Detección de localización subcelular de la proteína por etiquetado de proteína de fluorescencia verde y 4', 6-Diamidino-2-phenylindole coloración en Caenorhabditis elegans

Biology

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Summary

Este protocolo muestra cómo realizar el seguimiento un desplazamiento nuclear de la proteína bajo estrés de calor usando una fluorescencia verde (GFP) fusion proteína como marcador y 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tinción. El protocolo de tinción de DAPI es rápido y conserva las señales de localización subcelular de GFP y proteína.

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Liang, J., De Castro, A., Flores, L. Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (137), e57914, doi:10.3791/57914 (2018).

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Abstract

En este protocolo, una proteína de fusión de fluorescencia verde (GFP) de proteína y 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tinción se utilizan para el seguimiento de los cambios de localización subcelular de proteínas; en particular, una translocación nuclear bajo un calor estrés condición. Las proteínas reaccionan señales correspondientemente a internos y externas. Un mecanismo común es cambiar su localización subcelular. Este artículo describe un protocolo para el seguimiento de localización de la proteína que no requieren un anticuerpo etiquetado radiactivo y un microscopio confocal. En este artículo, GFP se utiliza para etiquetar la proteína diana EXL-1 de C. elegans, un miembro de la familia de proteínas (Predescargado) cloruro canal intracelular, incluyendo CLIC4 mamíferos. Una línea transgénica de traslación integrado exl-1::gfp (con un promotor y una secuencia del gen completo) fue creada por transformación y γ-radiación y estable expresa el gene y gfp. Recientes investigaciones demostraron que al estrés por calor, el estrés oxidativo no, EXL-1::GFP se acumula en el núcleo. Superposición de la señal GFP con la estructura de los núcleos y el DAPI señales confirma los cambios de la localización subcelular de EXL-1 bajo estrés. Este protocolo presenta dos métodos de fijación diferentes para tinción DAPI: fijación fijación del etanol y acetona. El protocolo de tinción DAPI presentado en este artículo es rápido y eficiente y conserva la señal GFP y los cambios de localización subcelular de la proteína. Este método sólo requiere un microscopio de epifluorescencia con un filtro DAPI, Nomarski y un filtro FITC. Es conveniente para un ambiente pequeño laboratorio, investigación de estudiante de pregrado, investigación de estudiante de secundaria y aulas de biotecnología.

Introduction

Un cambio de la localización subcelular de la proteína es un mecanismo común en respuesta a señales internas o externas como el estrés por calor, hambre, estrés oxidativo, apoptosis, fosforilación de proteínas y otros. Por ejemplo, estrés por calor induce un miembro FOXO DAF-16 translocación nuclear1,2y la proteína del BCL-2 pro-apoptótica que BID se transloca a la mitocondria a muerte recibe señalización3,4. Varias técnicas están disponibles para detectar estos cambios. Una combinación de western blot y aislar bioquímicamente estructuras subcelulares (p. ej., mitocondrias o el núcleo) bien podría alcanzar la meta de3. Sin embargo, requiere un anticuerpo específico contra la proteína de interés. Por lo tanto, un anticuerpo bien establecido se convierte en la clave del éxito. Un enfoque alternativo es rotular diferentes estructuras subcelulares u organelos con diversos marcadores como la proteína de fluorescencia verde (GFP), proteína de la fluorescencia roja (RFP), proteína de fluorescencia amarilla (YFP) y mCherry, y mientras tanto la proteína de la etiqueta interés con otros marcadores. Entonces, los observa bajo un microscopio confocal para localizar los objetivos5,6. Isótopos radiactivos son una alternativa para el etiquetado de las proteínas de la blanco y entonces detectar su localización subcelular7. Sin embargo, este método requiere una formación adecuada y el manejo de desechos radiactivos. En circunstancias como la falta de un anticuerpo específico, la ausencia de un marcador adecuado o el scarceness de equipos como el microscopio confocal, un enfoque alternativo debe ser considerado. Para identificar un desplazamiento nuclear de la proteína, es atractivo solamente etiquetar las proteínas de la blanco con un marcador y para teñir los núcleos con el reactivo químico 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ya que esto sólo requiere un microscopio de fluorescencia regular.

C. elegans de la inmunomarcación con anticuerpos es difícil debido a la baja permeabilidad de la cáscara de huevo o de la cutícula colagenosa que rodea el animal. Mientras tanto, ya que las proteínas de C. elegans son significativamente divergentes de sus ortólogos vertebrados, algunas compañías comerciales proporcionan C. elegans con productos específicos. Es difícil para un pequeño laboratorio generar anticuerpos C. elegans por sí mismos. Los investigadores en la comunidad suelen ser etiquetadas proteínas como marcadores para demostrar una expresión de localización o gen de la proteína. Este artículo utiliza EXL-1::GFP como un ejemplo a seguir un desplazamiento nuclear de la proteína bajo estrés de calor8. Una traslación integrado exl-1::gfp en el genoma de animales se utiliza para expresar estable el gen con la fusión de gfp . La investigación demostró que exl-1 se expresa en intestino, músculo de la pared del cuerpo y otras estructuras subcelulares8. Este protocolo muestra cómo sincronizar los gusanos para el cuarto lugar larvario (L4), realice una calor estrés experimento y conducta tinción DAPI, etanol de la fijación, fijación de acetona y la proyección de imagen en un microscopio de fluorescencia regular.

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Protocol

1. las soluciones

  1. Planchas NGM
    1. En un matraz de Erlenmeyer de 2 L, añadir 3 g de NaCl, 17 g de agar, 2,5 g de peptona y 975 mL de dH2O. tapa la boca del matraz con papel de aluminio. Autoclave el matraz durante 50 minutos enfriar durante 20-30 minutos.
    2. Luego añadir soluciones estériles: 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de colesterol 5 mg/mL en etanol, 1 mL de 1 M MgSO4y 25 mL de tampón de 1 M KPO4 (pH 6.0). Remolino de las soluciones para mezclarlos bien.
    3. Utilizando un dosificador de líquido, dispensar la solución NGM a placas de Petri de 60 mm. Llenado completo de las placas de 2/3 de agar. Guárdelos en un recipiente hermético a 4 º C para uso futuro.
  2. Tampón de4 de KPO de 1 M (pH 6.0)
    1. 10,83 g de KH2PO4 y 3,56 g de K2HPO4 en dH2O se disuelven, luego ajuste el volumen total a 100 mL. Autoclave de la solución durante 15 minutos.
  3. M9
    1. Disolver 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl en dH2O, añadir 1 mL de 1 M MgSO4y ajuste el volumen total a 1 L.
  4. DAPI de 10 μg/mL
    1. Añadir 1 μl de 10 mg/mL DAPI en 999 μl de dH2O.
  5. alcohol al 95% (v/v)
    1. Mida 95 mL de alcohol al 100% y añada agua destilada para ajustar el volumen a 100 mL.
  6. acetona al 30% (v/v)
    1. Añadir 30 mL de acetona a dH2O y ajuste el volumen total de 100 mL.

2. calor

  1. Generar una matriz Extracromosómica con un constructo traslacional de target genes9,10. También puede obtener tales líneas de centro de genética de Caenorhabditis (CGC), que es un recurso público para la investigación de C. elegans , o de un laboratorio de investigación previamente publicada.
  2. Integrar las líneas extracromosómicas en el genoma al exponer los gusanos a 3.800 Rad γ-radiación9. A continuación, seleccione las líneas estable expresadas para que cada animal expresa una proteína del marcador como GFP o rodillo.
  3. Para eliminar las mutaciones generadas durante la radiación, outcross las líneas por lo menos 2 x. Utilice esta línea transgénica para detectar cambios de patrones de expresión de la proteína bajo estrés.
  4. Preparar platos para NGM gusano como se describe en el paso 1.1. Raya un clon OP50 y cultura la bacteria en caldo LB líquido durante la noche. Semilla de las planchas NGM con líquido OP50 cultivan e incuban las placas en una incubadora de 37 ° C durante la noche para crecer un césped de bacterias como fuente de alimento para los gusanos. Enfriar las placas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos antes de su uso.
  5. Crecer la línea transgénica a 20 ° C sin hambre durante al menos 2 generaciones antes de la prueba de estrés de calor.
  6. Tomar a 8 a 10 jóvenes grávidas (útero llenado de huevos) que una nueva placa de gusano, luego deje que ellos ponen huevos por unos 3 a 5 h y retire a todos los adultos de las placas.
  7. Para sincronizar los gusanos, que los huevos se incuban y crecen las larvas de aproximadamente 48 h para el cuarto estadio larvario (L4). Examinar su vulva estructura una media luna para identificar la etapa (figura 1, flecha) L4 del11.
  8. Coloque las placas de gusano con las larvas L4 en una incubadora a 35 ° C por 2 – 5 h para alcanzar la tensión de calor. Coloque un termómetro en la incubadora para medir con precisión la temperatura.

3. tinción DAPI

  1. Fijación de etanol
    1. Añadir 10 μl del buffer M9 en el centro de un portaobjetos de vidrio.
    2. Recoger los gusanos dio una sacudida eléctrica el calor de paso 2.8 y ponerlos en el buffer M9 en el portaobjetos de cristal.
      1. Por otra parte, lavar la placa con la M9, centrifugar a 1.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante. Añadir los gusanos a lo portaobjetos de vidrio.
    3. Utilice un pañuelo de papel suave para drenar el exceso de líquido. Ver este paso con un microscopio de disección.
    4. Añadir 10 μl de alcohol 95% en los gusanos y déjelos secar al aire. Ver el proceso con un microscopio de disección y no permita que los animales se seca demasiado. Inmediatamente después de que el etanol se ha evaporado de los animales, proceder al siguiente paso.
      Nota: Etanol se evapora muy rápidamente.
    5. Repita el paso 3.1.4 dos veces para que los gusanos son fijos.
      Nota: Es normal que los animales parecen más oscuros y torcidos.
    6. Añadir 10 μl de DAPI (10 μg/mL) a los gusanos. Inmediatamente cubrir con un cubreobjetos y sellar la diapositiva con esmalte transparente de uñas de gel.
    7. Ve los animales después de alrededor de 10 min en un microscopio de fluorescencia.
  2. Fijación de la acetona (un enfoque alternativo)
    1. Lave la placa de calor-dio una sacudida eléctrica de paso 2.8 con M9, centrifugar a 1.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante. Lavar el pellet con 1 mL de dH2O recoger el diábolo y descarte el sobrenadante.
    2. Añadir 400 μL de acetona al 30% para centrifugar a 15 minutos a 1.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante. Use 500 μl de dH2O para lavar los animales 2 x. Deseche el sobrenadante.
    3. Añadir 200 μL de DAPI (10 μg/mL), o 4 x la cantidad de volumen de los gusanos total, en el tubo por 15 min.
    4. Centrifugar a 1.000 x g durante 1 min y descartar el sobrenadante. Lavar el precipitado 2 x con 500 μl de dH2O. colocar las lombrices sobre portaobjetos de vidrio, cubrir con cubre-objetos, sellar la diapositiva con esmalte transparente de uñas gel y observar los animales bajo un microscopio de fluorescencia.

4. microscopio imágenes

  1. Encienda la fuente de luz UV y un microscopio de fluorescencia. Encienda la computadora conectada al microscopio.
  2. Coloque el portaobjetos en el microscopio de fluorescencia. Utilice un objetivo de baja potencia (10 X) para localizar los gusanos, aumentar el poder de magnificación de 400 X y enfocarse en el espécimen.
  3. Abra el software provisto con el microscopio. Haga clic en "Adquisición" en el menú; Haga clic en "Cámara" y seleccione la cámara conectada al microscopio; Esto permite que la cámara seleccionada para comunicarse con el software.
    Nota: Diferentes microscopios pueden variar en funcionamiento.
  4. En el mismo "adquisición", haga clic en "Adquisición Multidimensional". Esto abre una nueva ventana de navegación "Adquisición Multidimensional". Haga clic en el botón de "Multicanal", y aparecerán todos los canales disponibles.
  5. Elegir azul, verde y DIC (contraste diferencial de interferencia) para observar a la muestra. En la ventana de navegación "Adquisición Multidimensional", deja el "Azul DAPI", "Verde-GFP" y "Gris-DIC", "Nomarski" canales Haga clic en otros canales, tales como "Rojo-rodamina" y "campo blanco brillante", para cerrarlas.
  6. En primer lugar, medir el tiempo de exposición para cada canal:
    1. Haga clic en el canal "Azul DAPI" para seleccionarla y luego haga clic en "Medida" para tomar una imagen en vivo en el canal DAPI con el tiempo de exposición automática. Aparecerá una nueva ventana con una imagen en vivo.
    2. En el lado izquierdo de la ventana de la imagen en directo, ajustar manualmente el tiempo de exposición si es necesario para que la imagen deseada.
    3. Por último, haga clic en "OK" en la ventana de la imagen en directo. Esto establece el tiempo de exposición en el canal DAPI.
  7. Repita el paso 4.6 para los otros canales "Verde-GFP" y "Gris-DIC", "Nomarski", para establecer los tiempos de exposición para los canales.
  8. En la ventana de navegación "Adquisición Multidimensional", haga clic en "Start" para recoger automáticamente 3 imágenes en los 3 distintos canales en orden (véase arriba) con tiempos de exposición específicos como conjunto.
  9. Para guardar el archivo, vaya al menú principal, haga clic en "File" luego en "Guardar como". Entrada de nombre de archivo y el nombre de carpeta. Guarde el archivo como el formato de archivo predeterminado para preservar la información detallada de la proyección de imagen para futuras referencias.
  10. Para exportar archivos en otros formatos:
    1. Vaya a "Archivo" y haga clic en "Exportar". Se abrirá una ventana de configuración de exportación.
    2. Establecer nombre de archivo y carpeta. Consulte "Crear una carpeta de proyecto" para mejor organiza los datos. El software también permite al usuario especificar 4 otras opciones: "Generar combinado imágenes", "Usar color para imágenes de canal", "Nombres de canales de uso" y "Sólo para la imagen combinada".
    3. Elija un tipo de archivo deseado en el menú desplegable, como "TIF", "BMP", "PSD", o "JPG" y otros tipos. Haga clic en "Start" exportar.

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Representative Results

Cloruro canal intracelular proteínas (CLIC) son proteínas multifuncionales que están muy conservadas entre especies12. Muchas investigaciones se muestran que Predescargado regula el estrés celular, autofagia, apoptosis, carcinogénesis, angiogénesis y la respuesta inmune innata de macrófagos en el sistema mamífero13,14,15,16 ,17. Hay dos homólogos CLIC en C. elegans: exl 1 y exc-4. El estudio reciente demostró que exl-1 regula el estrés animal gestión8. Integra una construcción traslacional exl-1::gfp en un genoma animal y crearon líneas transgénicas, que estable expresan gen exl-1 con un GFP como marcador (figura 2A y 2B). Bajo estrés por calor, EXL-1::GFP se acumula en el núcleo de la región intestinal ya que la fuerte señal GFP se superpone con la estructura del núcleo (figura 2 C -E). Para confirmar la localización subcelular, tinción DAPI fue utilizado como un método para teñir los núcleos. Utilizando fijación de etanol para los núcleos claros de tinción DAPI muestra en el cuerpo del animal (figura 3B). Fijación de acetona también logra resultados similares (figura 3E). Las señales superpuestas de GFP y DAPI confirman que EXL-1::GFP en efecto acumulado en los núcleos de la región intestinal (figura 3, F).

Figure 1
Figura 1: Imágenes de un cuarto larvario (L4) etapa C. elegans bajo energías de diferente aumento. (A) 63 X (B) 115 X, poder y (C) 400 X aumentos. Las flechas apuntan hacia la vulva de un gusano de L4; Nota media luna estructura. Barra de escala = 100 μm en todas las imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: bajo estrés por calor, EXL-1::GFP se acumula en los núcleos del intestino. Imagen de Normaski (A) de una región intestinal antes de choque térmico. (B) una fuerte señal GFP se observó en la región hepaticos antes de choque térmico. Imagen de Normaski (C) de la región intestinal después de choque térmico (punto flechas a los núcleos de la región intestinal). (D) una fuerte señal GFP se acumula después de choque térmico. (E) superposición de imagen de GFP y Normaski. Todas las fotografías se toman con el poder de magnificación de 400 X. Barra de escala = 50 μm en todas las imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: translocación nuclear EXL-1::GFP es confirmada por la coloración de DAPI. (A-C) Utilizando etanol fijación para tinción DAPI. (D-F) Utilizando acetona fijación para tinción DAPI. En A y D, color verde muestra señal GFP en la región intestinal. En B y E, color azul muestra los núcleos por la coloración de DAPI. C y F Mostrar imágenes superpuestas de GFP, DAPI y Normaski. Barra de escala = 50 μm en todas las imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria: Acetona fijación conserva a la muestra y 60 días después de la fijación de la acetona, las señales de GFP y DAPI son todavía observables. (A) verde es para GFP. (B) azul es para señal de DAPI. (C) superposición de imagen de GFP, DAPI y CID. Todas las imágenes son tomadas bajo 400 X potencia de aumento. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Este artículo presenta un método rápido y eficiente para verificar cambios subcelular de proteínas desde el citoplasma al núcleo. La expresión de la proteína fue demostrada por la fusión de GFP, mientras que la estructura del núcleo se verificó por DAPI tinción (figura 3). Desde proteínas de C. elegans inmunotinción es desafiante, más localizaciones subcelulares proteína de C. elegans se caracterizan por etiquetado con proteínas marcadoras como GFP, Laz, mCherry y otros18,19 , 20 , 21. en este artículo, gfp fue utilizado para etiquetar el objetivo gen exl-1 para demostrar su localización celular de la proteína. Para confirmar la localización nuclear, se utilizó la tinción DAPI. Se presentaron dos métodos alternativos para la coloración de DAPI. Ambos núcleos fuertes eficacia demostradas en gusanos dentro de un marco de tiempo de trabajo decente (menos de 1 h). La fijación de etanol es adecuada para una colección pequeña muestra como una observación de calidad (recogiendo gusanos de menos de 50). Evitar que los gusanos secado completamente es la clave. Una vez que el alcohol de 95% se evapora de los gusanos, proceder inmediatamente al siguiente paso. La fijación de la acetona es adecuada para una toma de muestras a gran escala como un análisis cuantitativo (que recoge más de 50 animales). Sin embargo, debido a los múltiples pasos del lavado de la muestra, algunas muestras se perderán. Por lo tanto, se recomienda retirar el sobrenadante y conservar tantos gusanos como sea posible. Una vez que están sellados, diapositivas resultante de fijación de acetona pueden guardarse durante una semana a 4 ° C.

Este protocolo se puede ajustar a otras proteínas de interés para el seguimiento de los cambios de localización subcelular. Además de la tensión de calor presentada aquí, podrían evaluarse otros ensayos de estrés, como el estrés oxidativo, metal pesado estrés, restricciones dietéticas y otros. Cambio de localización subcelular de la proteína también podría ser examinado cambiando el fondo genético de la proteína de interés. Por ejemplo, la línea transgénica puede ser cruzada en el fondo de un mutante diferente, para que la nueva interacción genética puede ser identificada. ARN de interferencia (ARNi) podría también ser aplicado para derribar genes específicos e investigar el cambio de localización subcelular de la proteína resultante. Estas aplicaciones son de gran interés para identificar los componentes regulatorios novedosos. Para una proteína desconocida, diferentes condiciones experimentales se deben probar, como las concentraciones de reactivo de prueba, la duración del estrés y las etapas específicas de desarrollo de los gusanos. En nuestro estudio, hemos tratado diferentes duraciones, desde 30 minutos a 5 h y las temperaturas de estrés de calor diferentes. Un choque de calor a 35 ° C para 3 h demuestra claramente un desplazamiento nuclear de la proteína.

Aplicaciones adicionales de tinción DAPI incluyen el examen de los procesos de meiosis y mitosis en gusanos, especialmente adentro germline las células22,23,24,25y un recuento del número de núcleos en un Fondo20,26,27. de genética mutante

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Disclosures

Los autores no tienen nada que declarar.

Acknowledgements

Las cepas de C. elegans utilizadas en este estudio se obtuvieron en el centro de genética de Caenorhabditis, que es apoyado por los institutos nacionales de salud - oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). Este trabajo fue financiado por los NIH: 1R03AG048578-01 a Jun Liang, CUNY CCRG 1501 a Jun Liang y PSC-CUNY 66184-00 44 y 45 de 67248-00 a Jun Liang. Agradecemos a Cathy salvaje-Dunn para compartir amablemente su espacio de laboratorio. Todas las imágenes de fluorescencia se recolectaron en instalaciones centrales de Queens College. Agradecemos a William J. Rice por sus comentarios sobre el manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Biotium 40043 both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well
OP50 CGC OP50 https://cgc.umn.edu/
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
Kim Wipe Kimberly-Clark Corporation soft tissue
Zeiss  AX10 Zeiss fluorescence microscope
Axiovision Rel 4.8 Zeiss microscope software
AxioCam MR Rev3 Zeiss digital camera
Incubator 
Micro centrifuge
Transparent nail polish gel
60 mm petri dishes
Glass slides
Glass coverslips
1-20 µL pipettor
20-200 µL pipettor
200-1000 µL pipettor
1-200 µL pipet tips
200-1000 µL pipet tips
1.5 mL microcentrifuge tubes
Platinum wire worm pick

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References

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