Opsporen van Eiwit Subcellular Localisatie door Green fluorescentie eiwit Tagging en 4', 6-Diamidino-2-phenylindole vlekken in Caenorhabditis elegans

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol laat zien hoe een eiwit nucleaire translocatie onder hittestress bijhouden met behulp van een groene fluorescentie proteïne (GFP) fusieproteïne als merkstof en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring. De DAPI kleuring protocol is snel en behoudt de GFP en eiwit subcellular localisatie-signalen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Liang, J., De Castro, A., Flores, L. Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (137), e57914, doi:10.3791/57914 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In dit protocol, een fusieproteïne van groene fluorescentie proteïne (GFP) en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring worden gebruikt voor het bijhouden van eiwit subcellular localisatie wijzigingen; in het bijzonder benadrukken een nucleaire translocatie onder een hitte voorwaarde. Eiwitten reageren dienovereenkomstig aan externe en interne signalen. Een gemeenschappelijk mechanisme is om te veranderen zijn subcellular localisatie. Dit artikel beschrijft een protocol voor het bijhouden van de lokalisatie van eiwit dat niet nodig een antilichaam, radioactieve labeling of een confocal microscoop. In dit artikel, wordt GFP gebruikt voor het label van de doel-proteïne EXL-1 in C. elegans, een lid van de chloride kanaal van intracellulaire eiwitten (CLICs) familie, waaronder zoogdieren CLIC4. Een geïntegreerde translationeel exl-1::gfp transgene lijn (met een promotor en een volledige gensequentie) werd bedacht door transformatie en γ-straling en stabiel de gene en gfpuitdrukt. Recent onderzoek toonde aan dat bij hittestress, niet oxidatieve stress, EXL-1::GFP hoopt zich op in de kern. Overlappende het GFP-signaal met zowel de structuur van de atoomkernen en de DAPI signalen bevestigt de EXL-1 subcellular localisatie wijzigingen onder stress. Dit protocol stelt twee verschillende fixatie methoden voor DAPI kleuring: fixatie van ethanol en aceton fixatie. De DAPI kleuring protocol gepresenteerd in dit artikel is snel en efficiënt en zowel het GFP-signaal en de eiwit subcellular localisatie wijzigingen blijven behouden. Deze methode vereist alleen een fluorescentie Microscoop met Nomarski, een FITC-filter en een DAPI-filter. Het is geschikt voor de instelling van een klein laboratorium, undergraduate student onderzoek, middelbare school student onderzoek en biotechnologie klaslokalen.

Introduction

Een verandering van eiwit subcellular localisatie is een gemeenschappelijk mechanisme in reactie op interne of externe signalen zoals hittestress, honger, oxidatieve stress, apoptosis, proteïne fosforylatie en anderen. Bijvoorbeeld induceert hittestress een FOXO lid1,2van de nucleaire translocatie van de DAF-16 en de pro-apoptotic BCL-2 eiwit die bod translocates aan de mitochondriën bij ontvangende overlijden signalering van3,4. Verschillende technieken zijn beschikbaar om deze wijzigingen te herkennen. Een combinatie van het westelijke bevlekken en biochemically isoleren subcellular structuren (bv, mitochondriën of de kernen) konden goed het bereiken van de doelstelling3. Het vereist echter een specifiek antilichaam tegen het eiwit van belang. Zo wordt een gevestigde antilichaam de sleutel tot het succes. Een alternatieve benadering is etikettering van verschillende subcellular structuren of organellen met verschillende markeringen zoals groene fluorescentie proteïne (GFP), rode fluorescentie eiwit (RFP), gele fluorescentie eiwit (YFP) en mCherry, en ondertussen de proteïne van label belang met andere markeringen. Dan, om hen onder een confocal microscoop te lokaliseren de doelstellingen5,6te observeren. Radioactieve isotopen zijn een alternatieve keuze voor het benoemen van doel eiwitten en vervolgens hun subcellular localisatie7opsporen. Echter, deze methode vereist een goede opleiding en de behandeling van radioactief afval. Omstandigheden zoals het gebrek aan een specifiek antilichaam, het ontbreken van een goede marker, of de schaarste van apparatuur, zoals een confocal microscoop moet een alternatieve aanpak worden overwogen. Ter identificatie van een nucleaire translocatie van eiwit, is het aantrekkelijk label alleen de doel-eiwitten met een marker en vlek kernen met het chemisch reagens 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) omdat dit alleen een regelmatige fluorescentie Microscoop vereist.

Immunolabeling, C. elegans met antilichamen is uitdagend vanwege de lage permeabiliteit van de "eggshell" of de collagene cuticle rondom het dier. Ondertussen, aangezien C. elegans eiwitten beduidend verschillend van hun gewervelde orthologs zijn, een paar commerciële bedrijven voorzien van C. elegans specifieke producten. Het is moeilijk voor een klein laboratorium voor het genereren van C. elegans antilichamen voor zichzelf. Onderzoekers in de Gemeenschap gebruiken vaak tagged eiwitten als markers om aan te tonen van een eiwit lokalisatie of gen-expressie. In dit artikel gebruikt EXL-1::GFP als voorbeeld voor het bijhouden van een nucleaire translocatie van eiwit onder hitte stress8. Een geïntegreerde translationeel exl-1::gfp in het genoom van dieren wordt gebruikt om het stabiel express het gen met gfp fusie. Onderzoek heeft uitgewezen dat exl-1 wordt uitgedrukt in de darm, lichaam muur spier en andere subcellular structuren8. Dit protocol laat zien hoe om te synchroniseren van wormen naar de vierde larvale fase (L4), voert u een hitte stress experiment, en gedrag DAPI kleuring, ethanol fixatie, aceton fixatie en beeldvorming onder een regelmatige fluorescentie Microscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. oplossingen

  1. NGM platen
    1. Toevoegen in een erlenmeyer van 2 L, 3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g pepton en 975 aantal milliliters dH2O. Cover de monding van de kolf met aluminiumfolie. Autoclaaf de kolf gedurende 50 minuten afkoelen voor 20-30 min.
    2. Voeg vervolgens gesteriliseerde oplossingen: 1 mL van de 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 mL van de 1 M MgSO4en 25 mL van de 1 M KPO4 (pH 6.0) buffer. Swirl de oplossingen om hen goed te mengen.
    3. Met behulp van een vloeistof dispenser, afzien de NGM oplossing voor 60 mm Petri platen. Vul de platen 2/3 vol agar. Opslaan in een luchtdichte verpakking bij 4 ° C voor toekomstig gebruik.
  2. 1 M KPO4 buffer (pH 6.0)
    1. Los 10.83 g van KH2PO4 en 3,56 g K2HPO4 in dH2O en het totale volume aan tot 100 mL. Autoclaaf de oplossing gedurende 15 minuten.
  3. M9
    1. Los 3 g KH2PO4, 6 g Na,2HPO4, 5 g NaCl in dH2O, voeg 1 mL 1 M MgSO4en het totale volume aan 1 L.
  4. 10 µg/mL DAPI
    1. Voeg 1 µL van 10 mg/mL DAPI in 999 µL van dH2O.
  5. 95% alcohol (v/v)
    1. Meten van 95 mL voor 100% alcohol en Voeg gedistilleerd water om het volume tot 100 mL.
  6. 30% aceton (v/v)
    1. Voeg 30 mL aceton toe aan dH2O en het totale volume aan tot 100 mL.

2. de hittestress

  1. Een lijn van de extrachromosomal matrix met een translationeel constructie van doel genen9,10te genereren. Als alternatief, verkrijgen deze lijnen uit de Caenorhabditis genetica Center (CGC), oftewel een publieke hulpbron voor C. elegans onderzoek, of van een eerder gepubliceerde onderzoekslaboratorium.
  2. De extrachromosomal lijnen in het genoom integreren door wormen 3.800 Rad γ-straling9bloot te leggen. Selecteer vervolgens de regels stabiel uitgedrukt zodat elk dier een marker-eiwit zoals een GFP of roller brengt.
  3. Genenoverdracht als wilt verwijderen mutaties gegenereerd tijdens de straling, de lijnen ten minste 2 x. Deze transgene lijn gebruikt om eiwit expressie patroon wijzigingen onder stress te herkennen.
  4. Bereiden NGM worm platen zoals beschreven in stap 1.1. Strijk een kloon van de OP50 en de cultuur van de bacteriën in vloeibare de pond-Bouillon 's nachts. Zaad de NGM platen met vloeibare OP50 cultuur en Incubeer de platen in een incubator 37 ° C's nachts een gazon bacteriën groeien als een bron van voedsel voor de wormen. De platen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik afkoelen.
  5. Groeien de transgene lijn bij 20 ° C zonder honger voor ten minste 2 generaties vóór de hitte-stress-test.
  6. Kies 8 – 10 gravid jongvolwassenen (baarmoeder gevuld met eieren) naar een nieuwe worm plaat en laat ze leggen eieren voor ongeveer 3-5 h en verwijder alle volwassenen van de platen.
  7. Als u wilt synchroniseren de wormen, laat de eieren uitkomen en groeien de larven gedurende ongeveer 48 uur tot het vierde larvale stadium van de (L4). Het onderzoeken van hun vulva structuur (een halve maan structuur) om te identificeren van de L4 fase (Figuur 1, pijl)11.
  8. Plaats de platen van de worm met de L4 larven in een incubator 35 ° C voor 2-5 h om hittestress. Plaats een thermometer in de incubator voor het nauwkeurig meten van de temperatuur.

