향상 된 Multilineage 차별화 힘으로 순진한 같은 상태로 기존의 인간의 Pluripotent 줄기 세포의 화학 귀선

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Developmental Biology

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Summary

선물이 epigenomically 안정 순 preimplantation epiblast 같은 만능 상태로, 대량, 효율적이 고 신속한 화학 귀선 기존의 혈통 액 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)의 대 한 프로토콜. 이 방법은 기존의 hPSC 라인의 광범위 한 레 퍼 토리에 걸쳐 감소 혈통 액 유전자 발현과 감독된 multilineage 차별화에 표시 되어 있는 개선에 발생합니다.

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Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Naïve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency. J. Vis. Exp. (136), e57921, doi:10.3791/57921 (2018).

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Abstract

순진한 인간 만능 줄기 세포 (N hPSC) 향상 된 기능 재생 의학에 다양 한 영향을 있을 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표 효율적으로 준비 하는 혈통, 기존의 인간 만능 줄기 세포 (hPSC) 향상 된 기능을 가진 순진한 같은 pluripotency에 피더 무료 또는 급지대 종속 상태에 유지 되돌릴 것입니다. 이 화학 순진한 귀선 메서드 GSK3β, 고전 백혈병 금지 요인 (LIF), 고용 및 MEK/ERK 저해 칵테일 (LIF-2i)는 tankyrase 억제제 XAV939만 보충 (LIF-3i). LIF 3i 안정적인 만능 주 생화학, transcriptional, 채택 및 인간의 사전 주입 epiblast의 후 성적인 기능에 기존의 hPSC 되돌립니다. 이 LIF 3i 메서드가 필요 최소한의 셀 문화 조작 하며 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 및 transgene 무료 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 라인의 광범위 한 레 퍼 토리에서 높은 재현성. LIF 3i 방법 차별화; 전에 다시 프라이 밍 단계를 필요 하지 않습니다. N hPSC 매우 높은 효율성과 직접 분화 될 수 있다 하 고 유지 하는 karyotypic 및 epigenomic 안정성 (찍힌된 loci에 포함). 방법의 보편성을 높이기 위해 기존의 hPSC 처음 두 개의 추가 작은 분자 단백질 키 니 아 제 (산림) 및 소닉 고슴도치 (쉿) (purmorphamine) 신호 (LIF-5i) 약효와 보충 LIF 3i 칵테일에 교양. 이 간단한 LIF 5i 적응 단계 크게 기존의 hPSC의 초기 클론 확장을 강화 하 고 그들 이후에 순진한 LIF-3i 혼자 대량 수량에 따라서 따기/subcloning 드문 N-hPSC에 대 한 필요성을 obviating와 복귀 허용 나중에 식민지입니다. LIF 5i 안정화 hPSCs 그 후에 유지 됩니다 LIF 3i 안티 apoptotic 분자의 필요 없이 혼자. 가장 중요 한 것은, LIF 3i 귀선 현저 하 게 그들의 혈통 액 유전자 발현을 감소 하 고 감독된 차별화의 인터 라인 변화를 일반적으로 지우기에 의해 기존의 hPSC의 광범위 한 레 퍼 토리의 기능 pluripotency를 향상 독립 hPSC 라인 사이 관찰. LIF 3i 돌 N-hPSC의 대표 characterizations 혈통 액 isogenic hPSC의 기능 비교에 대 한 제공, 그리고 실험적인 전략 있습니다. 순진한 같은 상태 설명 되어 있습니다.

Introduction

2i (MEK/ERK 및 GSK3β 억제제) 문화 시스템 유형이 다른 혈 청 기반 마우스 배아 줄기 세포 (mESC) 문화 마우스 preimplantation epiblast1유사 pluripotency의 균일 한 접지 상태를 수정 하기 위해 원래 개발 되었다. 그러나, 2i는 인간 만능 줄기 세포 (hPSC) 라인2의 안정적인 유지 보수를 지원 하지 않습니다. 다양 한 성장 인자를 보충 하는 복잡 한 작은 분자와 유전자 변형 방법 최근 상 캡처 보고 된 유사한 인간의 순 같은 만능 분자 상태2. 그러나, 또한 이러한 메서드를 사용 하 여 만든 "순진한 같은" 상태 karyotypic 불안정성, epigenomic 결함 (예: 글로벌의 손실 부모의 게놈 각 인), 전시 또는 차별화 잠재적 장애인.

에 대비, GSK3β, ERK 및 tankyrase 신호 트리플 화학 억제의 칵테일 및 백혈병 금지 요인 (LIF-3i) 기존의 hPSC 라인3의 광범위 한 레 퍼 토리의 안정 순-같은 버전에 대 한 충분 한 했다. LIF 3i 되돌릴 순 hPSC (N hPSC) 정상적인 karyotypes를 유지 하 고 순진한 특정 인간의 preimplantation epiblast 유전자의 그들의 식을 증가 (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, 스텔라 (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). Phosphorylated STAT3 신호 증가, 포함 mESC 같은 순진한 pluripotency에 고유한 분자와 생 화 확 적인 특성의 배열과 LIF 3i 버전도 수 여 hPSC 감소 ERK 인 산화, 글로벌 5-methylcytosine 포장 소비재 hypomethylation, 배아 줄기 세포 (ESC)에서 게놈 넓은 포장 소비재 demethylation-특정 유전자 발기인, 및 지배적인 원심 OCT4 증강 사용. 또한, 다른 순진한 비해 귀착되 었 다 aberrantly hypomethylated 복귀 방법 각 게놈 loci, LIF 3i 돌 N-hPSC 찍힌된 CpG 패턴의 체계적인 손실 또는 DNA methyltransferase 식의 손실 없는 (예: DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.

기존의 인간 배아 줄기 세포 (hESC)와 지류 또는 E8 급지대 무료 조건에서 자란 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)의 광범위 한 배열의 직접 LIF 3i 문화 순진한 epiblast 같은 상태로 신속 하 고 대량 귀선 달성. 그러나, 직접 LIF 3i 순진한 귀선 일부 불안정 한 기존의 hPSC 라인 고유의 게놈 및 혈통 액 variabilities 유전자 다양 한 기증자 배경에서 발생 하는 때문에 효율적인 하지 수 있습니다.

따라서, LIF 3i 메서드의 유틸리티를 확대, stepwise 최적화 개발 되었다 고 여기 제시 수 있는 거의 모든 기존의 hESC 또는 transgene 무료 hiPSC 선 보편적인 순진한 귀선 교양 모이 통에. 이 단신 순진한 귀선 메서드 사용 하 여 두 추가 작은 분자 (LIF-5i) 단백질 키 니 아 제 (산림)와 소닉 더 헤지호그 (sHH) (약효와 LIF 3i 칵테일을 보완 하는 기존의 hPSC에서 일시적인 초기 문화 단계 purmorphamine) 신호입니다. LIF 5i에 기존의 hPSC의 한 초기 통과 이후 안정적인 LIF 3i 버전 대량 수량에서을 그들을 적응 시킨다. 초기 LIF 5i 적응은 크게 E8 또는 지류 (LIF-3i 혼자에서 후속 안정적, 지속적인 통로) 이전에 성장 하는 기존의 hPSC의 초기 단일 세포 클론 증식을 증대 시킵니다. 기존의 hPSC 라인 적응 먼저 LIF 5i에 하나의 통로를 용납 이후 대량 클론 뿌리고 LIF 3i 조건에서 순진한 되돌릴 셀의 따기 및 subcloning 드문 안정적인 식민지, 또는 일상적인 사용의 필요성을 obviates는 안티-apoptotic 분자 또는 단백질으로 관련 된 키 (바위) 억제제.

LIF 3i 메서드는 성공적으로 안정적으로 확장 하 고의 광범위 한 레 퍼 토리를 유지 고용 되었습니다 > 30 독립, 유전으로 다양 한 기존의 hPSC 라인 > 10-30 구절 중 비 효소 또는 효소 분리 방법을 사용 하 여 고 염색체의 유도의 증거 없이 또는 epigenomic 이상, 찍힌된 유전자 loci에서 이상 포함 한. 또한, 순차 LIF-5i/LIF-3i 문화 유일한 순진한 복귀 방법입니다 지금까지 보고 그들의 혈통 액 유전자 발현을 감소 하 여 기존의 hPSC 라인의 광범위 한 레 퍼 토리의 기능 pluripotency를 개선 하 고 극적으로 개선 하는 그들의 multipotent 차별화 힘. 고유의 LIF 3i 순진한 복귀 방법 지웁니다 환승 혈통 액, 기존의 hPSC 라인의 차별화의 다양성 그리고 재생 의학 및 세포 치료에 응용 프로그램의 좋은 유틸리티.

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Protocol

모든 동물 절차 동물 관리 지침 및 프로토콜 존스 홉킨스 학교의 의학 연구소 동물 보호와 사용 위원회 (IACUC)의 승인에 따라 수행 했다.

1. 준비 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEF)의 피더 종속 기존 (hESC 매체/MEF)에 대 한 순진한 되돌릴 또는 (LIF 3i 매체/MEF) hPSC 문화

  1. 구입 또는 DR4 하이브리드 E13.5 마우스 배아 다음 게시 프로토콜4x CF1 또는 CF1 MEF 지류의 사내 낮은 통로 공급 준비.
    1. 낮은 통로 (p1-p2) MEF 문화 사전 (대 한 긴 기간 저장) cryopreserve 또는 (최대 6 개월)에 대 한 사후 조사 및 액체 질소가 게 앞4에서 설명한.
    2. 비추는 (5000 rad)는 γ-또는 X-레이-irradiator를 사용 하 여 p5 아래 확장 된 MEF 대량 저장용 단기 (6 개월 미만)는 초 저온 냉동 고에서-80 ° C에서 1.5 x 10에서 aliquots 유리병 당6 셀을 준비 하 고.
    3. 1.2 x 10 접시6 (갓 비 cryopreserved 반구)와 1.5 x 106 (반구 cryopreserved) MEF 아래 설명 된 대로 급지대 문화를 준비 하기 위한 하나의 6-잘 gelatinized 접시 당.
  2. 생물 안전 캐비닛에 각 음에 살 균 0.1% 젤라틴 솔루션의 1.5 mL를 추가 하 여 6-잘 마른 조직 문화 취급 판 젤라틴 코팅을 준비 합니다.
  3. 적어도 1 시간 동안 37 ° C에 판 젤라틴 코팅을 품 어 나 실험실 공동2 인큐베이터에서 밤새.
  4. 다음 날, 낮은 통로 (예를 들어, P2 p 4) DMSO cryopreserved 하 고 조사를 해 동 (5000 rad) MEF는 단계에 따라 아래에 표시 된.
    참고: 비-반구 MEF 해야 해 동, 확장, 수 있으며 사용 직전 반구.
  5. 37 ° C 물 욕조에 cryopreserved MEF 약 수를 놓습니다. 녹고, 에탄올 튜브 소독 고 즉시 biosafety 내각 (예: 전송 1 mL DMSO MEF 약 수 살 균 15 mL에 9 mL MEF 매체로 내에서 MEF 매체 (표 1)와 적어도 10 DMSO cryoprotectant 희석 원뿔).
  6. 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 5 분 동안 200 x g 에 희석된 MEF 셀 원심
  7. Biosafety 내각에서 발음 하 고 셀 무료 상쾌한 삭제 한 1-2 mL 신선한 MEF 매체에 셀 펠 릿 resuspend.
  8. 부드럽게 젤라틴 솔루션을 삭제 하 고 위에 표시 된 대로 다시 gelatinized 6 잘 플레이트의 각 음을 MEF 중간에 중단 하는 MEF의 2 개 mL를 추가 합니다. 수 MEF 전지와 접시 1.2 x 106 (갓 비 cryopreserved 반구) 또는 1.5 x 106 (반구 cryopreserved) MEF 한 6-잘 gelatinized 접시 당.
    참고: 캐비닛 biosafety에 CO2 배양 기에서 전송 되는 모든 세포 배양 배지 에탄올 살포 종이로 부드럽게 닦 일 수 있다 하지만 해야 하지 직접 살포 될에 70% 에탄올 솔루션을 우물에 에탄올 보급을 피하기 위해.
  9. 사용 하기 전에 첨부 파일을 허용 하도록 MEF 플레이트 37 ° c (5% CO2, 습 한 분위기) 실험실 CO2 배양 기에서 하룻밤을 품 어.

2. 대량 간단한 LIF-5i 적응 단계 후속 순진한 귀선에 대 한 기존의 hPSC 문화의 안정화

  1. 처음 LIF-5i/LIF-3i 복귀 전에 G 밴딩에 의해 정상적인 karyotype 소지에 대 한 모든 기존의 hPSC 라인을 확인 합니다.
    참고: 높은 통행 기존의 hPSC 라인의 LIF 3i 귀선 (., P > 40-50) 때문에 이러한 문화에 부정적인 영향을 줄 수의 안정적, 효율적이 고 대량 LIF 3i 귀선 액, 게놈 착오 항구 이미 수 있습니다 피해 야 한다 convetional hPSC 라인입니다.
  2. 유지 하 고 (제 1 항에 명시 된) 대로 MEF 기반 문화 시스템, 또는 (탐정의 찾아보십시오) 급지대 무료 문화 시스템에 유효한 정상적인 karyotypes 기존의 hPSC 문화를 확장.
    참고: 두 지류 종속 hPSC/MEF cocultures (예: hESC 매체 (표 1) 4-10 ng/mL bFGF 보충) 또는 급지대 무료 (., E8 5 또는 mTSER 6 미디어 (제조 업체의 지침에 따라 vitronectin 코팅 접시) 방법은 LIF-5i/LIF-3i/MEF 시스템 (그림 1)를 사용 하 여 대량 순진한 복귀와 호환 됩니다. 비 효소 메서드는 복귀에 대 한 그들을 준비 하기 전에 기존의 hPSC의 뿌리고에 대 한 선호. LIF 5i와 LIF 3i 미디어 공식 항생제 또는 항진균 성 대리인을 포함 하지 않습니다. Biosafety 내각 불 임 및 유지 보수에 대 한 표준 작업 규칙을 피하기 위해 어떤 세균 이나 곰 팡이 오염 엄격 하 게 관찰 될 것으로 예상 된다.
  3. MEF 기반 문화 시스템, 적어도 하루 전에 뿌리고 LIF 5i 적응 기존의 hPSC 문화의 섹션 1에서 설명한 대로 gelatinized 6 잘 플레이트에서 MEF 지류를 준비 합니다.
  4. 기존의 hPSC 문화 50 %confluency (즉, 초기 도금 후 3-5 일)에 도달 했습니다, 후 바꿉니다 표준 hESC 문화 매체 LIF 5i 매체 (2 mL 당 잘; 표 1)입니다.
    참고: 캐비닛 biosafety에 다음이 단계를 수행 합니다.
  5. 문화 고 최대 2 일 동안 LIF 5i에 CO2 인큐베이터 (5% CO2, 습 한 분위기)에서 기존 hPSC/MEF를 유지 합니다. LIF 5i 매체 매일 그들의 연속적인 통행 및 LIF 3i에 안정적인 복귀에 대 한 적응을 변경 합니다.
  6. 또는, 기존의 급지대 무료 문화 (예를 들어, e 8에)에 대 한 문화 hPSC LIF 5i에만 뿌리고 다음날 아침 전에 하룻밤.
    참고: LIF 5i와 LIF 3i 문화 모두 유지할 수 있습니다 대기 (21% O2) 또는 생리 (5% O2) 산소 수준 (5% CO2, 습 한 분위기) CO2 배양 기에서.
  7. 뿌리고, 이전 문화 접시 biosafety 내각에서 LIF 5i 적응 기존의 hPSC, PBS와 한 번 씻어 놓고 각 잘 하 셀 분리 시 약의 1 mL를 추가 합니다. CO2 배양 기에서 37 ° C에서 5 분 동안 incubate 그리고 biosafety 내각에서 다시 단일 세포 현 탁 액에는 피 펫으로 부드럽게 triturate.
    참고: 비 효소 분리 버퍼 또는 단일 셀 뿌리고 준비 사용할 수 있습니다.
  8. HESC 매체 (적어도 2-fold 희석) 살 균 15 mL 원뿔 튜브에에서 세포 현 탁 액을 수집 하 고 부드럽게 세포를 단일 세포 현 탁 액 pipetting으로 triturate.
  9. 5 분에 대 한 300 x g 에서 centrifuge, aspirate/삭제 상쾌한, 그리고 biosafety 캐비닛에 LIF 5i 매체의 1-2 mL에 셀 펠 릿 resuspend. hemocytometer 또는 자동 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
  10. PBS (6-잘 접시에 잘 당 2 mL)로 두 번 중 도금된 MEF 접시를 세척 하 고 1-2 x 106 셀 (2 mL LIF 5i 매체) PBS 씻어 MEF 접시의 1에 배포.
  11. 조정 하 고 각 개별 hPSC 라인 replating 효율성 높은 변수 수 순진한 되돌릴 수에 대 한 초기 도금 밀도 최적화. (5% CO2, 습 한 분위기) CO2 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
    참고: 안티 apoptotic 시 약의 사용은 권장 하지 않습니다 대부분의 hPSC 라인에 대 한이 방법으로. LIF 5i 시스템은 이미 상당히 기존의 hPSC 라인의 초기 대량 클론 다시 도금 효율성을 향상 시킵니다. 그러나, 바위 억제제의 한 번만 사용 (5-10 μ M Y-27632) 추가 성향으로 일부 불안정 한 혈통 액 hPSC 라인에 대 한 첫 대목에서 기존의 hPSC 문화의 초기 LIF 5i 클론 다시 도금 효율을 향상 시킬 수 있습니다 자연 감 별 법입니다.
  12. 해리 기존의 hPSC에 LIF-5i에의 한 잘 전송 급지대 무료 문화 (예를 들어, E8)에서 직접 시작 하는 경우 한 MEF 도금 잘 (, 1:1 통로) 반구.
  13. 다음 날, 부드럽게 연결 되지 않은 모든 셀 리프트, 매체 발음 접시 소용돌이 (PBS 세척은 선택 사항) LIF 5i 매체의 2 개 mL를 바꿉니다. Biosafety 캐비닛 3-5 일 동안 매일 또는 세포는 60-70% 합칠 (그림 1) 때까지이 단계를 수행 합니다. (5% CO2, 습 한 분위기) CO2 인큐베이터에 접시를 놓습니다.

3. 장기 유지 관리 및 N-hPSC LIF 3i 매체에서의 확장

  1. 초기 LIF 5i 적응, 다음 이후의 안정적인 LIF 3i 문화 biosafety 캐비닛, 또는 문화 60-70% 합칠 (그림 1)이 될 때 3-4 일 마다 통로.
    참고: LIF 3i 문화 필요로 엄격한 유지 보수 및 장기간된 문화에서 높은 confluency/세포 밀도 도달 N-hPSC 문화 허용 (., > 4 일) 이후 클론 다시 도금 효율 감소 및 자발적인 촉진 감 별 법입니다.
  2. Biosafety 내각에서 문화 매체를 삭제 하 고 각 씻어 부드럽게 PBS의 2 개 mL를 추가 하 여 LIF-5i/LIF-3i 문화의 잘. PBS를 무시 하 고 세포 분리 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. CO2 인큐베이터 (5% CO2, 습 한 분위기)에서 37 ° C에서 5 분 동안 품 어.
  3. 세포 현 탁 액을 수집, hESC 매체 추가 (억제제 또는 성장 인자 (표 1); 없이 적어도 2-fold 희석) 하 모든 hPSC를 복구 하 고 부드럽게 세포를 단일 세포 현 탁 액 pipetting으로 triturate. 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 정지를 전송.
  4. 5 분 동안 300 g에서 centrifuge 및 aspirate/삭제는 상쾌한. 다시 LIF 3i 매체에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. hemocytometer 또는 자동 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
  5. 플레이트 ~ 2 잘 당 105 셀 x LIF 3i 문화의 일상적인 뿌리고 위한 gelatinized 6 잘 플레이트에 비친된 MEF에. 초기 LIF 5i 적응 문화권 LIF-3i/MEF에 처음 높은 밀도 (4 x 105 셀/잘) 첫 대목 전에 접시.
  6. 다시 접시 그리고 LIF 5i 적응 hPSC 신선한 PBS 씻어 비친된 MEF 급지대 접시에 (위와 같이 전날 준비) LIF 3i 매체에 배포. LIF 3i 매체 매일 교체 합니다.
  7. 최소에 대 한 통행 N-hPSC 4-7 연속 대량 LIF 3i 중간 사전 기능 연구 또는 cryopreservation N hPSC의 사용에에서 통행. N-hPSC의 구절의 번호를 기록 기존의 또는 LIF 3i 미디어.
    참고: 높은 통행의 LIF 3i 버전 (예: > p40) 혈통 액, 기존의 hPSC 라인은 권장 하지 않습니다. 노력 그들은 사용할 수 있는 가장 낮은 가능한 통로에 기존의 hPSC 라인 복귀 하 여야 한다. 또한, 같은 N-hPSC 문화 때문에 장기간된 클론 세포 문화 선택 karyotypically 비정상적인 클론 항구 수 있습니다 이후 10 LIF 3i 구절 보다 큰 받은 LIF 3i 돌 hPSC 사용 하 여 기능 연구에 대 한 권장 하지 않습니다. 경우 낮은 통로 기존의 hPSC 라인의 신선한 LIF-5i/LIF-3i reversions 기능 연구에 대 한 실시 한다 N-hPSC와의 주식 < LIF 3i 10 구절은 사용할 수 없습니다.

4. cryopreservation 및 LIF 3i 돌 N-hPSC의 재개

  1. 기능 연구 또는 장기 cryopreservation 사용 하기 전에, 위에 표시 된 대로 되돌린된 N-LIF 3i에 적어도 5-7 구절에 대 한 hPSC를 확장 합니다. 기존의 조건 및 각 cryopreserved 유리병에 LIF 3i 조건 구절의 번호를 기록 하십시오.
    참고: 초과 LIF 3i 돌 N hPSC 기능 분석에 사용 되지 수 각 통로에 cryopreserved 하지만 낮은 후 귀선 구절의 동결 (예:., < p3) 가난한 사람, 또는 높은 가변 후 재개 복구 효율성에 발생할 수 있습니다.
  2. Biosafety 내각에 문화 매체를 발음 하 고, PBS (잘 당 2 mL)에 셀을 세척 하 고, PBS를 발음 한 세포 분리 솔루션 (우물 당 1 mL)을 사용 하 여 단일 셀에 hPSC 식민지를 분리. CO2 인큐베이터 (5% CO2, 습 한 분위기)에서 37 ° C에서 5 분 동안 접시를 놓습니다. (2-fold) LIF 3i 매체와 세포 분리 솔루션을 희석 하 고, 살 균 15 ml 원뿔 hPSC를 수집 하 고 5 분 동안 200 x g 에서 세포를 원심 한 LIF 3i 매체 (잘 상응 당 1-2 mL)에 셀 펠 릿 resuspend. hemocytometer 또는 자동 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
  3. LIF 3i 매체 (200 x g 5 분)에서 N-hPSC 원심 및 냉동 솔루션 (표 2), biosafety 내각에서 셀 1 x 10 이상6 셀/mL의 조밀도에 resuspend.
  4. 장기 저장 극저온 관으로 셀을 전송 하 고 느린 냉동 컨테이너에 배치. -80 ° C 냉장고에 하룻밤 동결을 샘플 수 있습니다.
  5. 다음 날, 장기 저장을 위한 액체 질소 냉동 고에는 cryovials를 전송 합니다.
  6. 녹고, 배치 냉동된 유리병 ~ 2 분 Sterilize 유리병 (즉, 에탄올 스프레이)에 대 한 37 ° C 물 목욕으로, hPSC 살 균 15 mL 원뿔에 전송 하 고 천천히 5 μ M의 보충 셀 사진에서 hESC 매체 (표 1) 희석 로 관련 된 단백질 키 니 아 제 (바위) 억제제 Y-27632 캐비닛 메 마른 생물 안전 후드 내에서.
  7. 5 분 동안 200 x g 에서 원심 분리기. Biosafety 내각에서 삭제 셀 무료 상쾌한 고 LIF 3i 매체 (1-2 mL) 5 μ M 바위 억제제 Y-27632 보충에 셀 펠 릿 resuspend.
    참고: Y-27632의 가난한 후 녹고 복구 효율성 (그림 2)에서 발생 합니다.
  8. PBS 씻어 MEF 도금 우물에 LIF-3i/ROCK 억제제에 resuspended 해 동된 셀을 전송 합니다. 병 당 1 x 106 세포의 밀도에서 LIF 3i 문화 cryopreserve 녹여 gelatinized 6 잘 플레이트의 한 잘 모이 통에이 튜브의 각.
  9. 다음 날로 키 니 아 제 억제 물 없이 일반 LIF 3i 중간 확장 시작.

