Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Immunology and Infection

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Summary

Efferocytosis, die phagocytic Entfernung der Apoptotic Zellen ist erforderlich, um die Homöostase und wird erleichtert durch die Rezeptoren und Signalwege, die für die Anerkennung, Engulfment und Internalisierung der Apoptotic Zellen ermöglichen. Hier präsentieren wir ein Fluoreszenz-Mikroskopie-Protokoll für die Quantifizierung des Efferocytosis und die Aktivität der Efferocytic Signalwege.

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Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G., Heit, B. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58149, doi:10.3791/58149 (2018).

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Abstract

Studieren die Regulierung des Efferocytosis erfordert Methoden in der Lage sind, die Aufnahme von apoptotischen Zellen genau zu quantifizieren und die Signalisierung und zelluläre Prozesse zu untersuchen, die Efferocytosis zu steuern. Diese Quantifizierung kann schwierig sein, wie Apoptotic Zellen oft bruchstückhaft, Efferocytosed sind durchführen, so erfordern Methoden, die genau zwischen dem Efferocytosed Teil eines Ziels Apoptotic versus passives unengulfed Mobilfunk abgrenzen können Fragmente. Die hier beschriebenen Ansatz nutzt Dual-Kennzeichnung Ansätze, um die Dynamik des Efferocytosis und Efferocytic der Efferocytes wie z. B. Makrophagen genau zu quantifizieren. Das Zytosol der apoptotischen Zelle ist mit einem Handy-Tracking-Farbstoff zu ermöglichen eine Überwachung aller apoptotische Zelle abgeleitet Materialien, während Oberfläche biotinylierungen der apoptotischen Zelle ermöglicht eine Differenzierung zwischen verinnerlichten und nicht verinnerlicht beschriftet apoptotische Zelle Brüche. Die Efferocytic-Kapazität des Efferocytes richtet sich nach fluoreszierende Bilder live oder festen Zellen und die Menge des gebundenen versus internalisierten Ziele zu quantifizieren, wie durch Streptavidin Färbung unterschieden. Dieser Ansatz hat mehrere Vorteile gegenüber Methoden wie Durchflusszytometrie, nämlich die genaue Abgrenzung von nicht-Efferocytosed versus Efferocytosed Apoptotic Zelle Brüche, die Fähigkeit, Efferocytic Dynamik durch live-Cell-Mikroskopie, Messen und die Kapazität, Untersuchungen der zellulären Signalisierung in Zellen, die mit dem Ausdruck eindringmittel beschriftet Transgene durchzuführen. Kombiniert, dienen die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden als Grundlage für eine flexible experimentellen Ansatz, der verwendet werden kann, um Efferocytic Tätigkeit genau zu quantifizieren und zelluläre Signalwege während der Efferocytosis aktiv zu verhören.

Introduction

Apoptose oder programmierter Zelltod ist ein stark regulierten physiologischen Prozess, der tritt in den meisten vielzelligen Organismen und ist entscheidend für ihre Entwicklung und Homöostase1. Neben der normalen Zellerneuerung und embryonale Entwicklung beteiligt, Apoptose ermöglicht die Beseitigung der infizierten oder beschädigten Zellen aus den Geweben und in Reaktion auf die Infektion, Entzündung, Krebs, und auch durch medizinische Eingriffe ausgelöst werden kann z. B. Strahlentherapie oder Steroide1. Apoptotische Zellen aussetzen "Essen-mich" Signale auf ihrer Zelloberfläche die von Rezeptoren auf eine Reihe von professionellen und nichtprofessionellen Phagozyten erkannt werden zusammenfassend als "Efferocytes" bezeichnet. Engagement dieser Rezeptoren induziert die Aufnahme und den Abbau der apoptotischen Zelle durch die Efferocyte durch einen Prozeß bekannt als Efferocytosis2,3. Phosphatidylserin ist die beste charakterisierten essen-mir signalisieren treibende Efferocytosis. Es normalerweise beschränkt sich auf die innere Broschüre der Plasmamembran, mit Apoptose ein Lipid-Scramblase das stört diese Membran-Asymmetrie, damit aussetzen Phosphatidylserin auf der Zelle Oberfläche4aktivieren. Phosphatidylserin ist auf der extrazellulären Oberfläche von einigen nicht-apoptotische Zellen wie Reifen Makrophagen gefunden und Thrombozyten aktiviert. Diese Zellen sind jedoch nicht Efferocytosed aufgrund des Vorhandenseins von "ISS mich nicht" Signale, wie z. B. CD47, auf ihrer Zelle Oberfläche5,6,7. Exponierten Phosphatidylserin wird durch eine Reihe von Efferocytic Rezeptoren geäußerten Efferocytes erkannt. Bindung dieser Rezeptoren, Phosphatidylserin, aktiviert entweder direkt oder durch die Hilfe von Opsonins, Signalwege, die die Verwicklung der apoptotischen Zelle in eine Membrane-springen Vakuole bezeichnet die Efferosome8, zu fördern 9 , 10 , 11 , 12. das Efferosome Sicherungen sequenziell mit Endosomen und Lysosomen, die liefern die molekularen Maschinen notwendig, die Efferosome Ansäuern und verschlechtern die Apoptotic Zelle Ladung13,14. Einmal abgebaut, die Apoptotic Zelle abgeleitet Materialien sind Opfer von Menschenhandel zu recycling Endosom – ein Prozess, welche Grenzen Immunantworten auf apoptotische Zelle abgeleitet Antigene, und die können für die Verwertung von Nährstoffen aus der apoptotischen Zelle13, 15. Ein Fehler im Efferocytosis führt zu eingeschränkter Clearance von apoptotischen Zellen; diese ungeklärten Zellen durchlaufen schließlich sekundären Nekrose. Nekrotische Zellen release Pro-inflammatorischen cytosolischen Inhalt, Krankheitserreger und Autoantigene in das extrazelluläre Milieu, somit eine Reichweite von infektiösen, Entzündungs-und Autoimmunkrankheiten16,17. Zusammen, Apoptose und Efferocytosis erleichtern die Entfernung der sterbende und tote Zellen und für die Aufrechterhaltung der Homöostase Gewebe erlauben.

Untersuchung der molekularen Mechanismen, die Efferocytosis erfordert Methoden, die eine klare Quantifizierung der apoptotischen Zelle Aufnahme bereitstellen. Diese Quantifizierung wird durch die Tatsache erschwert, dass im Gegensatz zu anderen Aufnahme Mechanismen wie z. B. Endozytose und Phagozytose18,19, Efferocytosis nicht die Verwicklung von intakten Zielzelle, wodurch die schrittweise Aufnahme führen kann der apoptotischen Zelle durch die Efferocyte20. Die hierin beschriebene Protokoll beschreibt einen in-vitro- Efferocytosis Assay, die genaue Abgrenzung von den verinnerlichten bietet im Vergleich zu nicht verinnerlicht Teile der einzelnen Apoptotic Zellen und kombinierbar mit einer Vielzahl von festen-Zelle und Leben-Zelle Mikroskopie Ansätze. Traditionelle Phagozytose Assays hinzufügen Antikörper spezifisch auf die phagocytic Ziel am Ende des Experiments um Ziele nicht verinnerlicht, wo, wie unsere Methode beschriften unterscheidet sich durch Kennzeichnung der Apoptotic Ziel mit kovalent verknüpft Biotin21 , 22. während apoptotischer Zellen spezifische Antikörper in diesem Assay verwendet werden können, der biotinylierungen Ansatz ermöglicht für jedes Protein-Lager Ziel gekennzeichnet werden und vermeidet mögliche Probleme mit sekundären Antikörper Kreuzreaktivität Immunostaining erfolgt . Im einzelnen erläutern wir die Vorbereitung des apoptotischen Jurkat-Zellen, die mit einer Zelle Tracking Farbstoff und Biotin Dual befleckt gewesen. Die Zelle tracking Farbstoff ermöglicht apoptotische Zelle abgeleitet Materialien, während Efferocytosis verfolgt, während Oberfläche biotinylierungen ermöglicht die Unterscheidung von aus nicht verinnerlicht Teilen des Efferocytosed Apoptotic Zellen verinnerlicht. Wir beschreiben auch die Kultur und die Vorbereitung von J774.2 und THP-1-Zell-Linien für den Einsatz als murinen und menschlichen Efferocytes, M2-Makrophagen Monocyte abgeleitet als Beispiel der Primärzelle Efferocytosis und Jurkat-Zellen für den Einsatz als Efferocytic Ziele. Diese Methoden können leicht auch auf andere Zelllinien oder Primärzellen, Zielzellen durchläuft jede Form des Zelltods (z. B. Apoptose, Nekrose und Necroptosis) und Mikron mittelständische imitiert die Apoptotic Zellen durch Lipid-Beschichtungen zu simulieren oder Beschichtung mit Liganden spezifisch für eine Efferocytic-Rezeptor von Interesse.

In diesem Protokoll beschriebenen Methode hat mehrere Vorteile gegenüber der Flow Cytometry basierend üblichen Methoden im Feld23,24. Durch bildgebende direkt die Phagozyten-apoptotische Zelle Interaktion, kombiniert mit klaren Kennzeichnung von beiden insgesamt und nicht verinnerlicht Apoptotic Zellmaterial können quantitative Maßnahmen des Efferocytosis vorgenommen werden. Darüber hinaus schränkt die Verwendung von pH-unempfindliche Fluorophore Störfaktoren wie die Unterdrückung der FITC und GFP Fluoreszenz bei lysosomalen pH, die einige alternative Methoden25verwirrt. Schließlich, während nicht im Detail beschrieben, diese Methoden eingesetzt werden mit Efferocytes mit dem Ausdruck eindringmittel beschriftet transgene oder mit Post-Fixierung Immunostaining, Quantifizierung der Signalisierung Molekül Aktivität und Überwachung ermöglicht die zelluläre Prozesse während der Efferocytosis.

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Protocol

Ansammlung von Blut von gesunden Probanden nahm Health Science Research Ethics Board von der University of Western Ontario. Venenpunktion wurde gemäß den Richtlinien der Tri-Rat Grundsatzerklärung zur Forschung am Menschen durchgeführt.

1. Kultur und Vorbereitung der Zelllinie THP-1 Monocyte

  1. Kultur THP-1 Monozyten als einer SUSPENSIONSKULTUR in T25 Fläschchen bei 37 ° C + 5 % CO2. Zellen sollten in Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10 % 5 mL fetalen Bovine Serum (FBS) angebaut werden.
  2. Jeden Tag anhalten Zellen gleichmäßig über die Wachstumsmedien durch sanft schütteln die Flasche dann zählen sofort Zellen mit einem Hemocytometer. Zellen sollten passagiert werden, sobald Zelldichte 1 x 106 Zellen/mL erreicht:
    1. Vorwärmen RPMI 1640 + 10 % FBS in einem 37 ° C-Wasserbad.
    2. 2 x 105 Zellen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch oder ein 15 mL konische Rohr, und Pellet durch Zentrifugieren bei 500 X g bei Raumtemperatur für 5 min zu übertragen.
    3. Entfernen Sie den überstand zu, ohne die Zelle Pellet zu stören und Aufschwemmen Sie das Pellet in 1 mL (1,5 mL Microcentrifuge Schlauch) oder 5 mL (15 mL konische Rohr) von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
    4. Zentrifuge das Rohr auf 500 X g bei Raumtemperatur für 5 min. Entfernen der PBS ohne zu stören die Zelle Pellet.
    5. Aufschwemmen Pellet in 1 mL frisches RPMI 1640 + 10 % FBS.
    6. In einen neuen T25 Kolben Platz 4 mL erwärmten Medien, und dazu die resuspendierte Zellen hinzufügen von 1.2.5. Kultur in einem 37 ° C + 5 % CO2 Inkubator, bis die Zellen benötigen passagierung (in der Regel 3 Tage) oder Zellen für ein Experiment benötigt werden.
  3. Entfernen Sie für ein Experiment mit THP-1-derived Makrophagen die erforderliche Anzahl von Zellen aus der Kanne und Teller vor passagierung:
    1. Legen Sie die erforderliche Anzahl von 18 mm Runde Glasdeckgläser (#1.5 Dicke) in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte – in der Regel 1 Deckglas pro Zustand und/oder Timepoint. In jedem gut aliquoten 5 x 104 THP-1 Monozyten. Die Anzahl der Zellen hinzugefügt zu jedem Bohrloch verändert werden kann, falls erforderlich.
    2. Bringen Sie das Gesamtvolumen der einzelnen Zelle-haltigen gut zu 1 mL mit RPMI + 10 % FBS auf 37 ° c erwärmt
    3. Geben Sie 100 nM Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) in jeder Kunst und Kultur für 3 Tage, Differenzierung der THP-1 Monozyten zu Makrophagen-wie Zellen induzieren.

(2) Kultur und Vorbereitung der J774.2 Makrophagen-Zelllinie

  1. Kultur J774.2 Zellen in T25 Fläschchen bei 37 ° C + 5 % CO2. Zellen sollten in 5 mL Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) + 10 % gewachsen FBS und passagiert sobald die Kultur 80-90 % Konfluenz erreicht. Durchgang-Zellen:
    1. Entfernen Sie alle Medien aus der Flasche und einmal mit 5 mL PBS.
    2. PBS aus der Flasche zu entfernen und ersetzen Sie mit 5 mL frischem DMEM + 10 % FBS.
    3. Mit einem Zelle Schaber, kratzen Sie die Unterseite des Kolbens, die Zellen in den Medien auszusetzen. Kräftig die Zellen pipette mehrmals Zelle Aggregate aufzubrechen.
    4. Verdünnen Sie Zellen 1:5, 4 mL Zellsuspension aus der Flasche entfernen und ersetzen es mit 4 mL frische Medien. Die restlichen Zellsuspension kann verworfen, verwendet, um eine neue Zellkultur in einem frischen T25 Kolben zu starten oder für ein Experiment verwendet.
  2. Für einen Efferocytosis-Test unter Verwendung von J774.2 Zellen eingerichtet:
    1. Suspendieren Sie einen Tag vor Beginn des Experiments, J774.2 Zellen in 5 mL frische Medien gemäß Schritte 2.1.1–2.1.3. Zählen von Zellen mit einem Hemocytometer und bereiten Sie das benötigte Volumen von Zellen in einer Konzentration von 5 x 104 Zellen/mL.
    2. Legen Sie die erforderliche Anzahl von 18 mm Runde Glasdeckgläser (#1.5 Dicke) in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte. In jedem gut aliquoten 1 mL 5 x 104 Zellen/mL Zellsuspension.
    3. Kultur über Nacht in die Zellen zur Einhaltung der Deckglas und erholen sich von passagierung ermöglichen.

3. Kultur der primären menschlichen M2-Makrophagen

  1. Sammeln Sie 10 mL heparinisierten Menschenblut für jeden 12-Well-Platte von M2-Makrophagen erforderlich.
  2. In einem 15 mL Zentrifugenröhrchen Schicht 5 mL des menschlichen Blutes auf 5 mL vorgewärmten Lympholyte-Poly Zelle Trennmedium. Bereiten Sie mehrere Röhren, wenn Verarbeitung > 5 mL Blut, anstatt größere Volumen Rohre zu verwenden.
  3. Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 35 min, mit mittlerer Beschleunigung und keine Pause.
  4. Entfernen Sie vorsichtig die obere mononukleären Zellen reiche Band mit einem Kunststoff-Pipette und Transfer in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen. Wenn mehrere Röhren in Schritt 3.2 erstellt wurden, können die Bänder in einem einzigen 50 mL-Tube gebündelt. Volumen des Schlauches zu bringen bis zu 50 mL mit PBS.
  5. 300 X g für 8 min zentrifugieren und den überstand zu entfernen. Legen Sie bei diesem Schritt autoklaviert 18 mm Durchmesser kreisförmige Deckgläsern (#1.5 Dicke) in jede Vertiefung eine 12-Well-Platte.
  6. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 300 µL serumfreien RPMI 1640 pro gewünschten Anzahl von Brunnen; z. B. wenn 10 mL Blut verarbeitet wurde, um eine vollständige 12-well-Platte vorzubereiten auszusetzen Zelle Pellet in 3,6 mL Medien.
  7. Fügen Sie hinzu, dass 300 µL Zellsuspension Deckglas-jeweils auch in der 12-Well-Platte. Inkubation für 1 h bei 37 ° C + 5 % CO2.
  8. Vorsichtig waschen Deckglas 3 X mit 1 mL erwärmten PBS, nicht-anhaftende Zellen zu entfernen.
  9. Fügen Sie 1 mL RPMI 1640 + 10 % FBS + 10 ng/mL rekombinanten menschlichen M-CSF + Zelle Kultur Antibiotikum/antimykotikums. 5 Tage bei 37 ° C + 5 % CO2 inkubieren.
  10. Ersetzen Sie Medien mit RPMI 1640 + 10 % FBS + 10 ng/mL rekombinanten menschlichen M-CSF + 10 ng/mL rekombinanten menschlichen IL-4 + Zelle Kultur Antibiotikum/antimykotikums. Inkubation bei 37 ° C + 5 % CO2 für 2 Tage M2 Polarisation.
  11. Polarisierte Makrophagen sollte innerhalb der nächsten 3 Tage verwendet werden.

4. Vorbereitung der Apoptotic Jurkat-Zellen

  1. Kultur Jurkat Zellen in 5 mL RPMI 1640 + 10 % FBS bei 37 ° C + 5 % CO2. Jurkats sind eine Aussetzung-Zell-Linie und durch passagierung 1:5 in frischen, vorgewärmten Medien alle 3 – 5 Tage beibehalten werden kann.
  2. Zur Vorbereitung der Apoptotic Zellen ermöglichen Sie Jurkat-Kultur zu hoher Dichte (4 – 5 Tage nach passagierung) wachsen. Aliquoten 1,5 mL in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 min.
  3. Überstand verwerfen und neu Zelle Pellet in 1 mL serumfreien RPMI 1640-haltigem Medium 1 µM Staurosporine auszusetzen.
  4. Inkubieren Sie 16 h bei 37 ° C + 5 % CO2 Apoptotic Zellen zu rendern.
  5. Falls gewünscht, bestätigen Sie Induktion der Apoptose durch Färbung mit Annexin V:
    1. Aliquoten 100 µL der Staurosporine behandelt Jurkat Zellkultur zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 min, überstand verwerfen und neu Zelle Pellet in 100 µL serumfreien RPMI 1640 Medium aussetzen.
    2. Fügen Sie 1 µL Fluorescein erfolgt (FITC)-konjugiert Annexin V und 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
    3. Fügen Sie 900 µL PBS und übertragen Sie das gesamte Volumen zu einem einzigen Brunnen von einer 12-Well-Platte mit einem 18 mm runden Glas Deckglas (#1.5 Dicke) zu. Spin-down in einer Zentrifuge, ausgestattet mit einem Adapter Platte 200 X g für 1 min, Zellen zu zwingen, das Deckglas einzuhalten. Alternativ können Zellen in einer gekammerten Folie für die Bildgebung platziert werden.
    4. Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop.

(5) Quantifizierung der Efferocytic Aufnahme und Dynamik mit einem festen Zelle Efferocytosis Assay und Inside-Out-Färbung

  1. Bereiten Sie THP-1, J774.2 oder M2 menschliche Makrophagen vor, wie in den Abschnitten 1 bis 3, beschrieben.
  2. Bereiten Sie am Abend vor dem Start des Experiments Apoptotic Jurkat Zellen wie in Abschnitt 4beschrieben.
  3. Unmittelbar vor dem Experiment zählen Sie Apoptotic Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer. Ausreichende Zahl von apoptotischen Zellen zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen – wir fügen in der Regel 5 x 105 Zellen/Brunnen, ein Ziel: Efferocyte Verhältnis 10:1.
  4. Pellet-Jurkat Zellen durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 min und in 500 μl PBS aufzuwirbeln.
  5. Während der Zentrifugation aliquoten 10 µL von DMSO zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Eine minimale Menge von N-Hydroxysuccinimidobiotin (NHS-Biotin) in die DMSO auflösen. 5-10 Kristalle (~0.005 mg) ist ausreichend.
  6. Übertragen Sie die 500 μL apoptotische Zelle/PBS-Aufhängung auf die DMSO/NHS-Biotin mit Rohr. Verdünnen Sie dann eine tracking-Farbstoff, vom Hersteller empfohlenen Konzentration in der Zellsuspension apoptotische Zelle. Stellen Sie sicher, wählen eine Zelle, die tracking-Farbstoff, der nicht Spektral mit FITC-Streptavidin (z. B. rot oder dunkelrote Zelle tracking-Farbstoff) überlappt.
  7. Inkubieren Sie Aufhängung für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Fügen Sie ein gleiches Volumen von RPMI 1640 + 10 % FBS und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln nicht umgesetztes Farbstoff zu stillen.
  8. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 min, überstand verwerfen und erneut aussetzen der gefärbten Apoptotic Zellen in 100 µL RPMI 1640 + 10 % FBS pro Bohrloch von Makrophagen.
  9. Fügen Sie 100 µL Zellsuspension gefärbten Apoptotic tropfenweise in jede Vertiefung von Makrophagen. Zentrifugieren Sie 200 X g für 1 min in einer Zentrifuge mit einer Platte-Adapter ausgestattet, um die Kontaktkraft zwischen Makrophagen und Apoptotic Zellen.
  10. Inkubieren Sie Platte für den gewünschten Zeitraum bei 37 ° C + 5 % CO2 in einer Gewebekultur Inkubator. Für Makrophagen, Efferocytosed Material ist in der Regel zuerst nachweisbar nach 20-30 min und nach 120-180 min abgeschlossen ist.
  11. Zum gewünschten Zeitpunkt entfernen Punkt(e) Zellen aus dem Inkubator. Waschen Sie Zellen zweimal mit 1 mL der Raumtemperatur PBS zu stoppen Efferocytosis und nicht Efferocytosed Apoptotic Zellen zu entfernen.
  12. FITC konjugiert Streptavidin bei einem 1:1,000 Verdünnung in jede Vertiefung hinzufügen und 20 Minuten im Dunkeln inkubieren. Dies wird die exponierten Biotin nicht Efferocytosed Apoptotic Zelle Material beschriften.
    Hinweis: Falls gewünscht, Zellkerne können auch gebeizt während dieses Schrittes durch Zugabe von 1: 20.000 Verdünnung von Hoechst 33342 oder 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI).
  13. Waschen Sie Zellen 3 Mal mit 1 mL PBS, sanft schütteln oder schaukeln die Proben 5 min pro Spülgang. Befestigen Sie Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 20 min bei Raumtemperatur. Spülen Sie Zellen einmal mit PBS, überschüssige PFA zu entfernen.
  14. Mount Deckgläsern auf einer Folie für Bildgebung und Transfer zu einem Fluoreszenzmikroskop. Z-Stapel eine ausreichende Anzahl von Zellen für die genaue Quantifizierung zu erfassen – in der Regel 10-30 Zellen pro Zustand. Nicht verinnerlicht Apoptotic Zellmaterial wird als Zelle tracking Farbstoff mit der Bezeichnung Material umhüllt von FITC-Streptavidin Färbung, während Efferocytosed Material diskrete Zelle tracking Dye Puncta frei von jeder Streptavidin bildet in das resultierende Bild ersichtlich sein Färbung.
  15. Efferocytosis in die entstandenen Bilder über eine Vielzahl von Maßnahmen zu quantifizieren:
    1. Berechnen Sie den Efferocytic Index pro Makrophagen durch Bestimmung der durchschnittlichen Anzahl der diskreten Efferosomes (Zelle tracking Dye+/streptavidin Puncta). Nur die Makrophagen an eine apoptotische Zelle gebunden sind oder diese enthalten ≥1 sichtbaren Efferosomes zu quantifizieren. Rekord Makrophagen gebunden, eine apoptotische Zelle, aber fehlende diskreten Efferosomes, als mit einem Efferocytic-Index von 0.
    2. Berechnen Sie Efferocytic Effizienz durch die Messung der Bruchteil von Makrophagen, die ≥1 Efferosome enthalten.
    3. Berechnen Sie die Rate des Efferocytosis durch bildgebende Zellen fixiert und gefärbt zu mehreren Zeitpunkten. Nur Bild Makrophagen an apoptotischen Zellen gebunden, oder mit sichtbaren Efferosomes mit Z-Stapel der einzelnen Zellen erfasst. Sobald ein Image erstellt, bestimmen Sie die Rate der Efferocytosis:
      1. Verwenden die Streptavidin Färbung, wie eine Anleitung und das Freihand oder Polygon-Auswahl-Werkzeug in Fidschi/ImageJ26 (oder andere Bild-Analyse-Software-Paket), aller der Zelle tracking Dye+/streptavidin (z.B. verinnerlicht) Kreis Material in einer Ebene im Z-Stapel. Messen Sie der integrierte Intensität der Verfolgung Farbstoff Zelle dieser Region. Einzelmaßnahmen für jede Efferosome (z. B. Durchmesser, Positionierung im Vergleich zu der Zellenrahmen oder Kern usw.)15,27 können leicht gleichzeitig mit diesen Messungen stark erworben werden Erhöhung der Daten während der Analyse gesammelt.
      2. Auf dem gleichen Z-Abschnitt, mit der Färbung als Richtschnur und dem Auswahl-Werkzeug Freihand oder Polygon Streptavidin Kreise alle tracking Dye+/streptavidin+ (z.B. nicht verinnerlicht) Zelle Material in einer Ebene des Stapels Z . Schließen Sie nur die Färbung von apoptotischen Zellen in Kontakt mit der Phagozyten. Messen Sie die integrierte Intensität dieser Region.
      3. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.3.1 zu 4.2.3.2 für die restlichen Z-Abschnitte des Bildes. Addieren Sie die integrierte Intensität der Efferocytosed (ΣEff) und nicht-Efferocytosed (ΣNe) Materialien. Der Anteil der apoptotischen Zelle Efferocytosed wurde kann für die Zelle als berechnet werden:
        Equation
      4. Die Bruch-Efferocytosed für alle Zellen zu allen Zeitpunkten zu quantifizieren. Beachten Sie, dass die fluoreszente Intensität der Apoptotic Zellen/Efferosomes zwischen den Bildern aufgrund von Schwankungen bei der Aufnahme der Zelle tracking Farbstoffe durch individuelle Apoptotic Zellen und aufgrund von Veränderungen im Bild Aufnahmeparameter wie Belichtungszeit variieren kann. Als solche nur vergleichen normalisierte Werte wie Bruchteil Efferocytosed oder Intensität-unabhängige Werte wie Efferocytic Index und Efferocytic Effizienz, zwischen Bildern, zwischen experimentellen Bedingungen und zwischen wiederholen Experimente.
    4. Um sicherzustellen, dass die daraus resultierende Datensatz entspricht genau die Variation in Efferocytosis zwischen den Zellen, Analysen Sie diese auf die maximale Anzahl der Zellen in jedem Experiment möglich.
      Hinweis: Efferocytic Effizienz und Efferocytic Index schnell errechnet werden (ein paar Sekunden/Zelle) und in der Regel wollen wir mindestens 100 Zellen pro Versuch, analysieren jedes Experiment mindestens 3 Mal wiederholen. Berechnung den Anteil der Efferocytosed Material und Efferosome-spezifische Maßnahmen sind aufwendiger, in der Regel unter 2 – 3 min./Zelle "" für einen erfahrenen Analytiker. Für diese Berechnungen beziffern wir mindestens 15 Zellen pro Zustand, pro Versuch.
    5. Rekord Efferocytic Index, Bruchteil Efferocytosed und individuellen Efferosome Daten auf einer Basis pro Zelle.
      Hinweis: Dies ermöglicht Datenanalyse mit einzelligen Ansätzen, so dass Inter Zelle Variationen quantifiziert werden. Populationsebene Analysen können noch auf diese Datensätze durch Mittelung einzellige Daten in einzelnen Experimente durchgeführt werden. Efferosome-spezifische Messungen analysiert werden können, an die Bevölkerung, einzellige Stufe, sowie Ensembles (z.B. als Populationen von Efferosomes unabhängig von den Zellen, die sie enthalten)15.

6. Leben Sie Zelle Efferocytosis Assay mit Apoptotic Zellen

  1. Bereiten Sie THP-1, J774.2 oder M2-Makrophagen, wie in den Schritten 1-3, beschrieben. Bei Bedarf sollten die Zellen mit Transgene transfiziert werden oder anderen genetischen Konstrukte mindestens 18 Stunden vor der Durchführung keine Experimente.
  2. Bereiten Sie am Abend vor dem Start des Experiments, Apoptotic Jurkat Zellen wie beschrieben in den Abschnitten 4 und 5 mit folgenden Änderungen:
    1. Verdünnen Sie Zellen zu und induzieren Sie Apoptose gemäß 4.1-4.3, und sammeln Sie die erforderliche Anzahl von apoptotischen Zellen gemäß 5.3 – 5,4.
    2. Hinzufügen einer Zelle tracking Farbstoff bei dem Hersteller empfohlenen Konzentration an die Apoptotic Zellsuspension. Inkubieren Sie Aufhängung für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Fügen Sie ein gleiches Volumen von RPMI 1640 + 10 % FBS und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln nicht umgesetztes Farbstoff zu stillen. Fügen Sie keine NHS-Biotin für diese Experimente.
    3. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 min, überstand verwerfen und erneut aussetzen gefärbten Apoptotic Zellen in 100 µL RPMI 1640 + 10 % FBS pro Bohrloch von Makrophagen.
  3. Bei Bedarf hinzugefügt Label, die Makrophagen Nährmedien aus jedem Bohrloch entfernen und Hinzufügen von 500 µL PBS mit den Herstellern empfohlenen Verdünnung einer Zelle tracking-Farbstoff, der mit der Zelle tracking-Farbstoff nicht Spektral überlappt an der Apoptotic Zellen oder fluoreszierende transgene ausgedrückt durch die Makrophagen. 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, dann fügen Sie ein gleiches Volumen DMEM + 10 % FBS und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln nicht umgesetztes Farbstoff zu stillen.
  4. Übertragen Sie die Makrophagen-haltigen Deckglas zu einer Kammer, Leiden. Fügen Sie 400 µL DMEM + 10 % FBS, gefolgt von 100 µL der beschrifteten Apoptotic Zellsuspension. Mischen Sie, indem Sie sanft pipettieren Medien 2 – 3 Mal.
  5. Übertragen die Leiden-Kammer auf eine beheizte und CO2-PERFUNDIERTEN Kammer eines live Zelle fluoreszierende Mikroskops.
    Hinweis: Für Mikroskop-Setups, die CO2 Perfusion Fähigkeiten fehlen, verwenden Gewebe Nährmedium gepuffert mit 1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES) anstatt Natriumbicarbonat zu physiologischen pH-Wert während der Kultur ist Luft ausgesetzt.
  6. Ein Time-Lapse-Serie enthält ein weißes Licht (Phasenkontrast oder DIC) Bild und Bilder von allen Fluoreszenzmarkierungen zu erfassen:
    1. Verwenden Sie ein 100 X Objektiv für Experimente, wo feine Details zu lösen ist (z.B. Membran Dynamik der Phagozyten-apoptotische Zelle Interaktionen) erforderlich. Unterdessen mehr allgemeine Maßnahmen (Rate der apoptotischen Zelle Aufnahme, Interaktion abwechselnd in Makrophagen und Apoptotic Zellen, etc.) werden am besten mit einem 60 X oder 63 X Objektiv abgebildet.
    2. Falls vorhanden, verwenden Sie Punkt-Besuch während einer einzigen Akquisition, wodurch sich die Anzahl der Efferocytic Ereignisse erfasst in einem einzigen Experiment mehrere Felder-of-View Image
    3. Da Efferocytes oft kleine Fragmente der Apoptotic Zellen, sondern als intakte Zellen verschlingen, empfiehlt es sich, Z-Stapel zu erfassen. Zur Minimierung von Phototoxizität Z-Profile durch die Fokustiefe Ihre Mikroskope Ziel getrennt zu erfassen (in der Regel 0,5-1,0 µm), durch die Dicke der Zelle (in der Regel 8 bis 10 µm für Makrophagen, z. B. 8 – 20 Scheiben/Zelle). Dies stellt sicher, dass alle Engulfment und Menschenhandel Veranstaltungen in mindestens einer Z-Ebene sichtbar ist. Alternativ verwenden Sie große (1 – 5 µm Durchmesser) apoptotische Zelle Mimik oder Apoptotic Zellen, die minimale Fragmentierung während Efferocytosis zu unterziehen (z. B. Wärme schockiert neutrophile) stattdessen ohne Z-stapeln. Wir haben die Vorbereitung der Mimik und Apoptotic Neutrophils beschrieben bisher28.
    4. Immunofluoreszenz zu minimieren, verwenden Sie helle Fluorophore und Capture Bilder mit Übernahme-Einstellungen, die Immunofluoreszenz minimieren – z. B. geringer Intensität Anregung kombiniert mit hohen Kameraverstärkung und kurze Belichtungszeiten Mal29. Wir empfehlen dringend, unter Verwendung eines Mikroskops, ausgestattet mit einer hochempfindlichen elektromagnetische – Coupled Ladegerät (EM-CCD) Kamera oder Spinning-Disk konfokale und ein High-Speed-piezoelektrische Kreuztisch für diese Form der Bildgebung.
  7. Die Anzahl der möglichen Analysemethoden, die diesen Time-Lapse Videos angewendet werden können, ist umfangreich und über unsere Fähigkeit, hier zu überprüfen. Als einige Beispiele verwenden Sie manuelle oder automatisierte tracking-Software verfolgen die Fusion, Spaltung und Bewegung des Efferosomes innerhalb von Zellen15, Efferosome Fusion Dynamik mit Endolysosomes durch ns1 Analyse in Makrophagen, die mit dem Ausdruck zu quantifizieren Fach-spezifischen fluoreszierenden transgene13, Monitor Aufnahme Prozesse wie Sondierung und WM Formation30, bestimmen die Rekrutierung Dynamik der Signal- und Proteine, die Efferosome13, Menschenhandel und/oder quantifizieren Sie die abbauende Aktivität des Efferosomes mit Apoptotic Zellen mit pH-Sensitive, Oxidationsmittel-Sensitive oder Protease-aktivierten Fluorophore31beschriftet.

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Representative Results

Über Nacht Kultur Jurkat Zellen mit 1 µM Staurosporine Ergebnisse bei der Apoptose von > 95 % der Zellen, die mit Annexin V Färbung (Abbildung 1) bestätigt werden kann. Andere Zelltypen können für diese Experimente verwendet werden, obwohl die Konzentration der Staurosporine und die Dauer der Staurosporine Behandlung für jede Zelllinie optimiert werden müssen. Für die zuverlässige Erkennung und Quantifizierung von Efferocytosis > 80 % der Zellen sollte Apoptotic vor Aufnahme in die Efferocytes. Anderen Induktoren der Apoptose (z.B. Hitzeschock, Etoposid und UV-Licht) können auch verwendet werden, aber nach unserer Erfahrung erzeugen diese eine heterogenere Induktion der Apoptose und daraus resultierenden gemischte Zell-Populationen mit Apoptotic, nekrotischen sekundäre und -apoptotische Zellen.

Für feste Zelle Bildgebung mit Inside-Out-Färbung, eng adaptiert Efferocyte-apoptotische Zelle Interaktionen beachtet werden, zu allen Zeitpunkten, mit klar abgegrenzten nicht-Efferocytosed (Streptavidin+/cell tracking Dye+) und Efferocytosed (Streptavidin/cell tracking-+) Materialien sichtbar (Abbildung 2). Es ist wichtig zu beachten, dass die Synapse, die zwischen der Efferocyte und der apoptotischen Zelle bildet häufig dicht genug, um Streptavidin ausschließen, und somit jede Zelle tracking Farbstoff gefärbt mit Streptavidin an jeder Stelle seines Umfangs Objekt betrachtet werden ein gebunden Sie Zelle und kein Efferosome. In die meisten Experimente wird der Bruchteil der Apoptotic Zellen, die Efferocytosed sind in einer zeitabhängigen Mode erhöhen, bis keine nicht verinnerlicht apoptotische Zelle Materialien bleiben oder bis die Phagozyten erreicht seine maximale Efferocytic-Kapazität (Abbildung 3). Analyse ist in der Regel durchgeführt und aufgezeichnet für einzelne Zellen (Abbildung 3A), jedoch können Daten über Zellen innerhalb der einzelnen Experimente und die Mittelwerte aus mehreren experimentellen Wiederholungen mit konventionellen analysiert gemittelt werden statistische Ansätze (Abb. 3 b). Änderungen dieses standardisierten Protokolls können vorgenommen werden, erlauben für primäre Zelltypen, alternative Efferocytic Ziele und zusätzliche Färbung einbezogen werden. Abbildung 4 zeigt beispielsweise eine primäre M2-polarisierten menschliche Makrophagen, die Efferocytosed Apoptotic Zelle ahmt umfasste 3 µm Durchmesser Kieselsäure Perlen beschichtet in einem Gemisch von Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin28, gefolgt von anschließende Fixierung, Permeabilisierung und Immunostaining für das recycling Endosom Marker Rab17.

Während live Cell imaging Efferocytic professionelle Phagozyten beobachtet werden zum aus- und einfahren kleine Prozesse in einem Prozess bezeichnet "sondieren"30 (Abbildung 5, t = 0); Wenn diese Prozesse ein Ziel begegnen sie fest auf das Ziel halten und ziehen es auf die Phagozyten. Diese bohrende Tätigkeit kann nicht mit nicht-professionelle Phagozyten wie Epithelzellen beobachtet werden. Die Efferocyte bilden dann eine enge "Synapse Efferocytic"32 zwischen sich und der apoptotischen Zelle, mit dieser Synapse oft einen großen Teil der apoptotischen Zelle umhüllt (Abbildung 5, t = 10). Die Efferocyte zieht dann Stücke der apoptotischen Zelle von dieser Synapse in der Zellflüssigkeit (Abbildung 5, 10-30 min). Bald nach ihrer Entstehung sind diese im Entstehen begriffene Efferosomes Weg von der Synapse und auf die Peri-nuklearen Bereich, ein Ergebnis von Rab7/RILP/dynien-Dynactin vermittelte Transport33verschleppt. Im Laufe der Zeit wird der Efferosomes verkleinert und die daraus resultierende degradierten Materialien verteilt in die Zelle, wo sie wahrscheinlich sind absorbiert oder Recycling-13,15. Die Möglichkeit, diese Prozesse zu erkennen ist stark abhängig von der Akquisition Framerate und Dauer des Experiments. Schnelle Prozesse wie sondieren können nicht bei niedrigeren Frameraten, beobachtet werden, während langsame Ereignisse (Handel mit Efferosome und Absorption) längere bildgebenden erfordern – in beiden Fällen diese großes Bild übernahmen oft erfordern die Erfassung von niedriger Intensität Bilder Immunofluoreszenz und Phototoxizität (Abbildung 5) zu begrenzen. Wie fest-Zelle-Assay kann die live-Cell-Version des Assays geändert werden um die Bedürfnisse des Prüfers. Abbildung 6 zeigt einen einzelnen Frame einer live Zelle Akquisition von J774.2 Makrophagen transgene eindringmittel demarkieren die Plasmamembran (PM-GFP) und die bindet selektiv die Signalisierung Lipid PI (3) P (FYVE-RFP) zum Ausdruck zu bringen. Generation von PI (3p) auf der Efferosome-Membran kann als Co Lokalisation der FYVE-RFP mit der PM-GFP+ Efferosome Membran erkannt werden. Durch die Intensität der FYVE-RFP auf die Efferosome zu quantifizieren, die Dynamik von PI (3) P-Signalisierung auf dem Efferosome quantifiziert werden kann (Abbildung 6).

Figure 1
Abbildung 1: Annexin V Färbung des apoptotischen und Apoptotic-Jurkat Zellen. Annexin V kennzeichnet die Phosphatidylserin "Essen-mich" Signal von apoptotischen Zellen ausgesetzt. (Oben) Unbehandelte (UT) Jurkat Zellen zeigen eine gesunde (glatte und abgerundete) Morphologie (DIC) und keine Flecken, mit Annexin V. (unten) Jurkat Zellen kultiviert über Nacht mit 1 µM Staurosporine (STS) auf eine apoptotische Morphologie (unregelmäßig und Blebbed) nehmen und mit Flecken Annexin V. Maßstabsleiste = 10 µm Bildintensität erscheint als eine Farbkarte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: frühe und späte Engulfment der Apoptotic Jurkat Zellen durch Makrophagen J774.2. Bilder sind von Makrophagen an einem frühen (60 min) und späten (120 min) Stadium der Efferocytosis. Weißlicht-(DIC) Bild veranschaulicht die enge Schnittstelle zwischen Makrophagen (Mφ) und apoptotische Zelle (AC). Handy-tracking-Farbstoff (rote CTD) zeigt die Lage aller apoptotische Zelle abgeleitet Materialien. FITC-Streptavidin Färbung (Str, grüne) identifiziert den Teil der apoptotischen Zelle, die noch nicht von den Makrophagen verschlungen worden. Makrophagen Kerne wurden vorher gebeizt mit DAPI (blau). Efferosomes (rot) im Vergleich zu den nicht verinnerlicht Teil der apoptotischen Zelle (grün/gelb) sind ohne weiteres in eine Überlagerung der Streptavidin und Zelle tracking Farbstoff Bilder bestimmt. Beachten Sie das Fehlen von Streptavidin Färbung an der Makrophagen-apoptotische Zelle Schnittstelle an die frühen Timepoint, erstellt durch den Ausschluss von Streptavidin aus der Synapse fest gegründeten Efferocytic (*). Die Makrophagen-Kern wird durch Hoechst Färbung (blau) identifiziert. Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: zeitlicher Verlauf des Bruches der Apoptotic Zellen Efferocytosed durch J774.2 Makrophagen. Efferocytosis Tests wurden durchgeführt für die angegebenen Zeiten und der Anteil der verschlungen Apoptotic Zellmaterial auf jeden Zeitpunkt mit Handy tracking-Farbstoff/Streptavadin Färbung bestimmt. (A) Anteil der Efferocytosed Materialien innerhalb einzelner Makrophagen, Daten aus einzelnen Zellen präsentiert wird, horizontale Balken zeigt den Mittelwert. 12 – 17 Zellen pro Zustand, Daten aus 1 von 5 unabhängigen Experimenten. (B) Anteil der Efferocytosed Materialien, gemittelt über 5 unabhängige Experimente, mindestens 10 Zellen/Zustand/wiederholen. p < 0,05 im Vergleich zu 30 min, Kruskal-Wallis-Test mit Dunn-Korrektur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Analyse der Rab17 Rekrutierung, Efferosomes in primären menschlichen Makrophagen. Ein M2-polarisierten Makrophagen verschlungen apoptotische Zelle Mimik (Pfeile) und war Immunostained für Rab17 (grün) 60 min nach Engulfment. Maßstabsleiste = 5 µm. Zellkern wird gefärbt, mit Hoeschst, DIC-Bild zeigt Zellmorphologie und dient zur Identifizierung der apoptotischen Zelle imitiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Live Zelle Efferocytosis Assay. Eine Zelle tracking Dye labeledJ774.2 Makrophagen (Mφ, grüne) aufgenommen wurde, da es eine apoptotische Jurkat Zellen beschriftet mit einer anderen Farbe Zelle tracking Farbstoff (AC, rot) verschlungen. Die Apoptotic Zelle gliedert sich in mehrere Fragmente bei der Internalisierung, was schrittweise Aufnahme und Bildung von mehreren Efferosomes (Pfeile). Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Verwendung von fluoreszierenden transgene Efferocytic Signalisierung untersuchen. Ein J774.2 Makrophagen war mit einem GLP-Tags Plasmamembran Marker (PM, grün) transfiziert und FYVE-RFP Konstrukt, das bindet die Signalisierung Lipid PI (3) P (rot). Efferocytosis bildet eine im Entstehen begriffene Plasmamembran abgeleitet Efferosome, die PI (3) P, enthält, wie von FYVE-RFP Rekrutierung (Pfeil) erkannt. Die Dynamik von PI (3) P-Signalisierung wurde quantifiziert, wie Intensität im Vergleich zu den FYVE-RFP-Signal vorhanden zum Zeitpunkt der Schließung der Efferosome Falten (t = 0, Grafik). Dieses Experiment verwendet eine apoptotische Zelle imitiert Wulst (Pfeil, DIC) anstatt Apoptotic Zellen. Maßstabsleiste = 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden ermöglichen die Bildgebung und Quantifizierung des dynamischen Efferocytic-Prozesses mit fest-Zelle und live-Cell Ansätzen. Diese Ansätze bieten mehrere Vorteile gegenüber den verwendeten Flow Cytometry-basierte Methoden23,24. Die Verwendung der Inside-Out-Färbung mit festen Proben bietet eine robuste und präzise Quantifizierung der Rate und das Ausmaß der Efferocytosis — in der Tat viele Flow Cytometry-basierte Methoden einfach beschriften Apoptotic Zellen und Makrophagen mit verschiedenen Fluorophore und Partitur Efferocytosis als Bruchteil der Makrophagen Co Färbung mit der apoptotischen Zelle Marker, somit fehlt die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen gebunden versus verinnerlichten Apoptotic Zellmaterial. Alternative Flow Cytometry Ansätze umfassen die Verwendung von pHrodo mit der Bezeichnung Apoptotic Zellen24. pHrodo ist ein pH-Sensitive Fluorophore, die in der Helligkeit bei sauren pH-Wert erhöht. Während dieser Fluorophor besseren Auflösung zwischen liefert nicht verinnerlicht versus verinnerlichten Materialien mit zunehmender Fluoreszenz speziell nach Internalisierung der apoptotischen Zelle und Übersäuerung des Efferosome, können die Folgen sein. verwirrte durch Krankheitsprozesse Efferosome Versauerung34,35beeinträchtigen und diese Methode wird in der Anfangsphase (Pre-Versauerung) von Efferocytosis36, in Versauerung-armen Regionen der Efferosomes verpassen die Zelle27, oder in Zellen, die schwach ihre Lysosomen37Ansäuern. Ein zweiter Vorteil der in diesem Protokoll beschriebenen Methode ist die Verwendung von live-Cell imaging um die Dynamik der Efferocytosis, als Prozesse wie sondieren, die Bildung der Efferocytic Synapse, Messen und lässt sich nicht der intrazellulären Handel mit efferosomes mit Flow Cytometry-basierte Ansätze nachgewiesen.

Während diese Methode viele Vorteile bietet, Experimente, erfordern die Quantifizierung von vielen hundert Zellen — z.B. Experimente erkennen seltene Ereignisse oder Quantifizierung hochvariablen Prozesse – kann schwierig sein, mit der Analyse dieser großen Datasets übermäßige viel Zeit nehmen. Hochdurchsatz-imaging Ansätze wie imaging Flow Cytometry38 für höheren Durchsatz als konventionellen Mikroskopie, können in unserer Erfahrung aktuelle automatisierte Bild Analyseprogramme sind zwar nicht immer in der Lage, präzise Segmentierung nicht verinnerlicht-versus verinnerlichten Materialien. Insbesondere die enge Efferocytic Synapse bildet zwischen der Apoptotic Zellen und Efferocyte kann ausschließen Streptavidin Färbung, und als solche eine gebundene apoptotische Zelle erscheint oft als eine feste Masse in der Zelle Farbstoff Kanal, tracking, die teilweise von umhüllt ist Streptavidin Färbung (Abbildung 2). Während Efferosomes leicht algorithmisch erkannt werden, ist der gebundene Teil der apoptotischen Zelle so oft als ein Efferosome wegen der Schwierigkeit der Bilanzierung von teilweise Streptavidin Färbung misidentified. Während wir noch um ein Programm, die genau identifizieren und quantifizieren die schrittweise Aufnahme von apoptotischen Zellen ohne menschliche Hilfe, fanden wir, dass dieser trainierbar teilautomatisierten Systeme39 Analyse erheblich beschleunigen können Bruchteil reduzieren Efferocytosed Messungen von 2 – 3 min. zu < 60 s pro Zelle. Alternativ, unverdauliche apoptotische Zelle imitiert oder Zelltypen, die minimal bei der Apoptose, fragmentieren kann stattdessen verwendet werden. Dies vereinfacht die Erkennung zum einzigen, größeren Strukturen, die möglicherweise besser geeignet, um automatisierte Ansätze und überflüssig für Z-stapeln. Sogar mit diesen Fortschritten die Erfassung und Analyse dieser Methode bleibt begrenzende, und als solche Durchflusszytometrie bleibt die praktikabelste Methode bei Analysen von großen Zellzahlen erforderlich23.

Obwohl wir diese Methode mit Zell-Linie und primären menschlichen Makrophagen als Efferocytes und Apoptotic Jurkat Zellen (eine T-Zell-Linie) als Ziele beschrieben haben, kann diese Methode auf alle Efferocytic Zelle Typ oder Apoptotic Zelle angewendet werden. In der Tat wurden ähnliche Ansätze zur Efferocytosis in Hepatozyten und Epithelzellen9,40,41, und die Efferocytosis von klinisch relevanten Ziele wie Tumor Zellen42zu untersuchen. Es möglicherweise erforderlich, dieses Protokoll bei nicht-immunen Efferocytes oder bei der Modellierung von spezifischen Efferocytic Veranstaltungen zu ändern. Zum Beispiel Jurkat-Zellen sind nicht-Anhänger und sind daher voraussichtlich nicht vollständig rekapitulieren die mechanischen Kräfte und räumliche Begrenzung Efferocytes stoßen bei der Interaktion mit anhaftenden Apoptotic Zellen oder Apoptotic Zellen in festen Geweben. Viele Zelltypen behalten Haftung während der Apoptose und können daher als anhaftende Ziele verwendet werden; als ein Beispiel unterziehen HeLa-Zellen über einen Zeitraum von 4 – 6 h unter Beibehaltung der Adhäsion der Zellkörper43reproduzierbar Staurosporine-induzierte Apoptose, kriechen, Phosphatidylserin und Blebbing. Ausgesetzt in einer Kollagenmatrix oder Stammzell-derived Organellen44 Zellen möglicherweise mögliche Modelle für das Studium Efferocytosis in festen Geweben, obwohl wir keine Studien nicht bewusst sind, die diese Ansätze verwendet haben. Für einige Modelle Immunzellen wie Jurkat-Zellen und Neutrophilen sollte nicht als apoptotische Ziele verwendet werden, da diese Zellen Zytokin-basierten freisetzen können "finde-mich" Signale, wie z.B. CX3CL1, die eine verwirrende Faktor in Modellen bei entzündlichen oder wandernde möglicherweise Prozesse sind untersuchten45. So, während die Vielseitigkeit des Assays dafür verwendet werden, um Efferocytosis in einer Reihe von Zelltypen und Modellsysteme erkunden kann, muss darauf geachtet werden, geeignete Efferocytes, Zielzellen und Kulturbedingungen zu den physiologischen beste Modell auswählen verarbeiten Sie untersucht.

In diesem Protokoll beschriebenen Analysemethoden sollen nur als Ausgangspunkt, mit der Imaging-basierte Natur dieser Experimente ermöglichen ein breites Spektrum von Analysen. Z. B. Efferosome Positionierung und Durchmesser Messungen gesammelt beim Bruch Efferocytosed Messungen durchführen oder in live-Zelle gemessen werden können Zeit-Kurse, um Prozesse wie den intrazellulären Menschenhandel zu untersuchen Efferosomes und die Rate der apoptotischen Zelle Abbau13,15. Immunostaining (Abbildung 4) kann verwendet werden, um der Rekrutierung von Proteinen, Efferosomes, während live Cell Imaging kombiniert mit morphologischen Analysen verwendet werden kann, um Prozesse zu quantifizieren zu untersuchen, diese Bindung Wirksamkeit und Preise von Engulfment30 , 46. führen wir häufig diese Assays in Makrophagen, die mit dem Ausdruck fluoreszierende transgene, die Berichten, Signalisierung Molekül Aktivierung oder die Aktivität der zelluläre Ereignisse während der Efferocytosis (Abbildung 6). Diese Reporter ermöglichen die Überwachung der Prozesse während der Efferocytosis-Signal; zum Beispiel haben wir eindringmittel getaggt Rab GTPases verwendet, um die Rolle von Rab5, Rab7 und Rab17 zu erkunden, bei der Vermittlung Efferosome Verarbeitung und anschließende Menschenhandel apoptotische Zelle abgeleitet Antigene13,15. Ebenso kann die Einbeziehung von Reportern der Zelltod, Efferosome pH, reaktiven Sauerstoff-Spezies-Produktion und andere zelluläre Prozesse ins Leben Zellexperimente verwendet werden, um die Prozesse, die den Abbau von Efferosomes31 Vermittlung untersuchen ,47. Eine gemeinsame Herausforderung in diesen Experimenten ist mit kompatibel Fluorophore transgene oder Reporter identifizieren; oft werden wir die Zelle tracking Farbstoff bzw. Streptavidin auf freie Kanäle für andere Fluorophore imaging beseitigen. Für einige Versuche ist es vorteilhaft, die Apoptotic Zelle durch eine nicht fragmentieren Imitation zu ersetzen. Dies ermöglicht eine Quantifizierung der Signalisierung Dynamik und zelluläre Prozesse ohne die Komplexität des Trackings, die mehrere Efferosomes aus einer einzigen apoptotische Zelle abgeleitet. Evans Et Al. finden Sie Anweisungen zur Vorbereitung apoptotische Zelle28imitiert.

Die häufigsten Schwierigkeiten bei der Gestaltung dieser Experimente ist eine Kombination aus Fluorophore finden, mit denen die gewünschten Prozesse abgebildet werden, bei gleichzeitiger Minimierung der Immunofluoreszenz und Phototoxizität29. Fluorophor Auswahl richtet sich weitgehend nach den Laser/Erregung filtern, Dichroics/Würfel und Emission Filter des Mikroskops, und damit die Wahl des Fluorophore ist oft spezifisch für einzelne Mikroskope. In der Regel längere Wellenlänge Fluorophore (orange bis dunkelrote, z.B. Emission Maxima > 580 nm) sind weniger anfällig für Immunofluoreszenz und diese Wellenlängen sind weniger störend auf Zellen. Grüne Fluorophore (Emission Maxima ~ 525 nm) kann verwendet werden, aber Sorgfalt muss angewendet werden, Phototoxizität zu den Zellen zu begrenzen. Fluorophore, die begeistern bei Wellenlängen weniger als 480 nm (violett und blau) sollte vermieden werden, aufgrund ihrer hohen Phototoxizität und Neigung für diese Erregung Wellenlängen andere Fluorophore29bleichen. Wo möglich, hoher Helligkeit und stabilen Fluorophore ausgewählt werden sollen. Ebenso sollte die Übernahme Bildparameter angepasst werden, um Immunofluoreszenz und Phototoxizität zu minimieren – z. B. längere Belichtungszeiten bei geringer Erregung Intensität werden höhere Erregung Intensitäten48vorgezogen. Die Zugabe von Antioxidantien wie Rutin und Entfernung von einigen Media-Komponenten können beide Photostabilität verbessern und reduzieren Phototoxizität49. Sogar mit der sorgfältigen Auswahl der Fluorophore und bildgebenden Bedingungen erfordert die Notwendigkeit, Immunofluoreszenz oft begrenzen die Aufnahme von Bildern mit niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis (siehe Abbildung 5 ein Beispiel). Quantifizierung der Fluoreszenzintensität Bedarf großer Sorgfalt zu treffenden Bildverarbeitungs-Artefakte zu begrenzen; im Idealfall sollten die raw-Bilder ohne jegliche Bearbeitung analysiert werden. Wenn Bilder vor der Quantifizierung deconvolving, muss ein Dekonvolution Algorithmus, der fluoreszierende Intensitäten bewahrt gebrauchte50,51.

Zelle, die Akquisitionen mit erfolgreichen Experimenten erfordern eine sorgfältige Balance zwischen Anregung Intensität, Belichtungszeit, Frame-Rate und Experiment Dauer besonders schwierig sein können zu leben. Anregung Intensität und Belichtung Zeit sollte angepasst werden, um Phototoxizität zu minimieren, wie beschrieben, mit dem Vorbehalt, dass längere Belichtungszeiten können Bewegung Artefakte durch Zelle Bewegung oder die Frame-Rate des Erwerbs zu begrenzen. Die Bildrate kann abhängig von den experimentellen Anforderungen variieren. Niedrigere Frameraten (5 – 30 min zwischen Frames) Bildgebung über längere Zeit (12 h oder mehr) lassen aber minimal Angaben über Phänomene wie Membran Dynamik und Post-Efferocytosis Handel mit Efferosomes. Hohe Bildraten (so schnell wie 1 Bild pro Sekunde) bieten gute zeitlichen Auflösung der Efferocytic Ereignisse und Efferosome des Handels – aber auch mit der sorgfältigen Auswahl der Fluorophore, Belichtungszeiten und Anregung Intensität – Immunofluoreszenz oder Phototoxizität Diese Experimente zu weniger als einer Stunde Dauer wird in der Regel eingeschränkt werden. Nach unserer Erfahrung erwerben Bilder alle 1 – 2 min. über experimentelle Zeiträume von 2 – 6 h sind ein akzeptabler Kompromiss, die quantifizierbaren Bilder einer ausreichenden Anzahl von Efferocytic Veranstaltungen, mit angemessener zeitlicher Auflösung bietet.

Veränderte und ausgefallenen Efferocytosis ist bekannt, dass die Pathologie von Krebs, Arteriosklerose und mehrere Autoimmunerkrankungen beteiligt, mit Efferocytosis-targeting Therapien Versprechen zeigt große klinische7,52, 53,54,55. Weitere Entwicklung in diesen Bereichen benötigen, Identifizierung und Charakterisierung von zellulären Prozessen, Rezeptoren und Signalwege, die Efferocytosis zu regulieren. Der Test präsentiert in diesem Protokoll stellt ein leistungsfähiges Werkzeug für diese Studien und kann geändert werden, um viele der zellulären und Signalisierung Prozesse regulieren Efferocytosis zu quantifizieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Acknowledgements

Diese Studie wurde von kanadischen Institute Health Research (CIHR) Betrieb Grant MOP-123419, Naturwissenschaften und Engineering Forschung Rat von Kanada Discovery Grant 418194, Ontario Ministerium für Forschung und Innovation frühen Forschungspreis für BH finanziert. DGW trugen einige der Bilder präsentiert, um die Optimierung der Protokolle und das Schreiben des Manuskripts; Er wurde durch eine selbstansaugende Pumpe von der University of Liverpool finanziert. CY wird von einem Vanier Graduate Stipendium und CIHR MD/PhD Zugehörigkeit finanziert. Förderinstitutionen hatte keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Media Wisent 3500-000-EL
DMEM Media Wisent 319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-150
PBS Wisent 311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness Electron Microscopy Sciences 72290-08 Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine Cayman Chemical 81590 Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488 ThermoFisher R37174
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217 Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO Sigma-Aldrich D2650
CellTrace FarRed ThermoFisher C34572
CellTrace Orange ThermoFisher C34851
Hoescht 33342 ThermoFisher 62249
FITC-Streptavadin ThermoFisher SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium Cedarlane Labs CL5071
Recombinant Human M-CSF Peprotech 200-04
Recombinant Human IL-4 Peprotech 300-25
J774.2 Macrophage Cell Line Sigma-Aldrich 85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line ATCC TIB-202
Jurkat T Cell Line ATCC TIB-152

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References

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