3. de DAPI kleuring

  1. Ethanol fixatie
    1. Voeg 10 µL van de M9 buffer in het midden van een glasplaatje.
    2. Kies de warmte-geschokt wormen uit stap 2.8 en leg ze in de buffer van de M9 op het glasplaatje.
      1. Als alternatief, wassen van de plaat met de M9, het Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. De wormen aan het glasplaatje toevoegen.
    3. Gebruik een zacht weefsel om eventuele overtollige vloeistof. Bekijk deze stap onder een Microscoop ontleden.
    4. Voeg 10 µL van 95% alcohol op de wormen en laat ze droge lucht. Bekijk het proces onder een Microscoop ontleden en laat niet de dieren krijgen te droog. Onmiddellijk na de ethanol is verdampt van de dieren, gaat u verder met de volgende stap.
      Opmerking: Ethanol verdampt zeer snel.
    5. Herhaal stap 3.1.4 tweemaal zodat de wormen worden opgelost.
      Opmerking: Het is normaal dat de dieren te kijken donkerder en vervormd.
    6. Voeg 10 µL van de DAPI (10 µg/mL) voor de wormen. Onmiddellijk dek ze af met een dekglaasje aan en verzegel de dia met doorzichtige nagellak gel.
    7. Bekijk de dieren na ongeveer 10 min op een fluorescentie Microscoop.
  2. Aceton fixatie (een alternatieve benadering)
    1. Wassen van de warmte-geschokt plaat uit stap 2.8 met M9, het Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Wassen van de pellet met 1 mL dH2O, verzamelen de pellet en verwijder het supernatant.
    2. Voeg 400 µL van 30% aceton voor 15 min. Centrifuge bij 1.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Gebruik van 500 µL dH2O te wassen de dieren 2 x. Verwijder het supernatant.
    3. Voeg 200 µL van de DAPI (10 µg/mL), of 4 x het bedrag van de totale wormen volume in de buis gedurende 15 minuten.
    4. Centrifugeer bij 1.000 x g voor 1 min en verwijder het supernatant. Wassen van de pellet 2 x met 500 µL van dH2O. plaats van de wormen op glas dia's, bestrijk ze met coverslips zegel van de dia met doorzichtige nagellak gel en observeren de dieren onder een fluorescentie Microscoop.

