Enkelt Sensillum optagelser for johannesbrød Palp Sensilla Basiconica

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dette papir beskriver en detaljeret og yderst effektiv protokol for enkelt sensillum optagelser fra sensilla basiconica på blækspruttearme af insekt mouthparts.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Li, H., You, Y., Zhang, L. Single Sensillum Recordings for Locust Palp Sensilla Basiconica. J. Vis. Exp. (136), e57863, doi:10.3791/57863 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Blækspruttearme af locust mouthparts betragtes som konventionelle gustatoriske organer, der spiller en vigtig rolle i en locust mad valg, navnlig til påvisning af ikke-flygtige kemiske signaler gennem sensilla chaetica (tidligere benævnt terminal sensilla eller crested sensilla). Der er nu stadig flere beviser at disse blækspruttearme også har en olfaktoriske funktion. En lugtstof receptor (LmigOR2) og en lugtstof-bindende protein (LmigOBP1) er blevet lokaliseret i neuroner og tilbehør celler, henholdsvis i sensilla basiconica af blækspruttearme. Enkelt sensillum optagelse (SSR) bruges til at registrere svarene fra lugtstof receptor neuroner, som er en effektiv metode til screening af aktive ligander på specifikke lugtstof receptorer. SSR bruges i funktionelle studier af lugtstof receptorer i palp sensilla. Strukturen i den sensilla basiconica beliggende på kuplen af blækspruttearme anderledes end af dem på antennerne struktur. Derfor, når du udfører en SSR fremkaldt af duftstoffer, nogle specifikke råd kan være nyttige for at opnå optimale resultater. I dette papir, er en detaljeret og yderst effektiv protokol for en SSR fra insekt palp sensilla basiconica indført.

Introduction

Dyr har udviklet sig en række chemosensory organer, der fornemmer eksogene kemiske signaler. I insekter er de vigtigste chemosensory organer antenner og blækspruttearme. På disse organer, er flere typer af chemosensory hår, kaldet chemosensory sensilla, innerveres af chemosensory neuroner (CSNs) inden for hår. CSNs i chemosensory sensilla genkende specifikke kemiske signaler gennem signaltransduktion fra kemiske stimuli til elektriske potentialer, der overføres efterfølgende til den centrale nervesystem1,2,3 .

CSNs udtrykke forskellige chemosensory receptorer [fxlugtstof receptorer (ORs)], ionotropic receptorer (IRs) og gustatoriske receptorer (GRs) på deres membraner, som indkode eksogene kemiske signaler forbundet med forskellige typer af chemosensation 4,5,6. Karakterisering af CSNs er nøglen til udredning af cellulære og molekylære mekanismer af insekt chemoreception. Nu enkelt sensillum optagelse (SSR) er en meget udbredt teknik til karakterisering af insekt CSNs i de antennal sensilla af mange insekter, herunder flyver7, møl8, biller9, bladlus10, græshopper11, og myrer12. Men få studier har anvendt en SSR insekt blækspruttearme13,14,15,16,17, fordi de særlige strukturer i deres sensilla gøre en elektrofysiologiske optagelse vanskeligt18.

Sværme af græshopper (Orthoptera) forårsage ofte alvorlige afgrøde skader og økonomiske tab19. Blækspruttearme menes at spille en vigtig rolle i mad udvælgelsen af græshopper20,21,22,23,24. To typer af chemosensory sensilla er undersøgt af en scanning elektron mikroskop (SEM). Normalt, er 350 sensilla chaetica og 7-8 sensilla basiconica observeret på hver kuppel af locust blækspruttearme18. Sensilla chaetica er gustatoriske sensilla, der fornemmer ikke-flygtige kemiske signaler, der henviser til, at sensilla basiconica har en olfaktoriske funktion, sensing flygtige kemiske signaler.

På locust blækspruttearme, diameteren af hår stikkene af sensilla basiconica (ca. 12 µm), er meget større end dem af sensilla chaetica (ca. 8 µm)18,25. Sensilla basiconica på blækspruttearme cuticular væg er meget tykkere end antennal sensilla18. Derudover har kuplen af palp væske indhold inden for en meget fleksibel neglebånd. Disse egenskaber betyder, at en penetration med en mikroelektrode og anskaffelsen af god elektrofysiologiske signaler er vanskeligere end for antennal sensilla. I dette papir præsenteres en detaljeret og yderst effektiv SSR protokol for johannesbrød palp sensilla basiconica med en video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fremstilling af instrumenter og insekt

  1. Forberede wolfram elektroder og stimuli løsninger
    1. Lave en ny wolfram wire (diameter på 0,125 mm, længde 75 mm) til en micromanipulator og skærpe det i en 10% (w/v) natrium nitrit (NaNO2) løsning i en sprøjte på 10 V leveret af en strømforsyning for ca. 1 min. under et stereomikroskop (40 X forstørrelse).
    2. Dyp skærpet wolfram wire gentagne gange i 10% NaNO2 løsning, omkring 4 mm på 5 V i < 1 min (figur 1A).
    3. Undersøge diameteren af skærpet wolfram spidsen ofte under stereomikroskopet, indtil det er fint nok til at trænge ind i neglebånd af en locust palp olfaktoriske sensillum (figur 1B).
    4. Forberede stimulus løsninger. Fortynd hver af stoffets kemiske stimuli i mineralsk olie. Fortyndes 1-nonanol og nonanoic syre på 10% fortyndinger. Fortyndes E-2-hexenal og hexanal på 10-2, 10-3, 10-4og 10-5.
    5. Forberede Pasteur rør transporterer stimuli: Indsæt filterpapir strimler (længde på 2 cm, bredde på 0,5 cm) i Pasteur rør, tilføje fortyndet stimulus løsninger (hver 10 µl) til filterpapir strimler, og sæt derefter Pasteur rør med pipette tips (1 ml).
  2. Forberede insekt
    1. Bageste græshopper (Locusta migratoria) med frisk hvede planter under overfyldt forhold ved en relativ luftfugtighed på 60%, en temperatur på 28-30 ° C og en lysperiode på 18:6 h (lys: mørke). Vælg 1 til 3 dage gamle 5th instar locust nymfer og fjerne antenner med fine saks til at undgå enhver form for indblanding, når du optager.
  3. Forberede locust maxillary palp indehaveren
    1. Bruge et glas dias (25 mm x 75 mm) som base af indehaveren maxillary palp (MPH). Vedhæfte en plastik stykke (1 mm i højde, bredde, længde 35 mm og 10 mm) til et hjørne af glas dias med dobbeltklæbende tape, og endelig fastsætte en cover glas (18 mm x 18 mm) oven på den plastik stykke med dobbeltklæbende tape. Placere et lille stykke af røde gummi tape på dækslet glas som en skridsikker lag. Den plastik stykke og dække glas udgør platformen for johannesbrød palp. Højden på platformen er ca. 1,5 mm.
    2. Installere en wolfram tråd (diameter på 0,125 mm, længde 36 mm) i en afstand af 1,5 mm parallelt med indvendigt kant af platformen. Fastsætte de to ender af wiren på platform med dobbeltklæbende tape.

2. forberedelse af Locust Maxillary blækspruttearme

  1. Skær et centrifugeglas (1,5 ml) lodret i halve og skære ned i bunden. Sted locust ind i rede rør. Forlade den ventrale region og lederen af johannesbrød udsat. Rette forsamling til glas dias med dobbeltsidet tape (figur 2A).
  2. Trække den lige maxillary palp på platformen.
  3. Sætte wolfram wire på den fjerde segment af palp. Placerer klæbestof putty på hver side af wolfram tråd, omkring 2 mm fra den maxillary palp (figur 2A og 2B).

3. fælles Sensillum optagelser

  1. Sted locust maxillary palp forberedelse under et mikroskop på en lav forstørrelse (100 X). Justere placeringen af præparatet, indtil palp er vinkelret optagelse elektrode (figur 3A).
  2. Indsæt referenceelektrode (Wolfram elektrode) i locust øjet ved hjælp af en micromanipulator. Flytte optagelse elektrode (Wolfram elektrode) tæt på den maxillary palp med micromanipulator (figur 3B og 3 C).
  3. Justere enhedens lugt levering til ca 1 cm fra den maxillary palp (figur 3B).
  4. Åbn indspilningsprogrammet Auto Spike 32. Indstille optagelse parametre som følger: optagelse skala på 500 µV; den høje cutoff af filteret på 300 Hz, lav cutoff på 200 Hz; og pretrigger på 10 s.
  5. Tilsluttes en 10 x universal AC/DC forstærker optagelse elektrode.
  6. Skifte mikroskop til en høj forstørrelse (500 X). Indsæt optagelse elektrode i bunden af en basiconic sensillum på den maxillary palp og fint justere optagelse elektroden for at opnå god spontan pigge (figur 3D).
  7. Åbn stimulus controller for at levere en kontinuerlig luftstrøm på 20 ml/s. indstille stimulation til 1 s. post signaler for 10 s, begynder 10 s inden fremkomsten af stimulus puls.
  8. Bruge en 10 x universal AC/DC forstærker til at forstærke signalerne. Feed signalerne i IDAC 4. Analysere signaler med Auto Spike 32 software. AC signaler er sporgruppe-pass filtreret mellem 200 og 300 Hz. Brug Auto Spike 32 for at skelne mellem peak til lavpunktet amplituder lyde. Beregne svar af neuroner som stigninger i aktionspotentialet frekvenser (spikes pr. sekund) over de spontane frekvenser. Udføre en statistisk analyse ved hjælp af GraphPad prisme 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

To sensilla undertyper (pb1 og pb2) på locust maxillary palp er identificeret, baseret på forskellige svar dynamics til kemiske duftstoffer (10% 1-nonanol og 10% nonanoic syre). Neuroner i pb1 producere væsentligt mere spikes til 1-nonanol end at nonanoic syre mens neuroner i pb2 er betydeligt mindre aktiveres af 1-nonanol sammenlignet med nonanoic syre (figur 4). Hexanal og E-2-Hexenal kan fremkalde en locust palp åbne svar (POR)26. Hexanal er en rigelig host plante grønne blad flygtige som kan bidrage til en yderligere bekræftelse til mad kilde26. Spikes fremkaldte i pb1 neuroner sidst længere end dem hos pb2 når de stimuleres af E-2-hexenal (figur 4). Neuroner i pb1 og pb2 udviser ligeledes robuste svar til hexanal (figur 4). Man sammenligner de gennemsnitlige ændringer af alle pigge mellem perioder 5 s før og 5 s efter stimulering angiver at svar på 1-nonanol er væsentligt højere end at nonanoic syre i pb1, men contrarily i pb2 (figur 5). Neuroner i disse to undertyper af sensilla reagere dosis-afhængigt til E-2-hexenal og hexanal, og deres svar mønstre til disse to aldehyder afviger (figur 6A og 6B).

Figure 1
Figur 1. Elektrode forberedelse. (A) dette panel viser en generel opfattelse af elektrode skarphed apparater. Sprøjte indeholdende 10% NaNO2 (venstre) bruges til at skærpe elektroden (til højre). (B) dette panel viser en tæt udsigt over elektroden tip (a: egnet; b: uegnet). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Locust maxillary palp indehaveren (MPH). (A) den MPH og en locust er monteret på glas dias før placerer sig under mikroskop. (B) dette panel viser et nærbillede af locust maxillary palp, fastsættes af wolfram tråd på platformen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Enkelt sensillum optagelser. (A) dette panel viser en udsigt over Elektrofysiologi setup. (B) dette panel viser en tæt udsigt over locust forberedelse monteret på mikroskopet. (C) dette billede viser den locust maxillary palp på 100 X forstørrelse. (D) dette billede viser en palp på 500 X forstørrelse. Pilen angiver en basiconic sensillum. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Svar spor af enkelt sensillum optagelser af locust maxillary palp. I dette panel står pb1 for undertype 1 af palp sensilla basiconica; pB2 står for subtype 2 af palp sensilla basiconica. Bjælker over sporene anføre stimulus (1 s). For disse optagelser bruges alle lugte på 10% fortyndinger bortset fra E-2-hexenal og hexanal, som er fortyndet til 1%. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al. 26. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Sammenligning af gennemsnitlig tal af pigge i neuroner i pb1 og pb2 stimuleret af nonanoic syre og 1-nonanol. Det gennemsnitlige antal pigge beregnes i perioder 5 s før og efter stimulation. I pb1, det gennemsnitlige antal pigge i neuroner reagerer på 1-nonanol stige betydeligt højere end de af pigge i neuroner reagerer på nonanoic syre (n = 11 blækspruttearme; ANAVA med post hoc t-tests; p < 0,0001), i modsætning til pb2 (n = 10 blækspruttearme; ANAVA med post hoc t-tests; p = 0.0110). Fejllinje repræsenterer SEM. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al. 26. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Mønstre af neuroner i pb1 og pb2 reagere dosis-afhængigt til E-2-hexenal og hexanal. (A) dette panel viser mønstre af neuroner i pb1 (± SEM; n = 12 blækspruttearme). (B) dette panel viser mønstre af neuroner i pb2 (± SEM; n = 10 blækspruttearme). Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al. 26. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Insekter afhængige blækspruttearme at opdage mad lugt, og deres blækspruttearme menes at spille en vigtig rolle i artsdannelse13,27. Blækspruttearme er simpel olfaktoriske organer og får stigende opmærksomhed som en attraktiv model for udforskning af neuromolecular netværk underliggende chemosensation28.

Insekt labellar og palp SSRs er blevet med held udført på Drosophila melanogaster, Anopheles gambiaeog Culex quinquefasciatus13,14,15,16 , 17 men er sjældent blevet rapporteret i form af en video-præsentation16,29. Derimod er video data på antennal SSRs tilgængelige for Drosophila, navlen orangeworm moth (Amyeloistransitella), Schistocerca Americanaog væggelus (Cimex lectularius)16, 30 , 31 , 32 , 33.

Locust palp sensilla basiconica har en særlig struktur, der adskiller sig fra locust antennal sensilla og mange andre insekt sensilla. Ved hjælp af metoden beskrevet her, handling potentialer genereret af locust palp sensilla basiconica undertyper pb1 og pb2 kunne registreres og diskriminerede (figur 4 og figur 5).

Den kritiske trin er penetration af optagelse elektrode. Optagelse elektrode bør indsættes i bunden af sensillum og avancerede indtil god signaler er erhvervet. Derudover er det vigtigt at forebygge kuplen af palp fra kollapse når optagelse elektrode er indsat i bunden af sensillum. For at opnå dette, vi etableret en platform, herunder en særlig locust maxillary palp indehaveren (MPH) og bruges en wolfram tråd til at komprimere den fjerde segment af palp. Mange gentagelser af denne procedure viser, at dette er effektiv. Baseret på respons mønstre af neuroner i sensilla til flere duftstoffer, har, vi for første gang har identificeret to undertyper af sensilla basiconica på locust maxillary palp, nemlig pb1 og pb2.

Begrænsning af den teknik, der er skitseret i denne publikation er at det kunne bruges til at optage store insekter (fx, møl, biller og græshopper) ikke at optage små insekter (fx, fluer og myg), som har deres egne platforme og teknikker13,14,15,16,17. Denne teknik er et supplement til eksisterende metoder.

Afslutningsvis er en yderst effektiv protokol af en SSR fra insekt palp sensilla basiconica beskrevet i detaljer. Denne protokol kan give forskere med en nyttig teknik i studiet af molekylære og cellulære mekanismer af insekt lugtesansen på mouthpart. Denne metode i forbindelse med gaschromatografi kunne bruges til at identificere naturlige electrophysiologically-aktiv ligander i uddrag af gunstige mad ressourcer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde er støttet af en bevilling fra National Natural Science Foundation of China (No.31472037). Enhver omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne artikel er udelukkende til brug for specifikke oplysninger og indebærer ikke en anbefaling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tungsten wire ADVENT W559504 Used for making the electrode and fixing the palp
NaNO2 Sigma-aldrich 563218-25G Used for sharpening the tungsten wire
AC Power Supply Syntech A2-70 Providing the voltage in sharpening the tungsten wire
Stereoscope Motic SMZ-163 Used for observing the sharpening of tungsten wire
Microscope Olympus W-51 Used for observing the sensilla on locust maxillary palp
Intelligent Data Acquisition Controller Syntech IDAC-4 Real-time on screen display of all signals before and during recording
Stimulus controller Syntech CS-55 Used for controlling the stimulus application
Electronic micromanipulator C.M.D.T CFT-8301D Used for minor movement of the recording electrode
Micromanipulator Narishige MN-151 Used for minor movement of the reference electrode
Speaker EDIFIER R101T06 Connected with IDAC-4 and providing sound for the signal
Magnetic base PDOK PD-101 Used to hold the electrode, and stimulus delivery tube
Vibration Isolation Table TianHe HAP-100-1208 Used for isolating the vibration from the equipment
Glass slide CITOGLAS ZBP-407 Used for making the base for the MPH
Blu-tack Bostik Blu-tack-45g Fixing the tungsten wire
Pasteur tube YARE WITEG Placing the filter paper containing stimuli stimulus solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carey, A. F., Carlson, J. R. Insect olfaction from model systems to disease control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (32), 12987-12995 (2011).
  2. Leal, W. S. Odorant reception in insects: roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes. Annual Review of Entomology. 58, 373-391 (2013).
  3. Zhang, J., Walker, W. B., Wang, G. Pheromone reception in moths: from molecules to behaviors. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 130, 109-128 (2015).
  4. Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96, (5), 725-736 (1999).
  5. Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila. Cell. 136, (1), 149-162 (2009).
  6. Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
  7. de Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. Odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 30, 537-552 (2001).
  8. Roelofs, W., et al. Sex pheromone production and perception in European corn borer moths is determined by both autosomal and sex-linked genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, (21), 7585-7589 (1987).
  9. Larsson, M. C., Leal, W. S., Hansson, B. S. Olfactory receptor neurons detecting plant odours and male volatiles in Anomala cuprea beetles (Coleoptera: Scarabaeidae). Journal of Insect Physiology. 47, (9), 1065-1076 (2001).
  10. Zhang, R., et al. Molecular basis of alarm pheromone detection in aphids. Current Biology. 27, (1), 55-61 (2017).
  11. Cui, X., Wu, C., Zhang, L. Electrophysiological response patterns of 16 olfactory neurons from the trichoid sensilla to odorant from fecal volatiles in the locust, Locusta migratoria manilensis. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 77, (2), 45-57 (2011).
  12. Sharma, K. R., et al. Cuticular hydrocarbon pheromones for social behavior and their coding in the ant antenna. Cell Reports. 12, (8), 1261-1271 (2015).
  13. de Bruyne, M., Clyne, P. J., Carlson, J. R. Odor coding in a model olfactory organ: the Drosophila maxillary palp. Journal of Neuroscience. 19, (11), 4520-4532 (1999).
  14. Syed, Z., Leal, W. S. Maxillary palps are broad spectrum odorant detectors in Culex quinquefasciatus. Chemical Senses. 32, (8), 727-738 (2007).
  15. Lu, T., et al. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Current Biology. 17, (18), 1533-1544 (2007).
  16. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36, e1725 (2010).
  17. Grant, A. J., Wigton, B. E., Aghajanian, J. G., O'Connell, R. J. Electrophysiological responses of receptor neurons in mosquito maxillary palp sensilla to carbon dioxide. Journal of Comparative Physiology A. 177, (4), 389-396 (1995).
  18. Blaney, W. The ultrastructure of an olfactory sensillum on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.). Cell and Tissue Research. 184, (3), 397-409 (1977).
  19. Hassanali, A., Njagi, P. G. N., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annual Review of Entomology. 50, 223-245 (2005).
  20. Chapman, R. F. Contact chemoreception in feeding by phytophagous insects. Annual Review of Entomology. 48, 455-484 (2003).
  21. Chapman, R. F., Sword, G. The importance of palpation in food selection by a polyphagous grasshopper (Orthoptera: Acrididae). Journal of Insect Behavior. 6, 79-91 (1993).
  22. Winstanley, C., Blaney, W. Chemosensory mechanisms of locusts in relation to feeding. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 750-758 (1978).
  23. Blaney, W., Duckett, A. The significance of palpation by the maxillary palps of Locusta migratoria (L.): an electrophysiological and behavioural study. Journal of Experimental Biology. 63, 701-712 (1975).
  24. Blaney, W. Electrophysiological responses of the terminal sensilla on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.) to some electrolytes and non-electrolytes. Journal of Experimental Biology. 60, 275-293 (1974).
  25. Jin, X., Zhang, S., Zhang, L. Expression of odorant-binding and chemosensory proteins and spatial map of chemosensilla on labial palps of Locusta migratoria (Orthoptera: Acrididae). Anthropod Structure & Development. 35, (1), 47-56 (2006).
  26. Zhang, L., Li, H., Zhang, L. Two olfactory pathways to detect aldehydes on locust mouthpart. International Journal of Biological Sciences. 13, (6), 759-771 (2017).
  27. Dweck, H. K. M., et al. Olfactory channels associated with the Drosophila maxillary palp mediate short- and long-range attraction. eLife. 5, e14925 (2016).
  28. Bohbot, J. D., Sparks, J. T., Dickens, J. C. The maxillary palp of Aedes aegypti, a model of multisensory Integration. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 48, 29-39 (2014).
  29. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. Journal of Visualized Experiments. 84, e51355 (2014).
  30. Ng, R., Lin, H. H., Wang, J. W., Su, C. Y. Electrophysiological recording from Drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility. Journal of Visualized Experiments. 125, e56147 (2017).
  31. Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. Journal of Visualized Experiments. 49, e2489 (2011).
  32. Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit recording methods to characterize neural activity in the locust (Schistocerca Americana) olfactory circuits. Journal of Visualized Experiments. 71, e50139 (2013).
  33. Liu, F., Liu, N. Using single sensillum recording to detect olfactory neuron responses of bed bugs to semiochemicals. Journal of Visualized Experiments. 107, e53337 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics