超常磁性鉄酸化物ナノプローブの合成、特性解析、応用による肺外結核検出

Medicine

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Summary

結核菌抗原の血清学的診断試験を改善するために、肺外結核を検出する超常磁性鉄ナノプローブを開発しました。

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Lee, C. N., Chiu, L. H., Fang, C. L., Yeh, S. D., Zuo, C. S., Chen, S. C., Kuo, L. K., Wang, Y. M., Lai, W. F. T. Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection. J. Vis. Exp. (156), e58227, doi:10.3791/58227 (2020).

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Abstract

超常磁性鉄酸化物(SPIO)ナノ粒子と結核菌表面抗体(MtbsAb)を含む分子イメージングプローブを合成し、肺外結核(ETB)のイメージング感度を高めた。SPIOナノプローブを合成し、MtbsAbと共役した。精製されたスピオ・ムトブアブナノプローブをTEMおよびNMRを用いて特徴付けた。プローブの標的化能を決定するために、SPIO-MtbsAbナノプローブをインキュベートしたインビトロイメージングアッセイ用に、Mtb接種マウスに注入し、磁気共鳴(MR)を用いたインビボ検査を行った。Mtb細胞およびTHP1細胞の磁気共鳴画像(MRI)のコントラスト増強減少は、SPIO-MtbsAbナノプローブ濃度に比例することを示した。Mtb感染マウスへの静脈内SPIO-MtbsAbナノプローブ注射の30分後、肉芽腫部位のシグナル強度は、PBS注射を受けたマウスと比較してT2加重MR画像で14倍増加した。MtbsAbナノプローブは、ETB検出のための新しいモダリティとして使用することができます。

Introduction

世界的に、肺外結核(ETB)は結核(TB)のかなりの割合を表す。それにもかかわらず、ETB診断は、その陰湿な臨床プレゼンテーションと診断テストのパフォーマンスの低下のためにしばしば見逃されたり遅れたりします。偽りの結果は、酸速いバチルに対する痰の塗抹標本、組織病理学上の肉芽腫組織の欠如、または培養性結核(Mtb)の欠乏を含む。典型的な症例に比べて、ETBは頻繁に起こりにくく、Mtbバチルの解放をほとんど伴う。さらに、通常は、リンパ節、胸膜、および骨関節領域1などのアクセスが困難な部位で局在化している。従って、細菌学的確認を危険で困難にする適切な臨床検体を得るための侵襲的な手順は、2、3、4に必須である。

ETBの市販の抗体検出テストは、その広い範囲の感度(0.00-1.00)と特異性(0.59-1.00)を組み合わせたすべての肺外部位に対して、臨床検出にとって信頼性が低い。インターフェロンγ、培養濾液タンパク質(CFP)、および初期分泌抗原標的(ESAT)の酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイは、潜在的および活性な結核を診断するために使用されている。しかし、結果はETB6、7、8を診断するための異なる疾患部位間で異なる。また、皮膚PPD(精製タンパク質誘導体)およびクワンティフェロン-TBは、偽陰性結果9をしばしば提供した。量子フェロン-TB-2Gは全血免疫反応性アッセイであり、これは、罹患した臓器からの検体を必要とせず、これを代替診断ツール6、10、11とすることができる。ポリメラーゼ連鎖反応のような結核髄膜炎に典型的に使用される他の診断方法は、臨床診断12、13を自信を持って排除するには依然として無神経である。これらの従来のテストは、肺外感染部位を発見するための不十分な診断情報を示す。したがって、新しい診断モダリティが臨床的に必要とされる。

分子イメージングは、生体内で疾患プロセスの特定の分子標的を直接スクリーニングできる新しいツールを設計することを目的している14,15.超常磁性鉄酸化物(SPIO)は、T2重み付けされたNMR造影剤であり、磁気共鳴(MR)画像化(MRI)16、17の特異性および感度を有意に高めることができる。この新しい機能イメージングモダリティは、リガンド受容体相互作用を通じて分子レベルで組織変化を正確にスケッチすることができます。本研究では、新しい分子イメージングプローブを、SPIOナノ粒子を含み、ETB診断のためにMtb表面抗体(MtbsAb)と共役するために合成した。SPIOナノプローブは、検査18、19の下で組織および身体に対して最小限の侵襲性を示す。さらに、これらのナノプローブは、その常磁性特性のために低濃度で正確なMR画像を示すことができます。さらに、SPIOナノプローブは、鉄イオンの存在が正常な生理学の一部であるため、アレルギー反応を最も少なからず引き出します。ここで、ETBを標的とするSPIO-MtbsAbナノプローブの感度および特異性を、細胞モデルおよび動物モデルの両方で評価した。その結果、ナノプローブがETB診断用の超高感度イメージング剤として適用可能であることを実証した。

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Protocol

動物実験に関するすべてのプロトコルは、国立実験動物の管理および使用に関する衛生ガイドライン(第8版、2011)に従って、実験動物の繁殖のための標準的な操作手順に従い、によって承認されています制度的な動物のケアと使用委員会。

1. SPIOナノ粒子合成

  1. デキストランコーティングされた酸化鉄磁性ナノ粒子を調製するには、デキストランT-40(5mL;50%w/w)と水性FeCl3×6H2O(0.45 g;2.77 mmol)およびFeCl2×4H2O(0.32 g;2.52 mmol)溶液を室温で激しく攪拌する。
  2. NH4OH (10 mL; 7.5% v/v) を迅速に追加します。
  3. さらに1時間黒懸濁液をかき混ぜます;その後、17,300 x gで10分間遠心分離し、凝集物を取り除く。
  4. ゲル濾過クロマトグラフィー20によって、結合されていないデキストランT-40から最終的なSPIO製品を分離します。
  5. 反応混合物(総体積=5 mL)を2.5cm×33cmカラムにロードし、pH 7.0で0.1M NaAcetateと0.15M NaClを含む緩衝液を用いて溶出させます。
  6. 精製デキストランコーティングされた酸化鉄磁性ナノ粒子をボイド体積に集め、塩酸とフェノール/硫酸法20を用いて、330nmと490nmの鉄とデキストランのカラム溶出物をアッセイします。

2. SPIO-MtbsAb合成

  1. 以前に報告された方法21,22を使用して SPIO 結合 EDBE を合成する 。
  2. SPIO-EDBE-コハク酸エステル(SA)を合成する。
    1. SPIO-EDBEおよびSA(1g;10 μmol)のアルカリ溶液(5 M NaOH;10 mL))を室温で24時間かき混ぜます。
    2. 分子多孔膜チューブ(12,000-14,000 MWカットオフ)を用いて蒸留水の2Lの20の変化を用いて溶液を透析する。変更ごとに 6 h。
  3. 最後に、4.5 mg/mL MtbsAbの400μLにSPIO-EDBE-SA(Feの4mg/mL)を100 μL加え、1-ヒドロキシベンゾゾトリアゾールおよび(ベンゾトリリアゾール-1-イロキシ)トリピロリジノホスホオニウムを用いてSPIO-MtbsAbを合成し、24溶液中で溶液中で溶液を攪拌する。
  4. 最後に、ゲル濾過クロマトグラフィーを介してアンバウンド抗体から溶液を分離する。
  5. 反応混合物(5 mL)を2.5cm×33cmカラムに積み込み、PBSバッファーを用いて溶出させます。ビチンポニン酸タンパク質アッセイキット23を用いてAb-ナノ粒子複合体(すなわちナノプローブ)を確認する。

3. 粒子形態観察・緩和層測定

  1. 100kVの電圧で透過型電子顕微鏡を用いて、平均粒子径、形態、サイズ分布を調べます。
    1. 複合分散液を200メッシュの銅グリッドにドロップキャストし、室温で空気乾燥してから顕微鏡に積み込みます。
  2. NMR緩和計を用いてナノプローブの緩和時間値(T1およびT2)を20MHzおよび37.0°C±0.1°Cで測定します。
    1. 各測定の前に、リラックスメーターを調整します。
    2. 反転回復とCarr-Cell-Meiboom-Gillパルスシーケンスを通じて生成された8つのデータポイントからr1およびr2の値をそれぞれ記録し、r1およびr2の緩和度20を決定する。

4. 細胞イメージング

  1. 10%のウシ胎児血清、50μg/mLゲンタマイシン硫酸、100単位/mLペニシリンGナトリウム、100μgのストレプトマイシン硫酸塩、0.25 μg/mL菌類を含むRPMI 1640でヒト単球THP-1を培養し、5%CO2インキュバターで5%CO2インキュバターで5%のCO2インキュバーターを有する。
  2. ミコバクテリウム・ボビスBCGの106コロニー形成ユニット(CFU)を備えたSPIO-MtbsAbナノプローブ(2mM)をマイクロ遠心分離管(1mL)で1時間5%CO2インキュベーターに1×107活性化単球でプレインキュベートした。
  3. 遠心管は200×gで、上清を捨てます。ペレットを培地(200 μL)に再溶解します。
  4. 高速勾配エコーパルスシーケンスを使用してサンプルをスキャンします(繰り返し時間(TR)= 500;エコー時間(TE) = 20;フリップ角度 = 10°) を介して 3.0-T MRI ナノプローブの特異性と感度を決定する21,22.

5. BCG(バチルス・カルメット=ゲリン)接種

  1. Sauton培地で凍結乾燥ワクチンまたは細菌ストックを再構成し、前述の24のように適切に分散するまで生理食塩水でストックを希釈する。
  2. ADIMMUNE(台湾・台北)から得られたM.ボビスBCGの生きた減衰株を接種する(Connaught株;イムシストアベンティス、パスツール・メリユー)は、前に説明したように、マウスの左右の小肩甲骨皮膚に皮内に0.1 mL/マウス(すなわち、107 CFU)の体積で23。陰性制御としてマウスに生理用アルコールを注入する。BCG接種後、毎日動物をモニターする。
  3. 二酸化炭素安楽死を用いた細菌接種1ヶ月後に動物を犠牲にする。皮内接種部位から組織を収穫する。組織を10%ホルマリンで固定し、5〜10 μmでシリアルセクションのパラフィンに埋め込み、酸性速細菌24のヘマトキシリン/エオシンおよびツィエル・ニールセン染色剤と鉄鉄25のベルリンブルーを含む染色組織セクション。

6. インビボ MRI

  1. 動物麻酔のために、ケタミン(体重80mg/kg)とキシラジン(体重12mg/kg)をマウスに皮下注射します。
  2. マウスの尾静脈にSPIO-TbsAbプローブ(2nmol/200 μL)を注入します。MR画像マウスは、プローブ注射の前と直後、そしてT2重み付き高速スピンエコー画像(TR = 3000;)TE = 90;視野 = 8)。
  3. シグナル強度(SI)を用いてすべてのMR画像を定量的に分析し、Mtb肉芽肉芽腫の中心と肉芽腫領域に隣接する背中の筋肉の比較位置に対して、定義された対象領域の測定を行います。
  4. 式を使用して、SI測定前(SIpre;制御)と0-3h(SIpost)の注入後(SIpost)を用いて相対信号の増強を計算する

    [(シポスト - シプレ)/シプレ] × 100

    ここでSIpreは、前強化されたスキャン上の病変のSIであり、シポストは後強化スキャン21、22上の病変のSIである。

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Representative Results

SPIO-MtbsAbナノプローブ合成と特性評価
SPIOナノ粒子は、MtbsAbと共役するように設計された。SPIOナノ粒子の表面上で安定化されたデキストランをエピクロロヒドリンにより架橋した。SPIOナノ粒子は、その後EDBEと組み込まれ、デキストラン末端で一次アミン官能基を活性化した。その後、SAを共役してSPIO-EDBE-SAを形成した。カップリング剤の存在下で、SPIO-EDBE-SAを用いたMtbsAbのコンジュゲーションを通して最終ステップで形成されたSPIO-MtbsAbナノプローブ。SPIO-MtbsAbナノプローブのTEM画像(図1)は、SPIO-MtbsAbナノプローブが良好に分散した外観を持っていたことを示しています。SPIO-MtbsAbナノプローブコアの平均サイズは3.8±0.4nm(200粒子計算)であった。

水溶液中で、緩和率値r1およびr2は、ナノプローブの23±3および151±8mM-1s-1、それぞれ、20MHz及び37.0°C±0.1°Cであった。スピオ-MtbsAbナノプローブのr1/r2比は、レソビストのそれと同様であった;しかし、リソビストのr1およびr2(それぞれ26および164mM-1s-1)は、SPIO-MtbsAbナノプローブのものよりもやや高かった。

インビトロ SPIO-MtbsAb ナノプローブの特性評価とイメージング
まず、ジエール・ニールセン染色を通して、酸速い細菌であるM.ボビスBCGをZiehl-Neelsen染色で検出しました(図2A)。細菌を単離し、鉄鉄を含むプローブで培養し、ベルリンの青色染色を通じて識別可能である(図2B)。SPIO-MtbsAbナノプローブのMtbターゲティング度合いは、T2加重MRIを介して決定された。陰性増強は、細菌細胞に付着したプローブの量に比例した。ナノプローブの存在下でのSIの減少は、濃度依存的に起こった(2C)。2,1,0.5 mMで、Mtbと共役したナノプローブは、それぞれ97.67±3.05、131.67±4.51、257.33±5.03のSIを示し、それぞれ90.755±2.47のSIを1mMノンコンジュゲートナノプローブに対して高く示した。PBS(SI = 1073.43 ± 13.62)と比較すると、TBのみのグループ(SI = 957.33 ± 12.53)ではほとんど信号減少は見られなかった。従って、スピオプローブは特にMtbバチルスを標的とした。さらに、増強されたMR画像では、SIはSPIOナノ粒子の量の増加に伴って減少した。

同様に、強化されたMR画像上のSIの減少は、ナノプローブを用いたTHP-1単球の培養後1時間に注目された。1 mM(SI = 225.33 ± 8.58)および2 mM(SI = 104 ± 2.16)の濃度が、PBSのみで投与された群(SI = 1005.33 ± 16.74)で投与された場合、またはナノprで投与されなかった場合に、TB群のSIの有意な減少が指摘された。OBe (SI = 991 ± 8.98)。1および2mMナノプローブに対するMtb基のMRI SI減少は、陽性1mMナノプローブ単独群(SI=112.33±3.68)と同等であった。上記の結果によると、SPIO-MtbsAbナノプローブは、ナノプローブ活性化THP-1単球の人身売買を監視するのに役立つ可能性があります。

インビボ SPIO-MtbsAb ナノプローブイメージング
細胞イメージング後、ETBに対するインビボMRIの有効性を決定した。SPIO-MtbsAbナノプローブをMtb感染マウスに静脈注射した。注射後0.5時間のMtb肉芽腫領域に明確に検出可能なMRシグナルが示された。しかし、最も高いSIをバックグラウンドにして、1時間の注入後に観察した。Mtb肉芽腫領域でMRシグナル伝達の有意な減少が指摘された(図3)。SIは、前(SIpre)および後(SIpost)造影剤注射を測定した。プローブ注入から1時間後、Mtbグラニューラマチ領域におけるT2加重シグナル低減の増強(3B)は、対照部位よりも約14倍高かった(3A;-1.68%±1.32%および-23.43%±7.24%;p < 0.001)。

スピオ・MtbsAbナノプローブの組織学的および免疫学的評価
C57BL/6マウスで感染してから1ヶ月後に皮下肉芽腫が発症した。リンパ球および上皮-マクロファージ凝集体と共にこれらの病変内で新しい血液血管化が注目された。組織化肉芽腫は徐々に成長していた(図4A)。また、TB病変とスピオ・MtbsAb MRシグナルの相関は、Mtb表面抗原と抗MtbsAbの免疫学的反応を通じてさらに決定された。肉芽腫領域(4B)において陽性のMtbsAb発現が明らかにされ、病変部位での酸速い桿菌染色陽性(4C)。鉄の鉄の強い染色物であるベルリンブルーを使用して、Mtbに対するプローブの感度を決定するために使用されました。すべての共ローカライズペアを図4A-Dに示します。

Figure 1
図1: TEMにおけるSPIO-MtbsAbナノプローブの平均コアサイズSPIO-MtbsAbナノプローブコアの平均サイズは3.8±0.4nmであり、TEM画像解析(200粒子計算)を用いて測定した。スケール バー = 15 nmこの図は、我々の以前の研究から変更されました26.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:SPIO-MtbsAbナノプローブのインビトロ特性評価酸速い桿菌は、(A)ジール・ニールセン染色を通して同定され、(B)ナノプローブの鉄鉄をベルリンの青色染色で同定された細菌に結合させることによって同定される。(C)SPIO-MtbsAbナノプローブをMtbでインキュベートした後に負の増強を示すT2加重MRIは、Mtbを使用してナノプローブを組み込んだ後に用量依存的に起こるSIの排除:(1)90.75±2.47(1.0mMプローブ)。(2) 97.67 ± 3.05 (Mtb + 2.0 mM プローブ);(3) 131.67 ± 4.51 (Mtb +1.0 mM プローブ);(4) 257.33 ± 5.03 (Mtb + 0.5 mM プローブ);(5) 957.33 ± 12.53 (Mtb +0 mM プローブ);(6) 1073.43 ± 13.62 (PBS).PBSコントロールグループに検出可能なシグナル減少は記載されていない。(D) THP-1単球における用量依存性陰性増強は、ナノプローブでインキュベートした後1時間。(C)と(D)のスケールバーは5mmです。この図は、我々の以前の研究から変更されました26.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:C57BL/6マウスの皮下ETB病変におけるインビボSPIO-MtbsAbナノプローブ。(A) コントロールおよび (B) Mtb肉芽腫症領域。MRシグナル伝達の有意な14倍の減少は、Mtb肉芽腫領域において、プローブ投与後の対照領域1時間(-1.68%±1.32%対-23.43%±7.24%、p <0.001)と比較して見られる。 結果は、手段として与えられる ± SDs. 二尾の学生のt検定を使用した統計的比較。p < 0.05 は有意であると考えられていました。この図は、我々の以前の研究から変更されました26.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:体学、免疫体化学、酸速、およびベルリンの青色染色の相関主にリンパ球および上皮細胞のマクロファージを示すMtb肉芽腫性領域のヒスチズム。これらの病変で観察されるリンパ球および上皮細胞および上皮細胞の新生血管化および豊富な凝集。(A)組織化された肉芽腫が徐々に発達するように見える。(B) 肉芽腫病変におけるMtbsAb発現を示す免疫賦皮染色は、(C)酸速い桿菌が同じ領域内に散在しているのに対し、(D) ベルリンの青染色SPIOプローブは、共局在化MtbsAb地域に見られる。鉄鉄のベルリンの青い染色はMtbにプローブの結合を示す。スケールバーは100μmである。この図は、我々の以前の研究から変更されました26.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

関連する研究と同様に、SPIO-MtbsAbナノプローブに関する我々の知見は、Mtb27,28に対して有意な特異性を示した。皮下Mtb肉芽腫は、マウスモデルにおいて結核注射の1ヶ月後に発見された。典型的な結核肉芽腫性の細胞学の所見は、リンパ球浸潤、上皮性マクロファージの存在、および新血管新生を含んでいた。酸速いバチル菌を結核病変に散乱し、MtbsAb免疫賦菌所見を裏付けた。これは、Mtb表面抗原とMtbsAbとの間の免疫学的反応を示した。ベルリンブルーはMtbsAbと同じ領域を強調し、酸速いMtbとの結合のためのプローブの特異性を裏付けました。

特に、Mtbおよび単球THP1細胞に対するMRIに対する陰性のコントラスト増強の程度は、SPIO-MtbsAbナノプローブ濃度に比例していた。Mtb肉芽腫を有するマウスをSPIO-MtbsAbナノプローブを投与した場合、肉芽腫部位での14倍のシグナル低下が、PBS注射を伴う対向部位と比較してT2加重MR画像に注目された。これは造影剤の著しい蓄積を示す。この結果は、造影剤の特定の標的化を得る可能性を示しており、臨床診断のための用量要件を減らすことができる。

我々の知見は、これらのナノプローブがMtb肉芽腫性病変に検出可能な体積を蓄積することを示している。これらの結果は、抗hMtbsAbを用いたSPIOナノプローブを開発することによって確認することができる。SPIOの磁気酸化鉄コアがMRI造影剤でT2短縮を誘導するために適用されてきたので、この知見は臨床診断用途における同様の細胞挙動を検出するための実用的かつ非侵襲的なアプローチを示唆している。

ここでは、2つの部分からなるプロトコルを提供します:セクション4〜6は細胞および動物のイメージングです。この技術は、細胞培養、動物実験、光学イメージングをカバーしています。セクション1~3はプローブ合成です。いくつかの重要な手順は、実験を再現するのに役立ちます。SPIOナノ粒子合成の重要なステップは、デキストラン被覆酸化鉄磁気ナノ粒子を調製することである。デキストランT-40、水性FeCl3-6H2O、およびFeCl 2-4H2O溶液を室温で激しく混ぜ合わせるのは非常に重要です。セクション2の重要なステップであるSPIO-MtbsAb合成は、SPIO-MTbsAbを合成するために、ムブサブをSPIO-EDBE-SAに結合させることです。適切な触媒を選択し、室温で溶液を十分に攪拌することは同様に重要である。そして、断面3の重要なステップとは、粒子形態観察および緩和層測定、各測定の前に緩和計を較正することである。プローブのサイズを正確に計算するためには、リラックスメーターのキャリブレーションも重要です。

本研究では、M.ボビスBCGおよびウサギ抗Mtbを用いた。ウシとウサギの供給源の交反応性は軽度と考えられていたが、データはMtbsAb結合SPIOがM.ボビスBCGとの強い相互作用を明らかにしたことを証明した。我々の発見は、SPIOナノプローブが特に結核を標的とすることを示唆した。ナノプローブおよびMtb細菌のインキュベーションは用量依存的に陰性増強方法を示したが、MRI上でのSPIOナノプローブに対して観察された増強の減少はSPIO粒子の存在と相関していた。我々のデータに基づいて、ナノプローブの特異性を高めるための可能な抗体結合アプローチを探求するためのさらなる研究は歓迎されるであろう。

以前の研究では、SPIOは、この研究で使用される濃度で細胞活性を変化させることなく、細胞毒性を最小限に抑えることを示しています29,30.我々の研究と一致して、我々の結果は、THP-1細胞に対するSPIOナノプローブの最小限の効果を示した。THP-1細胞を1時間細菌結合を用いてSPIOナノプローブでインキュベートした。SIは、ナノプローブ処理またはPBS単独を用いない対照群と比較して、1mMまたは2mMナノプローブの濃度を有するMtb基の有意な減少を提示した。結果はSPIOナノプローブの安全性をサポートし、ナノプローブの感受性を検証するために他の細菌負荷を適用するより多くの研究は歓迎される。

我々の研究の1つの制限は、マウスにおけるSPIO-MtbsAbナノプローブの生体分布を定量化しなかったことである。さらに、ナノプローブの血管内半減期および肝臓沈着を調べなかったため、Mtb病変に位置するTHP-1細胞へのプローブの暴露時間が変化する可能性がある。生分解に関するさらなる研究が保証されています。さらに、MRIは、SPIOナノプローブが細菌または単球に特異的に結合できるかどうか、またはこれらのプローブがエンドサイトトースされたかどうかを区別できませんでした。

結論として、我々は、生体適合SPIO-MtbsAbナノプローブを準備し、特徴付けるための明確で実現可能なプロトコルを開発しました。これらのナノプローブは、親水性であり、生理学的条件下でよく分散する。彼らは低濃度で最小限の細胞傷害性である。また、これらのSPIO-MtbsAbナノプローブは、インビトロおよびインビボ研究で実証されているように、Mtb感染の標的化と検出を可能にする。したがって、スピオ-MtbsAbナノプローブは、ETB検出のためのMRI造影剤として適用することができる。

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Disclosures

著者の誰も、この研究で調べた材料に独自の関心を持っていません。

Acknowledgments

著者らは、台湾経済省(NSC-101-2120-M-038-001、MOST 104-2622-B-038 -007、MOST 105-2622-B-038-004)からの資金援助に感謝しています。この原稿はウォレス・アカデミック・エディット編集編集によって編集されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Sigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazole Sigma-Aldrich
dextran(T-40) GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrate Fluka
ferrous chloride tetrahydrate Fluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCG Pasteur Mérieux Connaught strain; ImmuCyst Aventis
MRI GE medical Systems 3.0-T, Signa
NH4OH Fluka
NMR relaxometer Bruker NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300 GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25 GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off Spectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb Acris Antibodies GmbH BP2027
transmission electron microscope JEOL JEM-2000 EX II

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