4. de microscopische beeldvorming

  1. Schakel de UV-lichtbron en een fluorescentie Microscoop. Zet de computer verbonden met de Microscoop.
  2. Laden van de dia op de fluorescentie Microscoop. Gebruik een energiebesparende objectief (10 X) om de wormen te vinden, de vergroting verhogen tot 400 X en zich richten op het model.
  3. Open de software die wordt geleverd met de Microscoop. Klik op de "Overname" in het menu; Klik op de "Camera" en kies de camera die is aangesloten op de Microscoop; Hierdoor worden de geselecteerde camera om te communiceren met de software.
    Opmerking: Andere microscopen kunnen variëren in werking.
  4. Onder de dezelfde "overname", tikken voort "Multidimensionale verwerving". Dit opent een nieuw "Multidimensionale verwerving" navigatie venster. Klik op de "Multichannel" knop en alle beschikbare kanalen wordt weergegeven.
  5. Blauw, groen en DIC (differentiële interferentie contrast) acht het model te kiezen. In het venster "Multidimensionale verwerving" navigatie laat de "Blue-DAPI", "Green-GFP" en "Grey-DIC", "Nomarski" kanalen op; Klik met de rechtermuisknop op andere kanalen, zoals "Red-rhodamine" en "wit-helder veld", om hen te sluiten.
  6. Eerst meten de belichtingstijd voor elk kanaal:
    1. Klik met de linkermuisknop het kanaal van de "Blue-DAPI" te selecteren en klik dan op "Maatregel" om een live beeld onder de DAPI-kanaal met de geautomatiseerde blootstellingstijd. Er verschijnt een nieuw venster met een live beeld.
    2. Aan de linkerzijde van het venster live beeld, pas handmatig de belichtingstijd indien nodig om de afbeelding naar wens te maken.
    3. Tenslotte, tikken voort "" OK "in het venster live beeld. Hiermee stelt u de belichtingstijd onder de DAPI-kanaal.
  7. Herhaal stap 4.6 voor de andere kanalen, "Green-GFP" en "Grey-DIC", "Nomarski", de belichtingstijden voor die kanalen instellen.
  8. In het "Multidimensionale verwerving" navigatie venster, klik op "Start" voor het automatisch verzamelen van 3 beelden onder de 3 verschillende kanalen in volgorde (zie hierboven) met specifieke belichtingstijden als set.
  9. Als u wilt het bestand opslaat, gaan naar het hoofdmenu, klikt u op 'Bestand' en vervolgens op "Opslaan als". Naam van invoerbestand en de naam van de map. Sla het bestand als de standaardbestandsindeling voor het behoud van de beeldvorming Detailgegegevens voor toekomstig gebruik.
  10. Het bestand in andere indelingen exporteren:
    1. Ga naar "File" en klik op "Export". Dit zal een uitvoer instelling venster openstellen.
    2. Bestandsnaam en map instellen. Controleer dat de gegevens "Een projectmap maken" beter te organiseren. De software maakt het ook mogelijk de gebruiker 4 andere opties op te geven: "Genereer samengevoegd afbeeldingen", "Gebruik kleur voor afbeeldingen kanaal", "Gebruik kanaalnamen" en "Alleen samengevoegde afbeelding".
    3. Kies een gewenste bestandstype uit de drop-down menu, zoals "TIF", "BMP", "PSD", "JPG" of andersoortige. Klik vervolgens op "Start" om te exporteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Chloride kanaal van intracellulaire eiwitten (CLIC) zijn multifunctionele eiwitten die zeer over soorten12zijn bewaard. Veel onderzoek laat zien dat CLICs cellulaire stress, autophagy, apoptosis, carcinogenese, angiogenese en de macrofaag aangeboren immuunrespons bij de zoogdieren systeem13,14,15,16 regelen ,17. Er zijn twee CLIC homologen in C. elegans: exl-1 en Uitm-4. Onze recente studie toonde aan dat exl-1 regelt dieren stress management8. Wij een constructie translationeel exl-1::gfp in een dierlijke genoom geïntegreerd en gemaakt van transgene lijnen, die gene exl-1 met een GFP stabiel wordt uitgedrukt als een marker (figuur 2A en 2B). Onder hittestress, EXL-1::GFP hoopt zich op in de kern in de intestinale regio omdat het sterke signaal GFP met de structuur van de nucleus (Figuur 2 C -E overlapt). Om te bevestigen de subcellular localisatie, werd DAPI kleuring gebruikt als een aanpak om de kernen vlek. Met behulp van ethanol fixatie voor de DAPI kleuring toont duidelijk kernen in de dierlijke lichaam (figuur 3B). Aceton fixatie ook bereikt soortgelijke resultaten (figuur 3E). De overlappende GFP en DAPI signalen bevestigen dat EXL-1::GFP inderdaad opgebouwd in de kernen in de intestinale regio (Figuur 3 c, F).

Figure 1
Figuur 1: Beelden van een vierde larvale (L4) etappe C. elegans onder de bevoegdheden van de verschillende vergroting. (A) 63 X, (C) en (B) 115 X 400 X vergroting vermogen. Pijlen wijzen naar de vulva van een L4 worm; Opmerking halve maan structuur. Schaal bar = 100 µm in alle beelden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: onder hittestress, EXL-1::GFP hoopt zich op in de kernen van darm. (A) Normaski beeld van een intestinale regio voordat warmte schok. (B) een sterk signaal van GFP werd waargenomen in de instestinal regio voordat warmte schok. (C) Normaski beeld van intestinale regio na warmte schok (pijlen wijs de kernen van de intestinale regio). (D) een sterk signaal van GFP accumuleert na warmte schok. (E) overlappende beeld van GFP en Normaski. Alle foto's zijn geschoten met 400 X vergroting vermogen. Schaal bar = 50 µm in alle beelden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: EXL-1::GFP nucleaire translocatie wordt bevestigd door de DAPI kleuring. (A-C) Met behulp van ethanol fixatie voor DAPI kleuring. (D-F) Met behulp van aceton fixatie voor DAPI kleuring. A en Dzichtbaar groene kleur GFP signaal intestinale regio. B en E, blauwe kleur zichtbaar kernen door DAPI kleuring. C en F Toon overlappende beelden van GFP DAPI en Normaski. Schaal bar = 50 µm in alle beelden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur: Aceton fixatie behoudt het specimen en 60 dagen na aceton fixatie, GFP en DAPI signalen zijn nog waarneembaar. (A) groen is voor GFP. (B) blauw is voor DAPI signaal. (C) overlappende foto van GFP DAPI en DIC. Alle afbeeldingen zijn genomen onder 400 X vergroting vermogen. Schaal bar = 50 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit artikel voorgesteld een snelle en efficiënte methode om te controleren of eiwit subcellular wijzigingen ten opzichte van het cytoplasma naar de kern. De eiwituitdrukking bleek ontstaan door een fusie van GLP, terwijl de kern structuur werd gecontroleerd door de DAPI kleuring (Figuur 3). Aangezien immunokleuring C. elegans eiwitten is uitdagend, meeste C. elegans eiwit subcellular lokalisaties worden gekenmerkt door tagging hen met marker eiwitten zoals GFP Laz, mCherry en anderen18,19 , 20 , 21. in dit artikel, gfp gewend was het doel gene exl-1 label om aan te tonen van de cellulaire eiwit-lokalisatie. Om te bevestigen de nucleaire localisatie, werd DAPI kleuring gebruikt. Twee alternatieve methoden werden gepresenteerd voor de DAPI kleuring. Beide efficiënt toonde sterke kernen in wormen binnen het tijdsbestek van een fatsoenlijk werken (minder dan 1 uur). De fixatie van ethanol is geschikt voor een kleine steekproef collectie zoals een observatie van de kwaliteit (het verzamelen van minder dan 50 wormen). Verhinderen dat de wormen volledig drogen is de sleutel. Zodra de 95% alcohol uit de wormen verdampt, gaat u verder met de volgende stap onmiddellijk. De fixatie van de aceton is geschikt voor een grootschalige sample collectie zoals een kwantitatieve analyse (het verzamelen van meer dan 50 dieren). Nochtans, als gevolg van de verschillende stappen van het wassen van het monster, sommige exemplaren zullen worden verloren. Dus, is het sterk aanbevolen om zorgvuldig de bovendrijvende vloeistof verwijderen en wormen zoveel mogelijk behouden. Zodra zij zijn verzegeld, kunnen dia's als gevolg van aceton fixatie worden opgeslagen voor een week bij 4 ° C.

Dit protocol kan worden aangepast aan andere proteïnen van belang subcellular localisatie wijzigingen bijhouden. Naast de hitte-stress hier gepresenteerd, kunnen andere stress tests worden beoordeeld, zoals oxidatieve stress, heavy metal stress, dieetproducten beperkingen, en anderen. Eiwit subcellular localisatie verandering kan ook worden onderzocht door het veranderen van de genetische achtergrond van de proteïne van belang. Bijvoorbeeld, de transgene grens kan worden overschreden in een verschillende mutant achtergrond, zodat de nieuwe genetische interactie kan worden geïdentificeerd. RNA-interferentie (RNAi) kan ook worden toegepast om te neerhalen van specifieke genen en de resulterende eiwit subcellular localisatie verandering te onderzoeken. Deze toepassingen zijn van groot belang om nieuwe regelgevende onderdelen te identificeren. Voor een onbekende proteïne, moeten verschillende experimentele omstandigheden worden getest, zoals het testen reagens concentraties, de duur van de stress, en de specifieke ontwikkelingsstadia van de wormen. In onze studie, we hebben geprobeerd verschillende looptijden, van 30 min 5 h en verschillende warmte stress temperaturen. Een warmte-schok bij 35 ° C gedurende 3 uur toont duidelijk aan een eiwit nucleaire translocatie.

Aanvullende toepassingen van de DAPI kleuring omvatten het onderzoek van het proces van meiose en mitose in wormen, vooral in germline cellen22,23,24,25, en een telling van het aantal kernen in een de genetische mutant achtergrond20,26,27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te verklaren.

Acknowledgements

De stammen van de C. elegans gebruikt in deze studie werden verkregen uit de Caenorhabditis genetica Center, dat wordt ondersteund door de National Institutes of Health - Office van onderzoek infrastructuur-programma's (P40 OD010440). Dit werk werd gesteund door de NIH: 1R03AG048578-01 Jun Liang, CUNY-CCRG 1501 Jun Liang en PSC-CUNY 66184-00 44 en 67248-00 45 tot Jun Liang. Wij danken Cathy Savage-Dunn voor de kandidatuur delen haar laboratorium ruimte. Alle afbeeldingen van de fluorescentie werden verzameld bij Queens College Core faciliteit. Wij danken William J. Rice voor zijn opmerkingen over het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Biotium 40043 both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well
OP50 CGC OP50 https://cgc.umn.edu/
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
Kim Wipe Kimberly-Clark Corporation soft tissue
Zeiss  AX10 Zeiss fluorescence microscope
Axiovision Rel 4.8 Zeiss microscope software
AxioCam MR Rev3 Zeiss digital camera
Incubator 
Micro centrifuge
Transparent nail polish gel
60 mm petri dishes
Glass slides
Glass coverslips
1-20 µL pipettor
20-200 µL pipettor
200-1000 µL pipettor
1-200 µL pipet tips
200-1000 µL pipet tips
1.5 mL microcentrifuge tubes
Platinum wire worm pick

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Essers, M. A., et al. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK. The EMBO Journal. 23, (24), 4802-4812 (2004).
  2. Oh, S. W., et al. JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, (12), 4494-4499 (2005).
  3. Gross, A., et al. Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death. The Journal of Biological Chemistry. 274, (2), 1156-1163 (1999).
  4. Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. BH3-only proteins: a 20-year stock-take. The FEBS Journal. 282, (6), 1006-1016 (2015).
  5. Mayorova, T. D., et al. Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses. PLoS One. 13, (1), e0190905 (2018).
  6. Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death. Methods in Molecular Biology. 97-105 (2018).
  7. Pedrazzini, E., Vitale, A. Protein biosynthesis and maturation in the ER. Methods in Molecular Biology. 179-189 (2018).
  8. Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12, (9), e0184308 (2017).
  9. Evans, T. C. Transformation and microinjection. Wormbook. edited by The C. elegans Research Community (2006).
  10. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  11. Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. Wormbook. edited by The C. elegans Research Community (2006).
  12. Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator. The Journal of Biological Chemistry. 276, (5), 3319-3323 (2001).
  13. Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections. Molecular Carcinogenesis. 46, (8), 599-604 (2007).
  14. Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. 22, (3), 541-548 (2009).
  15. Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts. The American Journal of Pathology. 161, (2), 471-480 (2002).
  16. He, G., et al. Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide. European Journal of Immunology. 41, (5), 1221-1230 (2011).
  17. Zhong, J., et al. Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation. PLoS One. 7, (6), e39378 (2012).
  18. Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, (26), 6453-6464 (2003).
  19. Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (20), E2667-E2676 (2015).
  20. Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9, (7), e101929 (2014).
  21. Matus, D. Q., et al. Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression. Developmental Cell. 35, (2), 162-174 (2015).
  22. Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination. Cell. 118, (4), 439-452 (2004).
  23. Ames, K., et al. A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development. Current Biology. 27, (6), 905-913 (2017).
  24. Pekar, O., et al. Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche. Development. 144, (16), 2896-2906 (2017).
  25. Schvarzstein, M., et al. DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis. Genetics. 198, (1), 193-207 (2014).
  26. Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (10), 5285-5290 (2000).
  27. Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans. Genes to Cells. 9, (1), 39-47 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics