Un haut débit et haute teneur, liquide à base de c. elegans pathosystème

Immunology and Infection

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Summary

Nous décrivons ici un protocole qui est un hôte adaptable, entier, outil de dépistage de la forte teneur qui peut être utilisé pour étudier les interactions hôte-pathogène et être utilisé pour la découverte de médicaments.

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Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (137), e58068, doi:10.3791/58068 (2018).

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Abstract

Le nombre de nouveaux médicaments identifiés par traditionnel, en vitro écrans a diminué, réduisant le succès de cette approche dans la recherche de nouvelles armes lutter contre la pharmacorésistance multiple. Cela a conduit à la conclusion que les chercheurs ne sont pas seulement la nécessité de trouver de nouveaux médicaments, mais aussi besoin de développer de nouvelles façons de les trouver. Parmi les candidats prometteurs, les méthodes sont tout micro-organisme, in vivo , essais qu’affichages utilisation de haut-débit, phénotypiques et héberge qui vont de Caenorhabditis elegans à Danio rerio. Ces hôtes ont plusieurs avantages puissants, y compris des réductions spectaculaires de fausses positifs hits, comme les composés qui sont toxiques pour l’hôte et/ou biounavailable sont généralement supprimées dans l’écran initial, avant de suivre coûteux vers le haut.

Ici, nous montrons comment notre essai a été utilisée pour interroger la variation d’hôte dans bien documenté c. elegans— pathosystème liquide meurtre dePseudomonas aeruginosa . Nous démontrons également plusieurs extensions de cette technique bien travaillée dehors. Par exemple, nous sommes en mesure de réaliser des écrans génétiques haut-débit à l’aide d’Arni dans 24 ou 96 puits formats de plaque aux facteurs de l’hôte requête dans cette interaction hôte-pathogène. À l’aide de ce test, étude globale du génome entier peut être complété en seulement quelques mois, ce qui peuvent considérablement simplifier la tâche d’identifier des cibles thérapeutiques, potentiellement sans la nécessité d’approches de purification biochimiques laborieux.

Nous rapportons également une variante de notre méthode qui substitue la bactérie Gram-positive Enterococcus faecalis pour le pathogène Gram négatif de P. aeruginosa. Beaucoup comme c’est le cas pour P. aeruginosa, assassinat par E. faecalis est fonction du temps. Contrairement à la précédente c. elegans— essaisd’e. faecalis , notre essai pour E. faecalis ne nécessite pas de preinfection, améliorer son profil d’innocuité et réduisant les risques de contamination de manutention des liquides. L’essai est très robuste, montrant ~ 95 % taux de mortalité 96 h après l’infection.

Introduction

L’identification et le développement d’antibiotiques efficaces, à large spectre, maintenant il y a près d’un siècle a conduit à un moment décisif dans la santé publique où il y avait une croyance largement répandue qu’infectieuse maladie serait un fléau du passé. Quelques courtes décennies, cet optimisme commença à décliner, comme pathogène après que pathogène mis au point des mécanismes de résistance qui limite ces traitements une fois miraculeuses. Depuis un certain temps, la course aux armements entre les efforts de découverte de drogue et les agents pathogènes semblait équilibrée. Toutefois, la mauvaise utilisation des antimicrobiens a récemment abouti à l’émergence de souches résistantes aux médicaments-pan de Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescenset P. aeruginosa1, 2,3,4.

P. aeruginosa est un, gram négatif, multi-accueil agent pathogène opportuniste qui constitue une menace grave pour les patients atteints de brûlures graves, ceux qui sont immunodéprimés, ou souffrent de fibrose kystique. Il est également de plus en plus identifié comme un agent causal dans les infections nosocomiales graves, notamment en raison de son acquisition en cours de la résistance antimicrobienne. Pour commencer à faire face à cette menace, nous avons utilisé le bien documenté c. elegans-P. aeruginosa infection système5. Notre laboratoire a mis à profit ce système afin de développer une plate-forme de base liquide, haut débit, haute teneur de dépistage pour identifier de nouveaux composés qui limitent la capacité de l’agent pathogène de tuer l' hôte6. Curieusement, ces composés semblent appartenir au moins trois catégories général, y compris les antimicrobiens7 et virulence inhibiteurs8. Autres essais de découverte de drogue forte teneur chez c. elegans ont été rapportés pour Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, et Enterococcus faecalis, entre autres,9,10,11,12,13,14,15,16. Ces types d’analyses ont plusieurs avantages reconnus, comme limiter la fausses hits positifs qui peuvent être toxiques à la fois l’hôte et l’agent pathogène, la probabilité de biodisponibilité par rapport à un écran chimique et la capacité d’identifier les visites au-delà tout simplement limiter la croissance microbienne, comme anti-virulents, des molécules stimulants immunitaires ou des composés qui autrement faire pencher la balance de l’interaction hôte-pathogène, en faveur de l’ancien. En outre, les composés découverts dans ces écrans sont souvent efficaces chez les hôtes mammifères.

Il est à noter qu’il existe au moins deux autres essais17,18 réaliser des écrans de haut-débit chez c. elegans en liquide. Cependant, chacun de ces tests est une modification qui permet le dosage la colonisation de l’intestin prototypique, connu comme lent-assassinat, à effectuer dans un liquide, augmentant le débit et permettant aux composés à subir plus facilement. Attention la caractérisation a démontré avec certitude que les mécanismes de la virulence bactérienne sont différents entre ces tests et notre base liquide Ecran7. Étant donné que les deux types de virulence sont observés dans les systèmes mammaliens, il est important d’examiner quels déterminants de virulence est le plus pertinent pour les intérêts de l’expérimentateur avant la sélection du dosage.

Nous démontrons une version optimisée de la base liquide dosage c. elegans-P. aeruginosa . Nous rapportons également l’adaptation de notre méthode de dosage de base liquide pour accueillir la bactérie pathogène Gram positive Enterococcus faecalis. Comme P. aeruginosa, E. faecalis est plus en plus identifiée comme une menace de graves infections nosocomiales avec un armement croissant de la résistance aux antimicrobiens voies1. Bien que14il existe une méthode précédente pour le criblage à haut débit d’e. faecalis , requiere preinfection avec l’agent pathogène, ce qui complique la procédure et augmente la probabilité de contamination des équipements tels que le FlowSort COPAS. Notre protocole élimine le besoin de préalable à l’infection, améliorer le profil d’innocuité. Enfin, nous présentons un moyen par lequel ou l’autre de ces tests peuvent être combinés avec alimentation Arni, permettant à l’utilisateur de rechercher des facteurs de l’hôte qui jouent un rôle dans la mise en place de, ou résistance à l’infection.

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Protocol

ATTENTION : P. aeruginosa et E. faecalis sont des pathogènes de niveau de biosécurité 2 et précautions de sécurité appropriées doivent être prises pour prévenir l’infection accidentelle et de réduire au minimum la contamination des surfaces. Tous les supports et les matériaux qui entrent en contact avec des agents pathogènes doivent être stérilisés ou mis au rebut. Lignes directrices supplémentaires sont disponibles dans la publication CDC Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL), 5e édition.

1. préparation et entretien de P. aeruginosa

  1. Strie de P. aeruginosa provenant d’un stock congelé sur une gélose LB (lysogénie bouillon). Incuber pendant 16 à 24 heures à 37 ° C
    Remarque : Réaliser des expériences P. aeruginosa à l’intérieur d’une armoire pour assurer la stérilité de sécurité biologique BSL-2. Utilisez des précautions de sécurité appropriées afin de minimiser les risques d’infection pathogène ou contamination.
  2. Transférer cette plaque à 4 ° C. Cette plaque peut être conservée à 4 ° C et utilisée pour ensemencer les cultures pendant une semaine. Après une semaine, décontaminer et éliminer la plaque et faire une nouvelle plaque de strie LB.
    Remarque : La virulence P. aeruginosa diminue après un stockage prolongé.
  3. Deux jours avant la mise en place des plaques de dosage, ensemencer 3 à 5 mL de bouillon LB stérile avec une seule colonie de P. aeruginosa de la tôle au point 1.1. Incuber à 37 ° C pendant 12 à 16 h.
    Remarque : Incuber pas plus de 16 h. Dans des cultures liquides riches, P. aeruginosa PA14 commence à lyser.
  4. Préparer les assiettes stérile de 10 cm avec les médias tuent lentement (3 g de NaCl peptone de 3,5 g, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL de tampon phosphate (montant par litre : 132 mL K2HPO4 (1 M) et 868 mL de KH2PO4 (1 M)) et 18 g agar/L).
    Remarque : Préparer les plaques d’avance. Qu’elles puissent être stockées pendant 3 semaines dans un contenant hermétique à 4 ° C.
  5. Graines de chaque plaque de tuer lente de 10 cm (plaque SK) avec 350 μL de P. aeruginosa de culture nuitée fraîche de LB. À l’aide d’un épandeur bactérien stérile, répartir les bactéries sur la surface des supports et laisser pour sécher dans une armoire de sécurité biologique BSL-2.
  6. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 24 h.

2. préparation des bactéries de l’ARNi

  1. Strie sur ou pin-transfert désirés souches de bactéries contenant de l’ARNi sur plaques de gélose LB contenant des antibiotiques appropriés (carbénicilline à 100 µg/mL) et la tétracycline à 15 µg/mL pour les bibliothèques Ahringer et Vidal provenant d’un stock congelé.
    Remarque : Lorsque vous travaillez avec des bactéries non pathogènes, utilisez soit un BSL-2 A / B hotte biologique de sécurité ou un écoulement laminaire de BSL-1 cagoule pour assurer la stérilité des cultures et pour minimiser le risque de contamination croisée de la bibliothèque.
  2. Incuber les boîtes pendant 24 h à 37 ° C.
  3. Stocker les plaques à 4 ° C pendant deux semaines.
    1. Après deux semaines, jetez les plaques et les remplacer par des plats fraîchement préparés.
  4. Tester plusieurs souches d’Arni en parallèle en inoculant individuellement une seule colonie de chaque clone dans 4 mL de LB additionné de carbénicilline dans un seul bien d’une plaque de 24 puits puits profonds ou dans un tube stérile.
    Remarque : Tétracycline a été signalé à réduire l’efficacité de l’ARNi. Ne l’utilisez pas dans ce média.
  5. Placer les plaques 24 puits puits dans un incubateur à agitation optimisé pour plaques multipuits et incuber à 37 ° C pendant 16 h et en agitant à 950 tr/min.
    Remarque : Il est difficile d’obtenir une croissance bactérienne uniforme en plaques multipuits à l’aide d’un incubateur à agitation conventionnels. L’incubateur agitateur doit être capable de secouer à un minimum de 750 tr/min afin que les cultures de croître correctement. En l’absence d’un shaker spécialisé, il est possible de faire pousser de chaque culture dans un tube individuel. Cultures peuvent être transférées dans la plaque 24 puits pour la centrifugation par la suite, si vous le souhaitez.
  6. Récolter les germes par centrifugation pendant 5 minutes à 2 000 x g.
  7. Éliminer le surnageant en inversant la plaque et en agitant vigoureusement. Remettre en suspension les bactéries Arni dans 100 µL de S basale (5,85 g NaCl, g 1 K2HPO4, 6 g KH2PO4 dissous dans 1 L d’eau ultrapure et stérilisé par autoclave).
  8. Pipetter bactéries resuspendues dans un nombre approprié de puits d’une plaque multipuite de NGM (milieux de culture de nématode, 3 g de NaCl, peptone de 2,5 g, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL de tampon phosphate (montant par litre : 132 mL K2HPO4 (1 M) et 868 mL de KH2PO4 (1 M)) et agar de 18 g par litre d’eau) additionné d’IPTG (concentration finale de 1 mM) et la carbénicilline (concentration finale de 100 μg/mL).
    1. Utiliser 3,5 mL de médias NGM / puits de la plaque 6 puits, 1 mL par puits d’une plaque 24 puits ou 150 µL / puits de la plaque à 96 puits.
    2. Utilisez 100 μL/puits de bactéries pour plaque 6 puits ; 50 μL/puits pour 24 puits ; ou 20 μL/puits de la plaque à 96 puits. Laisser pour sécher.
      Remarque : Séchage est normalement effectuée sous une hotte à flux stérile pour promouvoir un séchage rapide et uniforme. Il est très important d’un séchage uniforme. Éviter de trop sécher, comme les fissures dans la gélose promouvoir les terriers de vers. Cela conduit à des pertes et le potentiel de colmatage des systèmes de traitement des liquides de ver.
  9. Utiliser les plaques préparées immédiatement ou le stockage à 4 ° C pendant deux semaines pour une utilisation ultérieure.
    Remarque : Pour éviter les plaques ne se dessèchent pas, ils peuvent être operculées avec film plastique paraffine ou placés dans un conteneur scellé hermétiquement avec un essuie-tout humide.

3. entretien et préparation de c. elegans

Remarque : Avant d’entreprendre des expériences, générer une population synchronisée de worms hermaphrodites gravides, adultes comme suit.

  1. Lavez-les gravides adultes (c'est-à-dire, avec plusieurs embryons visibles dans la gonade) de 4 à 6 plaques de NGM 10 cm dans un tube conique de 15 mL en ajoutant 4 mL S basale à plaque, agitant doucement et puis verser dans un tube conique de 15 mL.
  2. Pellet vers par centrifugation à 1 000 x g pendant 30 secondes.
  3. Aspirer le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber le culot à vis sans fin.
  4. Ajouter 3,5 mL de solution d’eau de Javel worm (concentration finale 0,5 M NaOH, hypochlorite de sodium 1 %, dans de l’eau stérile) au culot de ver et mélanger en retournant le pendant 1 minute.
  5. Brièvement de vortex et centrifuger à 1 000 x g pendant 30 secondes.
  6. Aspirer ou décanter le liquide surnageant, prenant soin de ne pas pour déranger le culot de ver.
  7. Ajouter 3,5 mL de solution d’eau de Javel fraîche ver au culot ver.
  8. Mélanger vigoureusement vers dans la solution d’eau de Javel. Régulièrement (environ toutes les dix secondes) inspecter visuellement les vers sous un microscope à dissection. Surveillez les cuticules ver de rompre, libérant des oeufs. Une fois que la plupart vers adultes ont été dissous (~ 95 %), diluer l’eau de Javel 15 mL avec basale S pour arrêter la digestion.
    Remarque : Les coquilles d’oeufs sont plus résistantes à l’eau de Javel que les tissus adultes, mais ils peuvent être dissous au cours d’une exposition prolongée. Pour éviter la dissolution de l’oeuf, n’exposez pas les oeufs pour ver la solution d’eau de Javel pendant plus de 7 minutes. Si les coquilles de œufs sont trop endommagés, les embryons vont mourir.
  9. Pellet embryons à 1 000 x g pendant 30 secondes et aspirer ou décanter le liquide surnageant sans enlever le culot d’embryons.
  10. Resuspendre worms dans S basale pour un volume final de 15 mL à diluer le reste de la solution eau de Javel.
  11. Répétez les étapes de lavage (3,9-3.10) trois fois plus pour un total de 4 lavages consécutifs.
  12. Après le quatrième lavage, aspirer le surnageant et ajouter jusqu'à 5 ou 6 mL S stérile basale dans le tube conique de 15 mL. L’objectif est de remettre en suspension les embryons à une concentration de 50 ~ vers par µL.
    Remarque : Le montant de base S dépend de la taille de la pastille de le œuf ; plus le pellet, la plus basale de S est nécessaire.
  13. Incuber le tube conique du jour au lendemain sur un rotateur plateau à température ambiante ou 48 h à 15 ° C. Les larves éclosent, mais arrêter le développement larvaire au stade L1 (L1 diapause) en raison de la privation en nutriments.
  14. Examiner les embryons sous un microscope à dissection afin de vérifier que la plupart d'entre eux ont éclos et arrêté au stade L1 de développement.
  15. Déterminer le nombre de vis sans fin en prenant 20 µL de la préparation de ver et il diluant avec 80 µL S basale. Déposer 10µl de solution diluée ver directement sur une plaque de NGM vide. Répéter 2 fois plus.
    1. Compter les larves dans chaque endroit et déterminer le nombre moyen. Cette moyenne de diviser par 2 pour obtenir un nombre approximatif de worms par µL dans la préparation de ver. Preps ver puis peuvent être utilisés que pour les plaques de propagation ou d’expériences.
      Remarque : Après 4-5 jours, les larves affamées commence à mourir ; Jetez la préparation à ce stade.
  16. Pour la propagation de la souche, pipette un nombre approprié de L1 vers (5 000-6 000) sur des plaques de 3-4 10 cm NGM parsemée concentré OP50 Escherichia coli – « Super » (e. coli OP50 repéré à concentration de X 25 (c.-à-d., 1 L de nuit OP50 cultivée dans des livres donne 40 mL de 25 X OP50 Super) ; 2 mL de cette suspension bactérienne concentrée sont repérées sur chaque plaque NGM 10 cm).
  17. Pour préparer les plaques pour des expériences, effectuez l’une des suivantes (pour utilisation 3.17.1 Configuration du « Protocole de base », pour les étapes d’utilisation « Arni écran mis en place » 3.17.2 - 3.17.4 le cas échéant) :
    1. Pipette de ~ 5 000 plaque de worms/10 cm ensemencé avec Arni ou OP50 superaliment.
    2. Pipette de ~ 500 vers/puits dans une plaque 6 puits ensemencé avec Arni.
    3. Pipette de ~ 300 vers/puits dans une plaque 24 puits ensemencé avec Arni.
    4. Pipette ~ 100 vers/puits dans une plaque à 96 puits ensemencé avec Arni.
      Remarque : Pour obtenir des instructions sur comment l’ARNi a été ensemencé reportez-vous aux étapes de 2,7 à 2,9 en préparation de bactéries de l’ARNi.
  18. Si on utilise une souche féconde de worms, incuber les vers à 25 ° C ~ 44-48 h. utilisation ces vers aussi rapidement que possible après que la population ait atteint l’âge approprié. Cela minimise l’impact de l’éclosion dans les vers pendant le test.
  19. Si la souche utilisée est température-stérile (par exemple, fer-15(b26); FEM-1(HC17) ou glp-4(bn2)), incuber les vers à 15 ° C pendant environ 16 h et puis transfert à 25 ° C pendant 44 heures achever le développement et prévenir l’embryogenèse.

4. liquide tuant test Setup (protocole de base)

Remarque : Il s’agit d’un protocole pour une souche bactérienne et une source de worms.

  1. À l’aide d’un grattoir de cellules, retirez P. aeruginosa téflonées SK et resuspendre dans ~ 5 mL S basale. S’intensifier si nécessaire. Mesurer la densité optique de la suspension bactérienne à l’aide d’un spectrophotomètre (OD600)
  2. Préparation de 24 mL dilué stock P. aeruginosa dans basale S à OD600 ≈ 0.09 (concentration finale de 3 X). Voir 4.6.2 pour contenu final / puits et adapte le volume de dilution bactérienne en conséquence.
  3. Ajouter 21 mL de milieu liquide de tuer lentement (3 g de NaCl, 3,5 g de peptone/L additionné de CaCl2 et MgSO4 à une concentration finale de 1 mM). À l’aide d’une pipette multicanaux, transfert 45 µL des bactéries et des médias dans chaque puits d’une plaque 384 puits.
  4. Laver vers de leur source (c'est-à-direétape 3.17.1) dans un tube conique de 50 mL et laisser les vers de s’installer sous la force de gravitation. Aspirer le surnageant à 5 mL. Resuspendre dans un total de 50 mL S basale.
  5. Répétez l’étape 4.4 deux fois.
  6. À l’aide d’un trieur de ver, trier environ 22 vers dans chaque puits de la plaque 384 puits.
    Remarque : Le programme d’installation supprime chaque ver en ~1.1 µL de liquide. 22 vers seront élèvera à 25 µL, apportant volume de dosage total à 70 µL/puits.
    1. La composition finale de chaque puits se compose de 70 µL. 45 µL de ce volume est ajouté comme moyen de bactéries (bactéries 0,03 OD600 µL 24 S basale et 21 µL SK additionné de CaCl2 et MgSO4). Les autres 25 µL est ajouté avec les 22 vers.
    2. Si la trieuse utilisé ici (voir la Table des matières) est indisponible, les vers peuvent être diluées à une concentration finale de 1 ver/µL en S basale et pipeté 25 µL/puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Toutefois, les résultats peuvent présenter variabilité accrue. Alternativement, il est possible d’utiliser un distributeur de liquid péristaltique, tel que décrit par Leung et collègues19.
  7. Après les vers ont été triés dans la plaque 384 puits, sceller la plaque avec un film perméable au gaz et incuber les boîtes à 25 ° C pendant 24 à 48 heures.
  8. À l’heure souhaitée, utilisez un laveur de microplaque pour laver la plaque 384 puits avec basale S 5 fois au total.
    1. Après le deuxième lavage, aspirer la plupart des médias, laissant environ 20 µL. vigoureusement secouer les plaques à l’aide d’une microplaque vortexer pendant au moins 30 secondes pour détacher les débris du fond du puits).
  9. Après le lavage final, surnageant aspirer jusqu'à 20 µL. Ajouter 50 µL de 0,98 µM nucleic acid stain (voir Table des matières) / puits de la plaque 384 puits, pour une concentration finale de 0,7 µM.
  10. Incuber à température ambiante pendant 12 à 16 h. Ce colorant se tachera seulement vers morts. Après la période d’incubation désiré, plaques de lavage à l’aide de la rondelle de la microplaque pour enlever tout excès tachent (un minimum de 3 lavages).
  11. D’acquisition de données, utilisez un spectrophotomètre ou un microscope automatisé afin d’imager les lumière transmise et fluorescence (531 nm excitation et émission 593).
    1. Utilisez un objectif de faible grossissement pour permettre une image du puits tout à saisir.
    2. Sinon, utiliser des flux vermimetry. Cette technique utilise un cytomètre de flux LOB comme un fluorimètre ver, mesurer la taille et la fluorescence de l’ensemble de l’organisme (p. ex., c. elegans) d’une manière qui ressemble fortement à la cytométrie en flux.
  12. Utilisez le logiciel d’analyse automatique d’image (tels que CellProfiler, un studio d’analyse image libre basé sur MatLab http://cellprofiler.org/) pour calculer les zones fluorescentes et total ver / puits de façon impartiale.
    Remarque : Le quotient de ces chiffres représente la mort de fraction pour chaque puits. Si l'on avait bien 7 colorées vers les 20 total, puis la mort de fraction comprend 0,35 ou 35 %.
    1. Avant la première utilisation, le pipeline de traitement d’image automatisé doit être validé par pointage manuel. Ceci est fait en comparant les résultats de la canalisation automatique aux scores obtenus par visuellement inspecter les images et l’enregistrement des fractions de vers morts pour chacun d’eux. Le processus de validation garantit que les paramètres pour le traitement automatisé d’imagerie sont exactes et représentent les données correctement.

5. adaptation des souches multiples de dépistage c. elegans ou passes rabattues (réglage de l’écran RNAi)

Remarque : Il s’agit d’un écran de RNAi décrit pour une installation de la plaque 24 puits.

  1. Ajouter 1 mL de S basale / puits d’une plaque 24 puits (voir étape 3.17.3). Doucement agiter vers en secouant la plaque, puis transférez-les vers à une plaque de fond de puits 24 vide et stérile. Permettre à worms régler gravitationnellement (~ 5 minutes).
  2. Aspirer le surnageant, en laissant environ 1 mL. Ajouter 7 mL S basale dans chaque puits.
  3. Répétez les étapes 5.1-5.2 un minimum de 2 fois plus. Après le lavage final, aspirer le surnageant, en laissant environ 400 µL.
  4. À l’aide de la fonction de rééchantillonnage de la trieuse de ver, trier 22 vers contre la suspension de ver plaque 24 puits dans chaque puits d’une plaque 384 puits (chaque puits d’une plaque 24 puits rendements 8-12 puits d’une plaque 384 puits).
    1. Pour éviter la famine, les bactéries de pipette en plaques 384 puits (une souche qui sert uniquement d’aliments tels que les OP50, ou une souche pathogène) avant le tri.
      Remarque : Les agents pathogènes peuvent être ajoutés par étapes suivantes 2,3 à 2,5 ou 6,4 à 6,5 et source de nourriture bactéries peuvent être dilués et ajoutés en suivant le même schéma que pour P. aeruginosa.
  5. Après les vers ont été triés dans la plaque 384 puits, ajouter de petites molécules ou autres matériaux d’expérience spécifique.

6. adaptation pour E. faecalis

Remarque : Seules les différences de dosage P. aeruginosa sont décrites.

  1. Préparer une source fraîche d’e. faecalis en ensemençant des bactéries provenant d’un stock congelé sur une gélose BHI (cœur-cervelle) et en incubant pendant 16 à 24 h à 37 ° C.
    Remarque : Réaliser des expériences d’e. faecalis à l’intérieur d’une armoire pour assurer la stérilité de sécurité biologique BSL-2. Utilisez des précautions de sécurité appropriées afin de minimiser les risques d’infection pathogène ou contamination.
  2. Plaques peuvent être stockés à 4 ° C pendant une semaine. Après cette période, remplacer par une nouvelle plaque.
  3. La nuit avant le tri vers, ensemencer 3 à 5 mL stérile BHI avec une seule colonie de E. faecalis. Incuber pendant 12 à 16 h à 37 ° C sous agitation.
  4. Ajouter des bactéries dans les puits que pour P. aeruginosa (3 x bactéries S basale, OD600≈0.09).
    Remarque : Pour E. faecalis, la composition finale du puits est : E. faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10 % v/v, avec le volume restant composé de S basale. N’oubliez pas que 25 µL de S basale seront livrés par vers.
    Remarque : E. faecalis produit des biofilms épais qui absorbe la tache fluorescente, provoquant des images floues. Un lavage peut être insuffisant pour enlever ce biofilm. Dans ce cas, les vers peuvent être transférées à une plaque vide à l’aide d’une pipette multicanaux. Pour faciliter le transfert, Tween 20 peuvent être ajoutés à S basale à une concentration finale de 0,1 % (v/v) de Tween 20 dans S basale. Cela contribue à éliminer les vers de biofilm.

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Representative Results

Paramètres importants pour la performance du test

Une bonne compréhension de la biologie qui sous-tendent ce dosage est nécessaire pour le dépannage et l’optimisation de l’analyse. À cette fin, nous appelons d’abord plusieurs documents clés élucider les mécanismes de la pathogenèse de P. aeruginosa-mediated tuant liquide7,,20. Pourvu que les étapes décrites ci-dessus sont respectées (voir la Figure 1 pour une représentation schématique du protocole dosage) dépendant du temps tuer des elegans de Caenorhabditis on remarquera qu’en présence de l’agent pathogène (Figure 2 a). En revanche, en l’absence de suppléments nutritionnels clés (par exemple, si la peptone est laissée sur les médias, et seulement S basale est ajoutée), peu ou aucun meurtre est observée (Figure 2 b). Fait intéressant, l’incubation en deux étapes P. aeruginosa (pour 24 h à 37 ° C, puis 24h à 25 ° C), qui est essentiel pour des dosages de lent-massacre classiques et était à l’origine mis en place en tuant liquide21, est dispensable dans cet essai ( Figure 2). Alors qu’il est possible d’ajouter de P. aeruginosa directement à partir de la culture LB pendant la nuit, faisant sensiblement modifie la cinétique de la létalité et n’est pas recommandé.

Comprendre la biologie de dosage permet aussi de simplification de l’essai, si approprié et souhaitable. Par exemple, le pilote le plus important de tuer dans cet essai d’accueil est la pyoverdine sidérophores et toxicité hôte causée par pyoverdine dépend de sa capacité à lier le fer7. Ainsi, le dosage peut être simplifié en remplaçant pyoverdine riches filtrat, pyoverdine purifiée ou même des chélateurs de fer produits chimiques synthétiques (par ex., 1, 10-phénanthroline) par des bactéries vivantes, comme la réponse transcriptionnelle de c. elegans à ces traitements est très similaire (Figure 3)22.

Plusieurs différentes sources de données, veuillez communiquer avec la robustesse de l’installation expérimentale. Tout d’abord, le programme d’installation tolère une large gamme de concentrations bactériennes initiales. Concentrations aussi faibles que DO600 = 0,0025 (environ 10 fois plus faible que celle recommandée) encore pièce dépendante du temps et concentration mise à mort, bien que le calendrier déplace (Figure 4 a). Deuxièmement, la reproductibilité du dosage est telle qu’aussi peu que 4 puits est souvent suffisant pour obtenir des données statistiquement significatives (Figure 4 b).

Il y a plusieurs changements que nous ne recommandons pas. Par exemple, à l’aide d’inoculums de bactéries initial avec des concentrations beaucoup plus élevées que celles inscrites dans le protocole ; il engendre donc en épais biofilm-comme matériau, qui est difficile, voire impossible laver efficacement, qui complique la létalité notation. En outre, forte concentration bactériennes inoculums aussi peuvent rivaliser pour l’oxygène et déclencher non-spécifiques hôte tuer7.

Une autre remarque importante est de limiter le délai entre le test d’arrêt et d’imagerie les vers morts. Notez que ce délai doit inclure une coloration, il est essentiel d’être efficace. Après la mort, la matière biologique dans worms commence à extruder ou être consommée par les bactéries. Dans une question des 24-32 h, reste seulement la cuticule. La cuticule des taches très mal et est très léger, rendant facile à perdre lors de lavages. Il est important de noter que souches ou conditions de souche/Arni avec une cinétique très différente de meurtre peuvent se compliquer de ce phénomène (par exemple, certains vers peuvent être encore en vie alors que d’autres ont déjà perdu leur contenu et il est impossibles d’image). Figure 4 a montre ce phénomène, que les vers sur le côté gauche de la plaque, inoculés avec de très faibles concentrations bactériennes initiales, sont encore en grande partie vivants tandis que vers le côté droit de la plaque, qui ont été exposés à des concentrations beaucoup plus élevées de bactéries, ont été emportées.

Un très important déterminant de la réussite du test est la méthode utilisée pour recueillir et analyser les données. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé au moins trois méthodes de collecte de données de ces tests : spectrophotométrie automatisée de la microscopie et vermimetry de débit (c.-à-d., l’adaptation des techniques de cytométrie en flux de c. elegans, littéralement, la mesure vers dans une solution qui coule). La première de ces méthodes utilise un spectrophotomètre pour lire de la fluorescence de la teinture ou le journaliste vers en question. Cette méthode a l’avantage d’utiliser un morceau assez omniprésent de l’équipement (un spectrophotomètre standard avec un lecteur de microplaques) et est la méthode la plus rapide d’acquérir des données. Cependant, il manque le contenu informationnel disponible de microscopie automatisée et la puissance statistique des flux vermimetry.

La microscopie automatisée est une autre option viable. Un certain nombre de systèmes d’imagerie microplaques est actuellement sur le marché, allant des prix qui sont abordables à un seul chercheur (p. ex., un Bio-Tek Cytation5) à une plus grande, plus cher et des machines de qualité supérieure qui sont plus fréquents dans le noyau installations (p. ex., un Microscope de ImageXpress dispositifs moléculaires). Dans la pratique, la plupart de ces solutions se prête pour la notation de la plupart des écrans et des essais. Plus des plates-formes d’imagerie automatisées peuvent également être couplés au logiciel en aval pour le traitement (p. ex., MetaMorph, ImageJ, Gene5 ou cellule Profiler) pour favoriser le rendement de l’information de l’image. Exemples de l’utilité du traitement sont présentés dans la Figure 5 et Figure 6. Lorsque le rapport signal-bruit est élevé (comme dans la Figure 5), l’analyse est simple et distinguer les conditions positives et négatives est trivial. Dans ces cas, hits même faibles peuvent être facilement identifiés. De nombreux essais, cependant, ont un ratio signal-bruit plus faible. Par exemple, traitement des PINK-1::GFP22 vers (avec expression constitutive mCherry dans leur déjà) avec 1,10-phenathroline augmente le niveau de rose-1::GFP. Pour l’analyse des données, le journaliste GFP inductible est normalisé au signal mCherry constitutive (Figure 6). Dans ce cas, le journaliste a plus faible expression et/ou n’est pas activé dans la majorité vers. Par conséquent, il peut être avantageux de mise en œuvre du traitement de l’image des outils supplémentaires, comme analyseur de cellules, qui peuvent réduire le fond et amplifier le signal.

Enfin, si un FlowPilot COPAS est disponible, il peut être utilisé pour acquérir des données par l’intermédiaire de flux vermimetry. Beaucoup comme le concept plus familier de la cytométrie en flux, cet instrument permet de mesurer la fluorescence de c. elegans au moins deux ou trois canaux à la fois. Cette méthode est très favorable à l’acquisition de données avec haute signification statistique, mais le débit est très diminué par rapport à la microscopie automatisée. L’avantage plus important des flux vermimetry est dans la capacité d’analyser les populations ver ensemble comme un seul groupe pour une adaptation, plutôt que fractionnant en plusieurs puits et l’analyse de la moyenne des puits. Analyse des grands groupes de cette manière dramatiquement améliore la puissance statistique et permet la détection des effets même petites.

Modification du dosage Killing liquide

Développements récents de l’analyse ont étendu son utilité en incluant le dosage activation de reporters fluorescents (Figure 6), à l’aide de techniques de RNAi de moyen - à haut-débit (Figure 3) et même la substitution de l’original agent pathogène.

La raison la plus évidente d’utiliser Arni mis en place est de tester des voies de défense du hôte contre P. aeruginosa (ou autres agents pathogènes). Exemples de RNAi knockdown de gènes pertinents pour la survie dans l’essai sont indiqués à la Figure 3. Compatible avec les précédentes observations20,23,24,25, daf-2(RNAi) amélioré la survie pendant l’exposition à P. aeruginosa, tout en daf-16 ( c. elegans RNAi), zip-2(RNAi) et cebp-1(RNAi) raccourci. Tel que mentionné, Arni n’est plus simplement inclus dans le test de worms sur plaques multipuits où chacun contient bien un autre clone de RNAi de plus en plus. En raison de la forte viscosité de la gélose et petits volumes impliqués, il est difficile de réaliser un remplissage uniform, sans bulles des plaques de 96 puits sans matériel spécialisé. En outre, les souches bactériennes transportant l’ARNi de séchage peut être aussi un problème, comme les puits extérieurs sèchent plus vite que les puits intérieurs, menant à potentiel non-uniformité et significatif pour le craquage de l’agar. Tel que noté ci-dessus, cela encourage les vers à creuser, réduisant le nombre d’animaux disponibles pour le dépistage et les risques de colmatage des machines de traitement des liquides. Pour ces deux raisons, plaques 24 puits sont plus faciles à travailler que les plaques à 96 puits. Bien que cela réduit le débit de dosage, il améliore la fiabilité et suggère, en particulier pour les dépistages initiaux.

Enfin, le dosage a été modifié le dosage pour remplacer P. aeruginosa avec E. faecalis. (En principe, substitution avec d’autres espèces bactériennes fournisse pas les difficultés indues, autant que de culture approprié et des conditions d’exposition sont identifiées.) Le facteur le plus important à considérer est les spécifications des supports de l’agent pathogène, tant pour la croissance et le développement que pour l’induction de la virulence. Par exemple, Gram positif, opportuniste pathogène E. faecalis exige des médias riches en éléments nutritifs (comme le BHI) et une incubation à une température plus élevée par rapport à P. aeruginosa14,26. En prenant ces facteurs en considération, adaptation de la le dosage à utiliser E. faecalis était simple. Tel qu’indiqué pour P. aeruginosa, nous avons vu tuer dépendant du temps (Figure 7). Fait intéressant, le moment de la mort était semblable aux déterminations publiées antérieurement utilisé avant infection sur plaques agar26, malgré l’absence de cette démarche, qui pourrait suggérer que les mécanismes impliqués dans la pathogenèse varient.

Figure 1
Figure 1 : schéma de la base liquide c. elegans – test d’infection à P. aeruginosa . Étapes impliquant la préparation et propagation de nématodes sont à gauche, préparation bactérienne sont à droite. Étapes impliquant tous les deux sont centrés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Mise à mort c. elegans par P. aeruginosa est spécifique et nécessite une bonne nutrition bactérienne. (A) c. elegans mort en présence d’e. coli et de P. aeruginosa. (B) mort de c. elegans en présence de P. aeruginosa (droit) et sans (à gauche) médias tuent lentement ajouté au mélange (c.-à-d. S seulement basale). S basale est un milieu minimal et ne contient pas les éléments nutritifs nécessaires à la croissance des bactéries et empêche la production de pyoverdine. (C) c. elegans mort en présence de différemment préparés de P. aeruginosa. p < 0,01, issu de Student t-test. Barres d’erreur représentent S.E.M. 10 puits ont été utilisés par réplicat biologique par l’État. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Résistance de c. elegans à P. aeruginosa dépend de voies immunitaires de l’hôte. Un panel de sélectionné Arni passes rabattues a été traité avec P. aeruginosa (A) ou 1, 10-phénanthroline (un chélateur chimique qui imite exposition à P. aeruginosa dans un liquide) (B). p < 0,01, #p < 0,05, issu de Student t-test. Barres d’erreur représentent S.E.M. 10 puits ont été utilisés par réplicat biologique par l’État. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Assassinat de c. elegans par P. aeruginosa est robuste et dépend de la concentration de bactéries. Images représentatives (A-B) (A) et la quantification (B) de la mort de c. elegans après exposition à des concentrations variables de P. aeruginosa pour 72 h. p-valeurs ont été calculées en fonction de l’étudiant t -tester. Barre d’échelle (A) est mm 1. 16 puits ont été utilisés par réplicat biologique par l’État. BF : Bright Field, FL : Fluorescence. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : acquisition et image informatique d’un test avec un signal fort. (A) des images représentatives des vivant (témoin négatif) et les morts (contrôle positif) c. elegans. (B) l’analyse statistique des témoins négatifs et positifs, basé sur la méthode d’acquisition de données, le mode de traitement et nombre de puits analysés. (C) Fluorescence a été analysée pour les vers de quatre puits d’une plaque de 96 puits (deux positives et deux puits témoin négatif). Chacune contenait bien ~ 100 vers. Chaque point sur le graphique représente un seul ver, montrant le temps de vol (qui est en corrélation avec, mais, en raison de l’enroulement vers vivants, imparfaitement représente la taille) et la fluorescence mesurée pour les vers qui sont colorées avec Sytox Orange. Contrôle positif vers ont été préalablement tués par exposition à la chaleur. En raison des changements de tension et de la forme de vers morts (comme peut être vu dans (A), mort vers apparaissent plus bâtonnet et ont peu de courbes corps) par rapport à leurs homologues de la vie, vers morts ont une TOF plus longtemps. p-valeurs ont été calculées en fonction de Student t-test. Barre d’échelle (A) est 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : acquisition et image informatique d’un test avec un signal modéré. (A) des images représentatives c. elegans transportant un journaliste PINK-1::GFP inductible et un marqueur constitutif de mCherry (pour normaliser l’expression des gènes du tableau extrachromosomique). C. elegans exposés au DMSO (témoin négatif) ou 1, 10-phénanthroline (contrôle positif). (B) l’analyse statistique des témoins négatifs et positifs, basé sur la méthode d’acquisition de données, le mode de traitement et nombre de puits analysés. (C) quatre puits individuels d’une plaque de 96 puits (deux positives et deux puits témoin négatif) ont été analysées à l’aide de flux vermimetry. p-valeurs ont été calculées en fonction de Student t-test. Barre d’échelle (A) est 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Assassinat de c. elegans par E. faecalis est robuste et temps dépendant. Images représentatives (A-B) (A) et la quantification (B) de la mort de c. elegans après exposition à E. faecalis. p < 0,01, issu de Student t-test. 10 puits ont été utilisés par réplicat biologique par l’État. Barres d’erreur représentent S.E.M. Echelle dans (A) est 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ce dosage (ou essais similaires où les autres pathogènes sont substituées pour P. aeruginosa ou E. faecalis) est utiles pour diverses fins, notamment la découverte de médicaments. Il est également utile pour traiter des questions biologiques fondamentales, telles que les facteurs de virulence, l’élucidation des voies de défense hôte et la détermination du mécanisme réglementaire impliqués dans l’interaction hôte-pathogène.

Bien que l’essai P. aeruginosa Killing liquide est robuste, il y a plusieurs points où une attention particulière devrait être accordée aux minimiser le risque de défaillance. Tout d’abord, comme indiqué, la plaque bactérienne source pour P. aeruginosa vaccins doit rester frais, peur que les bactéries perdent virulence, malgré la croissance durant la nuit dans des livres. Deuxièmement, il est essentiel pour s’assurer que le calcium et magnésium sont ajoutés à P. aeruginosa , tuant les dosages. Sans elle, virulence sera grandement compromise. Enfin, il est à noter que vers élevés sur HT115 (pour les analyses RNAi) mourra significativement plus tard que vers élevés sur OP50 (N. Kirienko, communication personnelle). Pour cette raison, si le passage à Arni axée sur les études, il est important de déterminer empiriquement le meilleur point de temps pour le dosage.

Pour tuer les dosages avec P. aeruginosa ou E. faecalis, il est crucial pour s’assurer qu’il y a une nourriture suffisante pour le développement vers dès le stade de L1 jusqu'à ce qu’ils sont prêts à être utilisés dans le test. Famine, même à court terme, est connu pour activer un certain nombre de voies de défense hôte, tels que l’insuline/IGF DAF-2/DAF-16 réseau27de signalisation. Nos résultats suggèrent que le DAF-16/FOXO est déjà légèrement activée par cultivée en liquide20, et activation supplémentaire est fortement indésirable, car cette DAF-16/FOXO encourage à large spectre pathogène résistance23.

Enfin, il est essentiel d’utiliser complètement stériles vers dans toute analyse qui s’appuie sur la mortalité comme une lecture. Si les vers sont fertiles, étant dans un liquide provoque des difficultés en ponte. Par conséquent, certains des embryons éclosent au sein de la société mère, finit par causer sa mort. Pour cette raison, nous utilisons généralement une lésion génétique, telles que glp-4(bn2)28, qui illustre un phénotype complètement par ressuage stérile de ces tests. L’utilisation de produits chimiques qui empêchent le développement embryonnaire, mais encore permettre de Ponte, par exemple 5-fluorodésoxyuridine (FUdR), devrait être évitée car ils peuvent également interférer avec le développement et la croissance bactérienne.

En général, nous avons trouvé très utile pour planifier plusieurs points dans le temps pour l’analyse. Bien que le dosage est robuste et le timing est généralement conforme, stochastiques et imperceptibles changements peuvent modifier le calendrier du mort lors de l’essai dans les 2 à 4 heures. Lorsque le dépannage est nécessaire, il est souvent utile d’examiner d’abord la plus simple des réponses ; c'est-à-dire, préparer les supports neufs, jeter les cultures bactériennes les plus récentes et ré-ensemencer les souches bactériennes de stocks congelés, etc. seulement très rarement ne ces mesures restaure le dosage à la fonctionnalité.

En raison de la relative simplicité de la méthode, une grande variété de modifications peut être facilement effectuée. Changer les vers d’un milieu uniforme glp-4(bn2) pour les écrans de RNAi de haut débit, tels que ceux nous décrivons ci-après, est utile pour l’identification des voies de réponse hôte pour un large éventail des xénobiotiques et des produits chimiques toxiques. Par exemple, en ajoutant le même produit chimique ou toxine dans chaque puits de plaques Arni (p. ex., Cry5B de toxine, phénanthroline, etc.), voies qui modifient la sensibilité à ces toxines peuvent être facilement identifiés. Ces types d’écrans peuvent également servir à identifier les réseaux de défense contre l’un de la panoplie des agents pathogènes qui infectent le c. elegans.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par la prévention du Cancer et le Research Institute of Texas (CPRIT) prix RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930 et par le National instituts de santé K22 AI110552 attribué à NVK. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COPAS FP BioSorter Union Biometrica Large object flow cytometer/worm sorter
Cytation 5 BioTek
EL406 Washer Dispenser BioTek
Multitron Pro Infors HT
24 Deep-Well RB Block Thermo Fisher Scientific CS15124
384-Well plate Greiner Bio-One MPG-781091
Nematode Growth Media (NGM) Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) plates Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) media Amount per liter:  3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Lysogeny Broth (LB) USBiological Life Sciences L1520
Brian Heart Infusion broth (BHI) Research Products International Corp 50-488-526
Worm Bleach Solution Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water
S Basal Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water
Agar USBiological Life Sciences A0930
NaCl USBiological Life Sciences S5000
Peptone USBiological Life Sciences P3300
CaCl2 USBiological Life Sciences
MgSO4 Fisher Scientific M63-500
Phospate buffer amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)
KH2PO4 Acros Organics 7778-77-0
K2HPO4 USBiological Life Sciences P5100
5% Sodium Hypochlorite Solution BICCA 7495.5-32
NaOH solution Fisher Scientific SS255-1
Breathe-easy Diversified Biotech BEM-1
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Fisher Scientific S11368
Bacterial Strains
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)

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