5. 피더 제거 N hPSC 샘플의 컬렉션에 대 한

  1. LIF-3i/MEF (또는 기존의 hESC/MEF)에서 샘플 문화 준비를 (, 유전자 발현에 대 한 (예를 들어, 양적 RT-PCR, microarrays) 또는 단백질 (예: 서쪽 오 점) 분석을 사용 하 여 MEF 지류에서 LIF 3i 문화 고갈 마그네틱 활성화 셀 정렬 ()로 맥 안티-TRA-1-81 항 체 코팅 제조 업체의 프로토콜에 따라 microbeads.
  2. 아래 설명 된 대로 또는 고갈 지류의 문화를 다음과 같은 간단한 사전 도금 메서드를 사용 합니다.
  3. 메 마른 생물 안전 후드 캐비닛, 셀 무료 상쾌한, 잘 당 2 mL 살 균 PBS 가진 펠 릿을 세척. 세포 분리 솔루션 (1 mL/음)를 사용 하 여 부착 LIF-3i/MEF 문화를 분리 합니다. CO2 인큐베이터 (5% CO2, 습 한 분위기)에서 5 분 동안 품 어. HPSC 살 균 15 ml 원뿔을 수집 합니다. 워시 2-fold에서 hESC 매체, 살 균 15 mL 원뿔 및 5 분 동안 200 x g 에서 원심 분리기로 전송 셀.
  4. Biosafety 내각에서 다시 LIF 3i 매체의 2 mL에 LIF-3i/MEF 해리 셀의 각 음을 중단 하 고 직접 갓 0.1% 젤라틴으로 코팅 6 잘 플레이트의 새로운 우물에 전송.
  5. CO2 인큐베이터 (5% CO2, 습 한 분위기)에서 37 ° C에서 1 시간에 대 한 hPSC 셀 LIF-3i/MEF를 품 어. 비 부착 한 세포 새로운 원뿔 튜브에 피 펫을 수집 합니다. 부드럽게 각 잘 하 hESC 매체의 2 개 mL를 추가 하 고는 나머지 비 부착 한 세포를 수집 소용돌이.
    참고: 방사능된 MEF의 대부분에 연결 됩니다 1 h에서 gelatinized 접시에에서는 hPSC의 대부분을 떠나.
  6. 결합 하 고 5 분 PBS에 세척에 대 한 300 x g 에서 세포를 원심. 스냅-액 셀 펠 릿 액체 질소에 원심, 후 또는 또는 다운스트림 단백질 또는 핵 산 분석 (그림 2B)와 호환 되는 lysing 버퍼에 다시 펠 릿을 일시 중단 합니다.
  7. LIF 3i hPSC 라인 일치 기존의 끝났다 isogenic hPSC 컨트롤의 characterizations을 수행 합니다.
    참고: 때문에 본질적인 가변성 사이 고 끝났다 문화 안에서 관련 컨트롤 일치 timepoint 문화 또는 순진한 복귀 이전에 준비 된다. 자세한 프로토콜 및 다운스트림 immunofluorescent bioimaging에 대 한 자료 흐름 cytometry, 부 럽, 유전자 발현 (RT-PCR 분석 실험 및 microarrays), 메 틸 화 연구 (점 오 점, CpG 메 틸 화 microarray), OCT4 인접과 원심 증강 우세 기자 분석 실험 및 신호 전달 억제제 분석 제공 됩니다 다른 곳3.

6. 게시 순진한 귀선: 게놈 무결성 유효성 검사와 보존의 부모의 인쇄물 LIF 3i 돌 N-hPSC 기능 분석 실험에서 사용 하기 전에

  1. LIF-5i/LIF-3i 복귀를 시작 하기 전에 정상적인 karyotype (예를 들어, 게시 된 방법 7을 사용 하 여 밴드 Giemsa 얼룩 분석)의 소유 물에 대 한 시작 끝났다, 기존의 hPSC 문화를 화면.
    참고:이 비정상적인 게놈 변경 artefactual 선택적 생존 이점을 클론 LIF 3i 조건에서 운전 수는 항구 수 있습니다 기존의 hPSC 인구를 제거 하는.
  2. 최적의 결과 위해 갓 복귀 기존의 hPSC 기능 연구에 그들의 사용에 몇 주 이전에 LIF 3i와 순진한 같은 상태로 문화 또는 차별화를 감독.
    참고: 루틴 LIF 3i 10 구절 다음 순진한 귀선은 권장 하지 않습니다에 대 한 조건에서 '유지 보수' 문화를 연장 한다. 일상적인 확장 및 유지 보수 hESC과 hiPSC의 전통적인 문화 시스템을 사용 하 여 수행 되어야 합니다 (예를 들어, E8, 또는 MEF/hESC bFGF와 중간).
  3. 정상의 보존 LIF 3i 복귀 후 5-7 구절 karyotypes에 대 한 사후 되돌린된 N hPSC 라인을 평가 (., 밴드 Giemsa 얼룩 분석7또는 어떤 다른 방법의 선택).
  4. 선택의 DNA 메 틸 화 분석에 의해 정상적인 부모의 게놈 인쇄물의 보존에 대 한 모든 되돌린된 N hPSC 라인을 평가 (예를 들어, 프로토콜 CpG DNA microarray 분석 LIF 3i 돌 N-hPSC에서 부모의 인쇄물의 다른3 제공 됩니다 ) LIF 3i 버전의 5-10 구절 후.

7. LIF 3i 돌 N-hPSC를 사용 하 여 양적 감독된 차별화 분석 실험에 대 한 게시물 순진한 귀선: 실험 설계 지침

  1. 직접 추가 셀 문화 조작 없이 설립된 감독된 차별화 프로토콜에 LIF 3i N-hPSC를 사용 합니다.
    참고: 다시 프라이 (즉, N-hPSC를 다시 감독된 차별화 분석 실험에서 사용 하기 전에 기존의 끝났다 조건 변환) LIF 3i 방법 불필요 하 고 권장 하지 않습니다.
  2. 분석 결과의 영향에 대 한 제어 및 개별 hPSC 라인의 기능 테스트에서 가변성을 환승, 최소한 3 개의 hPSC와 독립적인 분화 프로토콜을 채용 하 여 계보 관련 차별화 potencies 크로스 확인 선 독립 유전 배경에서 파생 된 (즉, 여러 기증자 파생 된 hiPSC 및 hESC).
  3. 기능 비교에 대 한 설정 형제, 해당 통로 번호, 그리고 기존의 혈통 액을 동시에 같은 (isogenic) hPSC 줄에서 문화와 LIF 3i 되돌릴 hPSC 문화. 그들의 각각 미디어에 액/순 형제 isogenic hPSC 문화를 유지 (., E8 vs. LIF-3i), 동시에 어떤 실험적인 바이어스 (그림 4)을 제거 하기 위해 동일한 차별화 프로토콜 및 재료를 사용 하 여 차별화.
  4. Isogenic 액 대 순 hPSC 비교, 조정 및 각 개별 차별화 분석 결과 대 한 초기 도금 밀도 최적화.
    참고: 신경 조상, 최종 endoderm LIF 3i 돌 N-hPSC의 hemato 내 피 감독된 차별화에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다 다른 곳 3. LIF 3i 돌 N-hPSC는 기존의 hPSC 보다 감독된 차별화 분석 실험에 더 강력한 증식 및 분화 용량을가지고. N hPSC는 일반적으로 기존의 hPSC 보다 낮은 초기 도금 농도 필요로 하 고 그들의 기존의 끝났다 hPSC 달리 대응 하지 않아도 다음 효소 그들의 클론 생존을 향상 시키기 위해 안티 apoptotic 시 약의 사용 차별화 분석 실험에서의 소화

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Representative Results

이 프로토콜 두 지류 종속 및 급지대 독립적인 계보 됐다는 기존의 hPSC 문화 (그림 1)에서 LIF 3i와 효율적인 순진한 같은 버전을 최적화합니다. 자세한 프로토콜 설명 여기, LIF-3i 어느 급지대 또는 급지대 무료 기존의 hPSC 조건 (예: E8 매체)에서 시작에 개요 순차적 적응.

여러 기존 hESC LIF 3i 버전에 대 한 결과 대표 하 고 transgene 무료 hiPSC 라인 그림 1-3에 표시 됩니다. 이러한 일반적인 결과 상용 hESC 라인 H9, 유효성을 검사할 수 또는 상업적으로 사용할 수와 함께 혈액 파생 episomal hiPSC 라인 (6.2) Zambidis 실험실8,9에서 파생 된 코드 transgene 무료. 초기 LIF 5i 적응 단계 소개 LIF 3i에 기존의 hPSC 문화의 매우 효율적인 후속, 대량 클론 전파를 허용 하 고 안티-apoptotic 대리인 또는 바위 억제제10 (그림 1A, B를 필요로 하지 않습니다. ). 순진한 같은 hPSC 샘플 다운스트림 분석 또는 multilineage에 대 한 신속 하 게 수집 될 수 있습니다 여러 접시 LIF 3i에만 5-7 구절 후 차별화를 감독. 또는, LIF 3i 문화 미래 응용 프로그램에 대 한 cryopreserved 수 있습니다. 수 셀 복구 후 녹고 cryopreservation 및 후 해 동 미디어11에 록 억제제의 포함을 통해 (그림 2)를 개선.

둘 다 생체 외에서 분자와 기능적인 pluripotency 및 태아에 결정 했다 최근 검토2. 이러한 요소는 유전적 배경, 주요 발달 유전자와 hESC 및 hiPSC 파생 문화 방법론의 차이 대 한 돌연변이의 문화 관련 수집 포함 됩니다. 제공 아래 사용할 수 있는 특성 및 phenotypic의 유효성 검사에 대 한 분자, 표준 분석 실험 요약 및 LIF 3i 돌 hPSC의 기능 pluripotencies입니다.

식민지 형태학
끝났다, 전통과 LIF 3i 돌 문화 시스템 간의 전환 hPSC 식민지 형태 (그림 1B)에서 뚜렷한 신체적 변화를 동반 된다. 기존의 hPSC 세포 증식으로 평면, 넓은 단층 식민지 (MEF 또는 급지대 무료 조건)에 작은 세포 덩어리만 제대로 단일 세포로 급속 하 게 확장 하는. LIF 3i를 기존의 hPSC 라인의 노출 성장과 확장을 촉진 하 고 작고, 긴밀 하 게 포장의 돔 모양의 식민지 clonally에서 발생 하는 단일 셀. 이러한 형태 변화는 완전히 가역 및 LIF 3i 철회 하 고 셀 다시 표준 기존의 hESC 매체에 교양 LIF 3i 돌 돔 모양의 식민지 자발적으로 기존의 단층의 형태를 다시 전환 수 있습니다. bFGF와 보충. 또한, 높은 confluent 밀도 (또는 자주 뿌리고 없이 장기간된 문화) LIF 3i를 되돌릴 셀의 확장 결과 평면, 기존의 형태학의 자발적인 획득 감소 클론 효율; LIF 3i 되돌릴 hPSC 및 성실한 유지 보수에 대 한 필요성을 강조 (., < 40-60% 합류).

면역 형광 염색 생활과 표면 pluripotency 마커의 cytometric 분석 흐름
다음 연속 LIF 3i 문화 수 순 같은 상태로 기존의에서 전환 하는 동안 pluripotency 마커의 평가 비 접촉 감지 LIF-3i/MEF 확장 (에 어떤 부정적인 영향 없이 얼룩 라이브 항 체를 사용 하 여 모니터링 ., TRA-1-81, TRA-1-60, 그리고 SSEA4에 대 한 형광 색소 활용 된 항 체 라이브-얼룩).

LIF 3i 복귀 동안 pluripotency의 모니터링할 수 있습니다 또한 정기적으로 TRA-1의 pluripotency 관련 표면 마커 식의 흐름 cytometric 분석 및 단일 동안 SSEA 항 셀 뿌리고 (그림 1C) 또는 그대로의 면역 형광 식민지에 고정 제자리에 (그림 3). 비록 이러한 마커 할 차별 하지 사이의 기존의 고 LIF 3i 상태, 그들의 수준 LIF 3i 조건에 기존의 hPSC에서 전환할 때 hPSC에서 발생할 수 있는 자발적인 차별화의 주파수와 반비례 상관. 좀 더 구체적으로 마크 인간의 순 같은 상태 체 외에서2,12,13 수 있습니다 추가 표면 항 원 또한 효과적인 LIF 3i hPSC 버전을 감지 사용할 수 있습니다.

N hPSC의 분자 pluripotency의 유효성 검사
HPSC 라인의 유전 배경 라인 변화에 강한 참여자로 특징 되었습니다, 때문에 엄격 하 게 hPSC 문화 시스템 (그림 4)를 비교할 때 일치 하는 문화 timepoints에서 isogenic 문화를 평가 하기 위해 중요 하다. 어떤 순진한 복귀 방법 N-hPSC 방식으로 독립적인 유전 배경의 수와 분석 해야 때문에 이러한 시스템의 일부를 이미 탈 게놈 및 epigenetic 구성2hPSC 인구를 생성 하기 위해 표시 되었습니다, 그건 생물 학적 재현성을 확인 하 고 비 발달 관련 "의사-만능" 상태 (즉, 분자 pluripotency 하지만 기능 차별화 능력 부족의 명백한 특징으로)을 제외 하기에 충분. Zimmerlin . 시 금 되돌린된 N-hiPSC 다양 한 재활 방법에서 파생 된 기능 다양성의 또 다른 알려진된 putative 참가자는의 분자와 기능적인 pluripotencies 포함 LIF 3i 문화 시스템의 유효성 검사를 추가 확장 만능 사이2상태.

따라서, 인간의 순 문화 시스템의 대부분의 연구에 초점을 맞춘 1에서 N-hPSC의 분자 pluripotency 시 금) 후 수준 (예: 히스톤 부호 칩 시퀀싱 또는 글로벌 DNA 메 틸 화 immunoblots 또는 전체 게놈 칩 PCR에 의해 황산 시퀀싱, 대립 유전자 특정 CpG 메 틸 화 microarrays, OCT4 증강 기자 시스템에 의해 우위 한 사용, DNAse 규제 요소에서 글로벌 활동 나 과민 증, 그리고 반복 요소 RNA 시퀀싱에 의해 프로 파일링), 2) transcriptomic 수준 (RNA 시퀀싱, 식 microarrays 그리고 양적 RT-PCR), 단백질 표정 분석 (., FACS, immunofluorescent 현미경 검사 법, 그리고 서쪽에 게 더 럽 히기) 3) 대사 연구 (예를 들어, 분해, 산화를 통해 인 산화 및 니코틴 대사)입니다. 면역 형광 검사 얼룩 및 분자 pluripotency의 주요 표식에 대 한 표현의 서쪽 오 점 검출의 대표적인 예는 (그림 3B, C)에 표시 됩니다. 예를 들어, 그림 3B에서은 활성화 phosphorylated (인)과 STAT3와 ERK1/2는 마우스 ESC-같은 순진한 pluripotency의 핵심 분자 특징의 총 isoforms입니다. 이러한 안티 STAT3 및 안티-ERK1/2 1 차 항 체를 사용 하 여 발견 했다. 또한, 기형종 차별화 분석 기능 pluripotency는 기존의 에서 보여 줍니다. LIF 3i 되돌릴 hPSC 기형종 조직 10 주 다음 주입 해 부 4% 포름알데히드에서 고정 및 임베디드 (그림 3D) 파라핀.

다운스트림 분자 분석을 위한 LIF-3i/MEF 또는 hESC/MEF/bFGF 샘플의 준비는 MEF 고갈을 포함 되어야 합니다. 두 가지 방법 우리의 실험실에서 성공적으로 고용 되었다 MEF 고갈에 대 한 위에 설명 합니다. MEF 사전 도금은 단순 하 고, 신뢰할 수 있는, 그리고 N-hPSC에서 모이 통을 제거 비용-효율적인 방법 분자 연구에 대 한 샘플 FACS 또는 맥 분리 (즉, 안티-TRA-1-81 또는 안티-TRA-1-60 항 체 기반 분리를 선호 대안 이다 ). 또한, LIF-5i/LIF-3i 문화에 자연스럽 게 차별화 TRA 1 음수가 부착 셀 삭제 될 수 있다 급속 하 게 신선한 MEF에 후속 LIF 3i 통로 이전 LIF-5i/LIF-3i N-hPSC 문화에서 사전 도금 효소 소화에 의해 0.1% 젤라틴 (그림 2)로 미리 코팅 접시에 1 시간에 대 한 단일 셀.

N hPSC의 기능 pluripotency의 평가
PSC의 기능 pluripotency의 가장 엄격한 분석 결과 blastocyst 주입 키메라 분석 결과, 윤리적인 이유로 N-hPSC 라인의 테스트에 제한 되는. 또는, 다른 다양 한 방법으로 N-hPSC의 세대를 보고 여러 그룹 interspecies 키메라 생성 하려고 했습니다. 그러나, 이러한 시도 표준 마우스 ESC2의 키메라 생성 용량에 비해 murine 또는 돼지 배아를 차별화 된 N-hPSC 계보의 매우 낮은 또는 실패 기여를 얻지 못했다.

추가 기능 연구 상 상속 N-hPSC의 다양 한 방법을 통해 파생의 차별화 감독 생체 외에서 조사 하지만 편견, 불완전, 또는 감소 multilineage 차별화 용량, 수 반하는 밝혀졌다 은닉 후 이상이2,13의. 특히 찍힌된 loci에서 비슷한 epigenomic 차 마우스 ESC에서에서 발견 된 LIF 2i 칵테일14에 장기간된 노출에 따라. 흥미롭게도, 일부 복귀 문화 시스템 trophectoderm 기여 비보에 대 한 향상 된 용량 등 PSC의 기능 pluripotency의 특정 특성에 글로벌 개선 보고가2,15 .

LIF 3i 되돌릴 hPSC 독립적으로 파생 된의 광범위 한 컬렉션을 사용 하 여, Zimmerlin 외. 고용 LIF 3i 시스템 극적으로 기존의 hPSC 라인 의 기능 pluripotency 향상을 보여 multilineage 차별화 분석 3. 이로써 기존의 대의 체계적인 분석 LIF 3i hPSC 라인 isogenic 쌍 환승 종속 변화 (그림 4)을 제거 하. LIF 3i 되돌릴 hPSC 라인 EB 차별화 전에 다시 프라이 밍 단계를 필요 하지 않습니다. 그러나, LIF 3i hPSC isogenic 셀 E8에 확장 하 고 따라서, 초기 낮은 도금 밀도 필요 각 문화 비슷한 timepoint에 합류에 도달 수 있도록 조정 보다 상당히 높은 클론 속도로 확산.

수 사관 vivo에서 기형종 분석 뿐만 아니라 신경를 차별화 분석에서 생체 외에서 감독을 포함 하는 LIF 3i 돌 hPSC의 향상 된 기능을 설명 하기 위해 여러 분석 활용 정기적으로 해야 확실 한 endoderm 및 hematovascular 계보3 여러 분석 (예:2D APEL3,16 , 3D embryoid 몸17,18 시스템)를 사용 하 여. 분석 결과 종속 재현성을 제어 하기 위해 적어도 두 개의 서로 다른 차별화 방법 각 isogenic 쌍 액/LIF-3i hPSC 문화 (예를 들어, 그림 4, APEL, embryoid 몸의 복제에서 수행 되어야 합니다. 차별화 프로토콜)입니다. 실험 설계는 강력한 수를 포함 해야 합니다 (예를 들어, > 3-5) hPSC의 isogenic 쌍 액/LIF-3i 여러 독립적인 기증자 유전 배경 (그림 4)에서 라인.

Figure 1
그림 1: 순진한 같은 조건 LIF 3i 방법으로 기존의 혈통 액 hPSC 문화의 는 단계적 전환. (A) stepwise LIF 3i 버전에 대 한 프로토콜 스키마. (위 도식) 전환에 대 한 일반적인 방법이 끝났다, LIF 3i 문화를 기존의 hPSC를. (아래 회로도) 기존의의 LIF 3i 순진한 귀선에 대 한 두 가지 요약된 전략 (끝났다) 급지대 (즉, LIF-3i/mef Primed/MEF), 또는 급지대 무료 조건 (, Primed/E8 LIF-3i/mef)에서 경작 하는 hPSC를. (B) 인간 PSC 형태학입니다. LIF 3i 버전 상용 인간의 episomal iPSC 라인 (6.2)를 사용 하는 동안 hPSC의 대표적인 photomicrographs은입니다. 표시 전환 초기 기존의 평면 단층 식민지 사이 관찰 되며 중간 LIF-5i와 안정적인 LIF 3i 문화 조건에 따라 발생 하는 후속 돔 모양의 clonogenic 식민지 통로. 스케일 바 = 200 µ m. (C) 대표적인 흐름 cytometric 분석 pluripotency 표면 마커. TRA-1-81 및 SSEA-4 표면 식 기존의 hPSC 라인 6.2 (p40) E8, LIF-5i/MEF에서 초기 통로 및 다음 1-9 구절 (P1-P9) 확장 LIF 3i 조건에서입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : N-hPSC의 cryopreservation 및 MEF 사전 도금 샘플 준비. (A) LIF-3i/MEF 문화의 동결/동결 해제 사이클의 예. 기존의 코드 혈액 파생, 통합 되지 않은, 인간의 transgene 무료 iPSC 라인 E5C3 파생 되었고 4ng/mL bFGF 18 구절에 대 한 보충 하는 hESC 매체에서 MEF 지류에 확장. 기존의 혈통 액 E5C3 LIF-5i (왼쪽)에 적응 하 고 3 구절 (센터)에 대 한 LIF 3i 매체로 전환 했다. E5C3 LIF-3i 셀 센터 패널에 표시 했다 cryopreserved DMSO 기반 cryoprotectant 매체 (표 2, 유리병 당 1 x 106 셀)를 사용 하 고 액체 질소에 저장). 한 유리병에는 한 달 후 해 동 했다 그리고 E5C3 셀 피더 6 잘 플레이트 (오른쪽)의 코팅에 옮겨 졌다. 셀 복구 5 µ M와 LIF 3i 매체를 보완 하 여 강화 될 수 있다 단지 1 일 후 해 동에 대 한 Y-27632. 스케일 바 = 200 µ m. MEF의 (B) 제거 (및 또한 부착 TRA 음수가 분화 세포) LIF-3i/MEF hPSC 문화에서 사전 도금 방법으로. TRA 1 항 원 네거티브와 사용 하 여 MEF 셀의 소모를 설명 하는 SSEA-1/CD15 항 체, SSEA-4 APC 활용 된 항 체와 TRA-1-60 항 체, PE 활용 된 안티-TRA-1-81 사전 도금 전후 흐름을 cytometric 분석은 표시는 1 시간 전 도금 방법입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : LIF-3i/MEF N-hPSC 문화에서 pluripotency의 특성. (A) 표면 및 핵 pluripotency 마커. 표현의 pluripotency 요소 NANOG는 같은 (isogenic) TRA-1-81+SSEA4에서에서+ , 기존의 액 코드 혈액에서 파생 된 hiPSC 라인 E5C3 (p39) 끝났다 (E8), 또는 순진한 LIF-3i (+ LIF-3i/MEF에서 p8) 조건에서 확장. Immunofluorescent 얼룩 챔버 슬라이드에 대표 hPSC 문화의 코어 pluripotency 요소 NANOG SSEA-4+TRA-1-81+ hPSC에서 경작된에 준비 하 고, 기존의 (E8 매체) 또는 LIF-3i/MEF의 유니폼, 핵 식 공개 조건입니다. 눈금 막대 = 100 µ m. (B) 서쪽 오 점 분석. STAT3 (왼쪽), ERK (센터), 그리고 기존의 (E8 매체) 또는 LIF-3i/MEF 조건 (3i) 대표 hPSC 선 (hESC 선 H9)에 대 한 제어 베타 걸 단백질 표정. 순진한 pluripotency 관련 된 녹음 방송 요인의 (C) 식입니다. 면역 형광 검사 대표 LIF-3i/MEF 문화에 의해 스텔라/DPPA3, NR5A2, 및 TFCP2L1은 (혈액에서 파생 된 hiPSC 라인 E5C3 p33 코드 (hESC/MEF) + p8 (LIF-3i/MEF). 눈금 막대 = 100 µ m. (D) 기형종 분석 전통과 LIF 3i 돌 hPSC의. Isogenic 대표 hiPSC 라인 기능성 pluripotency의 유효성 검사 (코드 혈액에서 파생 된 E32C6) 어느 E8에 교양 (p9) 또는 LIF-3i/MEF (+ p12) 기형종 분석 결과 의해. isogenic 병렬 교양 기존의 끝났다 vs LIF 3i 돌 hPSC의 10 x 106 셀 immunodeficient NSG 쥐의 팔 다리에 피하 주입 했다. 기형종 microsections의 hematoxylin 및 오신 얼룩 밝혀 체계적인된 ectoderm와 모든 3 개의 세균 층에 강력한 차별화 (신경 근 엽: NR, 망막 안료 epitheliam: RPE), mesoderm (chondroblasts: Ch), 그리고 endoderm (선 조직: GI) 계보. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: Isogenic 끝났다 고 순진한 국가 사이 기능 pluripotency의 비교. (A) 독립적인 분화 프로토콜에서 LIF-3i 교양 hPSC 대 기존의 isogenic에서 고유 만능 국가에서 기능 pluripotency를 평가 하기 위한 전략의 도식. 두 개의 hemato-혈관 뿌리 차별화 시스템 (APEL 단층 및 3D embryoid 몸 (EB) 시스템) 이전 기존의 의 차별화 효능을 평가 하기 위해 고용 했다은 LIF-3i-복귀 같은 (isogenic) hPSC 라인 같은 통로 번호 LIF 3i 귀선 병렬 게시물 경작. LIF 3i 되돌릴 hPSC 라인 EB 차별화 전에 다시 프라이 밍 단계를 필요 하지 않습니다 그리고 분화 프로토콜을 직접 받게 됩니다. (B) EB 혈관 뿌리 (부사장) 차별화 시스템. 이 연구에 대 한 고용 EB 3D 차별화 시스템 앞에서 설명한17,18이었다. 동일한 코드 혈액 (CB)의 isogenic 문화에 대 한 대표적인 결과 EB 차별화 (왼쪽된 패널)의 10 일에는 표시-E5C3 hPSC 선9, 어느 기존의 hESC/MEF에서 교양 파생 (Primed / MEF) 조건 또는 LIF-3i/MEF 순진한 조건입니다. 이러한 EB 셀의 흐름 cytometry 분석 표시 CD31의 극적인 증가+CD146+ 부사장 LIF 3i 귀선 차별 전에 E5C3 라인의 다음 인구. 히스토그램 표시 CD31의 평균 ±SD+CD146+ 부사장 세포 비율 독립적인 hPSC 라인 (즉, 두 개의 CB-hiPSC 및 성인 1 구와 파생의 3 isogenic 쌍을 사용 하 여이 EB 시스템에서 날 10에서 복구 hiPSC, 점선 연결 isogenic 쌍). 결과 여러 hPSC 라인의 유전 배경에서 EB 시스템에서 부사장 분화 효율의 상당한 개선을 보여줍니다. (C) APEL 단층 혈관 조상 차별화 시스템. 기존 (끝났다 E8) LIF 3i 복귀 hPSC 수 있는 3, 프로토콜 차별화 된 사용 하 여 동일한 문화 조건, 성장 인자, cytokines 및 작은 분자 stepwise APEL 내 피 분화의 직접 16. E5C3 코드 혈액에서 파생 된 hiPSC 선 및 CD31의 비율을 사용 하 여 실험을 차별화 하는 독립적인 APEL은+CD146+ APEL 차별화의 제 7 일에 혈관 조상 인구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

LIF 3i 시스템 인간의 pluripotent 줄기 세포 클래식 murine 2i 순진한 귀선 칵테일1 의 수정된 된 버전을 적용합니다. (이 혼자 2에서 확장할 수 없습니다) hPSC의 자기 갱신 tankyrase 억제제 XAV939 함께이 칵테일을 보완 하 여 LIF-2에서 안정 이다. LIF 3i 문화 대량 인간의 preimplantation epiblast3닮은 만능 상태로 기존의 hPSC의 효율적인 복구를 수 있습니다. HPSC에서 XAV939의 행동의 메커니즘은 복잡 한 가능성이 있지만 시너지 2i와 함께, 그들은 가능성이 포함 최소, 중요 한 안정화 및 WNT 경로3신호를 통해 hPSC 자기 갱신의 확대.

기존의 hPSC 문화는 일반적으로 높은 변수 혈통 액 유전자 식 및 포스트 주입 epiblast epigenetic 표시 일관성이 없거나 저하 기능 pluripotency2에서에서 발생할 수 있는 만능의 스펙트럼을 채택 . 이 고유의 혈통 못쓰게 기존의 hPSC 문화 또한 일부 hPSC 라인2의 성공적인 LIF 3i 귀선 방해할 수 있습니다. 그러나, LIF 3i 방법에서 초기 LIF 5i 적응 단계 (표 1)의 포함 보편적으로 LIF 3i 귀선 hPSC 라인의 무리 들의 효율성 및 방식으로 기존의 hPSC 라인의 대량 순 복귀를 추진 하 고 그 지루한 따기와 희귀 순진한 되돌릴 식민지, 또는 그들의 생존 능력을 안정화 하기 위해 일상적인 안티-apoptotic 분자의 사용을 위한 필요의 subcloning circumvents.

LIF-5i/LIF-3i 순진한 귀선 메서드는 hESC과 hiPSC의 광범위 한 다양 한에서 재현할. 그것은 기본적인 셀 문화 기술 가진 최소한의 훈련이 필요합니다. Zimmerlin 외. 성공적으로 되돌리려면이 순차적 전략 고용 > 30 독립적인 hESC과 기증자 3의 광범위 한 배열에서 transgene 무료 hiPSC 라인. LIF-5i (그림 1)에서 단일 통로 대부분 hPSC 라인 대량 hPSC 문화, 효율적인 순진한 버전을 받아야 하 고 더 그들의 후속 안정적인 유지 보수 및 확장 LIF-3i 혼자에 대 한 충분 합니다.

또한, LIF-3i/MEF 시스템 지원 모든 을 통해 강력한 대량 클론 확장 효율성 완료 순 같은 hPSC 버전을 줄곧 혈통 됐다는 기존의 hPSC 문화 사이 단계 (즉,., 적응, 전환 및 혼자 LIF-3i/MEF에서 7-10 구절에 대 한 확장). 이 문화 시스템의 현재 정립 피더 지원 필요, 하지만 LIF 3i 문화의 분석에 대 한 사전 도금 기술에 의해 지류를 고갈 하는 간단 하 고 저렴 한 방법 (그림 2)를 제공 됩니다.

여러 다른 문화 시스템 또한 보고 되었습니다 비슷한 순 같은 만능에 기존의 hPSC 홍보 상태2. 이러한 hPSC 문화 시스템 또한 클래식 마우스 순진한 2i 조건 활용에 의존, 하지만 대부분의 경우에서 이러한 단일 셀 passaging 메서드 또한 추가 화학 변조에 필요한 본질적으로 불안정 안정화 / 한다 인간 순진한 상태입니다. 중요 한 것은, 대부분 이러한 다른 방법의 시연 차별화에 따라 장애인된 기능 pluripotency 및 인수 비정상적인 epigenomic 인쇄물 또는2karyotypes. 비록 기존의 끝났다 hPSC 문화 내에서 비정상적인 karyotypes의 출현은 이미 잘 문서화19, 연장, 효소 단일 셀 뿌리고 메서드를 대부분 순진한 복귀 방법에. 이것은 또한 비정상적인 염색체 구성20,21;의 약효를 보여줘 왔다 더 중요 한 기술 (예:, 복사 번호 유사, 단일 염기 다형성) 추가 변경22,23공개 수 있습니다.

반면, LIF 3i 되돌릴 hPSC 라인의 넓은 레 퍼 토리 정상적인 karyotypes 낮은 매체 구절 (예를 들면, p5-p15), 및 또한 높은 통로 숫자를 소유 하기 위하여 확인 되었다 (., > p30) 다음 LIF 3i 문화3. 또한, LIF 3i 돌 hPSC에 epigenomic 인쇄물에 5-10 구절 LIF 3i 버전2reproducibly 정상적이 고 그대로 발견 되었다. 중요 한 대립 유전자 특정 상업 메 틸 화 배열 플랫폼을 사용 하 여, 이전 시연 되었다 CpG 메 틸 화 마크 찍힌된 loci LIF 3i 되돌릴 hPSC 라인 (LIF 3i의 다음 4-7 구절)의 넓은 레 퍼 토리의에서 조잡 한 것을 발견 했다 일반 구조1. 순진한 귀선,이 사용 하 여 전후 hPSC 문화를 확인 하는 연구를 장려 하 고이 프로토콜에 필수 지침 설명 했다 때문에 비정상적인 게놈 인쇄물 및 karyotypes 궁극적으로 hPSC의 기능 능력을 저하 될 수 있습니다, 방법으로 다른 사람입니다.

LIF 3i 메서드 hESC 및 비-유전자 변형 hiPSC 라인 (그림 3)의 큰 레 퍼 토리에 세균 레이어에서 기능 pluripotency를 향상. 다른 순진한 귀선 프로토콜 달리 LIF 3i 방법 않습니다 하지 다시 못쓰게 단계 N-hPSC의 후속 차별화에 대 한 필요 (즉, 기존의 끝났다 조건에 그들의 사용 이전에 다시 N-hPSC 변환 지시 차별화 분석 실험)입니다. LIF 3i 돌 N-hPSC 두 기형종 분석 실험 (그림 3D)에 isogenic 전통적인 hPSC 들 보다 훨씬 더 효율적인 차별화 용량을 표시 하 고 모두의 계보의 분화 프로토콜을 감독 3 개의 세균 층2. 분석 결과 종속으로 인해 기존의 hPSC의 기능 테스트에서 유사 환승, 혈통 별 차별화 독립적인 감독된 차별화 프로토콜 및 여러 유전 배경에서 파생 된 hPSC를 사용 하 여 평가 한다. 실험적인 설계를 사용 하 여, hPSC 라인의 광범위 한 배열은 크게 LIF 3i 조건에서 4-10 구절을 다음과 같은 그들의 isogenic 기존의 대응에 비해 그들의 multilineage 차별화 효율성 향상을 기대 수 있습니다.

요약 하자면,이 방법은 신속 하 고 clonally 확장 인간의 숫자 PSC, 그들의 다운스트림 차별화 효율성, 증가 차별화, 다음 계보 커밋된 조상 핸드폰 번호 향상과 감소 라인 변화 가운데 기존의 혈통 액 hPSC 라인. 이러한 N-hPSC 향상 된 기능 추가 기능 조직 발전 태아에 기여 하는 그들의 잠재력에 대 한 광범위 한 영향을 있을 수 있습니다. 예를 들어 안정 된 N-hESC transplantable 인간 장기 및 동물 키메라 개발에 성체 줄기 세포를 개발 또는 질병의 인간 답게 진 대상 동물 모델을 생성 하기 위한 채택 될지도 모른다. 이 메서드의 tankyrase 억제제 활용 LIF 3i에 더 최적화 정의 급지대 무료 GMP 준수 문화 조건에 대 한 기능 및 engraftable 세포 유형의 광범위의 효율적인 임상으로 유용한 생성을 촉진 한다 치료 사용 합니다.

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Disclosures

생활 기술 및 존스 홉킨스 대학 (JHU) 사이의 라이선스 계약에 따라 닥터 Zambidis 줄기 세포의 라이센스에 대 한 대학에서 받은 특허권 사용료의 몫을 받을 권리가 있다. 이 계약의 약관 JHU 상충 정책에 따라 관리 합니다. 이 저자의 준수 데이터 및 자료 공유에 저널 정책 변경 하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 NIH/네이 (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB 스타인 혁신 상 수상는 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금 (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk 과학 포럼 상와 모 슬 리 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated BD Biosciences 561716 use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibody Sigma Aldrich HPA029708 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibody Abcam ab6276 use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated  BD Biosciences 550315 use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugated eBioscience 17-0319-42 use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kit Miltenyi Biotec 130-091-935
anti-NANOG antibody Abcam ab109250 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibody Sigma Aldrich HPA005455 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody Cell Signaling 4695 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody Cell Signaling 4370 use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody Cell Signaling 9145 use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated Agilent E0432 use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated  R&D System FAB1435A use 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated R&D System NLLC1435G use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibody Cell Signaling 9139 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibody Millipore MAB4388 use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated  R&D System NLLC4770R use at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0068 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0069 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560193 use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560161 use 10µL per assay (FACS)
APEL2-Li StemCell Technologies 5271
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3311
CellAdhere dilution buffer StemCell Technologies 7183 dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouse Charles river 023
CHIR99021 R&D System L5283 reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope system Zeiss LSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC line Thermo Fisher Scientific A18945 also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates Corning 3506
Countess  cell counting chamber slide Thermo Fisher Scientific C10228
Countess automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)  Thermo Fisher Scientific 11995-065
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific 11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D2650
DR4 mouse The Jackson Laboratory 3208
Essential 8 (E8) medium StemCell Technologies 5940
Fetal bovin serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30071.03
Forskolin Stemgent 04-0025 reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G1890-100G resuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
mTeSR1 medium StemCell Technologies 85850
Nalgene cryogenic vials Thermo Fisher Scientific 5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System Fisher Scientific 154534
Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS USB Corporation  19943
PD0325901 Sigma Aldrich PZ0162 reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
Purmorphamine Stemgent 04-0009 reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin A Peprotech AF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 Peprotech 120-05ET resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF) Peprotech 100-18B resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human LIF Peprotech 300-05 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
SB431542  Stemgent 04-0010-05 reconstitute at 100mM in DMSO
Stemolecule Y27632 in Solution Stemgent 04-0012-02 ROCK inhibitor in solution (10mM)
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific A11105-01
Streptavidin-Cy3 conjugate Sigma Aldrich S6402 use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 Peprotech 100-21 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
Vitronectin XF matrix StemCell Technologies 7180 dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer
XAV939 Sigma Aldrich X3004 reconstitute at 100mM in DMSO
β-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023 light sensitive

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References

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