تصوير تفاعل الخلية في الغشاء المخاطي الرغامى أثناء عدوى فيروس الإنفلونزا باستخدام الفحص المجهري إينترافيتال اثنين-فوتون

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

في هذه الدراسة، نقدم بروتوكولا لأداء اثنين-فوتون إينترافيتال التصوير وخلية تحليل التفاعل في الغشاء المخاطي الرغامى مورين بعد الإصابة بفيروس الإنفلونزا. سوف يكون هذا البروتوكول ذات الصلة للباحثين دراسة ديناميات الخلايا المناعية أثناء التهابات الجهاز التنفسي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Palomino-Segura, M., Virgilio, T., Morone, D., Pizzagalli, D. U., Gonzalez, S. F. Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58355, doi:10.3791/58355 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تحليل خلية خلية أو خلية الممرض التفاعل في فيفو أداة هامة لفهم القوى المحركة للاستجابة المناعية للعدوى. اثنين-فوتون إينترافيتال المجهري (2 فناقلات الأمراض) يتيح مراقبة التفاعلات الخلية في الأنسجة العميقة في الحيوانات الحية، مع التقليل من فوتوبليتشينج التي تم إنشاؤها أثناء الحصول على الصور. وحتى الآن، وقد وصف نماذج مختلفة للناقلات ف 2 من الأجهزة اللمفاوية وغير اللمفاوية. ومع ذلك، تصوير الأجهزة التنفسية لا يزال يشكل تحديا نظراً للحركة المرتبطة بدوره التنفس للحيوان.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتصور التفاعلات في فيفو الخلايا المناعية في القصبة الهوائية في الفئران المصابة بفيروس الإنفلونزا باستخدام ناقلات الأمراض ف 2. ولهذا الغرض، قمنا بتطوير منصة تصوير مخصصة، والتي تشمل التعرض الجراحية وتنبيب القصبة الهوائية، متبوعاً باقتناء الصور الديناميكية من العَدلات والخلايا الجذعية (DC) في ظهارة الغشاء المخاطي. بالإضافة إلى ذلك، نحن بالتفصيل الخطوات اللازمة للقيام بالإنفلونزا يعطي داخل الآنف العدوى وتدفق سيتوميتريك تحليل للخلايا المناعية في القصبة الهوائية. وأخيراً، قمنا بتحليل العَدلات وحركية العاصمة، فضلا عن تفاعلها وأثناء الفيلم. يسمح هذا البروتوكول لتوليد الصور 4 د مستقرة ومشرق اللازمة لتقييم التفاعلات خلية خلية في القصبة الهوائية.

Introduction

اثنين-فوتون إينترافيتال المجهري (2 فناقلات الأمراض) أسلوب فعال للوقت الحقيقي التصوير من خلية إلى خلية التفاعلات التي تحدث في البيئة الطبيعية على1. واحدة من المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب أنه يتيح دراسة العمليات الخلوية في عمق عينة أكبر (500 ميكرومتر إلى 1 ملم) بالمقارنة مع سائر تقنيات التصوير التقليدية2. في الوقت نفسه، يقلل استخدام اثنين الفوتونات منخفضة الطاقة المتولدة عن الليزر اثنين-فوتون تلف الأنسجة الصور المرتبطة عادة ب عملية اقتناء الصورة2. خلال العقد الماضي، طبق ف 2-ناقلات الأمراض لدراسة مختلف أنواع التفاعلات خلية في عدة تخصصات3،،من45. وكانت هذه الدراسات ذات الصلة وبخاصة للتحقيق في الخلايا المناعية، التي تتميز بديناميتها عالية وتشكيل جهات بارزة بعد الإشارات التي تم إنشاؤها بواسطة الخلايا الأخرى والبيئة. 2 فناقلات طبق أيضا على دراسة التفاعلات بين العوامل الممرضة والمضيفة6. وفي الواقع، سابقا ثبت أن بعض العوامل الممرضة يمكن أن تغير نوع ومدة بالاتصالات بين الخلايا المناعية، تعوق الاستجابة المناعية7، نتيجة لذلك.

الغشاء المخاطي لمجرى الهواء هو أول موقع الاستجابة المناعية ضد العوامل الممرضة المحمولة جوا التي ولدت8. ولذلك، في فيفو تحليل التفاعلات المضيف الممرض في هذا النسيج أمر حاسم لفهم الشروع في آليات الدفاع المضيف أثناء الإصابة. 2 فناقلات الأمراض للخطوط الجوية غير صعبة أساسا نظراً للنتائج الملموسة التي تنتجها دورة التنفس للحيوان، الذي يعرض للخطر عملية الحصول على الصور. في الآونة الأخيرة، وقد وصف النماذج الجراحية المختلفة للتصوير القصبة الهوائية موريني9،10،11،12 والرئتين13،،من1415، 16. تمثل نماذج الرغامى ف 2-ناقلات الأمراض إعداد ممتاز لتصور المرحلة الأولى من رد فعل المناعة في الخطوط الجوية العليا، بينما نماذج ف 2-ناقلات الأمراض الرئة-الحويصلات الهوائية أكثر ملاءمة للدراسة في المرحلة المتأخرة من العدوى. نماذج الرئة المتقدمة هذا القيد المرتبطة بوجود الحويصلات الهوائية المملوءة بالهواء، التي تحد من اختراق الليزر الضوئية وجعل الطبقة المخاطية للخطوط الجوية الخزعات التي يتعذر الوصول إليها في فيفو التصوير17 . على العكس من ذلك، وهيكل القصبة الهوائية، التي شكلتها ظهارة مستمر، يسهل الحصول على الصور.

نقدم هنا، بروتوكولا يتضمن وصفاً مفصلاً للخطوات المطلوبة للقيام بعدوى الإنفلونزا، وإعداد العمليات الجراحية للحيوانات، وف 2-ناقلات الأمراض من القصبة الهوائية. وبالإضافة إلى ذلك، يصف لنا مجموعة تجريبية محددة للتصور من العَدلات والخلايا الجذعية (DC)، نوعين من الخلايا المناعية تلعب دوراً هاما كوسطاء لآلية الدفاع ضد فيروس الإنفلونزا18،19 . وأخيراً، يصف لنا إجراء تحليل التفاعلات العَدلات-DC. جهات الاتصال هذه قد ثبت أن تعدل DC التنشيط، ومن ثم تؤثر على الاستجابات المناعية ضد العوامل الممرضة20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وافق جميع الإجراءات الحيوان الفئران التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية "مكتب الطب البيطري الفدرالي السويسري" والبروتوكولات الحيوان سلطات بيطري محلي.

1. الإنفلونزا العدوى من الفئران CD11c-يفب

  1. السلامة الأحيائية
    ملاحظة: الماوس تكيف السلالة من الإنفلونزا H1N1 A/Puerto ريكو/8/34 (PR8) كان يزرع في البويضات المخصبة وتنقيته ومعاير كما هو موضح سابقا21. جميع الخطوات التي تنطوي على الحيوانات المصابة أو عينات بيولوجية كانت تجري بالسلامة الأحيائية مجلس الوزراء وفقا لمستوى السلامة الأحيائية (BSL) شروط 2.
    1. تنظيف مجلس الوزراء السلامة الأحيائية بمحلول إيثانول 70% قبل وبعد الإجراء العدوى.
    2. تجاهل جميع النفايات المنتجة خلال هذا الإجراء السليم الذي السلامة الأحيائية المبادئ التوجيهية التالية (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). التخلص من النفايات الصلبة في صناديق أوتوكلافابل والسوائل الملوثة في أكياس بلاستيكية مملوءة بالمطهر الطبي أو حل إيثانول 70%.
  2. عدوى الإنفلونزا يعطي داخل الآنف
    ملاحظة: B6. واستخدمت في هذه الدراسة cg-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/ي (CD11c-يفب)22 على خلفية C57BL/6J. وأبقى على الفئران في مرفق خالية من مسببات الأمراض خاصة في معهد للبحوث في الطب الحيوي.
    1. مكان كحد أقصى 5 العمر والجنس-المطابقة (ستة إلى ثمانية عاماً الأسبوع) CD11c-يفب الفئران في قفص. الانتظار لمدة يومين على الأقل للفئران التأقلم لظروف السكن قبل الإجراء العدوى.
    2. تذويب PR8 المخزون وإعداد تمييع المقابلة باستخدام x 1 الباردة المالحة العازلة فوسفات دولبيكو لتعديلها بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم (PBS) للحصول على تركيز نهائي 200 لوحة تشكيل وحدات (بفو) في 30 ميليلتر. إبقاء الفيروس تمييع على الجليد أثناء الإجراء بأكمله.
      ملاحظة: ينصح المعايرة لكل دفعة من فيروس الإنفلونزا قبل استخدامه التأكد من جرعة إصابة بدقة.
    3. حقن جرعة من الكيتامين (100 مغ/كغ) وإكسيلازيني (10 مغ/كغ) إينترابيريتونيلي (القائمة) باستخدام حقنه 1 مل إبرة ز 26.
    4. الانتظار حتى يتم الماوس تماما تخديره (خسارة كاملة للاستقامة ودواسة منعكس سحب). التخدير العميق ضروري لعدوى أمثل، حيث سيتم ابتلاع الفئران تماما عدم تخديره أو طرد العدوى الفيروس، مما يؤدي إلى اختلافات في جرعة العدوى.
    5. ضع الماوس أنيسثيتيزيد في موقف ضعيف. جمع 15 ميليلتر من فيروس العدوى. ضع طرف ماصة قريبة من الآنف الأيمن الماوس والاستغناء عن العدوى الفيروسية قطره قطره. كما يجب أن يكون استنشاقه قطرات، لا "الماصة؛" لهم مباشرة داخل تجويف الآنف.
    6. الانتظار 2-5 دقائق ووضع طرف ماصة تحتوي على ميليلتر 15 الباقية من فيروس العدوى في منخر الحق.
      ملاحظة: لتجنب الاختناق، الاستغناء عن قطرات صغيرة الحجم في حوالي 20 s الفواصل.
    7. تحقق من أن الماوس هو التنفس بشكل صحيح ووضعه في قفص في الأفقي استلقاء. رصد الماوس التنفس والتخدير الإنعاش (حوالي 60 دقيقة بعد التعريفي).
      ملاحظة: من الممكن أن تصيب الماوس أكثر من 1 في نفس الوقت. في هذه الحالة، إدارة العدوى الفيروسية في الآنف الأيسر من جميع الفئران في تسلسل والانتظار لمدة 2-5 دقائق وثم إدارة الفيروس في الآنف الصحيح. لتجنب التباين بين الأفراد، تصيب الفئران لا يزيد عن 3 في نفس الوقت.
    8. مراقبة صحة الحيوان مركز وفقدان الوزن يوميا.
    9. Euthanize الفئران وفقا لنقطة النهاية إنسانية يحدد المبادئ التوجيهية للسلطة. يجب أن تكون معتمدة من قبل السلطات الحيوان التجريب أسلوب القتل الرحيم ويجب احترام القواعد الأخلاقية المحلية. وبعد تجارب اثنين-فوتون، euthanize الفئران الإدارة من جرعة زائدة من الكيتامين/xylazine متبوعاً بخلع عنق الرحم. في جميع التجارب الأخرى، استخدم استنشاق أول أكسيد الكربون2 كأسلوب للقتل الرحيم.
      ملاحظة: يمكن إجراء المقايسة (RT-PCR) كما هو موضح سابقا23لقياس التتر الفيروسية من القصبة الهوائية المصابة أو المقايسة الجرعة المعدية (TCID50) زراعة الأنسجة 50% أو الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل.
  3. تقييم لتجنيد العَدلات في القصبة الهوائية بالتدفق الخلوي
    ملاحظة: يكون هذا الجزء من البروتوكول الاختياري. ويهدف إلى تقييم تجنيد العَدلات في مخاطية الرغامى بعد الإصابة بالإنفلونزا.
    1. Euthanize الفئران المصابة وغير مصاب مراقبة في اليوم الثالث بعد الإصابة (بي) باستنشاق أول أكسيد الكربون2 .
      ملاحظة: للحيلولة دون تلف الرغامى، تجنب استخدام التفكك عنق الرحم إلى euthanize الحيوانات. بالإضافة إلى ذلك، ينصح نضح euthanized الفئران لتفادي التلوث من العَدلات الدم.
    2. رش الرقبة الماوس مع الحل الإيثانول 70% وتنفيذ شق جلد باستخدام مقص جراحي من الصدر إلى الذقن.
    3. فصل في الغدد اللعابية استخدام الملقط وفضح القصبة الهوائية.
    4. تشريح العضلات حول القصبة الهوائية باستخدام الملقط، والمقص.
      ملاحظة: هذه الخطوة يجب إجراء بعناية منذ القصبة الهوائية يمكن أن تتلف بسهولة أثناء الإجراء.
    5. عقد القصبة الهوائية بالملقط وفصل المريء بعناية بالتشريح.
    6. عقد الجزء الوعائي من القصبة الهوائية مع الملقط، جعل شق في بداية الشجرة الشعب الهوائية. ثم فصل القصبة الهوائية من الحنجرة وإزالة بعناية أي عضلات غادر.
    7. ضع الجهاز في أنبوب 1.5 مل تحتوي على RPMI 1640 + حبيس المتوسطة (ربمي) على الجليد.
    8. إعداد الخليط إنزيم الهضم القصبة الهوائية، التي تتضمن 0.26 وحدة/مل من كولاجيناز (الأول والثاني) و 0.2 مغ/مل من الدناز في ربمي.
    9. مكان تشريح القصبة الهوائية في صفيحة 6-البئر الذي يحتوي على 1 مل مزيج الإنزيم.
    10. قطع الجهاز إلى قطع صغيرة بالمساعدة ملقط ومقص. تبقى لوحة على الجليد أثناء هذه الخطوة.
    11. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. وخلال هذا الوقت، اهتز لوحة كل 15 دقيقة.
    12. وقف إنزيم الهضم عن طريق إضافة 1 مل من نظام مراقبة الأصول الميدانية الغسيل المخزن المؤقت (2 مم يدتا و 2% معطل الحرارة تصفية تعقيم الجنين البقري المصل (FBS)) في برنامج تلفزيوني.
    13. ريسوسبيند الحل مع ماصة 1 مل للمساعدة في أن تنأى بالقطع عسر الهضم جزئيا من الأنسجة.
    14. نقل الحل إلى بئر أخرى بتمرير المحتوى من خلال مصفاة 40 ميكرومتر. ثم، بلطف تحطيم القطع المتبقية للجهاز المحاصرين على رأس مصفاة استخدام المكبس حقنه 2 مل.
      ملاحظة: تحطيم القطع عسر الهضم جزئيا من القصبة الهوائية عبر مصفاة خطوة حاسمة الحصول عدد أمثل من الخلايا أثناء تحليل تدفق سيتوميتريك.
    15. تغسل جيدا وفي المصفاة مع نظام مراقبة الأصول الميدانية الغسيل المخزن المؤقت ونقل التعليق في أنبوب 5 مل أبقى على الجليد.
    16. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 166 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية الغسيل المخزن المؤقت.
    17. المضي قدما في تلطيخ جسم السطحية للتدفق الخلوي. بإيجاز، كتلة مستقبلات Fc من الخلايا المعزولة باستخدام جسم مضاد ضد CD16/32، متبوعاً تلطيخ السطحية. لتحديد العَدلات بشكل صحيح، يجب أن تحتوي لوحة قياس التدفق الأضداد التالية: αLy6G، αCD11b، αCD45، فضلا عن بقاء صبغ لاستبعاد الخلايا الميتة.
    18. تشغيل المحتوى كله من العينات في سيتوميتير تدفق وتحليل البيانات.
      1. للحصول عدد أمثل من الخلايا المناعية، تشغيل تعليق خلية مفردة بسرعة لا تفوق 3,000 الأحداث/s. هذا سوف تقليل عدد الأحداث المستبعدة خلال اقتناء. باستخدام هذا البروتوكول، ينبغي أن يكون من الممكن الحصول على 1 إلى 2 مليون من الخلايا في القصبة الهوائية.

2-العزلة وحقن من العَدلات

ملاحظة: في هذا الإجراء، B6.129 (الممثل المدني)--تيراغرام (كاج-اكفب) CK6Nagy/ياء الفئران (CK6-اكفب) كانت تستخدم24. عن هذه الحيوانات الحراجية المعتمدة في جميع أنواع الخلايا تحت المروج البشرية β-أكتين. وبدلاً من ذلك، من الممكن أيضا استخدام الفئران C57BL/6J لعزل الخلايا ووصمة عار لهم وفقا للبروتوكول هو موضح في الخطوة 2، 6. تنقية والتلاعب في العَدلات قد يزيد وضعهم التنشيط، يحتمل أن تغيير خصائصها الوظيفية والكثيرة الارتحال.

  1. Euthanize الحيوان باستنشاق أول أكسيد الكربون2 .
  2. إزالة كل قصبة وتيبياس وتنظيفها برفق باستخدام الملقط.
  3. قطع epiphyses العظام وتدفق نخاع العظام باستخدام حقنه 1 مل مليئة ببرنامج تلفزيوني الباردة العقيمة، في أنبوب 50 مل أبقى على الجليد.
  4. ريسوسبيند الخلايا مع إبرة 18 جرام وتصفية تعليق خلية مع مصفاة 40 ميكرومتر. أغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني في 110 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند الخلايا في 2 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
  5. تمييع 100 ٪ بركل 9:1 في برنامج تلفزيوني x 10 وإعداد الحلول المتدرجة من بركل 72%، 64% و 52% 1 x PBS باستخدام. الطبقة 2 مل لكل من التدرجات الثلاثة في أنبوب 15 مل بعناية، بدءاً من الأكثر تركيز واحد.
    1. أضف بعناية 2 مل تعليق خلية نخاع العظم على رأس التدرجات وأجهزة الطرد المركزي في س 1,100 ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) دون تسريع والفرامل.
  6. بعناية إزالة الفرقة في مجال التفاعل بين 64 في المائة و 72 في المائة وغسله مرة واحدة في 200 x غ لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية مع برنامج تلفزيوني الباردة. ريسوسبيند الخلايا في حجم 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني وإبقائهم على الجليد. نقاء العَدلات من المتوقع أن يكون أعلى من 90%.
  7. بشكل اختياري، تسمية العَدلات مع مجموعة انتشار خلايا باستخدام البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. إضافة الصبغة إلى تعليق خلية لتركيز نهائي 10 ميكرومترات في حجم 1 مل واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ويغسل (166 س ز، 5 دقيقة).
  8. تقدير تركيز الخلية باستخدام هيموسيتوميتير وحقن الوريد 5 × 106 خلايا في حجم الحد أقصى من 100 ميكروليتر في الفئران المصابة سابقا CD11c-يفب+ استخدام ز 26 إبرة 1 مل حقنه، ح 12 قبل التصوير.

3-إعداد الماوس للتصوير

  1. التخدير
    1. تخدير الفئران CD11c-يفب+ المصابة في اليوم 3 بي وفقا للخطوة 1.2.3.
    2. حالما يتم تخديره عميق من الفئران، تعد قسطرة للتخدير إعادة الجرعات.
      1. إزالة إبرة 30 جرام من حقنه باستخدام الملقط.
      2. أدخل الإبرة لقطعة 20 سم من أنابيب السيليكون الطبي PE-10.
      3. إدراج 30 غ إبرة حقنه مليئة بخليط الكيتامين/إكسيلازيني على الجانب الآخر من الأنبوب.
      4. إزالة الهواء داخل الأنبوب.
    3. إعداد 20 غ قسطرة متصلة بأنبوب من جهاز إينسوفلاتينج أكسجين للمحافظة على التهوية الآلية (الشكل 1Aأنا). إعداده بنسبة التنفس من 130 نبضة في الدقيقة (b.p.m.) بحجم 0.2 مل استخدام إمدادات غاز أكسجين 100% من المد والجزر.
  2. إعداد الماوس لجراحة
    1. الاحتفاظ بالماوس على لوحة العمليات جراحية مخصصة محددة (1A الشكلالثاني-الثالث) عبر صفيحة ساخنة أو مقعد جراحية ساخنة تعيين في 37 درجة مئوية لكل الوقت لعملية جراحية.
    2. حلاقة الشعر من رقبة الماوس باستخدام حلاقة الكهربائية وكريم مزيل الشعر (الشكل 1Bأنا)-
    3. ضع الماوس فوق الماوس البلاستيك الموضعية (الشكل 1Aالثاني-أ)، إبقاء رأسه الحيوان خارج الموضعية (1B الشكلالثاني) لإنشاء زاوية تسهل تنبيب القصبة الهوائية.
    4. إصلاح الأمامية والكفوف والذيل مع الشريط الجراحي وترطيب العينين الماوس مع هلام فيتامين (أ) إثراء وتطهير الرقبة الماوس (1B الشكلالثاني).
  3. جراحة
    1. تحضير العناصر يعقم بشكل صحيح، إلا وهي المقص والمقص ميكروسورجيكال والملقط.
    2. إجراء شق صغير على محور وسطى طويل العنق، حوالي 1 سم طويل، في منطقة وسط بين أعلى الصدر وخط يمر عبر النقطة السفلي للفك السفلي (1B الشكلالثالث).
    3. التحرك أفقياً بقع الجلد والغدد اللعابية ووضع تصور للقصبة الهوائية، مشمولة بالعضلات. ثم تشريح عضلات القصبة الهوائية بعناية باستخدام الملقط (1B الشكلالثالث).
    4. التنبيب الماوس مع قسطرة وبدء التنفس الاصطناعي (1B الشكلالرابع).
      ملاحظة: وتتألف من جزء البلاستيك الخارجي، الذي يحمي الغشاء المخاطي الرغامى، وابرة حديد داخلية القسطرة. ويمثل وجود الإبرة الحل المثالي لتوسيع وتحقيق الاستقرار في القصبة الهوائية وتنظيم المعرض لها. وسوف تضمن التهوية الاصطناعية عن طريق القسطرة التنفس السليم للماوس.
    5. البدء فورا في التهوية الاصطناعية للماوس جهاز التنفس.
    6. إصلاح القسطرة الارتفاع واتجاه استخدام خطاف جراحي (1B الشكلالخامس) متصل بقضيب معينة على لوحة العمليات الجراحية (1A الشكلالثاني-ب). كشف القصبة الهوائية في نفس الارتفاع من الذقن.
    7. تطويق القصبة الهوائية مع فازلين وتغطية ذلك مع بضع قطرات من برنامج تلفزيوني ساخن مسبقاً لضمان ترطيب مناسب للجهاز (1B الشكلالسادس).
    8. جبل ساترة على أعلى الإعداد. لهذه الخطوة، الصق ساترة على حامل معدني (الشكل 1Bالسابع)، الذي سوف يكون مشدود إلى المترجم XYZ (1A الشكلالثاني-جيم). ضبط المترجم XYZ لوضع ساترة على رأس إعداد العمليات الجراحية.
    9. مكان القسطرة لإدارة التخدير إينترابيريتونيلي (1B الشكلالثامن).
    10. حقن 50 في المائة الجرعة الأولى من الكيتامين/xylazine الخليط كل 30 دقيقة.
      ملاحظة: إعادة الجرعات من 50% إلى 25% المخلوط الكيتامين/xylazine الأولية هو بديلة آمنة وصالحة25. بيد أن هذا البروتوكول المحطة الطرفية ومطلوب التثبيت دقيق للحيوان أثناء الإجراء بأكمله، استخدام جرعات أعلى للحفاظ على طائرة جراحية العميقة للتخدير.

4. في فيفو الوقت الفاصل بين التصوير

ملاحظة: الحصول على الصور وأجرى مع مجهر اثنين-فوتون تستقيم، مجهزة بأشعة الليزر Ti:Sa اثنين وغرفة حضانة درجة الحرارة التي تسيطر 25 X/1.1 غ الماء الغمر والهدف. وكانت فوتومولتيبليرس (PMT) المستخدمة للحصول على الصور كاشفات الهجين أو حساسية عالية جاسب.

  1. وضع المجلس الجراحية باستخدام الماوس أنيسثيتيزيد داخل غرفة الحضانة المجهر (قبل تسخينه عند 37-38 درجة مئوية) وإضافة قطره مياه على ساترة.
  2. تركيز المركز والعثور على أنسجة القصبة الهوائية.
  3. ضبط تردد المسح الضوئي إلى 800 هرتز، مع 520 x 520 بكسل، مجال رؤية ميكرومترات 440 × 4402 وخط متوسط 1.
    1. لحن Ti:Sa الليزر إلى 830 نانومتر لإثارة الجيل الثاني متناسق (SHG) من الكولاجين، مع قوة يدل على مصدر 150 ميغاواط. لحن الليزر Ti:Sa الثاني في 920 نيوتن متر مع 94 ميجاوات في المصدر، تثير الحراجية المعتمدة ويفب.
    2. الهيكل الثلاثي الأبعاد وطريقة اكتساب timelapse مع الإثارة المتزامنة
      ملاحظة: الاحتفاظ بصلاحيات الليزر منخفضة قدر الإمكان للتقليل من فوتوبليتشينج والضيائيه.
  4. سجل الفلورية استخدام قناتين في وضع غير ديسكانيد، مع مرآة مزدوج اللون رئيسي في 560 نانومتر. في التشكيل المستخدمة في هذا البروتوكول، تقسيم مرآة مزدوج اللون ثاني الإشارة في 495 نيوتن متر لفصل قناة 1 (تصفية الانبعاثات 475/50) من القناة 2 (تصفية الانبعاثات 525/50) (الشكل 2 أ). يجمع هذا التكوين SHG الخفيفة من الكولاجين في القناة الأولى، بينما يتم جمع الانبعاثات الحراجية المعتمدة في كلتا القناتين 1 و 2 ويتم جمعها يفب فقط في القناة الثانية.
  5. تعريف مجموعة ميكرومتر 50 على المحور Z، مع حجم خطوة 3 ميكرومتر (فوكسل الحجم 0.86 ميكرو x 3 ميكرومتر). سجل الصور كل 30 ثانية لمجموع مدة 30 دقيقة.
  6. إذا رغبت في ذلك، الحصول على مناطق متعددة. قبل تشغيل المزيد من المقتنيات، فحص العلامات الحيوية ونحثهما التخدير عن طريق القسطرة إذا لزم الأمر (راجع الخطوة 3.3.10).
  7. في نهاية عملية التصوير، euthanize الماوس عن طريق جرعة زائدة من الكيتامين/xylazine متبوعاً بخلع عنق الرحم.

5-صورة التحليل الكمي وتجهيز حركية العَدلات-العاصمة والتفاعل

ملاحظة: استخدمت برنامج تصوير متخصصة في هذا البروتوكول، لتحليل بيانات الفحص المجهري.

  1. بعد الانتهاء من الحصول على الصور د 4، نقل الملفات (البيانات والبيانات الوصفية) على محطة عمل مع الموارد الحسابية كافية (اقترح متطلبات النظام الحد الأدنى: 32 غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي، وحدة المعالجة المركزية سرعة سوليد الدول محركات، مؤخرا، مكرسة الجرافيك على أساس واسع العمارة المتوازية).
  2. فتح الملفات في برامج التصوير.
  3. تشغيل الفيديو والتأكد من أن الخلايا التي تهم مرئية بوضوح وأن التحف التصوير غائبة.
    ملاحظة: وتحقيقا لهذه الغاية، تحقق من أن كل حركة للعينة وتباين السطوع محصورة بما فيه الكفاية. وفي الواقع، تمثل هذه التحديات ل التحليل الآلي26. إذا كانت حركة عينة بين الإطارات المتجاورة المفرط، تطبيق أسلوب تصحيح الانحراف، على سبيل المثال باستخدام قناة SHG كمرجع ثابت. هذا يسمح لتدبير أفضل حركة الخلايا بدلاً من الحركة للعينة. بالإضافة إلى ذلك، وجود خلفية ساطعة أو الحطام، تقليم السطوح أعيد بناؤها باستخدام وحدة التخزين كمعلمة تحديد.
  4. إنشاء محدد قناة تعريب المشارك للخلايا الحراجية المعتمدة+ ، بغية فصل إشارة بين الحركة والكولاجين (SHG). وتحقيقا لهذه الغاية، الدلالة مضلع النابضة (الشكل 2Bأنا) الذي يحدد فقط فوكسيلس بعد كثافة إيجابية سواء في قناة الأخضر في القناة الزرقاء.
    ملاحظة: هذا الإجراء قد تختلف وفقا لتصفية مجموعة من المجهر وتلطيخ الخلايا. يمكن أن يتحقق عن طريق تحديد فقط فوكسيلس بكثافة كافية في كل من الأخضر والأزرق القنوات. بين الأدوات المتاحة، يمكن استخدام وظيفة "كولوك" لحساب قناة كولوكاليزاتيون استناداً إلى مستوى العتبة كثافة تلقائياً. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام أساليب تستند إلى التعلم الآلي لهذه الخطوة بالإشراف الخبراء27.
  5. كشف وتعقب الخلايا الحراجية المعتمدة+ ، والتعمير السطح التلقائي باستخدام وتتبع (أداة السطحية) عبر قناة التعريب المشارك المناسب.
    ملاحظة: curation اليدوية في نهاية المطاف تتبع الأخطاء والاستبعاد من المسارات لمدة أقصر من عتبة محددة (أي، 150 ق) قد تكون مطلوبة.
  6. إنشاء محدد قناة تعريب المشارك للخلايا CD11c-يفب+ ، بغية فصل الإشارات الحراجية المعتمدة ويفب. وتحقيقا لهذه الغاية، الدلالة مضلع النابضة (2B الشكلالثاني) الذي يحدد فقط فوكسيلس وجود كثافة إيجابية في قناة الأخضر ولكن كثافة منخفضة في القناة الزرقاء.
    ملاحظة: ميكروجرافس الممثل تظهر الإشارات من القناة الأولى والقناة 2 والقناة التعريب المشارك للحركة، قناة التعريب المشارك يفب والمزيج من جميع القنوات ويمكن الاطلاع على في 2B الشكلالثالث.
  7. إعادة بناء سطح الخلايا CD11c-يفب+ وتتبع موقفهم على مر الزمن (أداة السطحية).
    ملاحظة: غير مطلوب دليل تصحيح الأخطاء تتبع في نهاية المطاف لهذه الخطوة. والواقع أن سبب الديناميات المعقدة الزمانية للعاصمة، تعمير سطحها دقيقة من البيانات ف 2-ناقلات الأمراض هو مهمة صعبة لا يمكن أن تتحقق مع البرمجيات المتاحة تجزئة. بين الأسباب التي تجعل هذه المهمة الصعبة، نتوءات رقيقة وتغيرات سطوع لا تسمح باستخدام بعض تقنيات معالجة الصور، مثل تجانس مرشحات أو العتبة ثابتة. وعلاوة على ذلك، في شبكة العاصمة، من الصعب فصل الخلايا المفردة فقط استناداً إلى مظهرهم في البيانات ف 2-ناقلات الأمراض. لهذه الأسباب، بدلاً من محاولة تجزئة دقيقة بتوليف معلمات البرامج، نقترح إعادة بناء الأسطح غير دقيقة من العاصمة. ثم، معالجة الأخطاء المحتملة عن طريق قياسات قوية كما هو موضح في 5.8.
  8. قياس الهجرة الخلية.
    1. تصدير تدابير الهجرة الكلاسيكي للحركة+ والخلايا CD11c-يفب+ . ويشير إلى "تعني سرعة المسار" بين هذه، متوسط سرعة الهجرة من الخلايا بينما "تعقب الاستقامة" يشير إلى الاتجاه للخلايا. يمكن تصدير هذه التدابير كملف جدول بيانات من برامج التصوير.
    2. في ملفات جدول بيانات تم تصديرها، بحساب "الاستقامة تصحيح المسار" (المشار إليها أيضا كنسبة الولادة المصوبة) الحراجية المعتمدة+ والخلايا CD11c-يفب+ ، الذي يعرف بأنه "الاستقامة المسار" مضروبة في الجذر التربيعي "تعقب مدة" مقسوماً على الجذر التربيعي لمدة الفيديو. وهذا التدبير أكثر قوة من "تعقب الاستقامة" حضور قصيرة المسارات28، التي تنشأ على سبيل المثال من تتبع الأخطاء.
      ملاحظة: يمكن مقارنة أشرطة الفيديو فقط من نفس الطول بهذا التدبير.
  9. قياس التفاعل الخلية.
    1. تحديد جهة اتصال بين خلية الحراجية المعتمدة+ وخلية CD11c-يفب+ إذا كانت المسافة التي تفصل بينهما (أقرب فوكسيلس) مساوية أو أقل من عتبة (أي 2 ميكرومتر).
      ملاحظة: يجب أن تكون صارمة بما فيه الكفاية للكشف عن اتصال فقط عندما تكون الخلايا على مقربة من هذه العتبة. ومع ذلك، ونحن نشجع للحفاظ على هذه العتبة أكبر من 0, N مثالي مرات أكبر من دائرة نصف قطرها فوكسل (N > 2)، نظراً لتجانس الحدود يمكن أن تجعل إعادة إعمار خلايا أصغر من حجم الخلية الفعلية.
    2. عد العدد ومدة الاتصالات بين الحركة+ والخلايا CD11c-يفب+ . في برامج التصوير يمكن أن يتم ذلك على سبيل المثال بتنفيذ سد "قبله وتشغيل" في. يمكن تصدير هذه التدابير كملف جدول بيانات من علامة التبويب الإحصائيات.
  10. استيراد التدابير التي سبق حسابها في برامج إحصائية، وتوليد المؤامرات وإجراء الاختبارات الإحصائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا العمل، وصفناها بروتوكول مفصل للدراسة في فيفو الحركية والتفاعلات بين العَدلات والعاصمة أثناء الإصابة بالإنفلونزا في القصبة الهوائية مورين (الشكل 3A). لهذا الغرض، ونحن عزل الحراجية المعتمدة+ العَدلات (نقاء 92%؛ الشكل 3) من CK6-اكفب الفئران ونحن أدوبتيفيلي نقلتهم إلى ماوس يفب CD11c مصابة بإنفلونزا. وبعد ذلك، أجرينا ف 2-ناقلات الأمراض من القصبة الهوائية في بي يوم 3 عند هذه النقطة من الوقت لاحظنا توظيف واضحة من العَدلات في المنطقة المصابة، كما يتضح من تحليل تدفق سيتوميتريك (الشكل 3). البروتوكول ف 2-ناقلات الأمراض يتطلب استخدام لوحة العمليات جراحية محددة ومورد لأكسجين للقوارض (الشكل 1A). توريد الأوكسجين من خلال قنية إدراجها في القصبة الهوائية ساعدت الحيوان التنفس، ويسرت المعرض من القصبة الهوائية، والخاضعة لسيطرة حركة الجهاز المرتبطة بالتنفس (الشكل 1B). في أعقاب هذا التشكيل التجريبية، اكتسبناها مستقرة د 4 الصور في فيفو في القصبة الهوائية المصابة خلال فترة 30 دقيقة (الشكل 3Dفيلم 1).

يسمح تحليل الصور 4 د المكتسبة من خلال برامج التصوير المتخصصة لقياس هجرة الخلايا والتحديد الكمي لديناميات الزمانية العَدلات والعاصمة. فيما يتعلق بحركية الخلية، لاحظنا فوارق كبيرة بين حركة العاصمة والعدلات المعينين، الذي أظهر بسرعة أكبر كثيرا من هذا الأخير (الشكل 4 أ). وتؤكد هذه النتيجة الطبيعة الدينامية العَدلات، الموصوفة سابقا كخلايا متحركة عالية قادرة على ترحيل نحو مصدر تشيمواتراكتانت29. فيما يتعلق باتجاهيه، خلصنا إلى أن مورفولوجيا معقدة من العاصمة أسفرت عن أخطاء متكررة في خلية تتبع، الذي بدوره أنتج المسارات مع تناقص المدة وزيادة التباين يقاس سلوك الاتجاه (الشكل 4 باء). لهذا السبب، نحن يحسب متري قوية قادرة على قياس اتجاهية بالنظر في مدة المسار. باستخدام هذا المقياس، لاحظنا اختلافاً كبيرا في اتجاه العَدلات مقابل DC (الشكل 4).

بالإضافة إلى ذلك، يسمح حساب المسافة بين العاصمة والعدلات لكشف وتحليل اتصالاتهم مع مرور الوقت. وفي هذا النموذج التجريبي، لاحظنا بعض العَدلات التي شكلت اتصالات متعددة-موجز بالعاصمة وغيرها التي لا تشكل أي اتصال أثناء فترة المصورة (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، دراسة اتجاه متوسط المسافة بين العاصمة والعدلات مع مرور الوقت يسمح لنا لدراسة تحديد المواقع الشاملة للخلايا المدروسة (4E الشكل)، أثناء التحقيق في هذا الاتجاه في خلايا معينة يسمح بتميز سلوك لكل خلية واحدة (4F الرقم2 الفيلم).

Figure 1
رقم 1: المعدات والخطوات للناقلات ف 2 من القصبة الهوائية مورين. (منظمة العفو الدولية) تخدير الحيوان المحمولة النظام المسؤول عن التهوية الآلية متصل بمضخة أن إمدادات الأوكسجين إلى الماوس. الجبهة رأي (أخي) وعرض الجانب (أيي) المجلس الجراحية مصنوعة خصيصا تستخدم لنموذج القصبة الهوائية. ويتألف المجلس من مرحلة المعادن مع ماوس بلاستيك موضعية (أخي-أ)، رود للضغط المشبك منقولة (أخي-ب)، ودفع غرامة الانضباطي XYZ مترجم (أخي-ج). (ب) خطوات متسلسلة من طراز الجراحية الرغامى: (Bi) لإزالة الشعر من منطقة العمليات الجراحية، (Bii) لتحديد المواقع الماوس أنيسثيتيزيد في المجلس الجراحية، (بيي) المعرض الجراحية في القصبة الهوائية، (Biv ) تنبيب مع قسطرة مع التنفس الاصطناعي، وتثبيت القسطرة (Bv)، (جزر فيرجن البريطانية) بالإضافة لبرنامج تلفزيوني إلى القصبة الهوائية المكشوفة، تصاعد (بفيي) ساترة، ووضع قسطرة (بفييي) مع التخدير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الكشف عن إشارة مضيئة أثناء ف 2-ناقلات الأمراض- (أ) التمثيل التخطيطي لاكتشاف المجهر تصفية الإعداد وقنوات المقابلة. مرآة مزدوج اللون في يفصل 560 نانومتر الأزرق/الأخضر من انبعاثات الأحمر الأحمر/المتطرف. مرآة مزدوج اللون إضافية في 495 نانومتر يستخدم لزيادة الاعتراف بمختلف المناطق من طيف الانبعاث. وتوظف القناة 1 كاشف هجين (تصفية الانبعاثات 475/50)، بينما القناة 2 الاستخدامات حساسية عالية جاسب PMT (تصفية الانبعاثات 525/50). (ب) مبعثر الممثل دوت المؤامرات إشارات ف 2 عرض الاستراتيجية النابضة لتوليد قنوات كولوكاليزيشن للتعرف على الإشارات القادمة من الحراجية المعتمدة (Bi) و fluorophores يفب (Bii). (بيي) ميكروجرافس الممثل تظهر إشارات محددة من قناة 1 (الفصل 1، الأزرق الداكن) والقناة 2 (Ch 2، الأخضر) وقناة التعريب المشارك الحراجية المعتمدة (أزرق فاتح)، وقناة التعريب المشارك يفب (أصفر) والمزيج من جميع القنوات (الفصل 1 + الفصل 2 + CFP + يفب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تصوير د 4 إينترافيتال العَدلات والعاصمة في القصبة الهوائية إنفلونزا المصابة. (أ) ملخص تخطيطي للبروتوكول. (ب) تبين النسبة المئوية العَدلات فيما يتعلق بمجموع الخلايا CD45 + في تعليق خلية معزولة عن مورين نخاع العظام باستخدام أسلوب التدرج في بركل سكاتيربلوت سيتوميتريك تدفق الممثل. (ج) تدفق الممثل سيتوميتريك سكاتيربلوتس تظهر زيادة في تواتر حدوث العَدلات في تراتشيس من الفئران مصابة بالمقارنة بالفئران المصابة بفيروس الإنفلونزا في يوم 3 بي (د) (اللوحة اليمنى) الصورة التشريحية للفئران القصبة الهوائية عرض المنطقة المختارة للحصول على الصور. (اللوحة اليمنى) الممثل 3D الإسقاط صورة مجهرية ناقلات الأمراض ف 2 عرض تعمير السطحية من العَدلات (أزرق فاتح) والعاصمة (أصفر) جنبا إلى جنب مع المسارات في اليوم 3 بي SHG إشارة ترد في الظلام الأزرق. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: توصيف العَدلات وديناميات الهجرة والتفاعل DC في الإنفلونزا إصابة القصبة الهوائية. قطع الممثل عرض سرعة المسار يعني (أ) وتتبع الاستقامة (ب) وتصحيح المسار الاستقامة (ج)، كما حددها بلطمان وزملاؤه (2009)28، من العَدلات والعاصمة في القصبة الهوائية في بي يوم 3 مع فيروس الإنفلونزا. قياس الاستقامة تصحيح المسار المعارض متانة لتتبع الأخطاء. (د) المدرج التكراري 2D عرض تواتر العَدلات وفقا لعدد الاتصالات مع العاصمة ومتوسط مدة الاتصال. () متوسط المسافة من العَدلات إلى وحدة تحكم المجال DC الأقرب خلال مدة الفيلم. (و) (إلى اليسار) تحليل المسافة من ممثل العَدلات إلى أقرب وحدة تحكم المجال في الوقت. يشير الخط الأحمر المنقط إلى عتبة المسافة النظر في أن العَدلات إنشاء جهة اتصال مع وحدة تحكم المجال DC. (حق i-ثالثا) ميكروجرافس المكتسبة في نقاط زمنية مختلفة تمثل هجرة العَدلات (أزرق فاتح) إلى وحدة تحكم المجال DC (أصفر). يتم عرض المسارات الخلية كخط متعدد الألوان يتغير لونها من اللون الأزرق إلى اللون الأحمر لتمثيل الوقت. ويرد إشارة SHG من الكولاجين فيبريلاري باللون الأزرق الداكن. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. في كل الأرقام، تمثل البيانات المقدمة على الأقل ثلاث تجارب مستقلة. وترد نتائج يعني ± إحصاءات التنمية المستدامة. قبل اختبار وولش. ns p > 0.05؛ ف < 0.0001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Movie 1
الفيلم 1: العَدلات والعاصمة الديناميات في القصبة الهوائية أثناء الإصابة بالإنفلونزا. 30 دقيقة الوقت الفاصل بين صورة ثلاثية الأبعاد تظهر ديناميات التفاعل بين العَدلات (أزرق فاتح) والعاصمة (أصفر)، فضلا عن المسارات الخاصة بكل منها فيما يتعلق بشبكة الكولاجين (أزرق داكن) من القصبة الهوائية. يتم الإشارة إلى الممثل العَدلات-DC التفاعلات بالأسهم البيضاء. يتم عرض المسارات الخلية كخط متعدد الألوان يتغير لونها من اللون الأزرق إلى اللون الأحمر لتمثيل الوقت. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Movie 2
الفيلم 2: تفاعل العَدلات-DC قصيرة الأجل الممثل في القصبة الهوائية أثناء الإصابة بالإنفلونزا. صورة 3D الوقت الفاصل بين 30 دقيقة تبين وجود تفاعل ممثل بين من العَدلات (أزرق فاتح) ووحدة تحكم المجال DC (أصفر) وعلى كل المسارات. يتم عرض المسارات الخلية كخط متعدد الألوان يتغير لونها من اللون الأزرق إلى اللون الأحمر لتمثيل الوقت. إشارة SHG من الكولاجين يظهر باللون الأزرق الداكن. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويعرض هذا العمل بروتوكول مفصل لتوليد صور 4 د تظهر هجرة العَدلات أدوبتيفيلي المنقولة وتفاعلاتها مع العاصمة خلال عدوى إنفلونزا في القصبة الهوائية الماوس. سوف يكون النموذج المبين ف 2-ناقلات الأمراض ذات الصلة لدراسة ديناميات الخلايا المناعية أثناء التهاب في الشعب الهوائية.

