Geleneksel insan Pluripotent kök hücreler kimyasal Reversion için geliştirilmiş Multilineage farklılaşma potansiyeli ile saf gibi devlet

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Biz, toplu, verimli ve hızlı kimyasal reversion lineage astarlanmalıdır geleneksel insan pluripotent kök hücre (hPSC) bir epigenomically-kararlı saf Preimplantasyon epiblast benzeri pluripotent devlet için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem düşük lineage astarlanmalıdır gen ekspresyonu ve yönettiği multilineage ayrımında belirgin iyileşme geleneksel hPSC satırları arasında geniş bir repertuar sonuçlanır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Naïve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency. J. Vis. Exp. (136), e57921, doi:10.3791/57921 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Saf insan pluripotent kök hücreleri (N-hPSC) ile gelişmiş bir işlevsellik rejeneratif tıp alanında geniş bir etkisi olabilir. Bu iletişim kuralı, verimli bir şekilde lineage astarlanmalıdır, geleneksel insan pluripotent kök hücreler (hPSC) saf benzeri pluripotency için besleyici-Alerjik ya da besleyici bağımlı koşulları ile gelişmiş işlevsellik tutulan dönmek için hedeftir. Klasik lösemi inhibitör faktörü (LIF), GSK3β, bu kimyasal saf reversion yöntemi kullanır ve yalnızca bir tankyrase inhibitörü XAV939 ile desteklenmiş MEK/ERK inhibisyon kokteyl (LIF-2i), (LIF-3i). LIF-3i benimseyerek biyokimyasal, transkripsiyon bir istikrarlı pluripotent devlet ve insan pre-implantasyon epiblast epigenetik özellikleri geleneksel hPSC döner. Bu LIF-3i yöntemi en az hücre kültür manipülasyon gerektirir ve son derece geniş insan embriyonik kök hücre (hESC) ve transgene içermeyen insan indüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC) hatları repertuarında tekrarlanabilir. LIF-3i yöntemi farklılaşma önce yeniden astar bir adım gerekli değildir; N-hPSC doğrudan son derece yüksek verimlilik ile Ayrıştırılan ve karyotip korumak ve epigenomic stabiliteleri (baskılı loci dahil olmak üzere). Yöntem evrenselliğini artırmak için geleneksel hPSC ilk kültürlü protein kinaz (forskolin) ve (LIF-5I) sinyal sonic kirpi (SUS) (purmorphamine) kazara iki ek küçük moleküller ile desteklenmiş LIF-3i kokteyl içinde. Bu kısa LIF-5i adaptasyon adım önemli ölçüde geleneksel hPSC ilk klonal genişlemesi geliştirir ve onları daha sonra saf-döndürülmesi ile LIF-böylece malzeme çekme/subcloning nadir N-hPSC gerek obviating 3i toplu miktarlarda yalnız olmak izin verir koloniler daha sonra. LIF 5i stabilize hPSCs daha sonra anti-apoptotik molekülleri gerek olmadan tek başına LIF-3i içinde korunur. En önemlisi, LIF-3i reversion belirgin geleneksel hPSC geniş bir repertuar fonksiyonel pluripotency kendi soy astarlanmalıdır gen ekspresyonu azalan ve yönlendirilmiş farklılaşma Interline değişkenliği sık silme geliştirir bağımsız hPSC satırları arasında görülmektedir. Temsilcisi karakterizasyonu LIF 3i döndürülmesi N-hPSC, isogenic hPSC fonksiyonel karşılaştırmalar için sağlanan ve deneysel stratejiler lineage astarlanmalıdır vsvardır. saf gibi Birleşik özetlenmiştir.

Introduction

2i (MEK/ERK ve GSK3β inhibitörü) kültür sistemi ilk türdeş olmayan serum tabanlı fare embriyonik kök hücreler (mESC) kültürleri pluripotency fare Preimplantasyon epiblast1benzer bir Tekdüzen yer durumunu iyileştirmek için geliştirilmiştir. Ancak, 2i insan pluripotent kök hücre (hPSC) hatları2istikrarlı bakım desteklemez. Çeşitli karmaşık küçük molekül, büyüme faktörü-takıma ve transgenik yaklaşımlar son zamanlarda putatively yakalama bildirilmiştir benzer insan saf benzeri pluripotent moleküler Devletler2. Ancak, çoğu da bu yöntemler ile oluşturulan "saf gibi" Birleşik karyotip istikrarsızlık, epigenomic defektleri (Örneğin, genel kaybı ebeveyn genomik basma) sergilenen veya farklılaşma potansiyeli Engelli.

İçinde karşıtlık, GSK3β, ERK ve tankyrase sinyal Üçlü kimyasal inhibisyonu kokteyl ve lösemi inhibitör faktörü (LIF-3i) geleneksel hPSC hatları3geniş bir repertuar istikrarlı saf benzeri reversion için yeterli. LIF 3i döndürülmesi saf hPSC (N-hPSC) normal karyotypes muhafaza ve onların ifadeleri saf özel insan Preimplantasyon epiblast genlerin arttı (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i de haiz reversion hPSC moleküler ve biyokimyasal özellikleri artan fosforile STAT3 sinyal, dahil mESC gibi saf pluripotency için benzersiz bir dizi ile azalmıştır ERK fosforilasyon, küresel 5-metilsitozin CpG hypomethylation, genom çapında KSY demethylation, embriyonik kök hücre (ESC)-belirli bir gen rehberleri ve baskın distal OCT4 artırıcı kullanımı. Ayrıca, ile karşılaştırıldığında diğer saf aberrantly hypomethylated sonuçlandı reversion yöntemleri genomik loci baskılı, LIF 3i döndürülmesi N-hPSC edildi sistematik baskılı CpG desen veya kaybı DNA metiltransferaz ifade yoksun (Örneğin, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.

Geleneksel insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSC) büyümek besleyiciler ya da E8 besleyici-Alerjik koşulları üzerinde geniş bir dizi doğrudan LIF-3i kültürünün hızlı ve dökme reversion için saf epiblast gibi devlet elde. Ancak, doğrudan LIF-3i saf reversion bazı kararsız geleneksel hPSC hatları genetik olarak farklı donör kökenden gelen doğan içsel genomik ve soy astarlanmalıdır variabilities nedeniyle verimsiz olabilir.

Böylece, belgili tanımlık yarar LIF-3i yönteminin genişletmek için kademeli optimizasyonu geliştirilmiş ve burada, sunulan bu evrensel saf reversion neredeyse herhangi bir geleneksel hESC veya hiPSC transgene içermeyen satır Fiderler, fazla yükleyiciler kültürlü sağlar. Protein kinaz (forskolin) ve sonic kirpi (SUS) (kazara iki ek küçük moleküller (LIF-5I) LIF-3i kokteylle takviyeleri geleneksel hPSC geçici ilk kültür adımda bu universalized saf reversion yöntemi kullanır purmorphamine) işaret. Geleneksel hPSC LIF-5i bir ilk geçiş onları sonraki kararlı LIF-3i reversion toplu miktarlarda uyum sağlar. İlk LIF-5i adaptasyon geleneksel hPSC E8 veya besleyiciler (önce onların sonraki kararlı, sürekli pasajda LIF-3i yalnız) yetişen ilk tek hücre klonal çoğalması önemli ölçüde artırmaktadır. Geleneksel hPSC satırları adapte ilk LIF-5i bir pasajda için sonraki toplu klonal saf yeniden dönmek hücre LIF-3i koşullarında hangi malzeme çekme ve nadir istikrarlı kolonileri ya da rutin kullanımı subcloning gereğini namussuz passaging tahammül Anti-apoptotik molekülleri veya Rho ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörleri.

LIF-3i yöntemi başarıyla stabil genişletmek ve geniş bir repertuar korumak için istihdam edilmiştir > 30 bağımsız, genetik olarak farklı geleneksel hPSC hatlarında > 10-30 pasajlar ya enzimatik olmayan veya enzimatik ayrılma yöntemleri kullanarak ve İndüksiyon kromozom kanıtı olmadan veya epigenomic anormallikleri, baskılı gen loci, anormallikler de dahil olmak üzere. Ayrıca, sıralı LIF-5i/LIF-3i kültür kendi soy astarlanmalıdır gen ekspresyonu azaltarak geleneksel hPSC satırları geniş bir repertuar fonksiyonel pluripotency artıran şu ana kadar bildirilmiştir tek saf reversion yöntemidir ve büyük ölçüde onların multipotent farklılaşma potansiyeli geliştirmek. LIF-3i saf reversion yöntemi siler doğasında lineage astarlanmalıdır, geleneksel hPSC satırları farklılaşma değişkenliği Interline ve hücresel tedavi ve rejeneratif tıp uygulamasında a büyük yarar olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan yordamları hayvan bakımı yönergeleri ve Johns Hopkins okul, Tıp Enstitüsü tarafından hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi (IACUC) onaylı protokoller doğrultusunda gerçekleştirilmiştir.

1. hazırlık, fare embriyonik fibroblastlar (MEF) besleyici bağımlı Conventional (hESC orta/MEF) veya saf döndürülmesi (LIF-3i orta/MEF) hPSC kültür

  1. MEF besleyiciler içi düşük geçiş malzemeleri CF1 veya CF1 x DR4 hibrid E13.5 fare embriyo yayımlanmış protokolleri4takip hazırlamak veya satın alabilirsiniz.
    1. Cryopreserve düşük geçiş (p1-p2) MEF kültürler (uzun süreli depolama için) öncesi veya sonrası (6 ay için) ışınlama ve mağaza sıvı azot daha önce4açıklandığı gibi.
    2. Işınlatayım (5000 rad) bir γ - veya X-x-ray-irradiator kullanarak genişletilmiş MEF p5 altında toplu ve aliquots 1.5 x 10 şişe başına6 hücre kısa süreli depolama (6 aydan daha az) bir ultra düşük sıcaklık dondurucu-80 ° C'de hazırlamak.
    3. Plaka 1.2 x 10 arası6 (taze sigara cryopreserved radyasyona maruz) ve 1.5 x 106 (radyasyona maruz cryopreserved) aşağıda açıklandığı gibi besleyici kültürler, hazırlanması için bir 6-şey gelatinized plaka başına MEF.
  2. 6-şey steril doku kültürü tedavi plakaları jelatin kaplı bir biyolojik güvenlik kabin her kuyuya 1,5 mL steril % 0,1 jelatin çözeltisi ekleyerek hazırlayın.
  3. Jelatin kaplı plakalar için en az 1 h 37 ° C'de kuluçkaya veya bir laboratuvar CO2 kuluçka makinesine gece.
  4. Ertesi gün, düşük geçiş (Örneğin, P2 P4) DMSO cryopreserved ve ışınlanmış çözülme aşağıda belirtilen adımları göre (5000 rad) MEF.
    Not: Sigara ışınlanmış MEF gereken de çözdürülen, genişletilmiş ve hemen kullanım öncesinde ışınlanmış.
  5. Cryopreserved bir MEF aliquot bir 37 ° C su banyosunda yerleştirin. Çözdürme, üzerine tüp etanol ile sterilize ve hemen bir Biyogüvenlik kabini (Örneğin transferi 1 mL DMSO-MEF aliquot 9 mL steril 15 mL MEF ortamda içine içinde MEF Orta (Tablo 1) ile en az 10 kat DMSO cryoprotectant seyreltik Konik).
  6. Santrifüj kapasitesi sulandırılmış MEF hücreleri 200 x g steril 15 mL konik tüpler 5 min için de.
  7. Bir Biyogüvenlik kabini, Aspire edin ve boş hücre süpernatant atmak ve hücre pelet 1-2 mL taze MEF ortamda resuspend.
  8. Yavaşça jelatin çözüm atın ve yukarıda belirtildiği şekilde yeniden MEF orta gelatinized 6-şey plaka, her şey için askıya MEF 2 mL ekleyin. Count MEF hücreleri ve plaka 1.2 x 106 (taze sigara cryopreserved radyasyona maruz) veya 1.5 x 106 (radyasyona maruz cryopreserved) bir 6-şey gelatinized plaka başına MEF.
    Not: CO2 kuluçka Biyogüvenlik kabini aktarılır tüm hücre kültür plakaları yavaşça etanol püskürtülür kağıt ile sonunu olabilir ancak doğrudan etanol yayma Wells önlemek için % 70 etanol solüsyonu ile teniminhala değil.
  9. MEF plakaları geceleme bir laboratuvar CO2 kuluçka (%5 CO2, nemli atmosfer) 37 ° C'de eki, kullanmak için önceden izin vermek için kuluçkaya.

2. toplu kısa LIF-5i adaptasyon adım ile sonraki saf Reversion için geleneksel hPSC kültürlerin istikrar

  1. Başlangıç LIF-5i/LIF-3i reversion önce normal bir karyotip G bantlama tarafından sahip olmak için tüm geleneksel hPSC satırları doğrulamak.
    Not: LIF-3i reversion yüksek geçit geleneksel hPSC satır (Örn., P > 40-50) beri bu kültürler olabilir zaten liman astarlanmalıdır, dengeli, verimli ve toplu LIF-3i reversion, olumsuz etkileyebilir genomik anomalileri, kaçınılmalıdır Convetional hPSC satırları.
  2. Korumak ve geleneksel hPSC kültürleri ile doğrulanmış normal karyotypes bir kültür MEF-esaslı sistem (Bölüm 1'de belirtildiği gibi) veya bir besleyici-Alerjik kültür sistemi (göre araştırmacı'nın tercihi) genişletin.
    Not: Her iki besleyici bağlı hPSC/MEF cocultures (4-10 ng/mL bFGF ile desteklenmişÖrneğin, hESC Orta (Tablo 1)) veya besleyici-free (Örn., E8 5 veya mTSER 6 medya (üretici yönergelerine göre vitronectin kaplamalı plakalar) yöntemleri LIF-5i/LIF-3i/MEF sistemi (Şekil 1) kullanarak toplu saf reversion ile uyumludur. Non-enzimatik yöntemler onları reversion için hazırlanıyor önce geleneksel hPSC passaging için tercih edilir. LIF-5i ve LIF-3i medya formülasyonları antibiyotik veya antifungal ajanları içermez. Biyogüvenlik kabini kısırlık ve bakım için standart operasyon kuralları titizlikle herhangi bir bakteri veya mantar kirlenmesini önlemek için dikkat edilmesi bekleniyor.
  3. MEF-dayalı Kültür sistem için MEF besleyiciler gelatinized 6-şey plaka Bölüm 1'de geleneksel hPSC LIF 5i adapte kültürleri passaging önce en az bir gün açıklandığı şekilde hazırlayın.
  4. Sonra geleneksel hPSC kültürler ~ %50 confluency (Yani, 3-5 gün sonra ilk kaplama) ulaştınız, LIF-5i Orta (2 mL kuyusu; başına standart hESC kültür orta yerine Tablo 1).
    Not: bir Biyogüvenlik kabini içinde aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
  5. Kültür ve 2 gün içinde LIF-5i CO2 kuluçka (%5 CO2, nemli atmosfer) için geleneksel hPSC/MEF korumak. Onların sonraki geçit ve LIF-3i istikrarlı reversion için onları adapte LIF-5i orta her gün değiştirin.
  6. Alternatif olarak, (Örneğin, E8 içinde) besleyici-Alerjik geleneksel kültürler, LIF-5i kültür hPSC sadece gece ertesi sabah passaging önce.
    Not: LIF-5i ve LIF-3i kültürler her ikisi de atmosferik (%21 O2) ya da fizyolojik (%5 O2) oksijen ile düzeyleri (% 5 CO2, nemli atmosfer) CO2 kuluçka muhafaza edilebilir.
  7. Passaging önce kültür plakaları bir Biyogüvenlik dolapta yer, LIF 5i adapte geleneksel hPSC kez PBS ile yıkama ve her şey için hücre ayrılma reaktif 1 mL ekleyin. CO2 kuluçka 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya ve yavaşça bir tek hücre süspansiyon geri Biyogüvenlik kabini içine bir pipet ile triturate.
    Not: Enzimatik olmayan ayrılma arabellekleri alternatif olarak passaging için tek hücreleri hazırlamak için kullanılabilir.
  8. HESC Orta (en azından logosuna 2 kat seyreltme) steril 15 mL konik tüpler hücre süspansiyon toplamak ve yavaşça hücreleri tek hücre süspansiyon elde etmek için pipetting tarafından triturate.
  9. 300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi, Aspire edin / süpernatant atma ve hücre Pelet Biyogüvenlik kabini LIF-5i ortamda 1-2 ml resuspend. Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak.
  10. Önceden kaplama MEF plaka PBS (6-şey plakaları bir kuyu başına 2 mL) ile iki kez yıkayın ve 1-2 x 106 hücrelerde (2 mL LIF-5i orta) 1 de PBS yıkanmış MEF plaka üzerine dağıtın.
  11. İlk kaplama yoğunlukları verimliliği replating-ebilmek var olmak son derece değişken saf yeniden dönmek, olmak üzere her bireysel hPSC satır için en iyi duruma getirme ve ayarlayın. Plaka (%5 CO2, nemli atmosfer) bir CO2 kuluçka makinesine koyun.
    Not: Anti-apoptotik reaktifler rutin kullanımı ile bu yöntem çoğu hPSC satırları için tavsiye edilmez. LIF-5i sistem zaten önemli geleneksel hPSC satırları ilk toplu klonal yeniden hassasiyette verimliliği artırır. Ancak, tek seferlik bir ROCK inhibitörü kullanımı (5-10 mikron Y-27632) daha fazla ilk LIF-5i klonal yeniden hassasiyette verimliliği bazı kararsız lineage astarlanmalıdır hPSC satırlar için ilk geçişi için eğilimi ile geleneksel hPSC kültürler artırabilir spontan farklılaşma.
  12. Besleyici-Alerjik kültürler (Örneğin, E8), doğrudan başlangıç LIF-5i adapte Disosiye geleneksel hPSC bir kuyu aktarırsanız bir MEF kaplama iyi (yani, 1:1 geçiş) ışınlanmış.
  13. Ertesi gün, yavaşça ekli olmayan hücrelerin tümünü kaldır, orta Aspire için plaka girdap (PBS yıkama isteğe bağlı) ve LIF-5i Orta 2 mL ile değiştirin. Bir Biyogüvenlik Kabin 3-5 gün için günlük veya hücreleri % 60-70 birleşmesi (Şekil 1) kadar bu adımı gerçekleştirin. Plaka (%5 CO2, nemli atmosfer) bir CO2 kuluçka makinesine koyun.

3. uzun vadeli bakım ve N-hPSC LIF-3i orta genişlemesi

  1. İlk LIF-5i adaptasyon sonraki kararlı LIF-3i kültürler her 3-4 günde bir Biyogüvenlik kabini veya kültürler % 60-70 birleşmesi (Şekil 1) duruma geldiğinde geçiş.
    Not: LIF-3i kültürler özenli bakım ve N-hPSC kültürler yüksek confluency/hücre yoğunluğu uzun süreli kültüründen ulaşmak izin gerektirir (Örn., > 4 gün) sonraki klonal yeniden hassasiyette verimliliği azaltır ve spontan teşvik farklılaşma.
  2. Bir Biyogüvenlik kabini, kültür orta atmak ve her yıkama kültürlerin yavaşça PBS 2 mL ekleyerek de LIF-5i/LIF-3i. PBS atın ve 1 mL hücre dekolmanı çözeltisi ekleyin. Bir CO2 kuluçka (%5 CO2, nemli atmosfer) 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya.
  3. Hücre süspansiyon toplamak, hESC orta ekleyin (ezelî inhibitörleri ya da büyüme faktörleri (Tablo 1); en az logosuna 2 kat seyreltme) tüm hPSC kurtarmak için ve yavaşça hücreleri tek hücre süspansiyon elde etmek için pipetting tarafından triturate. Süspansiyon steril 15 mL konik tüp aktarın.
  4. 5 min için 300 gr, santrifüj kapasitesi ve Aspire edin / süpernatant atma. Hücre Pelet LIF-3i ortamda yeniden askıya alma. Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak.
  5. Tabağa ~ 2 x de başına 105 hücre rutin LIF-3i kültürleri passaging için gelatinized 6-şey plaka radyasyonlu MEF. LIF 5i adapte ilk kültürler için başlangıçta daha yüksek bir yoğunluk (4 x 105 hücreleri/de) LIF-3i/MEF ilk geçiş önce plaka.
  6. Yeniden plaka ve LIF 5i adapte hPSC (yukarıdaki gibi önceki gün hazırlanmış) taze PBS yıkanmış radyasyonlu MEF besleyici levha LIF-3i orta üzerine dağıtın. LIF-3i orta her gün değiştirin.
  7. Geçit N-hPSC için en az 4-7 sürekli toplu N-hPSC fonksiyonel çalışmalar veya dondurma kullanmadan LIF-3i orta önce pasajlar. N-hPSC geçişleri birinde kaydedin geleneksel ya da LIF-3i medya.
    Not: LIF-3i reversion yüksek geçiş (Örneğin > p40) soy astarlanmalıdır, geleneksel hPSC satırları tavsiye edilmez. Geleneksel hPSC satırları en düşük olası geçit onlar are elde edilebilir vasıl dönmek için bir çaba yapılmalıdır. Ayrıca, böyle N-hPSC kültürler olabilir liman karyotypically anormal klonlar uzun süreli klonal hücre kültür seçimi nedeniyle bu yana 10 LIF-3i geçişleri daha büyük uğramıştır LIF 3i döndürülmesi hPSC kullanımı fonksiyonel çalışmalar için tavsiye edilmez. Taze LIF-5i/LIF-3i reversions düşük geçiş geleneksel hPSC satırlarının yürütülen fonksiyonel çalışmalar için Eğer N-hPSC ile stokları < LIF-3i 10 pasajlar kullanılabilir değildir.

4. dondurma ve çözme LIF 3i döndürülmesi N-hPSC

  1. Dönüştürülen N-hPSC LIF-3i, en az 5-7 pasajlar için fonksiyonel çalışmalar veya uzun vadeli dondurma kullanmak üzere önce yukarıda belirtildiği şekilde genişletin. Pasajlar geleneksel koşulları ve LIF-3i koşullarında cryopreserved her şişe üzerinde kaydedin.
    Not: Aşırı LIF 3i döndürülmesi N-fonksiyonel deneyleri kullanılmaz hPSC her geçiş, cryopreserved, ama daha düşük sonrası reversion pasajlar donma olabilir (e.g., < p3) yoksul veya son derece değişken sonrası tezcan kurtarma verimliliği neden olabilir.
  2. Bir Biyogüvenlik kabini, kültür orta Aspire edin, PBS (iyi başına 2 mL) hücrelerde yıkayın, PBS Aspire edin ve tek hücrelere hücre dekolmanı çözümü (iyi başına 1 mL) kullanarak hPSC kolonileri ayırmak. Bir CO2 kuluçka (%5 CO2, nemli atmosfer) 37 ° C'de 5 min için tabak koyun. Hücre dekolmanı çözümü ile LIF-3i Orta (2 kat) sulandırmak, hPSC steril 15 ml konik toplamak, hücreleri 200 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve LIF-3i Orta (iyi-eşdeğer başına 1-2 mL) hücre Pelet resuspend. Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saydırmak.
  3. N-hPSC LIF-3i Orta (200 x g 5 min için) santrifüj kapasitesi ve donma çözüm (Tablo 2), bir Biyogüvenlik dolapta hücrelerde en az 1 x 106 hücre/mL bir yoğunluk resuspend.
  4. Hücreleri uzun vadeli depolama kriyojenik tüpler içine aktarmak ve yavaş dondurma konteyner içine yerleştirin. Gecede-80 ° C Buzlukta dondurma örnekleri sağlar.
  5. Ertesi gün, cryovials uzun süreli depolama için sıvı azot dondurucu içine aktarın.
  6. Çözdürme için 37 ° C su banyosu ~ 2 dakika Sterilize flakon (Yani, etanol sprey) süreyle donmuş şişe yerleştirin, steril 15 ml konik hPSC aktarmak ve yavaş yavaş sulandırmak 5 mikron ile desteklenmiş hücreleri 10 kat içinde hESC Orta (Tablo 1) Rho-associated protein kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 steril biyolojik Emanet kukuIeta kabine içinde.
  7. 5 min için 200 x g , santrifüj. Bir Biyogüvenlik kabini, boş hücre süpernatant atın ve hücre Pelet LIF-3i Orta (1-2 mL) 5 mikron ROCK inhibitörü Y-27632 takıma resuspend.
    Not: Y-27632 dışlanması zavallı sonrası çözülme kurtarma verimliliği (Şekil 2) içinde sonuçlanır.
  8. LIF-3i/ROCK inhibitörü PBS yıkanmış MEF kaplama wells üzerine resuspended çözdürülen hücreleri aktarın. LIF-3i kültürler şişe başına 1 x 106 hücre yoğunluğu, cryopreserve. Her biri bu tüpleri besleyiciler bir iyi bir gelatinized 6-şey plaka üzerine çözülme.
  9. Ertesi gün, düzenli LIF-3i orta genişleme Rho kinaz inhibitörü olmadan başlatın.

5. Besleyici kaldırılması için N-hPSC örnekleri topluluğu

  1. Örnekleri LIF-3i/MEF (veya hESC/MEF geleneksel) kültürler hazırlamak için (yani, gen ekspresyonu için (Örneğin, kantitatif RT-PCR, microarrays) veya protein (Örneğin, Western blot) analizleri, LIF-3i kültürler kullanarak MEF besleyiciler üzerinden tüketmek Manyetik aktif hücre sıralama (Mac) ile anti-TRA-1-81 antikor lastikteki üreticinin protokolüne göre kaplı.
  2. Alternatif olarak, aşağıda açıklandığı gibi besleyiciler, kültürleri tüketmek için aşağıdaki basit öncesi kaplama yöntemi kullanmaktadır.
  3. Kabine bir steril biyolojik Emanet Hood, boş hücre süpernatant atmak, 2 mL steril PBS ile Pelet iyi yıka. Yapisan LIF-3i/MEF kültürler hücre dekolmanı çözümü (1 mL/de) kullanarak ayırın. Bir CO2 kuluçka (%5 CO2, nemli atmosfer) 5 min için kuluçkaya. HPSC steril 15 ml konik toplamak. Yıkama logosuna 2 kat içinde hESC orta, steril 15 mL konik ve 5 min için 200 x g , santrifüj transfer hücrelere.
  4. Bir Biyogüvenlik kabini, her şey LIF-3i/MEF ayrışmış hücre 2 mL LIF-3i orta yeniden askıya alma ve doğrudan yeni bir kuyu taze % 0,1 jelatin ile kaplı bir 6-şey plaka üzerine aktarın.
  5. LIF-3i/MEF hPSC hücreler bir CO2 kuluçka (%5 CO2, nemli atmosfer) 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya. Yapışık olmayan hücreleri yeni bir konik tüp bir pipet ile toplamak. Yavaşça hESC Orta 2 mL her şey için ekleyin ve kalan yapışık olmayan hücreleri toplamak için girdap.
    Not: Radyoaktif MEF çoğunluğu 1 h, gelatinized plaka süspansiyon hPSC çoğunluğu bırakarak eklemek olacaktır.
  6. Birleştirmek ve 300 x g 5 dk. PBS makinaya hücreleri santrifüj kapasitesi. Ek-hücre Pelet sıvı azot Santrifüjü sonra donma, veya alternatif olarak granül aşağı akım protein veya nükleik asit Analizi (Şekil 2B) uyumlu bir lysing arabelleği yeniden askıya alabiliriz.
  7. Karakterizasyonu LIF-3i hPSC satır ile eşleşen bir geleneksel astarlanmalıdır isogenic hPSC kontrol gerçekleştirin.
    Not: kültür veya saf reversion önce eşleşen bir timepoint, ilgili denetimler arasında ve astarlanmalıdır kültürler içinde içsel değişkenlik nedeniyle hazırlanır. Detaylı iletişim kuralları ve aşağı akım immünfloresan bioimaging için malzeme akış sitometresi, Western blot, gen ekspresyonu (RT-PCR deneyleri ve microarrays), metilasyon çalışmalar (nokta leke, KSY metilasyonu Mikroarray), OCT4 proksimal ve distal artırıcı başka bir yerde ağırlığı muhabir deneyleri ve sinyal inhibitörü deneyleri3sağlanır.

6. saf reversion post: genomik bütünlük doğrulama ve saklama, ebeveyn izlerini LIF 3i döndürülmesi N-hPSC önce işlevsel deneyleri kullanımda,

  1. Başlangıç astarlanmış, geleneksel hPSC kültürler (Örneğin, Giemsa bantlı boyama analiz yayınlanan yöntemleri 7kullanarak) normal bir karyotip bulundurmaktan LIF-5i/LIF-3i reversion işlemini başlatmadan önce ekran.
    Not: Bu artefactual seçici sağkalım avantajı klonal LIF-3i koşullarda sürücü anormal genomik değişiklikler olabilir liman geleneksel hPSC nüfus ortadan kaldırmaktır.
  2. En iyi sonuçlar için taze dönmek geleneksel hPSC kültürlerin bir saf gibi devlet ile LIF-3i için birkaç hafta önce fonksiyonel çalışmalar bunların kullanımı veya farklılaşma yönetti.
    Not: Rutin 'bakım' kültür aşağıdaki saf reversion tavsiye edilmez 10'dan fazla pasajlar için LIF-3i koşullarında uzun. Rutin genişleme ve hESC ve hiPSC satırlarının bakım gerçekleştirilen geleneksel kültür sistemleri kullanarak (Örneğin, E8 veya MEF/hESC orta bFGF ile).
  3. Normal tutma 5 – 7 pasajlar LIF-3i reversion sonra karyotypes için sonrası dönüştürülen N-hPSC satırları değerlendirmek (Örn., Giemsa bantlı boyama analiz7veya başka bir yöntemi tercih ile).
  4. Tüm dönüştürülen N-hPSC satırları normal ebeveyn genomik diziniz tutma için seçim bir DNA metilasyonu Analizi tarafından değerlendirmek (Örneğin, protokolleri CpG DNA Mikroarray Analizi LIF 3i döndürülmesi N-hPSC ebeveyn diziniz sağlanmaktadır için başka bir yerde3 ) LIF-3i reversion 5 – 10 pasajlar sonra.

7. posta saf Reversion: Deneysel tasarım yönergeleri LIF 3i döndürülmesi N-hPSC kullanarak nicel yönlendirilmiş farklılaşma deneyleri için

  1. Doğrudan LIF-3i N-hPSC içine kurulmuş yönlendirilmiş farklılaşma protokolleri olmadan ek hücre kültür manipülasyonlar kullanmaktadır.
    Not: (N-hPSC geleneksel astarlanmalıdır koşulları yönlendirilmiş farklılaşma deneyleri kullanımları önce geri dönüştürme yeniden emişliyani ) LIF-3i yöntemi ile gerekli değildir ve önerilmez.
  2. Tahlil etkileri için kontrol ve değişkenliği bireysel hPSC satırlarının fonksiyonel test Interline, çapraz-lineage özgü farklılaşma potenslerine bağımsız farklılaşma iletişim kuralları en az üç hPSC ile istihdam ederek doğrulamak için satırları elde edilen bağımsız genetik kökenden gelen (Yani, birden çok donör kaynaklı hiPSC ve hESC).
  3. Fonksiyonel karşılaştırmalar için kardeş kültürler, eşdeğer geçiş sayısı hem de paralel olarak geleneksel lineage astarlanmalıdır aynı (isogenic) hPSC satırından ve LIF 3i döndürülmesi hPSC kültürler ayarlayın. Astarlanmalıdır/saf kardeş isogenic hPSC kültürleri kendi ilgili medyada Bakımı (Örn., E8 vs. LIF-3i) ve aynı anda aynı farklılaşma protokolleri ve malzemeler, deneysel herhangi bir önyargı (Şekil 4) ortadan kaldırmak için kullanarak ayırt etmek.
  4. İsogenic saf hPSC karşılaştırma astarlanmalıdır için ayarlamak ve ilk kaplama yoğunluğunu her bireysel farklılaşma tahlil için en iyi duruma getirme.
    Not: Ayrıntılı iletişim kuralları nöral progenitör, kesin endoderm ve LIF 3i döndürülmesi N-hPSC hemato-endotel yönlendirilmiş farklılaşma için başka bir yerde 3temin edilmektedir. LIF 3i döndürülmesi N-hPSC yönlendirilmiş farklılaşma deneyleri daha geleneksel hPSC daha sağlam proliferatif ve ayırt etme kapasitesi var. N-hPSC, genellikle geleneksel hPSC daha düşük bir başlangıç kaplama konsantrasyon gerektirir ve onların geleneksel astarlanmalıdır hPSC karşıtları, enzimatik takip onların klonal yaşam geliştirmek için anti-apoptotik reaktifler kullanımını gerektirmez farklılaşma deneyleri sindirim.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu iletişim kuralı verimli saf benzeri reversion LIF-3i ile hem besleyici bağlı ve besleyici bağımsız lineage astarlanmalıdır geleneksel hPSC kültürlerde (Şekil 1) en iyi duruma getirir. Detaylı iletişim kuralı, açıklanan burada, LIF-3i ya besleyici bağımlı veya besleyici-Alerjik geleneksel hPSC koşulları (Örneğin E8 orta) başlayarak sıralı uyum özetliyor.

Temsilcisi çeşitli geleneksel hESC LIF-3i reversion için sonuç ve hiPSC transgene içermeyen satırları rakamlar 1-3' te sunulmaktadır. Bu tipik sonuçlar piyasada bulunan hESC satırıyla H9 doğrulanabilir veya ticari olarak mevcut ile transgene içermeyen, episomal hiPSC kan kaynaklı satır (6.2) Zambidis laboratuvar8,9' türetilmiş kordon. İlk bir LIF-5i adaptasyon adım getirilmesi son derece verimli sonraki, toplu klonal yayma geleneksel hPSC kültürlerin LIF-3i içinde verir ve does değil istemek anti-apoptotik ajanlar veya ROCK inhibitörleri10 (Şekil 1A, B ). Birden çok tabak örnekleri hızla aşağı akım analizleri veya multilineage için toplanabilir saf gibi hPSC farklılaşma 5 – 7 pasajlar sonra LIF-3i içinde yönetti. Alternatif olarak, LIF-3i kültürler için gelecekteki uygulamalar cryopreserved. Hücre kurtarma sonrası çözdürme olabilir (Şekil 2) bir ROCK inhibitörü dondurma ve sonrası tezcan media11eklenmesi ile geliştirilmiş.

Moleküler ve fonksiyonel pluripotency, her iki vitro ve embriyo belirleyici son zamanlarda gözden geçirilmiş2vardı. Bu faktörler genetik arka plan, kültür ilişkili edinimi mutasyonlar için anahtar gelişimsel genler ve hESC ve hiPSC elde edilmesini ve kültür yöntemleri farklılıklar içerir. Sağlanan aşağıdaki karakterizasyonu ve fenotipik, doğrulama için moleküler istihdam edilebilir standart deneyleri özetini ve LIF 3i döndürülmesi hPSC fonksiyonel pluripotencies vardır.

Koloni morfolojisi
Astarlanmalıdır, geleneksel ve LIF 3i döndü kültür sistemleri arasında geçiş hPSC koloni morfolojisi (Şekil 1B) ayrı fiziksel değişiklikler eşlik ediyor. Geleneksel hPSC hücreleri olarak düz, küçük hücre kümeleri (üzerinde MEF veya besleyici-Alerjik koşulları), ancak kötü tek hücreler olarak hızla genişler geniş monolayer kolonileri çoğalırlar. Geleneksel hPSC satırlarının maruz LIF-3i büyüme ve genişleme teşvik ve daha küçük, sıkı paketlenmiş olarak, clonally kaynaklanan kubbe seklinde kolonileri hücreleri tek. Bu morfolojik değişiklikler alınamaz ve kubbe seklinde kolonileri LIF 3i döndürülmesi kendiliğinden geri bir geleneksel monolayer morfoloji LIF-3i içine kapanık ve hücreleri standart konvansiyonel hESC ortamda yeniden kültürlü geçiş yapabilir bFGF ile desteklenmiştir. Ayrıca, düz, geleneksel morfoloji azaltılmış klonal verimlilik ile spontan reacquisition LIF 3i döndürülmesi hücreleri yüksek konfluent yoğunlukları (ya da sık sık passaging olmadan uzun süreli kültür) sonuçlarında genişlemesi; gerek çalışkan bakım onarım ve bakımı LIF 3i döndürülmesi hPSC vurgulayan (Örn., < % 40-60 izdiham).

Ayirt boyama canlı ve akış sitometrik analiz yüzey pluripotency işaretleri
Non-invaziv LIF-3i/MEF genişleme () üzerinde herhangi bir olumsuz etkisi tespit olmadan boyama canlı antikor kullanarak pluripotency işaretleri değerlendirilmesi geleneksel aşağıdaki sürekli LIF-3i kültür olabilir bir saf gibi devlet geçiş sırasında izlenen Örn., Canlı Boyama TRA-1-81, TRA-1-60 ve SSEA4 karşı antikor fluorochrome Birleşik).

Pluripotent LIF-3i reversion sırasında kalıcılık da düzenli olarak izlenen göre yüzey marker pluripotency ilişkili ifade TRA-1 akış sitometrik analiz ve tek sırasında SSEA antijenleri hücre passaging (Şekil 1C) veya ayirt, sağlam, sabit kolonileri içinde in situ (Şekil 3). Her ne kadar bu işaretleri arasında geleneksel ayırımcılık değil ve LIF-3i Birleşik, bunların düzeyleri ters hPSC içinde geleneksel hPSC LIF-3i koşulları için geçiş oluşabilir kendiliğinden farklılaşma frekans ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Özellikle mark insan saf gibi Birleşik vitro2,12,13 Mayıs ek yüzey antijenleri da etkili LIF-3i hPSC reversion algılamak için istihdam edilebilir.

N-hPSC moleküler pluripotency doğrulama
Çünkü genetik arka plan hPSC satırlarının değişkenlik Interline için güçlü bir katkı olarak karakterize, kültür timepoints ne zaman hPSC kültür sistemleri (Şekil 4) karşılaştırma eşleşen, isogenic kültürlerin titizlikle değerlendirmek önemlidir. Bazı bu sistemler zaten hPSC nüfus anormal genomik ve epigenetik yapılandırmaları2oluşturmak gösterilmiştir beri herhangi bir saf reversion yöntemi ile N-hPSC bir şekilde bağımsız genetik kökenden bir dizi denetlesinler Bu biyolojik tekrarlanabilirlik doğrulamak ve gelişimsel olarak sigara ilgili "sözde-pluripotent" Birleşik (Yani, moleküler pluripotency ama fonksiyonel ayırt etme yeteneklerini eksik bariz işaretlerinden ile) dışlamak yeterlidir. Zimmerlin ve ark. daha fazla LIF-3i kültür dönüştürülen N-çeşitli programlama yöntemleri, elde edilen fonksiyonel değişkenlik başka bir bilinen sözde katılımcı olan hiPSC moleküler ve fonksiyonel pluripotencies raporlaması dahil sisteme doğrulanmasını genişletilmiş pluripotent arasında2Devletler.

Buna göre insan saf kültür sistemlerinin en çalışmaları 1 N-hPSC moleküler pluripotency raporlaması üzerinde odaklanmıştır) epigenetik düzeyi (Örneğin, histon işaretleriyle çip sıralama veya çip-PCR, küresel DNA metilasyonu immunoblots veya bütün genomik bisülfit sıralama, alleli özgü CpG metilasyonu microarrays, muhabir sistemleri tarafından OCT4 artırıcı baskın kullanımı, DNaz göre yasal unsurları itibariyle küresel aktivite ben aşırı duyarlılık ve RNA-sıralama tarafından tekrar öğe profil), 2) transcriptomic düzeyi (RNA-sıralama, ifade microarrays ve kantitatif RT-PCR) protein ifade analizi (Örn., FACS, immünfloresan mikroskobu ve Western blot) ve 3) yolu ile metabolik çalışmalar (Örneğin, glikoliz, oksidatif fosforilasyon ve nikotinamid metabolizması). Ayirt lekeleri ve Western blot algılama ifade anahtar işaretleri için moleküler pluripotency temsilcisi örnekleri (Şekil 3B, C) gösterilir. Örneğin, şekil 3B'aktif fosforile (Fosfo) ve fare ESC gibi saf pluripotency anahtar moleküler özellikleridir STAT3 ve ERK1/2, toplam izoformlarının gösterilmiştir. Bunlar anti-STAT3 ve anti-ERK1/2 birincil antikorları kullanarak tespit edildi. Ayrıca, fonksiyonel pluripotency teratoma farklılaşma deneyleri içinde geleneksel vsgösterilmiştir. LIF 3i döndürülmesi hPSC teratoma doku 10 hafta takip enjeksiyon disseke ve % 4 formaldehit sabit ve katıştırılmış (Şekil 3D) alkol.

LIF-3i/MEF veya hESC/MEF/bFGF örnekleri hazırlanması aşağı akım moleküler analiz için MEF tükenmesi içermelidir. İki yaklaşım başarıyla bizim laboratuvar olarak istihdam MEF tükenmesi için yukarıda açıklanan. MEF öncesi kaplama basit, güvenilir, ve besleyiciler üzerinden N-hPSC ortadan kaldırmak için maliyet-etkin yöntem için moleküler çalışmalar örnekleri ve FACS veya MAC'ler ayrılık (yani anti-TRA-1-81 veya anti-TRA-1-60 antikor tabanlı ayrımı için tercih edilen bir alternatif ). Buna ek olarak, kendiliğinden ayırt TRA 1 negatif yapışık hücreleri LIF-5i/LIF-3i kültürler hızla sonraki LIF-3i geçit taze MEF üzerine önce LIF-5i/LIF-3i N-hPSC kültürlerden enzimatik sindirilmiş Pre-Kaplama tarafından elimine edilebilir tek hücreler % 0,1 jelatin (Şekil 2) ile ön kaplamalı plakalar üzerinde 1 h için.

N-hPSC, fonksiyonel pluripotency değerlendirilmesi
PSC fonksiyonel pluripotency en titiz tahlil N-hPSC satırlarının etik nedenlerle sınamada sınırlıdır blastosist enjeksiyon chimera tahlil olduğunu. Alternatif olarak, N-hPSC üretimi diğer çeşitli yöntemlerle bildirdin çeşitli gruplar türler arası chimeras oluşturmak için çalıştılar. Ancak, bu çabaların farklılaştırılmış N-hPSC soy standart fare ESC2chimera üretme kapasitesine göre fare veya domuz embriyo için son derece düşük veya başarısız katkısını vermiştir.

Ek fonksiyonel çalışmalar çeşitli yöntemleri ile elde edilen sözde N-hPSC farklılaşma yönlendirilmiş vitro araştırdık, ama önyargılı, arızalı veya azalmış multilineage farklılaşma kapasiteyle verebildiği ortaya koymuştur Epigenetik anormallikler2,13yataklık. Fare ESC baskılı loci, özellikle de benzer epigenomic anomalileri tespit LIF-2i kokteyl14güneşe maruz takip. İlginçtir ki, bazı reversion kültür sistemleri PSC fonksiyonel pluripotency için in vivo trophectoderm katkıgeliştirilmiş kapasitesi gibi belirli öznitelikleri küresel iyileştirme bildirdin2,15 .

LIF 3i döndürülmesi hPSC bağımsız olarak elde edilen geniş bir koleksiyonunu kullanarak, Zimmerlin ve ark. istihdam LIF-3i sistemi önemli ölçüde geleneksel hPSC satırları fonksiyonel pluripotency geliştirir göstermek için multilineage farklılaşma deneyleri 3. bu isogenic çiftler halinde Interline bağımlı varyasyonları (Şekil 4) ortadan kaldırmak için LIF-3i hPSC satırları geleneksel vs sistematik analizi sağlar. LIF 3i döndürülmesi hPSC satırları yeniden astar bir adım önce EB farklılaşma gerektirmez. Ancak, LIF-3i hPSC isogenic hücreleri E8 içinde genişletilmiş ve böylece, ilk alt kaplama yoğunluğunu ayarlama her kültür benzer bir timepoint noktada ulaşmak izin istemek daha anlamlı olarak daha yüksek klonal hesaplı çoğalırlar.

Müfettişlerin rutin olarak hem de yönettiği vitro farklılaştırma deneyleri için sinirsel vivo içinde teratoma deneyleri içerir LIF 3i döndürülmesi hPSC gelişmiş işlevsellik göstermek için birden çok deneyleri kullanmalıdır, birden çok testleri (Örneğin, 2D APEL3,16 ve 3D embryoid vücut17,18 sistemleri) kullanarak kesin endoderm hematovascular soy ve3 . Tahlil bağımlı tekrarlanabilirlik için denetlemek için en az iki farklı ayırt etme yöntemleri astarlanmalıdır/LIF-3i hPSC kültürler (örn., Şekil 4, APEL, embryoid vücut isogenic her çift için REPLICATE içinde yapılmalıdır farklılaşma iletişim kuralları). Deneysel tasarım sağlam bir sayı içermelidir (Örneğin, > 3-5) hPSC astar/LIF-3i isogenic çift satırları birden çok, bağımsız donör genetik kökenden gelen (Şekil 4).

Figure 1
Şekil 1: Bir kademeli geçiş saf benzeri koşulların LIF-3i yöntemi ile geleneksel, lineage astarlanmalıdır hPSC kültürlerin. (A) kademeli LIF-3i reversion için iletişim kurallarının şema. (Üst şematik) Genel yöntemler geçiş için astarlanmalıdır, LIF-3i kültürler için geleneksel hPSC. (Alt şemaları) LIF-3i saf reversion, geleneksel için iki özetlenen strateji (hazır) besleyici (Yani, Primed/MEF LIF-3i/MEF için) veya besleyici-Alerjik koşulları (yani, Primed/E8 için LIF-3i/MEF) kültürlü hPSC. (B) insan PSC türleri morfoloji. Bir ticari olarak mevcut insan episomal IPSC hattı (6.2) kullanan LIF-3i reversion sırasında temsilcisi photomicrographs hPSC gösterilmiştir. Gösterilen ilk geleneksel düz monolayer kolonileri arasında geçişler gözlenen ve ardından ortaya çıkan sonraki kubbe seklinde klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar kolonileri ara LIF-5i ve istikrarlı LIF-3i kültür şartlarında geçiş. Ölçek çubukları 200 µm. (C) temsilcisi akış sitometrik analizleri pluripotency yüzey işaretlerinin =. TRA-1-81 ve genişletilmiş E8, LIF-5i/MEF ilk geçiş ve aşağıdaki 1-9 pasajlar (P1-P9) SSEA-4 yüzey ifadelerde geleneksel hPSC satır 6.2 (p40) LIF-3i koşullarda gösterilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : N-hPSC dondurma ve numune hazırlama MEF öncesi kaplama tarafından. (A) LIF-3i/MEF kültürlerin bir donma/çözülme döngüsü örneği. E5C3 türetilmiş ve MEF besleyiciler ile 18 geçişleri için 4ng/mL bFGF takıma hESC Orta üzerinde Genişletilmiş geleneksel kordon kan kaynaklı, Sigara entegre, transgene içermeyen insan IPSC hattı. Geleneksel, lineage astarlanmalıdır E5C3 LIF-5i (solda) uyarlanmış ve LIF-3i orta 3 pasajlar (Merkezi) için içine geçiş. Merkezi panel gösterilen E5C3 LIF-3i hücreleri DMSO tabanlı cryoprotectant Orta (Tablo 2; şişe başına 1 x 106 hücre) kullanarak ve sıvı azot içinde depolanan cryopreserved). Bir şişe bir ay sonra çözdürülen ve E5C3 hücreleri bir besleyici kaplı içinde de bir 6-şey plaka (sağda), transfer edildi. Hücre kurtarma gelişmiş 5 mikron ile LIF-3i orta ilave tarafından tek bir gün sonrası tezcan için Y-27632. Ölçek çubukları 200 µm. (B) eleme MEF = (ve ayrıca yapisan TRA-negatif farklılaşmış hücreler) LIF-3i/MEF hPSC kültürlerde öncesi kaplama yöntemi tarafından. Akış sitometrik analizleri önce ve sonra PE Birleşik anti-TRA-1-81 ve TRA-1-60 antikorlar, APC Birleşik SSEA-4 antikorlar ve SSEA-1/CD15 antikorlar tükenmesi TRA-1 antijen negatif ve MEF hücreleri kullanarak gösteren öncesi kaplama gösterilmiştir bir saat öncesi kaplama yöntemi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Pluripotent LIF-3i/MEF N-hPSC kültürlerde karakterizasyonu. (A) yüzey ve nükleer pluripotency işaretleri. Pluripotent faktör aynı (isogenic) TRA-1-81+SSEA4 MİCRORNAS ifade+ geleneksel, astarlanmalıdır kordon kanı elde edilen hiPSC satır E5C3 (p39) genişletilmiş astarlanmalıdır (E8) veya saf LIF-3i (+ p8 LIF-3i/MEF) koşulları. Çekirdek pluripotency faktör astarlanmalıdır, MİCRORNAS geleneksel (E8 orta) veya LIF-3i/MEF SSEA-4+TRA-1-81+ hPSC içinde kültürlü üniforma, nükleer ifade odası slaytlarda temsilcisi hPSC kültürlerin immünfloresan lekeler ortaya koşullar. Ölçek çubuğu 100 µm. (B) Western blot analizi =. (Solda) STAT3, ERK (Merkezi) ve denetim beta-aktin proteini ifade için bir temsilci hPSC veya bir satır (hESC hat H9) geleneksel (E8 orta) LIF-3i/MEF koşulları (3i). Saf pluripotency ilişkili transkripsiyon faktörleri (C) ifade. STELLA/DPPA3, NR5A2 ve TFCP2L1 ayirt temsilcisi bir LIF-3i/MEF kültür tarafından gösterilmiştir (kordon kanı elde edilen hiPSC satırında p33 E5C3 (hESC/MEF) + p8 (LIF-3i/MEF). Ölçek çubuğu 100 µm. (D) Teratoma deneyleri, geleneksel ve LIF 3i döndürülmesi hPSC =. Bir isogenic temsilcisi hiPSC doğrultusunda fonksiyonel pluripotency doğrulanmasını (kordon kanı elde edilen E32C6) her iki E8 kültürlü (p9) veya LIF-3i/MEF (+ p12) tarafından teratoma tahlil. isogenic paralel kültürlü geleneksel, astarlanmalıdır vs LIF 3i döndürülmesi hPSC 10 x 106 hücreleri subkutan immünyetmezligi NSG fareler bacaklarda enjekte edildi. Hematoksilen ve eozin lekeleri teratoma microsections ortaya iyi yapılandırılmış ektoderm ile tüm üç germ katmanlara sağlam farklılaşma (sinirsel rozet: NR, Retina pigmente epitheliam: RPE), mesoderm (chondroblasts: Ch) ve endoderm (glandüler doku: GI) soy. Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: İsogenic astarlanmış ve saf devletler arasındaki işlevsel pluripotency karşılaştırılması. (A) fonksiyonel pluripotency LIF-3i kültürlü hPSC bağımsız farklılaşma protokolleri vs geleneksel isogenic içinde farklı pluripotent devletlerden değerlendirmek için strateji şematik. Daha önce farklılaşma potens geleneksel vs değerlendirmek için istihdam edildi iki hemato-vasküler progenitör farklılaşma sistemleri (APEL monolayer ve 3D embryoid vücut (EB) sistemleri) gösterilmiştir LIF-3i-döndürülmesi aynı (isogenic) hPSC doğrultusunda paralel sonrası aynı geçiş numaraları ile LIF-3i reversion kültürlü. LIF 3i döndürülmesi hPSC satır EB farklılaşma önce yeniden astar bir adım gerektirmeyen ve farklılaşma protokolü doğrudan tabi tutulmaktadır. (B) EB vasküler dede (VP) ayırt etme sistemi. Bu çalışma için istihdam EB 3D farklılaşma sistem yukarıda açıklanan17,18oldu. Gösterilen temsilcisi EB farklılaşma (sol kapı aynası) 10 gün aynı kordon kanı (CB) isogenic kültürleri sonuçlarıdır-geleneksel ya da hESC/MEF'te kültürlü E5C3 hPSC hat9, türetilmiş (Primed / MEF) koşulları veya LIF-3i/MEF saf koşullar. Akış Sitometresi Analizi bu EB hücrelerinin göstermek CD31 dramatik artış+CD146+ VP LIF-3i reversion farklılaşma önce E5C3 satırının aşağıdaki nüfus. Histogram CD31 ortalama ±SD görüntüler+CD146+ VP hücre bağımsız hPSC satırları (iki CB-hiPSC ve bir yetişkin fibroblast elde edilenYani, üç isogenic çift kullanarak bu EB sistemde 10 gün kurtarılan yüzdeleri hiPSC, noktalı çizgiler isogenic çiftleri bağlayın). Sonuçlar VP farklılaşma verimliliği önemli iyileşme EB sisteminde birden fazla hPSC satır genetik arka planlar arasında gösterilmektedir. (C) APEL monolayer vasküler progenitör ayırt etme sistemi. Farklılaştırılmış aynı kültür koşulları, büyüme faktörleri, sitokinler ve küçük moleküller kademeli APEL endotel farklılaşma kullanarak protokol doğrudan 3, Conventional (astarlanmalıdır E8) ve LIF 3i döndürülmesi hPSC olabilir 16. E5C3 kordon kanı elde edilen hiPSC hat ve CD31 yüzdesini kullanarak bağımsız APEL farklılaşma deneyleri gösterilmiştir+CD146+ APEL farklılaşma vasküler progenitör nüfus günü 7. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LIF-3i sistem klasik fare 2i saf reversion kokteyl1 değiştirilmiş bir sürümü insan pluripotent kök hücreler için geçerlidir. (Hangi 2i yalnız genişletilemiyor) hPSC kendini yenileme LIF-2i içinde bu kokteyl ile tankyrase inhibitörü XAV939 ilave olarak stabil. LIF-3i kültür toplu ve geleneksel hPSC verimli reversion için insan Preimplantasyon epiblast3benzeyen bir pluripotent devlet sağlar. Her ne kadar hPSC XAV939 eylem olası karmaşık mekanizmalar ve 2i ile sinerjistik, büyük olasılıkla en az, bir önemli istikrar ve büyütme hPSC öz-yenilenmesi WNT sinyal yolları3üzerinden içerir.

Geleneksel hPSC kültürler, normalde bir spektrum pluripotent Devletler son derece değişken gen soy astarlanmalıdır ifadeler ve tutarsız veya azalmış fonksiyonel pluripotency2 neden olabilir sonrası implantasyon epiblast epigenetik işaretleri ile kabul . Bu doğal lineage astar geleneksel hPSC kültürlerin de bazı hPSC lines2başarılı LIF-3i reversion ile girişime neden olabilir. Ancak, içinde belgili tanımlık ilk LIF-5i adaptasyon adım (Tablo 1) LIF-3i yöntemi eklenmesi evrensel olarak LIF-3i reversion çok sayıda hPSC satırları arasında verimliliğini genişletiyor ve toplu saf reversion geleneksel hPSC satır bir şekilde teşvik Bu sıkıcı toplama ve nadir kolonilerin saf döndürüldü veya canlılığı dengelemek için rutin anti-apoptotik molekülleri kullanımı ihtiyacını subcloning kaçınmanızı sağlar.

LIF-5i/LIF-3i saf reversion yöntemi hESC ve hiPSC hatları geniş bir tekrarlanabilir. Temel hücre kültür beceri ile asgari eğitim gerektirir. Zimmerlin ve ark. başarıyla dönmek için sıralı bu strateji istihdam > 30 bağımsız hESC ve bağış 3geniş bir dizi satırlarından transgene ücretsiz hiPSC. LIF-5i (Şekil 1) tek bir pasajda verimli saf reversion toplu hPSC kültürlerde sahiptirler ve onların sonraki kararlı bakım ve LIF-3i yalnız genişleme daha da ilerlemek en hPSC satırlar için yeterlidir.

Ayrıca, LIF-3i/MEF sistem sağlam toplu klonal genişleme verimliliği Tüm boyunca geleneksel hPSC lineage astarlanmalıdır kültür sonuna kadar tamamlanmış saf gibi hPSC reversion arasında adımları destekler (i.e., adaptasyon, geçiş ve LIF-3i/MEF yalnız 7 – 10 pasajlar için genişleme). Bu kültür sistemi geçerli formülasyonu besleyici destek gerektirse de, LIF-3i kültürlerin analiz öncesi kaplama tekniği ile besleyiciler tüketmek için basit ve uygun fiyatlı bir Yöntem (Şekil 2) sunulur.

Sistemleri de benzer saf benzeri pluripotent için geleneksel hPSC tanıtmak için bildirilmiş olan birden çok kültür2Devletler. Bu hPSC kültür sistemleri de klasik fare saf 2i koşulları kullanımı yararlanmıştır rağmen çoğu durumda bu tek hücreli passaging yöntemleri de ek kimyasal modülasyon bir doğal olarak kararsız sabitleme için gerekir / metastable insan saf devlet. Önemlisi, bu diğer yöntemlerin çoğu Engelli fonksiyonel pluripotency farklılaşma takip gösterdi ve/veya edinsel anormal epigenomic izlerini veya2karyotypes. Geleneksel astarlanmalıdır hPSC kültürler içinde anormal karyotypes ortaya çıkması zaten iyi olmasına rağmen uzun süreli,19, rutin en saf reversion yöntemleri istihdam edilmektedir enzimatik tek hücreli passaging yöntemlerini belgeledi. Bu da anormal kromozom yapılandırmaları20,21üretimi artırmak için gösterilmiştir; daha hassas teknikleri (örn., kopya numarası çeşitleri, tek nükleotit polimorfizmi) ek değişiklikler22,23ortaya çıkarabilir.

Buna ek olarak, LIF 3i döndürülmesi hPSC satırları geniş bir repertuar doğruladı, düşük-orta pasajlar (Örneğin, p5-p15) hem de yüksek geçit numaraları normal karyotypes sahip olmak (Örn., > p30) LIF-3i kültür3takip. Ayrıca, LIF 3i döndü hPSC epigenomic diziniz tekrarlanarak normal ve sağlam 5 – 10 geçişleri sonrası LIF-3i reversion2bulundu. Hassas alleli özel ticari metilasyonu dizi platformu kullanarak, bu daha önce CpG metilasyonu izlerine LIF 3i döndürülmesi hPSC satırları (LIF-3i aşağıdaki 4 – 7 pasajlar) geniş bir repertuar baskılı loci fena halde olduğu tespit gösterilmiştir normal yapısı1. Anormal genomik diziniz ve karyotypes sonuçta hPSC fonksiyonel kapasite bozabilen beri önkoşul yönergeleri araştırmacılar hPSC kültürler önce ve sonra saf reversion, bu kullanarak doğrulamak için teşvik eder bu protokolü özetlenen Yöntem hem de diğerleri.

LIF-3i yöntemi hESC ve transgenik olmayan hiPSC çizgiler (Şekil 3) büyük bir repertuar olarak germ katmanları arasında fonksiyonel pluripotency geliştirilmiş. Diğer saf reversion protokollerinden farklı olarak, LIF-3i Yöntem mu değil yeniden astar bir adım N-hPSC sonraki farklılaşması için gerekli (N-hPSC geleneksel astarlanmalıdır koşullar onların kullanımda önce geri dönüştürmeYani, yönetmen farklılaşma deneyleri). LIF 3i döndürülmesi N-hPSC onların isogenic konvansiyonel hPSC göre daha önemli ölçüde daha verimli ayırt etme kapasiteleri her iki teratoma deneyleri (Şekil 3D) görüntülemek ve soy tüm protokollerin farklılaşma yönetmen Üç germ katmanlar2. Tahlil bağımlı nedeniyle ve fonksiyonel geleneksel hPSC test çeşitleri Interline, lineage özgü farklılaşma-var değerlendirildi bağımsız yönlendirilmiş farklılaşma protokolleri ve birden çok genetik kökenden gelen türetilmiş hPSC kullanarak. Dikkatli deneysel tasarım kullanarak, hPSC hatları geniş bir dizi önemli ölçüde 4 – 10 pasajlar LIF-3i koşullarında takip isogenic geleneksel karşılıkları karşılaştırıldığında onların multilineage farklılaşma verimliliği artırmak için beklenebilir.

Özet olarak, bu yöntem hızla ve clonally insan sayısı genişletir PSC, soy için kabul edilen progenitör hücre sayıları farklılaşma takip onların aşağı akım farklılaşma verimliliği artar geliştirir ve düşüşler Interline değişkenlik geleneksel, lineage astarlanmalıdır hPSC satırları arasında. Bu N-hPSC gelişmiş işlevsellik ile daha da gelişmekte olan embriyo fonksiyonel dokulara katkıda bulunmak onların potansiyel için geniş bir etkisi olabilir. Örneğin, istikrarlı N-hESC transplantable insan organlarını ve erişkin kök hücreleri gelişmekte olan hayvan chimeras geliştirmek için veya hastalığın insanlaşmış gen hedefli hayvan modelleri oluşturmak için istihdam edilebilir. Bu tankyrase inhibitörü kullanan LIF-3i yönteminde daha fazla optimizasyon besleyici-Alerjik GMP uyumlu tanımlanan kültür koşulları işlevsel ve engraftable hücre tipleri için geniş bir dizi verimli klinik olarak yararlı üretimi kolaylaştırmak terapötik kullanım.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yaşam teknolojileri ve Johns Hopkins Üniversitesi (JHU) arasında bir lisans sözleşmesi kapsamında, Dr. Zambidis kök hücrelerinin lisans için üniversite tarafından alınan telif pay hakkına sahiptir. Bu düzenleme şartları JHU tarafından çıkar çatışması ilkelerine uygun olarak yönetilir. Bu veri ve malzemeleri paylaşımı günlük ilkeleri yazarların bağlılık değiştirmez.

Acknowledgments

Bu eser hibe NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Yenilik Ödülü, Maryland kök hücre araştırma fonu (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk bilim Forum Ödülü ve Moseley Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated BD Biosciences 561716 use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibody Sigma Aldrich HPA029708 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibody Abcam ab6276 use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated  BD Biosciences 550315 use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugated eBioscience 17-0319-42 use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kit Miltenyi Biotec 130-091-935
anti-NANOG antibody Abcam ab109250 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibody Sigma Aldrich HPA005455 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody Cell Signaling 4695 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody Cell Signaling 4370 use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody Cell Signaling 9145 use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated Agilent E0432 use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated  R&D System FAB1435A use 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated R&D System NLLC1435G use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibody Cell Signaling 9139 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibody Millipore MAB4388 use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated  R&D System NLLC4770R use at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0068 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0069 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560193 use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560161 use 10µL per assay (FACS)
APEL2-Li StemCell Technologies 5271
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3311
CellAdhere dilution buffer StemCell Technologies 7183 dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouse Charles river 023
CHIR99021 R&D System L5283 reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope system Zeiss LSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC line Thermo Fisher Scientific A18945 also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates Corning 3506
Countess  cell counting chamber slide Thermo Fisher Scientific C10228
Countess automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)  Thermo Fisher Scientific 11995-065
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific 11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D2650
DR4 mouse The Jackson Laboratory 3208
Essential 8 (E8) medium StemCell Technologies 5940
Fetal bovin serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30071.03
Forskolin Stemgent 04-0025 reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G1890-100G resuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
mTeSR1 medium StemCell Technologies 85850
Nalgene cryogenic vials Thermo Fisher Scientific 5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System Fisher Scientific 154534
Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS USB Corporation  19943
PD0325901 Sigma Aldrich PZ0162 reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
Purmorphamine Stemgent 04-0009 reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin A Peprotech AF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 Peprotech 120-05ET resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF) Peprotech 100-18B resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human LIF Peprotech 300-05 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
SB431542  Stemgent 04-0010-05 reconstitute at 100mM in DMSO
Stemolecule Y27632 in Solution Stemgent 04-0012-02 ROCK inhibitor in solution (10mM)
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific A11105-01
Streptavidin-Cy3 conjugate Sigma Aldrich S6402 use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 Peprotech 100-21 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
Vitronectin XF matrix StemCell Technologies 7180 dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer
XAV939 Sigma Aldrich X3004 reconstitute at 100mM in DMSO
β-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023 light sensitive

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, (7194), 519-523 (2008).
  2. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26, (16), 1141-1161 (2017).
  3. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143, (23), 4368-4380 (2016).
  4. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
  5. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8, (5), 424-429 (2011).
  6. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, (2), 185-187 (2006).
  7. Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203 (2014).
  8. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, (4), 18293 (2011).
  9. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7, (8), 42838 (2012).
  10. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, (6), 681-686 (2007).
  11. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24, (3), 580-589 (2009).
  12. Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20, (6), 874-890 (2017).
  13. Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14, (11), 1055-1062 (2017).
  14. Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548, (7666), 219-223 (2017).
  15. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169, (2), 243-257 (2017).
  16. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9, (6), 1514-1531 (2014).
  17. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83, (1), 114-126 (2013).
  18. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129, (3), 359-372 (2014).
  19. Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29, (4), 313-314 (2011).
  20. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23, (1), 19-20 (2005).
  21. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, (11), 2029-2040 (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8, (1), 106-118 (2011).
  23. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471, (7336), 58-62 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics