Síntesis, caracterización y aplicación de nanosondas de óxido de hierro superparamagnético sin empleo para la detección de tuberculosis extrapulmonar

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Summary

Para mejorar las pruebas diagnósticas serológicas de antígenos de Mycobacterium tuberculosis, desarrollamos nanosondas de óxido de hierro superparamagnético para detectar la tuberculosis extrapulmonar.

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Lee, C. N., Chiu, L. H., Fang, C. L., Yeh, S. D., Zuo, C. S., Chen, S. C., Kuo, L. K., Wang, Y. M., Lai, W. F. T. Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection. J. Vis. Exp. (156), e58227, doi:10.3791/58227 (2020).

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Abstract

Se sintetizó una sonda de imagen molecular compuesta por nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPIO) y anticuerpos superficiales de Mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) para mejorar la sensibilidad a la toma de imágenes para la tuberculosis extrapulmonar (ETB). Una nanosonda SPIO fue sintetizada y conjugada con MtbsAb. La nanosonda sPIO-MtbsAb purificada se caracterizó utilizando TEM y NMR. Para determinar la capacidad de focalización de la sonda, las nanosondas SPIO-MtbsAb se incubaron con Mtb para ensayos de imágenes in vitro y se inyectaron en ratones inoculados por Mtb para la investigación in vivo con resonancia magnética (RM). La reducción de la mejora del contraste en la resonancia magnética (RM) de las células Mtb y THP1 mostró proporcional a la concentración de nanosondas SPIO-MtbsAb. Después de 30 minutos de inyección intravenosa de nanosondas SPIO-MtbsAb en ratones infectados por Mtb, la intensidad de la señal del sitio granulomatoso se mejoró por 14 veces en las imágenes de RM ponderadas por T2 en comparación con la de los ratones que recibieron inyección de PBS. Las nanosondas MtbsAb se pueden utilizar como una modalidad novedosa para la detección de ETB.

Introduction

A nivel mundial, la tuberculosis extrapulmonar representa una proporción significativa de los casos de tuberculosis (TB). Sin embargo, el diagnóstico de ETB a menudo se olvida o se retrasa debido a su insidiosa presentación clínica y el bajo rendimiento en las pruebas diagnósticas; los resultados falsos incluyen frotis de esputo negativos para bacilos ácidos rápidos, falta de tejido granulomatoso en histopatología o falta de cultivo Mycobacterium tuberculosis (Mtb). En relación con los casos típicos, la ETB ocurre con menos frecuencia e implica poca liberación de los bacilos de Mtb. Además, generalmente se localiza en sitios de difícil acceso, como ganglios linfáticos, pleura y áreas osteoarticulares1. Así, los procedimientos invasivos para la obtención de muestras clínicas adecuadas, lo que hace que la confirmación bacteriológica sea arriesgante y difícil, son esenciales2,3,4.

Las pruebas de detección de anticuerpos disponibles comercialmente para la ETB no son fiables para la detección clínica debido a su amplia gama de sensibilidad (0,00-1,00) y especificidad (0,59-1,00) para todos los sitios extrapulmonares combinados5. Los ensayos de inmunospot ligado a enzimas (ELISPOT) para el interferón, la proteína filtrada de cultivo (CFP) y el objetivo antigénico del secretor temprano (ESAT) se han utilizado para diagnosticar la tuberculosis latente y activa. Sin embargo, los resultados varían entre diferentes sitios de la enfermedad para el diagnóstico de ETB6,7,8. Además, la piel PPD (derivado de proteína purificada) y QuantiFERON-TB con frecuencia proporcionaron resultados falsos negativos9. QuantiFERON-TB-2G es un ensayo de reactividad inmune de sangre completa, que no requiere una muestra del órgano afectado y puede ser una herramienta de diagnóstico alternativa6,10,11. Otros métodos de diagnóstico utilizados normalmente para la meningitis por tuberculosis, como la reacción en cadena de la polimerasa, siguen siendo demasiado insensibles a excluir con confianza el diagnóstico clínico12,13. Estas pruebas convencionales demuestran información diagnóstica insuficiente para descubrir el sitio de infección extrapulmonar. Por lo tanto, se requieren clínicamente nuevas modalidades de diagnóstico.

La imagen molecular tiene como objetivo diseñar nuevas herramientas que puedan examinar directamente objetivos moleculares específicos de los procesos de la enfermedad in vivo14,15. El óxido de hierro superparamagnético (SPIO), un agente de contraste de RMN ponderado por T2, puede mejorar significativamente la especificidad y sensibilidad de la resonancia magnética (RM)16,17. Esta nueva modalidad de imagen funcional puede esbozar con precisión los cambios de tejido a nivel molecular a través de interacciones ligando-receptor. En este estudio, se sintetizó una nueva sonda de imágenes moleculares, que comprende nanopartículas SPIO, para conjugar con el anticuerpo de superficie Mtb (MtbsAb) para el diagnóstico de ETB. Las nanosondas SPIO son mínimamente invasivas para los tejidos y cuerpos bajo examen18,19. Además, estas nanosondas pueden demostrar imágenes mr precisas a bajas concentraciones debido a sus propiedades paramagnéticas. Además, las nanosondas SPIO aparecen que son menos alérgicas porque la presencia de iones de hierro es parte de la fisiología normal. Aquí, la sensibilidad y especificidad de las nanosondas SPIO-MtbsAb dirigidas a ETB se evaluaron tanto en modelos celulares como animales. Los resultados demostraron que las nano sondas eran aplicables como agentes de imágenes ultrasensibles para el diagnóstico de ETB.

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Protocol

Todo protocolo relativo al experimento con animales sigue los procedimientos operativos estándar para la cría de animales de laboratorio de acuerdo con las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (8a Edición, 2011) y está aprobado por el comité institucional de cuidado y uso de animales.

1. Síntesis de nanopartículas SPIO

  1. Preparar nanopartículas magnéticas de óxido de hierro recubiertas de dextran agitando vigorosamente una mezcla de dextran T-40 (5 mL; 50% p/p) y soluciones acuosas de FeCl3x 6H2O (0,45 g; 2,77 mmol) y FeCl2x 4H2O (0,32 g; 2,52 mmol) a temperatura ambiente.
  2. Añadir NH4OH (10 mL; 7.5% v/v) rápidamente.
  3. Agitar aún más la suspensión negra durante 1 h; posteriormente, centrífuga a 17.300 x g durante 10 minutos y luego eliminar los agregados.
  4. Separe los productos SPIO finales de la dextranT T-40 sin consolidar mediante cromatografía de filtración en gel20.
  5. Cargue la mezcla de reacción (volumen total de 5 ml) en una columna de 2,5 cm a 33 cm y eluya con una solución tampón que contenga 0,1 M de acetato de Na y 0,15 M de NaCl a pH 7,0.
  6. Recoger las nanopartículas magnéticas de óxido de hierro recubierto de dextran purificado en el volumen vacío y ensayo los eluatos de columna para hierro y deextran a 330 y 490 nm mediante el uso de ácido clorhídrico y los métodos de fenol/ácido sulfúrico20, respectivamente.

2. Síntesis SPIO-MtbsAb

  1. Sintetizar EDBE conjugado por SPIO utilizando los métodos21,22.
  2. Sintetizar anhydrida SPIO-EDBE-succínico (SA).
    1. Revuelva una solución alcalina (5 M NaOH; 10 mL)) de SPIO-EDBE y SA (1 g; 10 omol) a temperatura ambiente durante 24 h.
    2. Dialyze la solución con 20 cambios de 2 L de agua destilada utilizando tubos de membrana molecular porosa (12.000-14.000 MW de corte). 6 h por cada cambio.
  3. Por último, añadir 100 l de SPIO-EDBE-SA (4 mg/ml de Fe) a 400 éL de 4,5 mg/ml de MtbsAb para sintetizar SPIO-MtbsAb utilizando 1-hidroxibenzotriazol y (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluoro como catalizador y agitar la solución de la sala de 24.
  4. Por último, separe las soluciones del anticuerpo no unido mediante cromatografía de filtración en gel.
  5. Cargue la mezcla de reacción (5 ml) en una columna de 2,5 cm a 33 cm y eluda con un búfer PBS. Confirme el complejo Ab-nanopartículas (es decir, nanosonda) utilizando un kit de ensayo de proteína de ácido bicinhiniico23.

3. Observación de la morfología de las partículas y medición del nivel de relajación

  1. Examine el tamaño medio de las partículas, la morfología y la distribución del tamaño utilizando un microscopio electrónico de transmisión a una tensión de 100 kV.
    1. Coloque la dispersión compuesta en una rejilla de cobre de 200 mallas y seque al aire a temperatura ambiente antes de cargarla en el microscopio.
  2. Mida los valores de tiempo de relajación (T1 y T2) de las nano sondas utilizando el relajanteómetro de RMN a 20 MHz y 37,0 oC a 0,1 oC.
    1. Calibre el relajanteómetro antes de cada medición.
    2. Registre los valores r1 y r2 de los ocho puntos de datos generados a través de la inversión-recuperación y la secuencia de pulsos Carr-Purcell-Meiboom-Gill, respectivamente, para determinar r1 y r2 relaxivities20.

4. Imágenes celulares

  1. Cultivar monocitos humanos THP-1 en RPMI 1640 con suero bovino fetal al 10%, sulfato de gentamicina de 50 g/ml, 100 unidades/ml de penicilina G sódica, 100 g de sulfato de estreptomicina y 0,25 g/ml de fungizona en una incubadora de 5% de CO2 a 37 oC.
  2. Incubar nanosondas SPIO-MtbsAb (2 mM) con 106 unidades formadoras de colonias (CFU) de Mycobacterium bovis BCG preincubado con 1 x 107 monocitos activados en tubos de microcentrífuga (1 ml) en una incubadora de CO2 al 5% a 37 oC durante 1 h.
  3. Tubos centrífugos a 200 x g y desechar el sobrenadante. Volver a disolver los gránulos en el medio (200 l).
  4. Escanee las muestras utilizando una secuencia de pulsos de eco de gradiente rápido (Tiempo de repetición (TR) a 500; Tiempo de eco (TE) á 20; Gire el ángulo de 10o) a través de una resonancia magnética de 3,0 T para determinar la especificidad y sensibilidad de la nanosonda21,22.

5. BcG (Bacillus Calmette–Guérin) inoculación

  1. Reconstituir la vacuna liofilizada o el stock bacteriano en el medio de Sauton y luego diluir la población con salina hasta que se disperse adecuadamente como se describió anteriormente24.
  2. Inocular una cepa viva atenuada de M. bovis BCG, obtenida de ADIMMUNE (Taipei, Taiwán) (cepa connaught; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) a un volumen de 0,1 ml/ratón (es decir, 107 CFU) intrador en la piel escapular dorsal izquierda o derecha de los ratones, como se describió anteriormente23. Inyecte salina en ratones como control negativo. Monitoree a los animales diariamente después de la inoculación de BCG.
  3. Sacrificar animales 1 mes después de la inoculación de bacterias utilizando eutanasia de dióxido de carbono. Extraer el tejido del sitio de inoculación intradérmica. Fijar el tejido en 10% de formalina e incrustar en parafina para secciones en serie a 5-10 m. Secciones de tejido de mancha con las manchas de hematoxilina/eosina y Ziehl-Neelsen para bacterias ácidasrápidas 24 y con azul berlinés para hierro férrico25.

6. RMN in vivo

  1. Inyectar ketamina (80 mg/kg de peso corporal) y xilazina (12 mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea en ratones para la anestesia animal.
  2. Inyectar sondas SPIO-TbsAb (2 nmol/200 l) en las venas de la cola de los ratones. Imágenes de RM nórfusiones antes e inmediatamente después de la inyección de la sonda y luego cada 5 minutos durante 30 minutos para adquirir imágenes de eco de giro rápido ponderadas en T2 (TR a 3000; TE 90; campo de visión n.o 8).
  3. Analizar cuantitativamente todas las imágenes de RM utilizando intensidad de señal (SI), una medición de regiones definidas de interés en lugares comparables de un centro de granuloma Mtb y el músculo posterior adyacente a un área granulomatosa.
  4. Calcular mejoras de señal relativas utilizando la medición SI antes (SIpre; control) y 0-3 h después de la inyección (SIpost) de los agentes de contraste utilizando la fórmula

    [(SIpost - SIpre)/SIpre] á 100

    donde SIpre es el SI de la lesión en la exploración pre-mejorada y SIpost es el SI de la lesión en la exploración post-mejorada21,22.

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Representative Results

Síntesis y caracterización de nanosondas SPIO-MtbsAb
Las nanopartículas SPIO fueron diseñadas para conjugar con MtbsAb. El dextran estabilizado en la superficie de las nanopartículas SPIO fue reticulado por epiclorohydrin. Posteriormente se incorporaron nanopartículas SPIO con EDBE para activar grupos funcionales de amina primaria en los extremos de la dextran. SA fue conjugada para formar SPIO-EDBE-SA. Las nanosondas SPIO-MtbsAb se formaron en el último paso a través de la conjugación de MtbsAb con SPIO-EDBE-SA en presencia de los agentes de acoplamiento. La imagen TEM de las nanosondas SPIO-MtbsAb(Figura 1) demuestra que las nanosondas SPIO-MtbsAb tenían un aspecto bien disperso. El tamaño medio del núcleo de nanosonda SPIO-MtbsAb fue de 3,8 x 0,4 nm (cálculo de 200 partículas).

En solución acuosa, los valores de relajación, r1 y r2,de las nano sondas fueron de 23 a 3 y 151 a 8 mM-1s-1, respectivamente, a 20 MHz y 37,0 oC a 0,1 oC. La relación r1/r2 de nanosondas SPIO-MtbsAb fue similar a la de Resovist; sin embargo, r1 y r2 de Resovist (26 y 164 mM-1s-1, respectivamente) fueron algo más altos que los de las nanosondas SPIO-MtbsAb.

Caracterización e imágenes de nanosondas SPIO-MtbsAb in vitro
En primer lugar, detectamos M. bovis BCG, una bacteria ácida-rápida, a través de la tinción Ziehl-Neelsen(Figura 2A). Las bacterias fueron aisladas y luego cultivadas con sondas que contenían hierro férrico, identificables a través de la tinción azul de Berlín(Figura 2B). El grado de orientación Mtb de la nanosonda SPIO-MtbsAb se determinó mediante RMN ponderada por T2; mejora negativa se proporcionó a la cantidad de sondas unidas a la célula bacteriana. La disminución del SI en presencia de las nano sondas se produjo de manera dependiente de la concentración(Figura 2C). Con 2, 1 y 0,5 mM, las nanosondas conjugadas con Mtb exhibieron Si de 97,67 a 3,05, 131,67 a 4,51 y 257,33 a 5,03, respectivamente, todas ellas más altas del SI de 90,75 a 2,47 para la nanosonda no conjugada de 1 mM. En comparación con el PBS (SI a 1073,43 a 13,62), casi no se observó ninguna reducción de la señal en el grupo de la tuberculosis solamente (SI a 957,33 a 12,53). Por lo tanto, las sondas SPIO se dirigió específicamente a los bacilos de Mtb; además, en las imágenes de RM mejoradas, el SI disminuyó con el aumento de la cantidad de nanopartículas SPIO.

Del mismo modo, las reducciones de SI en imágenes de RM mejoradas se observaron 1 h después del cultivo de monocitos THP-1 con las nanosondas. Se observó una reducción significativa del SI del grupo de tuberculosis cuando se emplearon concentraciones de 1 mM (SI a 225,33 a 8,58) y 2 mM (SI a 104 x 2,16) de las nano sondas en comparación con los grupos administrados únicamente con PBS (SI a 1005,33 a 16,74) o no se administraron con el nanopr obe (SI 991 a 8,98). La reducción de la RMN SI en los grupos de Mtb para nanosondas de 1 y 2 mM fue comparable a la del grupo de nanosondas positivas de 1 mM solo (SI a 112,33 a 3,68). Según los resultados anteriores, las nanosondas SPIO-MtbsAb podrían ayudar a monitorear el tráfico de monocitos THP-1 activado por nanosondas.

In vivo SPIO-MtbsAb nanosonda
Después de la toma de imágenes celulares, determinamos la eficacia de la RMN in vivo para la ETB. Las nanosondas SPIO-MtbsAb se inyectaron por vía intravenosa en ratones infectados por Mtb. Se observó una señal de RM claramente detectable en el área granulomatosa de Mtb 0,5 h después de la inyección; sin embargo, el SI más alto a fondo se observó después de 1 h de inyección. Se observó una reducción significativa en la señalización de RM en la zona granulomatosa de Mtb(Figura 3). EL SI se midió antes de la inyección de agente de contraste (SIpre) y después (SIpost). Una hora después de la inyección de la sonda, la mejora ponderada por T2 de la reducción de la señal en las zonas granuladas de Mtb(Figura 3B)fue aproximadamente 14 veces mayor que la de los sitios de control(Figura 3A;-1,68% a 1,32% y -23,43% a 7,24%; p < 0.001).

Evaluación histológica e inmunohistoquímica de nanosondas SPIO-MtbsAb
Se desarrolló un granuloma subcutáneo 1 mes después de la infección en ratones C57BL/6. Se observó una nueva vascularización sanguínea dentro de estas lesiones junto con los agregados de linfocitos y epitelioide-macrofago. El granuloma organizado había crecido progresivamente(Figura 4A). La correlación de lesiones de tuberculosis con señales de RM SPIO-MtbsAb se determinó aún más a través de la reacción inmunohistoquímica del antígeno superficial Mtb con anti-MtbsAb. La expresión positiva de MtbsAb se reveló en las zonas granulomatosas(Figura 4B),con bacilos ácidos rápidos que manchan positivamente en el lugar de la lesión(Figura 4C). El azul berlinés, una mancha férrica de hierro positivo, se utilizó para determinar la sensibilidad de las sondas a la sonda SPIO sanamente positivo de Mtb. Berlín se encontró en la misma ubicación que MtbsAb(Figura 4D). Todos los pares colocalizados se mostraron en la Figura 4A-D.

Figure 1
Figura 1: Tamaño medio del núcleo de las nanosondas SPIO-MtbsAb en TEM. El tamaño medio del núcleo de nanosonda SPIO-MtbsAb fue de 3,8 x 0,4 nm, medido mediante el análisis de imágenes TEM (cálculo de 200 partículas). Barra de escala a 15 nm. Esta cifra ha sido modificada de nuestro estudio anterior26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Caracterización in vitro de la nanosonda SPIO-MtbsAb. Los bacilos ácido-rápidos se identifican a través de (A) Tinción Ziehl-Neelsen y (B) la conjugación del hierro férrico de la nanosonda a las bacterias identificadas a través de la tinción azul de Berlín. (C) RMN ponderada por T2 que muestra una mejora negativa después de que las nanosondas SPIO-MtbsAb se incuban con Mtb. Eliminación de SI que se produce dependiente de la dosis después de la incorporación de las nanosondas con Mtb: (1) 90,75 a 2,47 (sonda de 1,0 mM); (2) 97,67 a 3,05 (Sondas Mtb + 2,0 mM); (3) 131,67 a 4,51 (sonda Mtb +1,0 mM); (4) 257,33 a 5,03 (Sondas Mtb + 0,5 mM); (5) 957,33 a 12,53 (sonda Mtb +0 mM); (6) 1073,43 a 13,62 (PBS). No se observa ninguna reducción de señal detectable en el grupo de control PBS. (D) Mejora negativa dependiente de la dosis en monocitos THP-1 1 h después de la incubación con las nano sondas. Las barras de escala en (C) y (D) son de 5 mm. Esta cifra ha sido modificada de nuestro estudio anterior26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Nanosondas In vivo SPIO-MtbsAb en lesiones subcutáneas de ETB del ratón C57BL/6. (A) Control y (B) Zonas granulomatosas Mtb. Se encuentra una reducción significativa de 14 veces en la señalización de RM en las zonas granulomatosas de Mtb en comparación con las áreas de control 1 h después de la administración de la sonda (-1,68% a 1,32% frente a -23,43% a 7,24%, p < 0,001). Los resultados se dan como medios : SDs. Las comparaciones estadísticas utilizadas en las pruebas t de los estudiantes de dos colas. p < 0.05 fue considerado como significativo. Esta cifra ha sido modificada de nuestro estudio anterior26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Correlaciones de histología, inmunohistoquímica, ácido-rápido, y la tinción azul de Berlín. Histología de las zonas granulomatosas de Mtb que demuestra predominantemente linfocitos y macrófagos epitelioides. La neovascularización y la abundante agregación de linfocitos y macrófagos epitelioides observados en estas lesiones. (A) Los granulomas organizados que parecen desarrollarse progresivamente. (B) La tinción inmunohistoquímica que demuestra la expresión de MtbsAb en las lesiones granulomatosas, mientras que(C)los bacilos ácidos-rápidos están dispersos en las mismas zonas. (D) Las sondas SPIO de tinción azul de Berlín se encuentran en las áreas colocalizadas de MtbsAb. La tinción azul de Berlín para hierro férrico demuestra la conjugación de la sonda con Mtb. Las barras de escala son de 100 m. Esta cifra ha sido modificada de nuestro estudio anterior26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Al igual que en estudios relevantes, nuestros hallazgos sobre nanosondas SPIO-MtbsAb demostraron una especificidad significativa para Mtb27,28. El granuloma subcutáneo de Mtb se encontró 1 mes después de la inyección de tuberculosis en los modelos de ratón. Los hallazgos típicos de la histología granulomatosa de tuberculosis incluyeron infiltración de linfocitos, presencia de macrófagos epitelioides y neovascularización. Los bacilos ácidos rápidos se dispersaron en las lesiones de tuberculosis, corroborando los hallazgos de inmunohistoquímica de MtbsAb. Esto indicó una reacción inmunológica entre el antígeno superficial mtb y MtbsAb. El azul berlinés destacó las mismas áreas con MtbsAb, corroborando la especificidad de las sondas para la conjugación con el Mtb ácido rápido.

En particular, el grado de mejora negativa del contraste en la RMN para las células Mtb y la monocítica THP1 fue proporcional a la concentración de nanosondas SPIO-MtbsAb. Cuando se administraron nanosondas SPIO-MtbsAb en ratones que llevaban granulomas de Mtb, se observó una reducción de la señal de 14 veces en el sitio granulomatoso en imágenes de RM ponderadas por T2 en comparación con un sitio opuesto con inyección de PBS. Esto indica una acumulación significativa del agente de contraste. Los resultados demuestran la posibilidad de obtener una segmentación específica del agente de contraste, lo que podría reducir el requisito de dosis para el diagnóstico clínico.

Nuestros hallazgos indican que estas nanosondas acumulan un volumen detectable en lesiones granulomatosas de Mtb. Estos resultados se pueden confirmar mediante el desarrollo de una nanosonda SPIO utilizando anti-hMtbsAb. Como el núcleo de óxido de hierro magnético del SPIO se ha aplicado para inducir el acortamiento de T2 en agentes de contraste de RMN, los hallazgos sugieren un enfoque práctico y no invasivo para detectar comportamientos celulares similares para aplicaciones de diagnóstico clínico.

Aquí, proporcionamos el protocolo que consta de 2 partes: las secciones 4 a 6 son imágenes celulares y animales. Las técnicas cubren el cultivo celular, los experimentos con animales y las imágenes ópticas. Las secciones 1 a 3 son sintetizadores de sonda. Algunos pasos críticos ayudarán a replicar el experimento. El paso crítico de la síntesis de nanopartículas SPIO es preparar nanopartículas magnéticas de óxido de hierro recubiertas con dextran; es crucial agitar vigorosamente y mezclar completamente las soluciones dextran T-40, FeCl3-6H2O acuosa y FeCl2-4H2O a temperatura ambiente. El paso crítico para la sección 2, síntesis SPIO-MtbsAb, es conjugar MtbsAb a SPIO-EDBE-SA para sintetizar SPIO-MtbsAb. Para seleccionar los catalizadores adecuados y agitar adecuadamente la solución a temperatura ambiente también son críticos. Y el paso crítico para la sección 3, observación de morfología de partículas y medición del nivel de relajación, es calibrar el relajanteómetro antes de cada medición. Con el fin de calcular con precisión el tamaño de las sondas, una calibración del relajanteómetro también es crucial.

En este estudio, se utilizaron M. bovis BCG y rabbit anti-Mtb. La interreactividad de las fuentes bovinas y de conejo se consideró leve, aunque los datos demostraron que el SPIO conjugado por MtbsAb reveló fuertes interacciones con M. bovis BCG. Nuestro hallazgo sugirió que las nanosondas SPIO se dirigen específicamente a la tuberculosis. La incubación de nanosondas y bacterias Mtb mostró una forma de mejora negativa dependiente de la dosis, mientras que la disminución en la mejora observada para las nanosondas SPIO en la RMN se correlacionó con la existencia de partículas SPIO. Sobre la base de nuestros datos, se acogerían con beneplácito nuevas investigaciones para explorar posibles enfoques de conjugación de anticuerpos para mejorar la especificidad de la nanosonda.

Estudios anteriores demuestran que SPIO muestra una citotoxicidad mínima sin alterar la actividad celular a una concentración utilizada en este estudio29,30. De acuerdo con investigaciones previas, nuestros resultados demostraron un efecto mínimo de las nano sondas SPIO a las células THP-1. Las células de THP-1 se incubaron con nanosondas SPIO con conjugación bacteriana durante 1 hora. SI presentó una disminución significativa en los grupos de Mtb con una concentración de nanosondas de 1 mM o 2 mM, en comparación con el grupo de control sin tratamiento de nanosondas o PBS solo. El resultado apoya la seguridad de la nanosonda SPIO, y más estudios aplicando otras cargas bacterianas para validar la sensibilidad de la nanosonda es bienvenido.

Una limitación de nuestro estudio fue que no cuantificamos la biodistribución de la nanosonda SPIO-MtbsAb en ratones. Además, no investigamos la vida media intravascular y la deposición hepática de la nanosonda, lo que podría alterar el tiempo de exposición de las sondas a las células THP-1 ubicadas en las lesiones de Mtb. Se justifican más investigaciones sobre la biodegradación. Además, la RMN no podía diferenciar si las nano sondas SPIO podían unirse específicamente a bacterias o monocitos o si estas sondas estaban endocitos.

En conclusión, hemos desarrollado un protocolo claro y factible para preparar y caracterizar nanosondas SPIO-MtbsAb biocompatibles. Estas nanosondas son hidrófilas y se dispersan bien en condiciones fisiológicas; son mínimamente citotóxicos a bajas concentraciones. Además, estas nanosondas SPIO-MtbsAb permiten la focalización y detección de la infección por Mtb, como lo demuestran nuestros estudios in vitro e in vivo. Por lo tanto, las nanosondas SPIO-MtbsAb se pueden aplicar como agentes de contraste de RMN para la detección de ETB.

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Disclosures

Ninguno de los autores tiene ningún interés propio en los materiales examinados en este estudio.

Acknowledgments

Los autores están agradecidos por el apoyo financiero del Ministerio de Economía de Taiwán (concede NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) para realizar este trabajo de investigación. Este manuscrito fue editado por Wallace Academic Editing.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Sigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazole Sigma-Aldrich
dextran(T-40) GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrate Fluka
ferrous chloride tetrahydrate Fluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCG Pasteur Mérieux Connaught strain; ImmuCyst Aventis
MRI GE medical Systems 3.0-T, Signa
NH4OH Fluka
NMR relaxometer Bruker NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300 GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25 GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off Spectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb Acris Antibodies GmbH BP2027
transmission electron microscope JEOL JEM-2000 EX II

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