पारंपरिक मानव Pluripotent के रासायनिक पुनः संस्करण स्टेम कोशिकाओं में सुधार Multilineage भेदभाव शक्ति के साथ एक भोली की तरह राज्य

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Developmental Biology

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Summary

हम कुशल, थोक, और पारंपरिक वंश के तेजी से रासायनिक पुनः संस्करण के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान-मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC) एक epigenomically में स्थिर भोली आरोपण epiblast-pluripotent राज्य की तरह । इस विधि में कमी हुई वंश में परिणाम-जीन अभिव्यक्ति और पारंपरिक hPSC लाइनों की एक व्यापक प्रदर्शनों की प्रक्रिया के पार निर्देशित multilineage भेदभाव में चिह्नित सुधार ।

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Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Naïve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency. J. Vis. Exp. (136), e57921, doi:10.3791/57921 (2018).

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Abstract

बेहतर कार्यक्षमता के साथ भोली मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं (एन hPSC) अपक्षयी दवा में एक व्यापक प्रभाव हो सकता है । इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को कुशलतापूर्वक वापस वंश-प्रधान, पारंपरिक मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC) या तो फीडर पर बनाए रखा है मुक्त या फीडर पर निर्भर परिस्थितियों में सुधार की कार्यक्षमता के साथ एक भोली की तरह pluripotency । इस रासायनिक भोली reversion विधि शास्त्रीय ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (लिफ), GSK3β, और खल्क/ERK निषेध कॉकटेल (लिफ-2i), केवल एक tankyrase अवरोध करनेवाला XAV939 (लिफ-3i) के साथ पूरक कार्यरत हैं । लिफ-3i जैव रासायनिक, transcriptional, और मानव पूर्व आरोपण epigenetic की epiblast सुविधाओं को अपनाने के लिए एक स्थिर pluripotent राज्य को पारंपरिक hPSC वापस आ जाता है । इस लिफ-3i विधि ंयूनतम सेल संस्कृति हेरफेर की आवश्यकता है और मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESC) और transgene मुक्त मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) लाइनों की एक व्यापक प्रदर्शन की प्रक्रिया में अत्यधिक reproducible है । लिफ-3i विधि एक फिर से भड़काना कदम से पहले भेदभाव की आवश्यकता नहीं है; N-hPSC सीधे अत्यंत उच्च क्षमता के साथ विभेदित किया जा सकता है और बनाए रखने karyotypic और epigenomic stabilities (सहित पर अंकित loci) । विधि की सार्वभौमिकता में वृद्धि करने के लिए, परम्परागत hPSC पहले दो अतिरिक्त छोटे अणुओं के साथ पूरक लिफ-3i कॉकटेल में कल्चरित होते हैं जो शक्ति प्रदान प्रोटीन कळेनासे ए (forskolin) और सोनिक हेज (श्श्श) (purmorphamine) सिग्नलिंग (लिफ-5i) होते हैं । इस संक्षिप्त लिफ-5i अनुकूलन कदम काफी पारंपरिक hPSC के प्रारंभिक क्लोनिंग विस्तार को बढ़ाता है और उंहें बाद में भोली-लिफ के साथ वापस आ गया है, भारी मात्रा में अकेले 3i, इस प्रकार खरीदना/उपक्लोनिंग दुर्लभ N-obviating की आवश्यकता के लिए अनुमति hPSC बाद में कालोनियां । लिफ-5i-स्थिर hPSCs के बाद लिफ-3i में अकेले विरोधी अपोप्तोटिक अणुओं की आवश्यकता के बिना बनाए रखा जाता है । सबसे महत्वपूर्ण बात, लिफ-3i reversion के रूप में स्पष्ट रूप से उनके वंश को कम करने से पारंपरिक hPSC की एक व्यापक प्रदर्शनों की कार्यक्षमताओं के कार्यात्मक pluripotency में सुधार-प्रधानमंत्री जीन अभिव्यक्ति और निर्देशित भिंनता की पंक्ति परिवर्तनशीलता मिटा सामांयतः स्वतंत्र hPSC लाइनों के बीच मनाया । लिफ के प्रतिनिधि characterizations-3i-वापस आ एन hPSC प्रदान की जाती हैं, और वंश में isogenic hPSC के कार्यात्मक तुलना के लिए प्रयोगात्मक रणनीति- बनामप्रधानमंत्री भोले-भाले राज्यों की तरह रेखांकित होते हैं.

Introduction

2i (खल्क/ERK और GSK3β अवरोधक) संस्कृति प्रणाली मूलतः विषम सीरम-आधारित माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को परिष्कृत करने के लिए विकसित किया गया था (mESC) pluripotency के एक समान जमीन राज्य के लिए संस्कृतियों जैसा माउस आरोपण epiblast1। हालांकि, 2i मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC) लाइनों2के स्थिर रखरखाव का समर्थन नहीं करता है । विभिंन जटिल छोटे अणु, विकास फैक्टर-पूरक है, और ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण हाल ही में putatively समान मानव पर कब्जा करने की सूचना दी गई है pluripotent आणविक राज्यों2की तरह । हालांकि, इन तरीकों के साथ बनाया "भोली की तरह" राज्यों में भी karyotypic अस्थिरता, epigenomic दोषों (जैसे, माता पिता का जीनोमिक के वैश्विक नुकसान का प्रदर्शन), या बिगड़ा भेदभाव की क्षमता के कई ।

इसके विपरीत, GSK3β, ERK और tankyrase संकेतन और ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक के ट्रिपल रासायनिक निषेध की कॉकटेल (लिफ-3i) पारंपरिक hPSC लाइनों3की एक व्यापक प्रदर्शनों की तरह स्थिर भोली-पुनः संस्करण के लिए पर्याप्त था । लिफ-3i-लौट भोली hPSC (एन hPSC) ने सामान्य karyotypes बनाए रखा और भोली-विशिष्ट मानव आरोपण epiblast जीन (जैसे, NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, स्टेला (DPPA3), KLF17 के उनके भाव बढ़ गए , TFCP2L1) । लिफ-3i पुनः संस्करण भी hPSC आणविक और जैव रासायनिक विशेषताओं की एक सरणी mESC के लिए अद्वितीय की तरह भोली pluripotency है कि वृद्धि हुई phosphorylated STAT3 संकेतन शामिल है, कम ERK फास्फारिलीकरण, ग्लोबल 5-methylcytosine CpG विशिष्ट जीन प्रमोटरों, और प्रमुख बाहर OCT4 बढ़ाने के उपयोग-भ्रूण स्टेम सेल (ESC) पर hypomethylation, जीनोम चौड़ा CpG इसके अलावा, अंय भोली reversion तरीकों की तुलना में है कि aberrantly hypomethylated अंकित जीनोमिक loci के परिणामस्वरूप, लिफ-3i-वापस आ N-hPSC अंकित CpG पैटर्न या डीएनए methyltransferase अभिव्यक्ति की हानि के व्यवस्थित नुकसान से रहित थे (जैसे, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.

एक प्रत्यक्ष लिफ पारंपरिक मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESC) और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) या तो भक्षण या E8 फीडर मुक्त शर्तों पर हो एक व्यापक सरणी के 3i संस्कृति तेजी से और थोक एक भोली epiblast के लिए पुनः संस्करण हासिल की तरह राज्य । हालांकि, प्रत्यक्ष लिफ-3i भोली पुनः संस्करण अंतर्निहित जीनोमिक और वंश-आनुवंशिक रूप से विविध दाता पृष्ठभूमि से उत्पंन variabilities के कारण कुछ अस्थिर पारंपरिक hPSC लाइनों में अक्षम हो सकता है ।

इस प्रकार, लिफ-3i विधि की उपयोगिता को व्यापक करने के लिए, एक stepwise अनुकूलन विकसित किया गया था और यहां प्रस्तुत किया है, कि लगभग किसी भी पारंपरिक hESC या transgene के साथ सार्वभौमिक भोली पुनः संस्करण की अनुमति देता है मुक्त hiPSC लाइन भक्षण पर संस्कृति । इस सार्वभौमिक भोली reversion विधि पारंपरिक hPSC में एक क्षणिक प्रारंभिक संस्कृति कदम है कि दो अतिरिक्त छोटे अणुओं (लिफ-5i) कि शक्ति प्रदान प्रोटीन कळेनासे एक (forskolin) और ध्वनि हेज हॉग (श्श्श) के साथ लिफ-3i कॉकटेल की खुराक को रोजगार ( purmorphamine) सिगनलिंग. लिफ में पारंपरिक hPSC के एक प्रारंभिक बीतने-5i उन्हें भारी मात्रा में बाद में स्थिर लिफ-3i reversion करने के लिए अनुकूल है । प्रारंभिक लिफ-5i अनुकूलन काफी पारंपरिक E8 या भक्षण पर बड़े hPSC के प्रारंभिक एकल कोशिका क्लोनिंग प्रसार वृद्धि (उनके बाद स्थिर, लिफ में निरंतर बीतने-3i अकेले) से पहले । पारंपरिक hPSC लाइनों लिफ में एक मार्ग के लिए पहली बार अनुकूलित-5i बर्दाश्त बाद में लिफ-3i शर्तों, जो उठा और दुर्लभ स्थिर कालोनियों, या के नियमित उपयोग के उपक्लोनिंग के लिए की जरूरत obviates में भोली-लौट कोशिकाओं के बाद थोक क्लोनी passaging विरोधी अपोप्तोटिक अणु या Rho-जुड़े प्रोटीन कळेनासे (रॉक) अवरोधकों ।

लिफ-3i विधि सफलतापूर्वक किया गया है के लिए छुरा का विस्तार और बनाए रखने के लिए > 30 स्वतंत्र, आनुवंशिक रूप से विविध पारंपरिक hPSC लाइनों के लिए > 10-30 या तो गैर-एंजाइमी या एंजाइमी पृथक्करण तरीकों का उपयोग कर मार्ग, और गुणसूत्र या epigenomic विषमताओं के प्रेरण जीन loci में विषमता सहित, के सबूत के बिना । इसके अतिरिक्त, अनुक्रमिक लिफ-5i/लिफ-3i संस्कृति ही भोली reversion विधि है कि इस प्रकार अभी तक सूचित किया गया है कि उनके वंश के कम से पारंपरिक pluripotency लाइनों की एक व्यापक प्रदर्शनों की प्रक्रिया के कार्यात्मक hPSC में सुधार है प्रधानमंत्री जीन अभिव्यक्ति और नाटकीय रूप से उनके multipotent विभेद शक्ति में सुधार । लिफ-3i भोली पुनः संस्करण विधि वंश के विभेद की अंतर्निहित पंक्ति परिवर्तनशीलता-प्रधानमंत्री, पारंपरिक hPSC लाइनों को मिटाता है, और अपक्षयी चिकित्सा और सेलुलर चिकित्सा में आवेदन के एक महान उपयोगिता होगी ।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं पशु देखभाल के दिशा निर्देशों और प्रोटोकॉल पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के चिकित्सा संस्थान के जॉंस हॉपकिंस स्कूल द्वारा अनुमोदित के अनुसार प्रदर्शन किया गया ।

1. फीडर के लिए माउस भ्रूण Fibroblasts (MEF) की तैयारी-आश्रित परम्परागत (hESC मीडियम/MEF) या भोली-लौट (लिफ-3i मीडियम/MEF) hPSC कल्चर

  1. खरीद या CF1 या CF1 एक्स DR4 हाइब्रिड ई 13.5 माउस से MEF भक्षण के घर कम मार्ग की आपूर्ति तैयार प्रोटोकॉल4प्रकाशित निंनलिखित ।
    1. Cryopreserve कम मार्ग (p1-p2) MEF संस्कृतियों पूर्व (लंबी अवधि के भंडारण के लिए) या पोस्ट-(6 महीने के लिए) विकिरण और तरल नाइट्रोजन में स्टोर के रूप में पहले4वर्णित है ।
    2. विकीर्ण (५,००० राड) एक γ-या एक्स-रे-irradiator का उपयोग p5 के तहत थोक विस्तार MEF और १.५ x 106 कम अवधि के भंडारण के लिए प्रति शीशी (6 महीने से कम) में-८० डिग्री सेल्सियस एक अल्ट्रा कम तापमान फ्रीजर में aliquots तैयार करते हैं ।
    3. १.२ x 106 के बीच प्लेट (हौसले से विकिरणित गैर-cryopreserved) और १.५ x 106 (विकिरणित cryopreserved) MEF प्रति एक 6-अच्छी तरह से जिलेटिन की थाली फीडर संस्कृतियों की तैयारी के लिए, जैसा कि नीचे वर्णित है ।
  2. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में एक अच्छी तरह से बाँझ ०.१% जिलेटिन समाधान की १.५ मिलीलीटर जोड़कर जिलेटिन-लेपित 6-अच्छी तरह से बाँझ ऊतक संस्कृति का इलाज प्लेटें तैयार करें ।
  3. एक प्रयोगशाला CO2 मशीन में ३७ ° c से कम 1 घंटे या रात भर के लिए जिलेटिन-लेपित प्लेटें मशीन ।
  4. अगले दिन, गल कम मार्ग (जैसे, P2 पी 4) DMSO-cryopreserved और विकिरणित (५,००० राड) नीचे दिए गए चरणों के अनुसार MEF ।
    नोट: गैर-विकिरणित MEF भी गल जाना चाहिए, विस्तार, और विकिरणित तुरंत उपयोग करने से पहले ।
  5. ३७ ° c जल स्नान में एक cryopreserved MEF aliquot रखें । गल पर, इथेनॉल के साथ ट्यूब को निष्फल और तुरंत DMSO cryoprotectant कम 10-MEF मध्यम (तालिका 1) के साथ एक गैर-सुरक्षा कैबिनेट के भीतर गुना पतला (जैसे हस्तांतरण 1 एमएल DMSO-MEF aliquot में 9 मिलीलीटर MEF माध्यम में एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु) ।
  6. बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में 5 मिनट के लिए २०० x g पर पतला MEF कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
  7. एक सुरक्षा कैबिनेट में, महाप्राण और सेल मुक्त supernatant त्यागें, और 1 में सेल गोली पुनः स्थगित-2 मिलीलीटर ताजा MEF माध्यम ।
  8. धीरे जिलेटिन समाधान त्यागें और MEF पुनः के 2 मिलीलीटर जोड़ने के MEF माध्यम में एक अच्छी तरह से 6 प्लेट के प्रत्येक कुआं, ऊपर संकेत के रूप में निलंबित कर दिया । गिनती MEF कोशिकाओं और प्लेट १.२ x 106 (हौसले विकिरणित गैर cryopreserved) या १.५ x 106 (विकिरणित cryopreserved) MEF प्रति एक 6-अच्छी तरह से जिलेटिन प्लेट ।
    नोट: सभी सेल कल्चर प्लेट्स कि CO2 मशीन से करने के लिए से स्थानांतरित कर रहे है के लिए है, तो धीरे से इथेनॉल के साथ साफ किया जा सकता है-छिड़काव कागज लेकिन सीधे नहीं होना चाहिए पर छिड़काव के साथ ७०% इथेनॉल समाधान कुओं में इथेनॉल से बचने के लिए ।
  9. ३७ ° c में रात भर MEF प्लेटें एक प्रयोगशाला co2 मशीन (5% co2, आर्द्र वातावरण) में रातोंरात अनुलग्नक की अनुमति देने के लिए, उपयोग करने से पहले ।

2. एक संक्षिप्त लिफ-5i अनुकूलन कदम के साथ बाद में भोली पुनः संस्करण के लिए पारंपरिक hPSC संस्कृतियों के थोक स्थिरीकरण

  1. मांय जी द्वारा एक सामांय कैरयोटाइप रखने के लिए सभी पारंपरिक hPSC लाइनों बैंडिंग, लिफ-5i/लिफ-3i पुनः संस्करण शुरू करने से पहले ।
    नोट: लिफ-3i उच्च बीतने के पारंपरिक hPSC लाइनों (उदा, पी > 40-50) से बचा जाना चाहिए, के बाद से इन संस्कृतियों पहले से ही जीनोमिक वाकया है कि नकारात्मक स्थिर, कुशल प्रभाव मई बंदरगाह सकता है, और थोक लिफ-3i का पुनः संस्करण, convetional hPSC लाइनें ।
  2. बनाए रखने और या तो एक MEF आधारित संस्कृति प्रणाली में मांय सामांय karyotypes के साथ पारंपरिक hPSC संस्कृतियों का विस्तार (के रूप में खंड 1 में उल्लिखित), या एक फीडर मुक्त संस्कृति प्रणाली (है अंवेषक वरीयता के अनुसार) ।
    नोट: दोनों फीडर-निर्भर hPSC/MEF cocultures (जैसे, hESC मध्यम (तालिका 1) 4 के साथ पूरक-10 एनजी/एमएल bFGF) या फीडर-मुक्त (जैसे, E8 5 या mTSER 6 मीडिया (पर निर्माता के निर्देशों के अनुसार vitronectin-लेपित प्लेटें) तरीकों लिफ-5i/लिफ-3i/MEF प्रणाली (चित्रा 1) का उपयोग कर थोक भोली पुनः संस्करण के साथ संगत कर रहे हैं । गैर एंजाइमी तरीकों पारंपरिक hPSC के passaging के लिए उंहें पुनर्संस्करण के लिए तैयार करने से पहले पसंद कर रहे हैं । लिफ-5i और लिफ-3i मीडिया योगों में एंटीबायोटिक या रोधी एजेंट नहीं होते हैं । सुरक्षा कैबिनेट बांझपन और रखरखाव के लिए मानक संचालन नियमों को कड़ाई से किसी भी जीवाणु या कवक संक्रमण से बचने के लिए मनाया जाने की उंमीद कर रहे हैं ।
  3. MEF-आधारित संस्कृति प्रणाली के लिए, लिफ-5i-अनुकूलित पारंपरिक hPSC संस्कृतियों के passaging से पहले खंड 1 में वर्णित के रूप में जिलेटिन 6-अच्छी प्लेट में MEF भक्षण तैयार करते हैं ।
  4. पारंपरिक hPSC संस्कृतियों के बाद पहुंच गए है ~ ५०% प्रवाह (यानी, 3-5 दिन प्रारंभिक चढ़ाना के बाद), मानक hESC संस्कृति माध्यम लिफ के साथ बदलें-5i मध्यम (अच्छी तरह से प्रति 2 मिलीलीटर; तालिका 1) ।
    नोट: एक सुरक्षा कैबिनेट में ये चरण निष्पादित करें ।
  5. संस्कृति और बनाए रखने के लिए लिफ में 2 दिनों के लिए पारंपरिक hPSC/MEF-5i में सह2 मशीन (5% co2, आर्द्र वातावरण) । लिफ-5i मध्यम दैनिक उंहें उनके बाद बीतने और लिफ-3i में स्थिर पुनः संस्करण के लिए अनुकूलित करने के लिए बदल जाते हैं ।
  6. वैकल्पिक रूप से, के लिए फीडर मुक्त पारंपरिक संस्कृतियों (जैसे, E8 में), संस्कृति लिफ में hPSC-5i अगली सुबह passaging से पहले ही रातोंरात ।
    नोट: लिफ-5i और लिफ-3i संस्कृतियों दोनों या तो वायुमंडलीय (21% हे2) या शारीरिक (5% ओ2) ऑक्सीजन के स्तर में सह2 मशीन (5% सह2, आर्द्र वातावरण) के साथ बनाए रखा जा सकता है ।
  7. passaging करने से पहले, एक गैर सुरक्षा कैबिनेट में संस्कृति प्लेट प्लेस, धो लिफ-5i-पंजाबियों के साथ एक बार पारंपरिक hPSC अनुकूलित, और एक अच्छी तरह से सेल पृथक्करण रिएजेंट के 1 मिलीलीटर जोड़ें । एक सह2 मशीन में ३७ ° c में 5 मिनट के लिए मशीन, और धीरे एक सेल में एक पिपेट के साथ triturate के निलंबन वापस सुरक्षा कैबिनेट में ।
    नोट: गैर-एंजाइमी पृथक्करण बफ़र्स वैकल्पिक रूप से passaging के लिए एकल कक्ष तैयार करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
  8. एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में hESC माध्यम में सेल निलंबन (कम से कम 2 गुना कमजोर पड़ने) लीजिए, और धीरे triturate कोशिकाओं pipetting द्वारा एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ।
  9. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक, महाप्राण/supernatant को त्यागें, और लिफ-5i माध्यम के 1-2 मिलीलीटर में सेल गोली को पुनर्स्थगित करें । किसी hemocytometer या किसी स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों की गणना करना.
  10. पंजाबियों के साथ पहले से मढ़वाया MEF प्लेट दो बार धो लें (6 अच्छी तरह से प्लेटों में प्रति अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर) और 1-2 x 106 कोशिकाओं (2 मिलीलीटर लिफ-5i माध्यम में) 1 पर पंजाब-धोया MEF प्लेट की अच्छी तरह से वितरित ।
  11. समायोजित करें और प्रत्येक व्यक्ति hPSC लाइन के लिए प्रारंभिक चढ़ाना घनत्व का अनुकूलन भोली-लौट, के रूप में reचढ़ाना क्षमता अत्यधिक चर सकता है । एक सह2 मशीन में थाली प्लेस (5% सह2, आर्द्र वातावरण) ।
    नोट: एंटी-अपोप्तोटिक रिएजेंट का नेमी उपयोग इस विधि के साथ अधिकांश hPSC रेखाओं के लिए अनुशंसित नहीं है । लिफ-5i प्रणाली पहले से ही काफी पारंपरिक hPSC लाइनों के प्रारंभिक थोक क्लोनी पुनः चढ़ाना क्षमता को बढ़ाता है । हालांकि, एक रॉक अवरोधक के समय का उपयोग (5-10 माइक्रोन Y-२७६३२) आगे कुछ अस्थिर वंश के लिए पहले पारित होने में पारंपरिक hPSC संस्कृतियों के 5i क्लोनिंग पुनः चढ़ाना दक्षता में सुधार हो सकता है-लिफ सहज के लिए प्रवृत्ति के साथ प्रधानमंत्री hPSC लाइनों भेदभाव.
  12. यदि फीडर से शुरू मुक्त संस्कृतियों (जैसे, E8), सीधे असंबद्ध पारंपरिक hPSC के एक अच्छी तरह से एक 5i विकिरणित में लिफ में रूपांतरित-MEF-अच्छी तरह से मढ़वाया (यानी, 1:1 मार्ग) स्थानांतरण ।
  13. अगले दिन, धीरे प्लेट सभी गैर संलग्न कोशिकाओं को उठाने के लिए घूमता है, महाप्राण माध्यम (पंजाबियों धोने वैकल्पिक है) और लिफ-5i मध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित । एक सुरक्षा के लिए दैनिक मंत्रिमंडल में इस कदम प्रदर्शन 3-5 दिन या जब तक कोशिकाओं रहे है 60 – 70% धाराप्रवाह (चित्रा 1) । एक सह2 मशीन में थाली प्लेस (5% सह2, आर्द्र वातावरण) ।

3. लिफ-3i माध्यम में एन-hPSC का दीर्घकालिक अनुरक्षण एवं विस्तार

  1. प्रारंभिक लिफ के बाद-5i अनुकूलन, बीतने के बाद स्थिर लिफ-3i संस्कृतियों हर 3-4 दिनों में एक गैर सुरक्षा कैबिनेट, या जब संस्कृतियों 60-70% धाराप्रवाह (चित्रा 1) बन जाते हैं ।
    नोट: लिफ-3i संस्कृतियों कठोर रखरखाव की आवश्यकता होती है और N-hPSC संस्कृतियों उच्च प्रवाह तक पहुंचने के लिए और लंबे समय तक संस्कृति से सेल घनत्व (जैसे, > 4 दिन) के बाद क्लोनल पुनः चढ़ाना दक्षता घट जाती है, और सहज बढ़ावा देता है की अनुमति भेदभाव.
  2. एक सुरक्षा कैबिनेट में, संस्कृति माध्यम को त्यागें और धीरे से पंजाब के 2 मिलीलीटर जोड़कर लिफ-5i/लिफ-3i संस्कृतियों के प्रत्येक कुआं को धो लें । पंजाबियों को छोड़ें और 1 मिलीलीटर सेल टुकड़ी समाधान जोड़ें । एक सह2 मशीन में ३७ ° c में 5 मिनट के लिए मशीन (5% सह2, आर्द्र वातावरण) ।
  3. सेल निलंबन ले लीजिए, hESC मध्यम जोड़ (अवरोधकों या विकास कारकों (तालिका 1) के बिना; एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए pipetting द्वारा सभी hPSC और धीरे triturate कोशिकाओं को ठीक करने के लिए कम से कम 2 गुना कमजोर पड़ने). एक बाँझ 15 एमएल शंकु ट्यूब करने के लिए निलंबन स्थानांतरण ।
  4. 5 मिनट और महाप्राण के लिए ३०० g पर केंद्रापसारक/supernatant छोड़ दें । लिफ-3i माध्यम में सेल गोली पुनः निलंबित । किसी hemocytometer या किसी स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों की गणना करना.
  5. थाली ~ 2 x 105 प्रति अच्छी तरह से लिफ-3i संस्कृतियों की दिनचर्या passaging के लिए जिलेटिन 6-अच्छी तरह से थाली में विकिरणित MEF पर कोशिकाओं । प्रारंभिक लिफ के लिए-5i-रूपांतरित संस्कृतियों, प्लेट एक शुरू में उच्च घनत्व (4 x 105 कोशिकाओं/लिफ में पहले पारित होने से पहले-3i/MEF ।
  6. पुन: प्लेट और वितरित लिफ-5i-ताजा पंजाब-धोया विकिरणित MEF फीडर प्लेटों पर अनुकूलित hPSC (ऊपर के रूप में पिछले दिन तैयार) लिफ-3i माध्यम में । लिफ-3i मीडियम को रोजाना बदलें ।
  7. गद्यांश n-hPSC के लिए लिफ-3i मध्यम से कम 4 – 7 निरंतर थोक मार्ग का उपयोग करने से पहले n-hPSC कार्यात्मक अध्ययन या cryopreservation में । या तो पारंपरिक या लिफ-3i मीडिया में N-hPSC के मार्ग की संख्या रिकॉर्ड ।
    नोट: लिफ-3i उच्च मार्ग का पुनः संस्करण (जैसे > p40) वंश-प्रधानमंत्री, पारंपरिक hPSC लाइनों की सिफारिश नहीं है । एक प्रयास है कि वे उपलब्ध है सबसे कम संभव बीतने पर पारंपरिक hPSC लाइनें वापस किया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, लिफ-3i-वापस hPSC है कि 10 से अधिक लिफ-3i मार्ग से गुजरा है का उपयोग कार्यात्मक अध्ययन के लिए अनुशंसित नहीं है, क्योंकि ऐसी N-hPSC संस्कृतियों karyotypically-असामांय क्लोन लंबे समय तक क्लोनिंग सेल संस्कृति के चयन के कारण बंदरगाह हो सकता है । ताजा लिफ-5i/लिफ-3i hPSC-hPSC में < 10 अंश के साथ एन-लिफ के स्टॉक्स उपलब्ध नहीं हैं, तो कम बीतने वाले पारंपरिक 3i लाइनों के कार्यात्मक अध्ययन के लिए आयोजित किया जाना चाहिए ।

4. लिफ के Cryopreservation और गल-3i-वापस आ गए N-hPSC

  1. विस्तृत लिफ-3i, के रूप में ऊपर संकेत दिया, कार्यात्मक अध्ययन या दीर्घकालिक cryopreservation में उपयोग करने से पहले के लिए वापस आ एन-hPSC का विस्तार करें । पारंपरिक स्थितियों में और प्रत्येक cryopreserved शीशी पर लिफ-3i स्थितियों में मार्ग की संख्या रिकॉर्ड करें ।
    नोट: अतिरिक्त लिफ-3i-वापस आ एन hPSC कार्यात्मक परख में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है प्रत्येक मार्ग पर cryopreserved है, लेकिन कम पद के जमने-reversion मार्ग (जैसे, < p) गरीब, या उच्च चर के बाद गल वसूली क्षमता में परिणाम हो सकता है ।
  2. एक सुरक्षा कैबिनेट में, संस्कृति माध्यम महाप्राण, पंजाब में कोशिकाओं को धोने (प्रति अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर), महाप्राण पंजाब और अलग कर देना hPSC कालोनियों एकल कोशिकाओं में सेल टुकड़ी समाधान का उपयोग (प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर) । एक सह2 मशीन में ३७ ° c में 5 मिनट के लिए थाली प्लेस (5% co2, आर्द्र वातावरण) । लिफ-3i मध्यम (2 गुना) के साथ सेल टुकड़ी समाधान पतला, एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु में hPSC लीजिए, 5 मिनट के लिए २०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक और लिफ-3i मध्यम (अच्छी तरह से प्रति 1-2 मिलीलीटर-समकक्ष) में सेल गोली reसस्पेंड । किसी hemocytometer या किसी स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों की संख्या गिनना ।
  3. केंद्रापसारक N-hPSC लिफ-3i मध्यम में (5 मिनट के लिए २०० x g ) और ठंड समाधान (तालिका 2) में एक सुरक्षा कैबिनेट में कोशिकाओं को पुनः निलंबित, एक घनत्व से कम 1 x 106 कोशिकाओं/
  4. लंबी अवधि के भंडारण क्रायोजेनिक ट्यूबों में स्थानांतरण कोशिकाओं और एक धीमी ठंड कंटेनर में जगह है । नमूने एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रात भर फ्रीज करने की अनुमति दें ।
  5. अगले दिन, लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक तरल नाइट्रोजन फ्रीजर में cryovials हस्तांतरण ।
  6. गल के लिए, के लिए एक ३७ ° c जल स्नान में जमे हुए शीशी प्लेस ~ 2 मिनट । शीशी (यानी, इथेनॉल स्प्रे) निष्फल, एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु में hPSC हस्तांतरण और धीरे-hESC मध्यम (तालिका 1) में कोशिकाओं को पतला 10-गुना के 5 माइक्रोन के साथ पूरक Rho-जुड़े प्रोटीन कळेनासे (रॉक) एक बाँझ जैविक सुरक्षा हूड कैबिनेट के भीतर अवरोधक Y-२७६३२ ।
  7. 5 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक । एक सुरक्षा कैबिनेट में, सेल मुक्त supernatant त्यागें और लिफ में सेल गोली reसस्पेंड-3i मध्यम (1-2 एमएल) 5 माइक्रोन रॉक अवरोधक Y-२७६३२ के साथ पूरक ।
    नोट: Y-२७६३२ का बहिष्करण गरीब पोस्ट-गल वसूली क्षमता (चित्रा 2) में परिणाम होगा ।
  8. पंजाब-धोया MEF-मढ़वाया कुओं पर लिफ-3i/रॉक अवरोधक में reसस्पैंड सड़ कोशिकाओं स्थानांतरण । Cryopreserve लिफ-3i संस्कृतियों के घनत्व पर 1 x 10 शीशी प्रति6 कोशिकाओं । एक जिलेटिन 6 अच्छी तरह से प्लेट के एक कुआं में भक्षण पर इन शीशियों में से प्रत्येक गल ।
  9. अगले दिन, Rho कळेनासे अवरोधक के बिना नियमित रूप से लिफ-3i मध्यम विस्तार शुरू करते हैं ।

5. एन-hPSC नमूनों के संग्रह के लिए फीडर रिमूवल

  1. लिफ से नमूने तैयार करने के लिए-3i/MEF (या hESC/MEF पारंपरिक) संस्कृतियों (यानी, जीन अभिव्यक्ति के लिए (जैसे , मात्रात्मक आरटी-पीसीआर, microarrays) या प्रोटीन (जैसे, पश्चिमी दाग) विश्लेषण, लिफ भक्षण से 3i-MEF संस्कृतियों का उपयोग निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार विरोधी तर्-1-81 एंटीबॉडी लेपित microbeads के साथ चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस) ।
  2. वैकल्पिक रूप से, निंनलिखित सरल पूर्व चढ़ाना विधि का उपयोग करने के लिए भक्षण की संस्कृतियों गिरेगा, जैसा कि नीचे वर्णित है ।
  3. एक बाँझ जैविक सुरक्षा डाकू कैबिनेट में, सेल मुक्त supernatant त्यागें, अच्छी तरह से प्रति 2 मिलीलीटर बाँझ पंजाबियों के साथ गोली धोने. देताच अनुयाई लिफ-3i/MEF सेल टुकड़ी समाधान का उपयोग संस्कृतियों (1 मिलीलीटर/ एक सह2 मशीन में 5 मिनट के लिए मशीन (5% सह2, आर्द्र वातावरण) । एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु में hPSC लीजिए । धो 2-hESC मध्यम में गुना, बाँझ में 15 मिलीलीटर शंकु में स्थानांतरण कोशिकाओं और 5 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक ।
  4. एक सुरक्षा कैबिनेट में, पुनः लिफ के प्रत्येक अच्छी तरह से निलंबित-3i/MEF असंबद्ध कोशिकाओं के 2 मिलीलीटर लिफ-3i माध्यम में, और सीधे एक 6 अच्छी तरह से थाली है कि हौसले से ०.१% जिलेटिन के साथ लेपित गया है की एक नई अच्छी तरह से हस्तांतरण ।
  5. मशीन लिफ-3i/MEF एक सह2 मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए hPSC कोशिकाओं (5% co2, आर्द्र वातावरण) । एक नए शंकु ट्यूब में एक पिपेट के साथ गैर अनुयाई कोशिकाओं को इकट्ठा । धीरे से एक अच्छी तरह से hESC मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ने और भंवर शेष गैर अनुयाई कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए ।
    नोट: विकिरणित MEF के बहुमत 1 एच में जिलेटिन की थाली को देते हैं, निलंबन में hPSC के बहुमत छोड़कर जाएगा ।
  6. गठबंधन और ३०० एक्स जी में सेल केंद्रापसारक 5 मिनट के लिए पंजाब में धो लो । स्नैप-फ्रीज के बाद तरल नाइट्रोजन में सेल गोली, या वैकल्पिक रूप से एक lysing बफर कि बहाव प्रोटीन या न्यूक्लिक एसिड विश्लेषण (चित्रा 2बी) के साथ संगत है में छर्रों फिर से सस्पेंड ।
  7. characterizations लिफ-3i hPSC लाइनों के एक मेल पारंपरिक प्राइम isogenic hPSC नियंत्रण के साथ प्रदर्शन ।
    ध्यान दें: क्योंकि आंतरिक परिवर्तनशीलता के बीच और के भीतर प्रधानमंत्री संस्कृतियों, प्रासंगिक नियंत्रण संस्कृति में एक मेल timepoint पर तैयार है या भोली reversion करने से पहले । विस्तृत प्रोटोकॉल और बहाव immunofluorescent के लिए सामग्री इमेजिंग, फ्लो cytometry, वेस्टर्न सोख्ता, जीन अभिव्यक्ति (आरटी-पीसीआर परख और microarrays), मिथाइल अध्ययन (डॉट दाग, CpG मिथाइल microarray), OCT4 समीपस्थ और बाहर बढ़ाने प्रबल संवाददाता परख और संकेत अवरोध करनेवाला परख कहीं3प्रदान की जाती हैं ।

6. पोस्ट भोली पुनः संस्करण: जीनोमिक अखंडता और लिफ-3i के माता पिता के निशान के प्रतिधारण के सत्यापन-वापस आ N-hPSC पहले कार्यात्मक परख में उपयोग के लिए

  1. स्क्रीन शुरू प्रधानमंत्री, एक सामांय कैरयोटाइप के कब्जे के लिए पारंपरिक hPSC संस्कृतियों (जैसे, Giemsa-बैंड धुंधला विश्लेषण प्रकाशित तरीकों का उपयोग कर के साथ 7) लिफ-5i/लिफ-3i पुनः संस्करण आरंभ करने से पहले ।
    नोट: यह पारंपरिक hPSC आबादी है कि असामांय जीनोमिक परिवर्तन जो क्लोनिंग लिफ-3i स्थितियों में artefactual चयनात्मक अस्तित्व लाभ ड्राइव कर सकते है बंदरगाह को खत्म करने के लिए है ।
  2. इष्टतम परिणामों के लिए, हौसले से लिफ-3i कई हफ्तों के साथ एक भोली की तरह राज्य के लिए पारंपरिक hPSC संस्कृतियों वापस कार्यात्मक अध्ययन में उनके उपयोग से पहले या भेदभाव का निर्देश दिया ।
    नोट: नियमित रूप से लंबे समय तक ' रखरखाव ' संस्कृति लिफ-3i शर्तों में 10 से अधिक के लिए भोली पुनः संस्करण निंनलिखित मार्ग अनुशंसित नहीं है । नियमित विस्तार और hESC और hiPSC लाइनों के रखरखाव पारंपरिक संस्कृति प्रणालियों का उपयोग किया जाना चाहिए (जैसे, E8 में, या MEF/hESC के साथ मध्यम bFGF) ।
  3. मूल्यांकन पोस्ट-वापस आ N-hPSC लाइनों सामांय karyotypes 5 के प्रतिधारण के लिए-7 लिफ के बाद मार्ग-3i पुनः संस्करण (जैसे, Giemsa-बैंड धुंधला विश्लेषण7, या पसंद के किसी भी अंय विधि के साथ) ।
  4. मूल्यांकन सभी n-hPSC लाइनों सामांय माता पिता का जीनोमिक के प्रतिधारण के लिए एक डीएनए (जैसे, प्रोटोकॉल CpG डीएनए microarray विश्लेषण के लिए लिफ में माता पिता के मुद्रण के विश्लेषण के आधार पर) का आकलन-3i-वापस आ एन hPSC कहीं प्रदान की जाती है3 ) 5 के बाद-लिफ के 10 मार्ग-3i पुनः संस्करण ।

7. पोस्ट भोली पुनः संस्करण: मात्रात्मक निर्देशित विभेद परख लिफ का उपयोग कर के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन दिशानिर्देश-3i-वापस आ N-hPSC

  1. सीधे अतिरिक्त सेल संस्कृति जोड़तोड़ के बिना स्थापित निर्देशित भेदभाव प्रोटोकॉल में लिफ-3i एन-hPSC का उपयोग ।
    नोट: Re-भड़काना (यानी, पारंपरिक प्रधानमंत्री शर्तों को वापस hPSC बदलने के निर्देश में भिंनता परख में उनके उपयोग से पहले) लिफ-3i विधि के साथ आवश्यक नहीं है और अनुशंसित नहीं है ।
  2. परख और व्यक्तिगत hPSC लाइनों के कार्यात्मक परीक्षण में परस्पर रेखांकन के प्रभावों के लिए नियंत्रित करने के लिए, पार से कम तीन hPSC के साथ स्वतंत्र भेदभाव प्रोटोकॉल को रोजगार द्वारा वंश-विशिष्ट भेदभाव potencies मांय स्वतंत्र आनुवंशिक पृष्ठभूमि (यानी, कई दाता-व्युत्पंन hiPSC और hESC) से व्युत्पंन लाइनें ।
  3. कार्यात्मक तुलना के लिए, भाई संस्कृतियों की स्थापना की, समकक्ष पारित संख्या में, और एक ही (isogenic) hPSC रेखा से पारंपरिक वंश के समानांतर में-प्रधानमंत्री और लिफ-3i-hPSC संस्कृतियों वापस आ गया । अपने संबंधित मीडिया में (जैसे, E8 बनाम) भोली सहोदर isogenic hPSC संस्कृतियों को बनाए रखना । लिफ-3i), और एक साथ समान भेदभाव प्रोटोकॉल और सामग्री का उपयोग कर अंतर, किसी भी प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह (चित्रा 4) को खत्म करने के लिए ।
  4. भोली hPSC तुलना बनाम isogenic के लिए, समायोजित करें और प्रत्येक व्यक्ति भेदभाव परख के लिए प्रारंभिक चढ़ाना घनत्व का अनुकूलन ।
    नोट: विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए तंत्रिका जनक, निश्चित अन्तः और hemato-endothelial निर्देशित भेदभाव के लिफ-3i-वापस N-hPSC कहीं प्रदान की जाती हैं 3. लिफ-3i-वापस आ एन hPSC अधिक मजबूत प्रफलन और पारंपरिक hPSC से निर्देशित भेदभाव परख में भिंनता क्षमता है । N-hPSC आमतौर पर पारंपरिक hPSC की तुलना में कम प्रारंभिक चढ़ाना एकाग्रता की आवश्यकता है, और उनके पारंपरिक प्रधान hPSC समकक्षों के विपरीत, विरोधी के उपयोग की आवश्यकता नहीं है अपोप्तोटिक रिएजेंट के लिए अपने क्लोनी अस्तित्व को बढ़ाने के निंनलिखित एंजाइमी विभेद परख में पाचन ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल लिफ-दोनों फीडर पर निर्भर है और फीडर-स्वतंत्र वंश प्रधान पारंपरिक hPSC संस्कृतियों (1 चित्रा) में 3i के साथ कुशल भोली की तरह पुनः संस्करण का अनुकूलन । विस्तृत प्रोटोकॉल, यहां वर्णित है, लिफ के लिए अनुक्रमिक अनुकूलन रूपरेखा-या तो फीडर पर निर्भर या फीडर-मुक्त पारंपरिक hPSC स्थितियों (जैसे E8 माध्यम) से शुरू 3i ।

लिफ के लिए प्रतिनिधि परिणाम-3i कई पारंपरिक hESC और transgene मुक्त hiPSC लाइनों के संस्करण 1 आंकड़ेमें प्रस्तुत कर रहे है-3 । इन विशिष्ट परिणामों के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध hESC लाइन H9, या एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध transgene-मुक्त, गर्भनाल रक्त व्युत्पंन episomal hiPSC लाइन (६.२) Zambidis प्रयोगशाला8,9में व्युत्पंन के साथ मांय किया जा सकता है । एक प्रारंभिक लिफ का परिचय-5i अनुकूलन कदम अत्यधिक कुशल बाद परमिट, थोक लिफ-3i में पारंपरिक hPSC संस्कृतियों के क्लोनिंग प्रचार, और विरोधी अपोप्तोटिक एजेंटों या रॉक अवरोधकों की आवश्यकता नहीं है10 (चित्रा 1ए, बी ). भोले की तरह hPSC नमूनों की कई प्लेट तेजी से बहाव विश्लेषण या multilineage केवल 5 के बाद विभेद निर्देशित के लिए एकत्र किया जा सकता है-लिफ-3i में 7 मार्ग । वैकल्पिक रूप से, लिफ-3i संस्कृतियों भविष्य अनुप्रयोगों के लिए cryopreserved जा सकता है । बाद गल सेल वसूली में सुधार किया जा सकता है (चित्रा 2) cryopreservation और बाद गल मीडिया11में एक चट्टान अवरोधक के शामिल किए जाने के माध्यम से ।

आणविक और कार्यात्मक pluripotency के निर्धारकों, दोनों विट्रो में और भ्रूण में हाल ही में2की समीक्षा की गई । इन कारकों आनुवंशिक पृष्ठभूमि, संस्कृति प्रमुख विकासात्मक जीन के लिए उत्परिवर्तनों के अधिग्रहण से जुड़े, और hESC और hiPSC व्युत्पत्ति और संस्कृति के तरीके में मतभेद शामिल हैं । नीचे दिए गए मानक परख कि लक्षण वर्णन और phenotypic, आणविक के सत्यापन के लिए नियोजित किया जा सकता का एक सारांश है, और कार्यात्मक लिफ के pluripotencies-3i-वापस hPSC ।

कॉलोनी आकृति विज्ञान
प्रधान, पारंपरिक और लिफ-3i-वापस संस्कृति प्रणालियों के बीच संक्रमण hPSC कॉलोनी आकृति विज्ञान में विशिष्ट शारीरिक परिवर्तन के साथ है (चित्रा 1बी) । परम्परागत hPSC कोशिकाओं को समतल, चौड़ी monolayer कालोनियों के रूप में पैदा करना है जो छोटे सेल के झुरमुट (MEF या फीडर-फ्री शर्तों पर) से तेजी से फैलता है, लेकिन सिंगल सेल के रूप में खराब है । लिफ के लिए पारंपरिक hPSC लाइनों के एक्सपोजर-3i वृद्धि और विस्तार और छोटे, कसकर पैक, गुंबद के आकार की कालोनियों है कि एकल कोशिकाओं से क्लोनिंग पैदा को बढ़ावा देता है । इन रूपात्मक परिवर्तन पूरी तरह से प्रतिवर्ती कर रहे हैं, और लिफ-3i-वापस गुंबद के आकार के कालोनियों अनायास एक पारंपरिक monolayer आकृति विज्ञान के लिए वापस संक्रमण कर सकते है अगर लिफ-3i वापस ले लिया है और कोशिकाओं को मानक पारंपरिक hESC माध्यम में फिर से संस्कृति रहे है bFGF के साथ पूरक । इसके अतिरिक्त, उच्च धाराप्रवाह घनत्व पर लिफ-3i-वापस कोशिकाओं का विस्तार (या लगातार passaging के बिना लंबे समय तक संस्कृति) फ्लैट के सहज पुनर्प्राप्ति में परिणाम, कम क्लोनल दक्षता के साथ पारंपरिक आकृति विज्ञान; मेहनती रखरखाव और लिफ की देखभाल के लिए की जरूरत पर बल-3i-वापस hPSC (जैसे, < 40 – 60% संगम) ।

सतह pluripotency मार्करों के लाइव इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और फ्लो cytometric विश्लेषण
निरंतर लिफ-3i संस्कृति के बाद एक भोली-जैसे राज्य के लिए पारंपरिक से संक्रमण के दौरान pluripotency मार्करों का मूल्यांकन गैर-इनवेसिव पर किसी भी नकारात्मक प्रभाव का पता लगाने के बिना लाइव एंटीबॉडी धुंधला का उपयोग कर मॉनिटर किया जा सकता लिफ-3i/MEF विस्तार ( उदाहरणके लिए, जीना-धुंधला fluorochrome-संयुग्मित एंटीबॉडी के खिलाफ-1-81, तर्-1-60, और SSEA4) ।

लिफ के दौरान pluripotency के प्रतिधारण-3i भी नियमित रूप से pluripotency के प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा मॉनिटर किया जा सकता है-एक सेल SSEA के दौरान तर्-1 और passaging एंटीजन की सतह मार्कर अभिव्यक्ति (चित्रा 1सी) या इम्यूनोफ्लोरेसेंस की बरकरार, सीटू में तय हुई कालोनियां (आंकड़ा 3) । हालांकि इन मार्करों पारंपरिक और लिफ-3i राज्यों के बीच भेदभाव नहीं करते हैं, उनके स्तर व्युत्क्रम सहज अंतर है कि hPSC में हो सकता है जब पारंपरिक hPSC से लिफ-3i स्थितियों में संक्रमण की आवृत्ति के साथ सहसंबंधी बनाना । अतिरिक्त सतह एंटीजन जो अधिक विशेष रूप से चिह्नित कर सकते हैं मानव भोली-जैसे राज्यों में इन विट्रो2,12,13 भी प्रभावी लिफ-3i hPSC reversion का पता लगाने के लिए नियोजित किया जा सकता है ।

एन-hPSC के आण्विक pluripotency की मान् यता
क्योंकि hPSC लाइनों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि को रेखांकित परिवर्तनशीलता के लिए एक मजबूत योगदानकर्ता के रूप में विशेषता है, यह कड़ाई से संस्कृति timepoints मिलान में isogenic संस्कृतियों का आकलन महत्वपूर्ण है जब hPSC संस्कृति प्रणालियों (चित्रा 4) की तुलना । इन प्रणालियों में से कुछ पहले से ही ंयायपालिका जीनोमिक और epigenetic2विन्यास के साथ hPSC आबादी उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया है, किसी भी भोले reversion विधि एन के एक नंबर के साथ परख की जानी चाहिए-स्वतंत्र आनुवंशिक पृष्ठभूमि के hPSC, एक तरीके से कि जैविक reproducibility को मांय करने के लिए पर्याप्त है और गैर बाहर विकास प्रासंगिक "छद्म pluripotent" राज्यों (यानी, आणविक pluripotency की स्पष्ट पहचान के साथ, लेकिन कार्यात्मक भेदभाव क्षमताओं की कमी) । Zimmerlin एट अल. इसके अलावा लिफ-3i संस्कृति प्रणाली की मांयता को शामिल करने के लिए वापस आ एन-hiPSC विभिंन reprogramming तरीकों, जो कार्यात्मक परिवर्तनशीलता का एक और ज्ञात ख्यात योगदानकर्ता है से व्युत्पंन के आणविक और कार्यात्मक pluripotencies परख pluripotent राज्यों के बीच2.

तदनुसार, मानव भोली संस्कृति प्रणालियों के अधिकांश अध्ययनों की परख आणविक pluripotency पर ध्यान केंद्रित किया है N-hPSC पर 1) epigenetic स्तर (जैसे, चिप अनुक्रमण या चिप द्वारा हिस्टोन के निशान-पीसीआर, immunoblots या पूरे जीनोमिक द्वारा वैश्विक डीएनए मिथाइल bisulfite अनुक्रमण, एलील-विशिष्ट CpG मिथाइल microarrays, OCT4 बढ़ाने रिपोर्टर सिस्टम द्वारा प्रमुख उपयोग, नियामक तत्वों पर वैश्विक गतिविधि DNAse मैं अतिसंवेदनशीलता, और आरएनए-sequencing द्वारा दोहराने तत्व रूपरेखा), 2) transcriptomic स्तर (आरएनए-अनुक्रमण, अभिव्यक्ति microarrays, और मात्रात्मक आरटी-पीसीआर), प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण (जैसे, FACS, immunofluorescent माइक्रोस्कोपी, और पश्चिमी सोख्ता) और 3) चयापचय अध्ययन के माध्यम से (जैसे, glycolysis, ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण और nicotinamide चयापचय) । इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग और आणविक pluripotency के प्रमुख मार्करों के लिए अभिव्यक्ति के पश्चिमी दाग का पता लगाने के प्रतिनिधि उदाहरण (चित्रा 3बी, सी) दिखाया गया है । उदाहरण के लिए, चित्र 3 बी में दिखाया गया है सक्रिय phosphorylated (phospho) और STAT3 और ERK1 के कुल isoforms/2, जो माउस ESC की प्रमुख आणविक पहचान कर रहे है जैसे भोली pluripotency । ये एंटी-STAT3 और एंटी-ERK1/2 प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर पाए गए । इसके अतिरिक्त, teratoma भेदभाव परख में कार्यात्मक pluripotency बनामपारंपरिक में प्रदर्शन किया है लिफ-3i-वापस hPSC teratoma ऊतकों 10 सप्ताह इंजेक्शन के बाद और 4% formaldehyde और आयल एंबेडेड (चित्रा 3डी) में तय की विच्छेदित ।

लिफ-3i/MEF या hESC/MEF/bFGF नमूने के बहाव आणविक विश्लेषण के लिए तैयार MEF कमी शामिल होना चाहिए । दो दृष्टिकोण MEF कमी है कि सफलतापूर्वक हमारी प्रयोगशाला में नियोजित किया गया है के लिए ऊपर वर्णित हैं । MEF पूर्व चढ़ाना एक सरल, विश्वसनीय, और लागत कुशल विधि को आणविक अध्ययन के लिए एन hPSC नमूनों से भक्षण को खत्म करने और FACS या एमएसीएस जुदाई के लिए एक पसंदीदा विकल्प है (यानी, विरोधी तर्-1-81 या विरोधी तर्-1-60 एंटीबॉडी-जुदाई आधारित ). इसके अतिरिक्त, अनायास-विभेदन तर्-1-नकारात्मक अनुयाई कोशिकाओं में लिफ-5i/लिफ-3i संस्कृतियों तेजी से लिफ से समाप्त किया जा सकता है-5i-लिफ 3i एन-hPSC से पहले बाद में ताजा लिफ-3i-पच-चढ़ाना प्लेटों पर 1 एच के लिए एकल कोशिकाओं पूर्व ०.१% जिलेटिन (चित्रा 2) के साथ लेपित ।

N-hPSC के कार्यात्मक pluripotency का मूल्यांकन
पीएससी के कार्यात्मक pluripotency की सबसे कठोर परख ब्लास्टोसिस्ट इंजेक्शन कल्पना परख है, जो नैतिक कारणों से एन hPSC लाइनों के परीक्षण में सीमित है । वैकल्पिक रूप से, कई समूहों है कि विभिंन अंय तरीकों के साथ N-hPSC की जनरेशन chimeras उत्पंन करने का प्रयास किया है की सूचना दी है । हालांकि, इन प्रयासों murine या सुअर का भ्रूण के लिए विभेदित N-hPSC वंश का बहुत कम या असफल योगदान उपज है, मानक माउस ESC2की कल्पना क्षमता पैदा करने की तुलना में ।

अतिरिक्त कार्यात्मक अध्ययन इन विट्रो ख्यात एन के भेदभाव-hPSC विभिंन तरीकों के माध्यम से व्युत्पंन में निर्देशित जांच की है, लेकिन पक्षपाती, दोषपूर्ण, या कम multilineage अंतर क्षमता से पता चला है, सहवर्ती के साथ epigenetic विषमताओं की शरण2,13. इसी तरह के epigenomic वाकया, विशेष रूप से अंकित loci में, लिफ-2i कॉकटेल14के लिए लंबे समय तक निवेश के बाद माउस ESC में पाया गया है । दिलचस्प है, कुछ पुनर्संस्करण संस्कृति प्रणालियों के लिए बढ़ाया क्षमता के रूप में पीएससी के कार्यात्मक pluripotency की विशिष्ट विशेषताओं में वैश्विक सुधार की सूचना दी है vivo trophectoderm योगदान2,15 .

स्वतंत्र रूप से व्युत्पंन लिफ-3i-वापस hPSC, Zimmerlin एट अल का एक व्यापक संग्रह का उपयोग कर multilineage विभेद परख कार्यरत को दिखाने के लिए कि लिफ-3i प्रणाली नाटकीय रूप से पारंपरिक pluripotency लाइनों के कार्यात्मक hPSC में सुधार 3. यह isogenic जोड़े में पारंपरिक बनाम लिफ-3i hPSC लाइनों के व्यवस्थित विश्लेषण के लिए परस्पर निर्भर रूपांतरों (चित्रा 4) को खत्म करने की अनुमति देता है । लिफ-3i-वापस hPSC लाइनों एक पुनः भड़काना कदम EB भेदभाव से पहले की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, isogenic में विस्तारित E8 कोशिकाओं की तुलना में काफी अधिक क्लोनिंग दर पर लिफ-3i hPSC पैदा करना, और इस प्रकार, प्रारंभिक कम चढ़ाना घनत्व प्रत्येक संस्कृति एक समान timepoint पर संगम तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए समायोजन की आवश्यकता होती है ।

जांचकर्ताओं नियमित रूप से कई परख का उपयोग करने के लिए लिफ की कार्यक्षमता में सुधार-3i-वापस hPSC कि न केवल vivo teratoma परख में भी शामिल है लेकिन इन विट्रो में अंतर परख तंत्रिकाओं को निर्देशित करना चाहिए, निश्चित अन्तः और hematovascular वंश3 एकाधिक परख (जैसे, 2d APEL3,16 और 3 डी embryoid शरीर17,18 प्रणालियों) का उपयोग कर । करने के लिए परख पर निर्भर reproducibility नियंत्रण, दो अलग भेदभाव तरीके कम से isogenic के प्रत्येक के लिए दोहराने में किया जाना चाहिए/लिफ-3i hPSC संस्कृतियों (जैसे, चित्रा 4, APEL, embryoid शरीर विभेद चलत) । प्रयोगात्मक डिजाइन एक मजबूत संख्या (उदा, > 3 – 5) लिफ-3i isogenic जोड़े hPSC लाइनों के कई, स्वतंत्र दाता आनुवंशिक पृष्ठभूमि (चित्रा 4) से शामिल होना चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1: पारंपरिक, वंश के एक stepwise संक्रमण-लिफ-3i विधि के साथ भोली की तरह शर्तों के लिए hPSC संस्कृतियों प्रधानमंत्री । (A) stepwise लिफ-3i reversion के लिए प्रोटोकॉल का स्कीमा । (शीर्ष योजनाबद्ध) प्रधानमंत्री के संक्रमण के लिए एक सामांय विधि, पारंपरिक hPSC लिफ-3i संस्कृतियों के लिए । (नीचे योजनाबद्ध) लिफ के लिए दो संक्षेप रणनीतियों-पारंपरिक (प्रधान) के 3i भोली reversion hPSC या तो फीडर (यानी पर कल्चरित, primeed/MEF to लिफ-3i/MEF), या फीडर-फ्री की शर्तें (अर्थात, E8/लिफ को 3i-MEF/ (ख) मानव पीएससी morphologies. दिखाया गया है प्रतिनिधि photomicrographs hPSC के दौरान लिफ-3i एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव episomal iPSC लाइन (६.२) का उपयोग कर पुनः संस्करण । दिखाया संक्रमण प्रारंभिक पारंपरिक फ्लैट monolayer कालोनियों के बीच मनाया जाता है, और बाद में गुंबद के आकार clonogenic कालोनियों कि मध्यवर्ती लिफ-5i और स्थिर लिफ-3i संस्कृति की स्थिति में पारित होने के बाद पैदा होते हैं । स्केल बार्स = २०० µm. (C) pluripotency सतह मार्करों के प्रतिनिधि प्रवाह cytometric िरा । दिखाया तर्-1-81 और SSEA-4 पारंपरिक hPSC लाइन ६.२ में सतह के भाव (p40) E8 में विस्तार, लिफ में प्रारंभिक मार्ग-5i/MEF, और निंनलिखित 1 से 9 मार्ग (P1-P9) लिफ-3i स्थितियों में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : एन के Cryopreservation-hPSC और MEF प्री-चढ़ाना द्वारा नमूना तैयारी । (क) लिफ-3i/MEF संस्कृतियों के एक फ्रीज/गल चक्र का उदाहरण । पारंपरिक गर्भनाल रक्त व्युत्पंन, गैर एकीकृत, transgene मुक्त मानव iPSC लाइन E5C3 प्राप्त किया गया था और hESC माध्यम में MEF भक्षण पर विस्तार 4ng/एमएल bFGF के साथ 18 मार्ग के लिए पूरक । पारंपरिक, वंश-प्रधान E5C3 लिफ में रूपांतरित-5i (बाएं) और 3 मार्ग (केंद्र) के लिए लिफ-3i माध्यम में संक्रमण किया गया । केंद्र पैनल में दर्शाए गए E5C3 लिफ-3i कोशिकाओं का उपयोग cryopreserved DMSO आधारित cryoprotectant मीडियम (Table 2; 1 x 106 कोशिकाएं प्रति शीशी) और लिक्विड नाइट्रोजन में संग्रहित) से किया जाता है । एक शीशी एक महीने बाद गल गया था और E5C3 कोशिकाओं एक फीडर में हस्तांतरित किया गया-एक 6 अच्छी तरह से प्लेट (सही) की अच्छी तरह से लेपित । सेल वसूली केवल एक दिन के बाद गल के लिए 5 µ एम वाई-२७६३२ के साथ लिफ-3i माध्यम का सप्लीमेंट द्वारा बढ़ाया जा सकता है । स्केल बार्स = २०० µm. (ख) MEF के उंमूलन (और भी अनुयाई तर्-नकारात्मक विभेदित कोशिकाओं) में लिफ-3i/MEF hPSC संस्कृतियों द्वारा पूर्व चढ़ाना विधि । दिखाया गया है प्रवाह cytometric जोडकर पहले और बाद में पीई के चढ़ाना-संयुग्मित विरोधी-तर्-1-81 और तर्-1-60 एंटीबॉडी, APC-संयुग्मित SSEA-4 एंटीबॉडी और SSEA-1/CD15 एंटीबॉडी की कमी के प्रदर्शन की तर्-1 प्रतिजन नकारात्मक और MEF कोशिकाओं का उपयोग एक घंटे पूर्व विधि चढ़ाना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : लिफ-3i/MEF N-hPSC संस्कृतियों में pluripotency का लक्षण वर्णन । (क) सतह और परमाणु pluripotency मार्कर. उसी में pluripotency कारक NANOG की अभिव्यक्ति (isogenic) तर्-1-81+SSEA4+ परम्परागत, प्राइमेड कॉर्ड रक्त-व्युत्पंन hiPSC लाइन E5C3 (p39) में विस्तारित या तो प्रधान (E8), या भोली लिफ-3i (+ p8 में लिफ-3i/MEF) की स्थिति । चैंबर स्लाइड पर प्रतिनिधि hPSC संस्कृतियों के Immunofluorescent दाग से पता चला की वर्दी, परमाणु अभिव्यक्ति की कोर pluripotency फैक्टर NANOG में SSEA-4+तर्-1-81+ hPSC में कल्चर्ड प्राइमेड, परम्परागत (E8 मीडियम) या लिफ-3i/MEF शर्तों. स्केल बार = १०० µm. (B) पश्चिमी दाग विश्लेषण । STAT3 (बाएँ), ERK (केंद्र), और नियंत्रण बीटा-ACTIN प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक प्रतिनिधि hPSC लाइन (hESC लाइन H9) में परम्परागत (E8 माध्यम) या लिफ-3i/MEF conditions (3i). (ग) भोली pluripotency की अभिव्यक्ति-सम्बद्ध प्रतिलेखन कारक. दिखाया स्टेला/DPPA3, NR5A2, और TFCP2L1 द्वारा इम्यूनोफ्लोरेसेंस में एक प्रतिनिधि लिफ-3i/MEF संस्कृति (गर्भनाल रक्त-hiPSC पर E5C3 लाइन p33 व्युत्पंन (hESC/MEF) + p8 (लिफ-3i/MEF) । स्केल बार = १०० µm. (घ) परम्परागत और लिफ-3i की Teratoma परख-वापस hPSC. एक isogenic प्रतिनिधि hiPSC रेखा में कार्यात्मक pluripotency के सत्यापन (गर्भनाल रक्त व्युत्पंन E32C6) या तो E8 (p9) या लिफ-3i/MEF (+ p12) teratoma परख द्वारा में संस्कृति । 10 x 106 isogenic की कोशिकाओं समानांतर-पारंपरिक संस्कृति, प्राइमेड बनाम लिफ-3i-वापस hPSC immunodeficient एनएसजी चूहों के अंगों में चमड़े के नीचे इंजेक्शन थे । Hematoxylin और teratoma microsections के eosin दाग अच्छी तरह से संरचित बाह्य त्वक स्तर के साथ सभी तीन रोगाणु परतों में मजबूत भेदभाव का पता चला (तंत्रिका rosette: NR, रेटिना pigmented epitheliam: RPE), मध्य त्वक स्तर (chondroblasts: Ch), और अन्तः (ग्रंथियों ऊतक: सैनिक) वंश. स्केल बार्स = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 4
चित्रा 4: isogenic प्रधान और भोली राज्यों के बीच कार्यात्मक pluripotency की तुलना । (एक) isogenic पारंपरिक बनाम लिफ में विशिष्ट pluripotent राज्यों से कार्यात्मक pluripotency का आकलन करने के लिए रणनीति की योजनाबद्ध-3i स्वतंत्र भेदभाव प्रोटोकॉल में hPSC । दिखाया गया है दो hemato-संवहनी जनक भेदभाव प्रणालियों (APEL monolayer और 3 डी embryoid शरीर (EB) प्रणालियों) कि पहले पारंपरिक बनाम लिफ के भेदभाव शक्ति का आकलन करने के लिए कार्यरत थे-3i-वही (isogenic) hPSC लाइन में लौट समानांतर पोस्ट लिफ में सुसंस्कृत-3i एक ही मार्ग संख्या के साथ पुनः संस्करण । लिफ-3i-वापस hPSC लाइनों एक पुनः भड़काना कदम EB भेदभाव से पहले की आवश्यकता नहीं है और भिंनता प्रोटोकॉल के अधीन है सीधे । (ख) EB संवहनी जनक (वीपी) विभेद प्रणाली । इस अध्ययन के लिए कार्यरत EB 3 डी विभेदन प्रणाली पहले17,18बताई गई थी । दिखाया EB भेदभाव के 10 दिन में प्रतिनिधि परिणाम कर रहे है एक ही गर्भनाल रक्त (सीबी) की isogenic संस्कृतियों के लिए (बाएं पैनलों)-व्युत्पंन E5C3 hPSC लाइन9, या तो पारंपरिक hESC/MEF (primeed/MEF) में संस्कृति या लिफ-3i/MEF भोली शर्तों. इन EB कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण CD31+CD146+ वीपी आबादी के नाटकीय वृद्धि दिखाने के लिफ 3i लाइन के बाद विभेद करने से पहले संस्करण । हिस्टोग्राम CD31 का मतलब ± एसडी+CD146+ वीपी सेल इस EB प्रणाली में 10 दिन में बरामद किया स्वतंत्र hPSC लाइनों के तीन isogenic जोड़े का उपयोग (यानी, दो सीबी-hiPSC और एक वयस्क fibroblast-प्राप्त hiPSC, बिंदीदार लाइनों isogenic जोड़े कनेक्ट) । परिणाम कई hPSC लाइनों के आनुवंशिक पृष्ठभूमि में EB प्रणाली में वीपी भेदभाव क्षमता के महत्वपूर्ण सुधार का प्रदर्शन । (ग) APEL monolayer संवहनी जनक विभेद प्रणाली । परम्परागत (prime E8) और लिफ-3i-वापिस hPSC को सीधे ही संस्कृति की स्थिति, विकास कारकों, साइटोकिंस और stepwise APEL endothelial भेदभाव प्रोटोकॉल 3 के छोटे अणुओं का उपयोग कर विभेदित किया जा सकता है , 16. दिखाया स्वतंत्र APEL भेदभाव E5C3 गर्भनाल रक्त का उपयोग कर प्रयोग कर रहे है hiPSC लाइन व्युत्पंन, और CD31 के प्रतिशत+CD146+ संवहनी जनक आबादी APEL भेदभाव के 7 दिन में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

लिफ-3i प्रणाली मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं को क्लासिक murine 2i भोली पुनः संस्करण कॉकटेल1 का एक संशोधित संस्करण लागू होता है । hPSC के स्व-नवीकरण (जो अकेले 2i में विस्तार नहीं कर सकते हैं) tankyrase अवरोधक XAV939 के साथ इस कॉकटेल का सप्लीमेंट द्वारा लिफ-2i में स्थिर है । लिफ-3i संस्कृति एक pluripotent राज्य के लिए पारंपरिक hPSC के थोक और कुशल reversion की अनुमति देता है मानव प्रत्यारोपण epiblast3। हालांकि hPSC में XAV939 की कार्रवाई के तंत्र की संभावना जटिल है और 2i के साथ synergistic, वे संभावना एक ंयूनतम पर शामिल हैं, एक महत्वपूर्ण स्थिरीकरण और hPSC के माध्यम से स्व-नवीकरण के विस्तार संकेतन रास्ते3

पारंपरिक hPSC संस्कृतियों आम तौर पर उच्च चर वंश के साथ pluripotent राज्यों की एक स्पेक्ट्रम को अपनाने प्रधानमंत्री जीन अभिव्यक्ति और बाद आरोपण epiblast epigenetic निशान है कि असंगत या कम कार्यात्मक pluripotency 2 में परिणाम हो सकता है . पारंपरिक hPSC संस्कृतियों के इस अंतर्निहित वंश भड़काने भी कुछ hPSC2लाइनों के सफल लिफ-3i पुनः संस्करण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । हालांकि, प्रारंभिक लिफ के शामिल किए जाने-5i अनुकूलन कदम (तालिका 1) लिफ-3i विधि में सार्वभौमिक लिफ लाइनों की एक भीड़ के बीच एक प्रकार की क्षमता को विस्तृत करता है-3i पुनः संस्करण और पारंपरिक hPSC लाइनों के थोक भोले reversion को बढ़ावा एक तरीके से यह कठिन उठा और दुर्लभ भोली-वापस कालोनियों, या दिनचर्या विरोधी अपोप्तोटिक अणुओं के उपयोग के लिए उनकी व्यवहार्यता को स्थिर करने की आवश्यकता के उपक्लोनिंग को दरकिनार ।

लिफ-5i/लिफ-3i भोली पुनः संस्करण विधि reproducible और hESC लाइनों की एक व्यापक विविधता में है । इसके लिए बेसिक सेल कल्चर स्किल के साथ न्यूनतम प्रशिक्षण की आवश्यकता है । Zimmerlin एट अल. सफलतापूर्वक वापस करने के लिए इस अनुक्रमिक रणनीति कार्यरत > 30 स्वतंत्र hESC और transgene- 3दाताओं की एक व्यापक सरणी से मुक्त hiPSC लाइनों । लिफ में एक ही मार्ग-5i (चित्रा 1) सबसे hPSC लाइनों के लिए पर्याप्त थोक hPSC संस्कृतियों में कुशल भोली reversion से गुजरना है, और आगे उनके बाद स्थिर रखरखाव और लिफ में विस्तार-3i अकेले अग्रिम ।

इसके अलावा, लिफ-3i/MEF प्रणाली के वंश के बीच सभी चरणों में मजबूत थोक क्लोनल विस्तार क्षमता का समर्थन करता है प्रधानमंत्री परम्परागत hPSC संस्कृति सभी तरह hPSC पुनः संस्करण की तरह पूरा करने के लिए (यानी, अनुकूलन, संक्रमण और 7 के लिए विस्तार-लिफ में 10 मार्ग-3i/MEF अकेले) । हालांकि इस संस्कृति प्रणाली के वर्तमान निर्माण फीडर समर्थन की आवश्यकता है, एक सरल और सस्ती विधि लिफ-3i संस्कृतियों के विश्लेषण के लिए पूर्व चढ़ाना तकनीक द्वारा भक्षण को चूस (2 चित्रा) प्रस्तुत की है ।

कई अंय संस्कृति प्रणालियों को भी ऐसी ही भोली-pluripotent राज्यों2की तरह पारंपरिक hPSC को बढ़ावा देने की सूचना दी गई है । हालांकि इन hPSC संस्कृति प्रणालियों भी शास्त्रीय माउस भोली 2i शर्तों के उपयोग पर भरोसा किया है, ज्यादातर मामलों में इन एकल सेल passaging तरीकों को भी एक स्वाभाविक अस्थिर स्थिर करने के लिए अतिरिक्त रासायनिक मॉडुलन की आवश्यकता/ metastable मानव भोली अवस्था । महत्वपूर्ण बात, इन अंय तरीकों के सबसे बिगड़ा कार्यात्मक pluripotency निंनलिखित विभेद और/या प्राप्त असामांय epigenomic प्रिंट या karyotypes2का प्रदर्शन किया । हालांकि पारंपरिक प्रधान hPSC संस्कृतियों के भीतर असामांय karyotypes के उद्भव पहले से ही अच्छी तरह से19प्रलेखित है, लंबे समय तक, एंजाइमी एकल सेल passaging तरीके है कि नियमित रूप से सबसे भोली पुनः संस्करण तरीकों में कार्यरत हैं । यह भी असामान्य गुणसूत्र विन्यास की पीढ़ी शक्ति प्रदान करने के लिए दिखाया गया है20,21; अधिक संवेदनशील तकनीक (जैसे, कॉपी संख्या रूपांतरों, एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता) अतिरिक्त परिवर्तन प्रकट हो सकता है22,23.

इसके विपरीत, लिफ की एक विस्तृत प्रदर्शन-3i-hPSC लाइनें वापस आ गया कम मध्यम मार्ग पर सामांय karyotypes अधिकारी (जैसे, p5-p15) की पुष्टि की थी, और भी उच्च मार्ग संख्या (जैसे, > p30) निंनलिखित लिफ-3i संस्कृति3पर । इसके अतिरिक्त, epigenomic लिफ में प्रिंट-3i-वापस hPSC पाया गया reproducibly सामांय और बरकरार पर 5-10 मार्ग पोस्ट लिफ-3i पुनः संस्करण2। संवेदनशील एलील-विशिष्ट वाणिज्यिक मिथाइल सरणी मंच का उपयोग कर, यह पहले से प्रदर्शित किया गया था कि लिफ की एक विस्तृत प्रदर्शनों की loci पर CpG मिथाइल के निशान-3i-hPSC लाइनों (निंनलिखित 4-लिफ में 7 मार्ग-3i) पाया गया था निहायत 1संरचना में सामांय । के बाद से असामांय जीनोमिक प्रिंट और karyotypes अंततः hPSC की कार्यात्मक क्षमता ख़राब कर सकते हैं, आवश्यक दिशा निर्देशों इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित है कि शोधकर्ताओं को प्रोत्साहित करने से पहले और भोली reversion के बाद hPSC संस्कृतियों को मांय कर रहे थे, इस का उपयोग विधि के रूप में अच्छी तरह से दूसरों ।

लिफ-3i विधि hESC और गैर-ट्रांसजेनिक hiPSC लाइनों (चित्रा 3) की एक बड़ी प्रदर्शन की प्रक्रिया में रोगाणु परतों के पार कार्यात्मक pluripotency में सुधार हुआ । अंय भोली पुनः संस्करण प्रोटोकॉल के विपरीत, लिफ-3i विधि एन के बाद विभेद के लिए एक फिर से भड़काने कदम-hPSC की आवश्यकता नहीं है (यानी, परिवर्तित एन-hPSC वापस पारंपरिक प्रधान स्थितियों के लिए निर्देशित में उनके उपयोग से पहले विभेद परख) । लिफ-3i-वापस आ एन hPSC दोनों hPSC परख (चित्रा 3डी) में अपने isogenic पारंपरिक teratoma समकक्षों से काफी अधिक कुशल विभेदक क्षमता प्रदर्शन, और सभी की वंश के भेदभाव प्रोटोकॉल का निर्देशन तीन रोगाणु परतों2। परख के कारण निर्भर है और पारंपरिक hPSC के कार्यात्मक परीक्षण में परस्पर रेखा भिंनता, वंश-विशिष्ट भेदभाव स्वतंत्र निर्देशित विभेद प्रोटोकॉल और कई आनुवंशिक पृष्ठभूमि से व्युत्पंन hPSC का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाना चाहिए । सावधान प्रयोगात्मक डिजाइन, hPSC लाइनों की एक व्यापक सरणी का उपयोग करने के लिए काफी अपने multilineage भेदभाव क्षमता में सुधार की उंमीद कर सकते है अपने isogenic पारंपरिक समकक्षों की तुलना में 4 निंनलिखित-लिफ-3i स्थितियों में 10 मार्ग ।

संक्षेप में, इस विधि तेजी से और क्लोनिंग मानव पीएससी की संख्या का विस्तार, उनके बहाव विभेदक दक्षता में सुधार, वंश-प्रतिबद्ध जनक कोशिका संख्या भेदभाव के बाद बढ़ जाती है, और कम हो जाती है रेखा परिवर्तनशीलता पारंपरिक के अलावा, वंश-hPSC लाइनें प्रधानमंत्री । इन N-सुधार कार्यशीलता के साथ hPSC आगे अपनी क्षमता के लिए एक व्यापक प्रभाव के लिए एक विकासशील भ्रूण के लिए कार्यात्मक ऊतकों योगदान हो सकता है । उदाहरण के लिए, स्थिर एन hESC पशु chimeras विकसित करने में प्रत्यारोपण मानव अंगों और वयस्क स्टेम सेल के विकास के लिए नियोजित किया जा सकता है, या मानव जीन-लक्षित रोग के पशु मॉडल पैदा करने के लिए । इस tankyrase अवरोध करनेवाला के आगे अनुकूलन-निर्धारित फीडर में लिफ-3i विधि का उपयोग-मुक्त जीएमपी-अनुरूप संस्कृति की स्थिति के लिए कार्यात्मक और engraftable सेल प्रकार की एक व्यापक सरणी के कुशल नैदानिक उपयोगी पीढ़ी की सुविधा होगी चिकित्सीय उपयोग ।

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Disclosures

जीवन प्रौद्योगिकियों और जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय (झळ) के बीच एक लाइसेंस समझौते के तहत, डॉ Zambidis स्टेम सेल के लाइसेंस के लिए विश्वविद्यालय द्वारा प्राप्त रॉयल्टी का एक हिस्सा के लिए हकदार है । इस व्यवस्था की शर्तें अपनी हितों की नीतियों के विरोध के अनुरूप ही झळ द्वारा प्रबंधित की जाती हैं. यह लेखकों के पालन में परिवर्तन नहीं करता है डेटा और सामग्री साझा करने पर जर्नल नीतियां ।

Acknowledgments

यह काम NIH से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था/नेि (R01EY023962), NIH/niched (R01HD082098), रपब स्टीन अभिनव पुरस्कार, मैरीलैंड स्टेम सेल अनुसंधान कोष (२०१८-MSCRFV-४०४८, २०१४-MSCRFE-०७४२), नोवो Nordisk विज्ञान फोरम पुरस्कार, और Moseley फाउंडेशन ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated BD Biosciences 561716 use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibody Sigma Aldrich HPA029708 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibody Abcam ab6276 use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated  BD Biosciences 550315 use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugated eBioscience 17-0319-42 use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kit Miltenyi Biotec 130-091-935
anti-NANOG antibody Abcam ab109250 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibody Sigma Aldrich HPA005455 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody Cell Signaling 4695 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody Cell Signaling 4370 use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody Cell Signaling 9145 use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated Agilent E0432 use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated  R&D System FAB1435A use 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated R&D System NLLC1435G use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibody Cell Signaling 9139 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibody Millipore MAB4388 use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated  R&D System NLLC4770R use at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0068 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0069 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560193 use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560161 use 10µL per assay (FACS)
APEL2-Li StemCell Technologies 5271
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3311
CellAdhere dilution buffer StemCell Technologies 7183 dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouse Charles river 023
CHIR99021 R&D System L5283 reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope system Zeiss LSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC line Thermo Fisher Scientific A18945 also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates Corning 3506
Countess  cell counting chamber slide Thermo Fisher Scientific C10228
Countess automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)  Thermo Fisher Scientific 11995-065
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific 11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D2650
DR4 mouse The Jackson Laboratory 3208
Essential 8 (E8) medium StemCell Technologies 5940
Fetal bovin serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30071.03
Forskolin Stemgent 04-0025 reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G1890-100G resuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
mTeSR1 medium StemCell Technologies 85850
Nalgene cryogenic vials Thermo Fisher Scientific 5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System Fisher Scientific 154534
Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS USB Corporation  19943
PD0325901 Sigma Aldrich PZ0162 reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
Purmorphamine Stemgent 04-0009 reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin A Peprotech AF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 Peprotech 120-05ET resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF) Peprotech 100-18B resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human LIF Peprotech 300-05 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
SB431542  Stemgent 04-0010-05 reconstitute at 100mM in DMSO
Stemolecule Y27632 in Solution Stemgent 04-0012-02 ROCK inhibitor in solution (10mM)
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific A11105-01
Streptavidin-Cy3 conjugate Sigma Aldrich S6402 use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 Peprotech 100-21 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
Vitronectin XF matrix StemCell Technologies 7180 dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer
XAV939 Sigma Aldrich X3004 reconstitute at 100mM in DMSO
β-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023 light sensitive

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References

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