やかな揺れで 5 分 MgCl2 AP バッファーの 18 ml スライド メーラーでスライドを洗います。
  5. MgCl2、 ap 通信バッファーを注ぐ、18 mL の AP バッファーを追加します。穏やかな揺れで 5 分間洗浄します。5 分インキュベーション後 AP バッファーを離れて注ぎ、18 ml の新鮮な AP バッファーの交換および穏やかな揺れで 5 分間洗浄します。
  6. 暗闇の中、ap 通信バッファーを注ぐし、スライド メーラーに BM purple の 18 mL を追加します。暗闇の中で室温でスライドを孵化させなさい、開発されているプローブに基づく可視化すべて ½ h. 反応時間が異なります紫発色のチェックします。
    注: BM 紫可視化ではなく開発ソリューション可能 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) とニトロ ブルー テトラゾリウム (NBT) を使用します。手順については表 1を参照してください。
  7. スライドを 18 ml の暗闇の中、室温で 5 分間トリス EDTA (TE) バッファーの新しい滅菌スライド メーラーに転送することによって発色を停止します。
  8. TE バッファーを離れて注ぎ、スライド メーラーと暗闇の中、1 分間洗浄する 18 mL の RNase フリーの水を追加します。
  9. 水からスライドを削除して、組織の境界に乾燥させる.グリセロール媒体をマウントを追加し、coverslips を置きます。写真は撮影する準備ができているまで、4 ° C でスライドを保存します。

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Representative Results

このプロトコルを完了すると、細胞や関心の RNA プローブを表現している組織の同定が得られます。このプロトコルの代表的な結果は、AP-1、FosB、および TNFR41 です。これらの結果は、以前トレーラー ノウルズ11RNA のショー空間表現は、熱ストレスにさらされた大人のサンゴにプローブします。染色の種類の 2 つの例は図 1に示した。図 1 aは、びまん性組織染色の例です。汚れが特定のセルでだけでなく、組織全体であります。ここでは、対策をした意味 AP 1 の式は表皮と口腔 gastrodermis11 (図 1 a) で発見されます。染色には、ディフューズ ライト、および 1 つの特定のセル型に分離ですが。このタイプの染色では、結果のいくつかは、非特定の染色のためかもしれないと同時に感覚コントロールを実行する特に重要です。

染色の 2 番目のタイプは、セル固有の染色が特定の細胞型にのみ含まれています。FosB (図 1 b) と TNFR41 (図 1) この種類の染色を示します。これらのプローブの両方は11熱ストレスにさらされていた大人のサンゴの組織サンプルで使用されました。アンチセンス パネル紫染色が観察されます。TNFR41 は、さまざまな種類の cnidocytes、刺胞動物 (図 1) 内でのみ検出された細胞のタイプの家族に表現されました。具体的には、それは microbasic mastigophore オルガネラ (刺胞) を生成する nematocytes と spirocysts、サンゴの組織の表皮内で検出されたすべての生成 spirocytes ステンド グラス。Nematocytes にもサンゴ、calicodermis; などの他の組織の層、します。ただし、この特定のサンプルで実行区分によりその情報が収集されなかった。FosB はまたステンド グラス cnidocytes と spirocytes と nematocytes の両方に固有だった。これらのプローブの両方について, 感覚コントロールを示さなかった染色、アンチセンス プローブの染色が確かに特定であることを示します。これらは、2 つのプローブの種類と存在する染色法の代表的な結果 (びまん性組織染色と細胞特異染色)。この変動に起因感覚コントロールを使用して、非特定の染色を確認する重要です。

Figure 1
図 1: 特定のセルをステンド グラス風の代表的な結果。(A) 最初のパネルで AP 1 プローブの感覚コントロールはほとんど染色がスライド内に存在を示しています。2 番目のパネルでは、AP - 1 アンチセンス プローブは、このプローブ染色が組織全体にびまん性を示しています。汚れは、経口 gastrodermis と表皮に固有です。このタイプの染色では、観察された染色される特定ように感覚コントロールを実行するが重要です。(B) 最初のパネルの FosB プローブの感覚コントロールは、少し染色存在を示しています。2 番目のパネルの FosB のアンチセンス プローブを示しています染色 spirocytes と nematocytes、表皮と口腔の gastrodermis を通して拡散染色に固有。(C) 最初のパネルで TNFR 41 プローブの感覚コントロールはほとんど染色がスライド上に存在を示しています。2 番目のパネルで TNFR 41 のアンチセンス プローブは spirocytes、nematocytes、および microblastic mastigophores 内染色固有に示します。省略形: spirocytes (SP)、symbiodium (SY)、nematocyte (NE)、microbasic mastigophores (MM)、共生を含む gastrodermal セル (SU)。この図は、アクセス許可11で再現しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

注:すべて希釈はオートクレーブ処理したガラス製品の滅菌、RNase フリー水でされるべきであります。
Prehybe バッファー (50 mL) 追加
ホルムアミド 25 mL
20 X SSC (pH 4.5) 12.5 mL
20 mg/mL のヘパリン 0.1 mL
50 X Denhardts 5 mL
20% Tween 20 0.5 mL
20% SDS 0.5 mL
10 mg/mL サケ精子 DNA (追加する前に変化させなさい) 2 mL
RNase フリー水 4.4 mL
注:レインポンチョの 50 mL チューブにソリューションが可能です。サケの精子は、ソリューションに追加する前に 5 分のヒート ブロックの上に沸騰によって変性する必要があります。
交配バッファー (47 mL) 追加
ホルムアミド 25 mL
20 X SSC (pH 4.5) 12.5 mL
20 mg/mL のヘパリン 0.1 mL
50 X Denhardts 5 mL
20% Tween 20 0.5 mL
20% SDS 0.5 mL
10 mg/mL サケ精子 DNA (追加する前に変化させなさい) 2 mL
RNase フリー水 1 mL
注:レインポンチョの 50 mL チューブにソリューションが可能です。サケの精子は、ソリューションに追加する前に 5 分のヒート ブロックの上に沸騰によって変性する必要があります。
10 X PBS (1.0 L) 追加
18.6 ミリメートル NaH2PO4 2.56 g
84.1 mM Na2HPO4 11.94 g
1,750 mM の NaCl 102.2 g
ノート:1.0 L のボリュームの水約 800 mL にリン酸塩をミックスします。PH を確認してください。それは 7.4 ± 0.4 をする必要があります。それ以外の場合 pH を 7.4 NaOH の塩酸を追加の塩化ナトリウムと水の残りの部分を調整します。後 pH 調整したオートクレーブです。
20 X SSC (1.0 L) 追加
3 M の NaCl 175.3 g
0.3 M Na クエン酸 88.2 g
ノート:1.0 L のボリュームをもたらすに RNase 自由水の約 800 mL のミックスします。4.5 とオートクレーブに pH を調整します。
MgCl2 (50 mL) w/o アルカリ ・ フォスファターゼ (AP) バッファー 追加
1 M の NaCl 5.0 mL
1 M トリス、pH 9.5 5.0 mL
20% Tween 20 1.25 mL
RNase フリー水 38.75 mL
ノート:50 mL のチューブで使用するちょうど前を準備します。
アルカリ性ホスファターゼ (AP) バッファー (100 mL) 追加
1 M の NaCl 10.0 mL
1 M MgCl2 5 mL
1 M トリス、pH 9.5 10 mL
20% Tween 20 2.5 mL
RNase フリー水 72.5 mL
ノート: 50 mL のチューブで使用する直前の準備します。ソリューションは、数時間後曇りになるし、酵素反応のための仕事は、もはや。
AP 基板ソリューション 追加
Ap 通信バッファー 25 mL
NBT 82.5 uL
BCIP 82.5 uL
ノート: これは BM 紫の代わりに使用できます。50 mL のチューブで使用するちょうど前を準備します。箔チューブをカバーし、低光の中の準備で暗闇の中でこのソリューションをしてください。
プロティナーゼ K 原液 (10 mg/mL) 追加
プロテイナーゼ K 10 mg
RNase フリー水 10 mL
ノート:因数と-20 ° C にてストア
作業ソリューション プロティナーゼ K 追加
プロティナーゼ K 原液 90 ul
1X PBS 18 mL
ノート:直前に最良の結果を使用するを確認します。
0.2% グリシン PBS 溶液 追加
10 X PBS 45 mL
RNase フリー水 405 mL
グリシン 1 g
ノート: オートクレーブ処理したガラス容器の準備します。グリシンは完全に溶解するまで室温 stirer プレート上でミックスします。
ベーリンガーインゲルハイム マンハイム ブロック バッファー (30 mL) (掘る洗浄とブロック バッファー セットの一部) 追加
解決を妨げる x 10 3 mL
マレイン酸バッファー x 1 27 mL
メモ: 直前に最良の結果を使用すること。ブロック原液とマレイン酸バッファーから使用された、「掘るを洗って、ブロック-バッファー セット」。
4 X SSC-50% ホルムアミド (30 mL) 追加
20 X SSC 6 mL
50% ホルムアミド 24 mL
ノート:50 mL のチューブで使用するちょうど前を準備します。研究所のフードの下で準備します。
グリセロールは、メディアをマウント 追加
50 mM トリス、pH 8.4 80 Μ L
グリセロール 20 Μ L

表 1: ソリューションを実行するための在庫その場で交配します。テーブルは、このプロトコルに必要なさまざまな在庫ソリューションのリストです。合計金額は約 2 スライド メーラーのパフォーマンスのために推定されます。それは処理されているスライド量に基づく合計金額を調整する勧めします。

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Discussion

このプロトコルで説明する方法は、医学と進化的発達研究8,9,10,12,17で前作から変更されています。このプロトコルは、保持されているし、パラフィンに埋め込まれた大人のサンゴに DIG 標識 RNA アンチセンス プローブの in situハイブリダイゼーションのニュアンスに焦点を当てください。このメソッドは、パラフィン包埋もサンゴを超えて生物のサンプルを簡単に転送できます。最後に、このメソッドを実行できる日中のサンゴ (例えば幼虫) または細胞培養内の異なるライフ ステージがサンプルのこれらのタイプは、必ずしもパラフィン埋め込まれた5,6ではないために、正確なプロトコルが異なる場合があります。.

プロティナーゼ K の治療、プローブの交配およびプローブの発色を含む、このプロトコルではいくつかの重要な手順があります。プロティナーゼ K の治療中には、タイミングがとても重要です。治療が推奨するよりも長い場合は、組織することができます低下なり破損しています。さらに、指定のフルタイム位置にプロティナーゼ K 反応の停止を行わなければなりません。また交配の一定温度でサンプルを保つために重要です、温度の低下としてプローブの非特異的結合が発生し、結果を複雑にします。プローブを洗浄、スライドを行う低温プローブと交配しないことを確保するため、一度にすべてではなく、時間で 1 つハイブリダイゼーション オーブンから各スライドを取ることが重要です。また、プローブの交配後、スライドを徹底的に洗浄は、非特異的結合を防ぐのに役立ちます。最後に、プローブの発色は、このプロセスの最も重要なまだ主観的な手順の 1 つです。発色を簡単に行き過ぎまたは余りにすぐに停止することができます。この手順には忍耐が必要です、そのオーバー スライド染色ように警戒が発生しません。

このプロトコルのトラブルシューティング手順の数のための非常に困難なプロセスをすることができます。プロトコルは、否定的な結果を生成ならそれは最高のそれはアンチの意味 (意味ない) かどうかを確認するプローブを調べることによって開始するプローブ。さらに、ソリューションが古いなら、リメイクしたり置き換えたりしてので、このプロトコルを実行するとき、彼らは新鮮な価値です。プローブの交配またはバック グラウンドと非特異染色の量を減らすことの可能性を高めるため、交配と、ブロックの長さなどの変更を実装できます。このプロトコルの手順の数が多いためそれはトラックを失うことは容易かもしれないそのため、整理整頓し、プロトコルのどの部分が完了しているかを追跡することが重要です。また、手順をスキップしません、孵化および洗浄中に、当時のカットされていないことを確認する重要です。親指の良いルールは、すべてのスライドが徹底的にクリーンアップされるように短い洗浄よりも長いためにです。

このメソッドの最大の制約は、結果もつかないです。これは質的研究法、組織学、トランスクリプトミクス、プロテオミクスなど他の方法でのコンサートでは非常に有益です。交配時間と同様の主観的可視化時の違いは、染色の強さを定量化、簡単に達成されません。言う大きな強度を示していますが、このプロトコル (発色の許容時間の量) などの変動に伴う遺伝子発現量を決定できない場合、プローブはより高度に発現する魅力的です。

この手法は生物学の新しい方法ではありません。しかし、大人のサンゴで非常によく実行されません 1 つです。それは組織に遺伝子発現データを固定またはセル入力11アダルト サンゴにこのメソッドを使用しては非常に強力。ゲノムとトランスクリプトーム サンゴ生物学で人気のある、強力なツールとなっています。ただし、これらのメソッドは、全体の動物ので一般的に行われます。これは、興味の遺伝子を表現しているサンゴのどの部分を識別するために挑戦し、こうして実際のメカニズムを理解することより困難になります。遺伝子発現データと共にっぽいを使用して遺伝子を発現する場所とはどの程度をより包括的なアプローチを実現できます。これはアダルト サンゴで異なるストレス応答経路を担当のメカニズムの理解に大きく役立ちます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品賞によって資金が供給されたないです。バローズ Wellcome 基金ポスドク濃縮プログラムから国立科学財団海洋科学員と賞の no.1012629 を介して OCE 1323652。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Denhardt's solution Affymetrix 70468 50 ML
Bioworld Alkaline phosphatase buffer Fisher 50-198-724
Slide mailers Fisher 12-587-17B
Bioworld Alkaline phosphatase buffer Fisher 50-198-724
50 mL Falcon tubes Fisher 14-959-49A
UltraPure Salmon Sperm DNA solution Invitrogen 15632-011
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 Invitrogen AM9625
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL Invitrogen 10977-023
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL Invitrogen 10977-023
UltraPure Salmon Sperm DNA solution Invitrogen 15632-011
Slide white apex superior adhesive Leica Biosystems 3800080
PBS solution, pH 7.4 Life Technologies 10010072
Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL New England Biolabs P8107S
Super Pap Pen Liquid Blocker Promega 22309
DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments Roche 11093274910
BM Purple, 100 mL Roche 11442074001
DIG Wash and Block Buffer Set Roche 11585762001
NBT/BCIP Roche 11681451001
Formaldehyde solution, 500 mL size Sigma-Aldrich 252549-500ML
SSC Buffer 20X concentration Sigma-Aldrich S6639-1L
Acetic Anhydride Sigma-Aldrich 320102-100ML
Formamide Sigma-Aldrich 47670-250ML-F
Triethanolamine Sigma-Aldrich 90279-100ML
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3149-10KU
Xylenes, AR (ACS), For Histological Use VWR MK866806
Ethanol VWR EM-EX0276-4S
TE buffer VWR PAV6232
hybridization oven VWR 97005-252, 97005-254
Orbital shaker VWR 89032-088

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301, (5635), 933 (2003).
  2. Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30, (Supplement C), 12-20 (2015).
  3. Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318, (5857), 1742 (2007).
  4. Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9, (1), 540 (2008).
  5. Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8, (4), R59 (2007).
  6. Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8, (1), 311 (2008).
  7. Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392, (1-2), 14-21 (2007).
  8. In situ hybridization protocols. Darby, I. A., Hewitson, T. D. Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).
  9. Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization. Oxford University Press. (1987).
  10. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, (2), 81-85 (1989).
  11. Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220, (10), (2017).
  12. Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
  13. Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5, (1), 15 (2014).
  14. Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6, (1), (2015).
  15. Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8, (1), 24 (2017).
  16. Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5, (1), 3 (2014).
  17. Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48, (8-9), 719-729 (2004).

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