في الآونة الأخيرة، كانت عدة نماذج تستند إلى تصور ديناميات الخلية في الخطوط الجوية المتقدمة9،،من1011،،من1213،14،15 ،16. ومع ذلك، في فيفو تصوير الرئة لا تزال صعبة، نظراً الموقف التشريحية لهذا الجهاز والصعوبات التقنية لتقليل الحركة خلال دورة التنفس30. للتغلب على هذه المشاكل، اقترح بعض المؤلفين استخدام دائرة شفط دائرية مبنية خصيصا، التي يلزم إدراجها جراحيا في الصدر13،14. ومع ذلك، يتطلب هذا الإجراء تدخل الغازية التي يمكن أن تنال من النتائج، لا سيما في تلك الدراسات التي ركزت على التحقيق في الاستجابة الالتهابية. وعلاوة على ذلك، يقدم الرئة الجراحي نماذج قيداً لتصوير الأنسجة العميقة بسبب إنكسار الضوء التي نشأت عن طريق الهواء في الحويصلات الهوائية17. على العكس من ذلك، نماذج مختلفة من القصبة الهوائية وقد استخدمت مؤخرا لدراسة ديناميات الخلية في ظهارة مجرى الهواء. تصوير هذا الجهاز يقدم مزايا واضحة مقارنة بالرئة، مثل جراحة بسيطة نسبيا اللازمة لكشف وشل الجهاز، فضلا عن إمكانية الوصول إلى أعلى ظهارة الرغامى. النموذج المقترح الرغامى أيضا ذات صلة بالتحقيق بدء الاستجابة ضد مجرى الهواء من مسببات الأمراض، مثل فيروس الإنفلونزا، حيث القصبة الهوائية واحدة من المواقع الأولى للنسخ المتماثل الفيروسية أثناء الإصابة بالإنفلونزا8.

من المثير للاهتمام، نشرت دراسة عرض بديل خال من تنبيب الأسلوب للتصوير في القصبة الهوائية وقد مؤخرا12. هذا الأسلوب يتميز انخفاض التهاب ويبين مزايا واضحة في الدراسات التي يحتاج فيها الدالة موكوسيلياريتي للخلايا الظهارية للحفاظ عليها. ومع ذلك، هذا الأسلوب لا يضمن الاستقرار كافية والحصول على إشارات أكثر إشراقا اللازمة لدراسة الاتصالات خلية خلية في نطاق عدد قليل ميكرومتر. على العكس من ذلك، الطريقة التي عرضت في البروتوكول الحالي يوفر التثبيت أفضل للجهاز شكرا التنبيب، ويتيح الكشف عن الإشارات fluorescence أقوى نتيجة المسافة أقصر بين الجهاز و ساترة12.

إنجاز التثبيت الأنسجة خلال في فيفو ف 2-ناقلات صورة اقتناء هو الخطوة الأكثر أهمية لتوليد البيانات الأمثل. وتشمل بعض التدابير الحاسمة التي تساهم في استقرار طريقة عرض: تخدير ماوس مناسب؛ تنبيب ماوس صحيح؛ وعرضا جراحية في القصبة الهوائية التي تسمح سهولة وصول إلى الجهاز قبل ساترة. بالإضافة إلى ذلك، ستعزز التصوير العدد الصحيح من الخلايا (خلايا 30 من الناحية المثالية كل مجال الرؤية) النتائج التي تم الحصول عليها. تعيين العدد الأمثل للخلايا سيتوقف إلى حد كبير على جرعة العدوى الفيروسية، الذي يتأثر كثيرا بالإدارة المناسبة للعدوى الفيروسية.

خطوة حاسمة أخرى من البروتوكول هو المعرض الجراحية في القصبة الهوائية. ويمكن اتخاذ تدابير مختلفة للتقليل من الضرر الذي يلحق الجهاز أثناء الجراحة. على سبيل المثال، القصبة الهوائية وينبغي أن لا يكون مباشرة لمست مع الأدوات الجراحية. بدلاً من ذلك، فإنه ينبغي أن تتعرض عن طريق التلاعب في الأنسجة المحيطة بها فقط (الجلد والغدد اللعابية والعضلات). إذا كان ضروريا، ينبغي معالجة القصبة الهوائية باستخدام العناصر unsharpened. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي بذل الجهود لتجنب حدوث تلف في الأوعية الدموية. أخيرا، لمنع التجفاف الجهاز، من المهم أيضا لتغطية ذلك مع برنامج تلفزيوني فورا بعد الجراحة.

على الرغم من مزايا فريدة من نوعها لهذا الأسلوب على الأساليب الموصوفة سابقا لتصور تفاعلات الخلايا المناعية في الغشاء المخاطي الرغامى، واستخدام هذا النموذج يعرض بعض القيود. كما هو موضح أعلاه، قد يمثل وجود التهاب المرتبطة جراحة الرغامى عيب عند دراسة الاستجابات المناعية. للتغلب على هذا القيد، من الممكن لإدارة العقاقير المضادة للالتهابات قبل البدء في هذا الإجراء. قيد آخر من هذا الطراز بوجود إشارة قوية أوتوفلوريسسينسي الموجودة في الخطوط الجوية، التي تم إنشاؤها أساسا بواسطة الخلايا المقيمين وطبقة المخاط. ينشئ هذه الأسفار غير محددة المصنوعات اليدوية التي قد تعوق التحليل. وعلاوة على ذلك، قد يتم إنشاء حساب مضللة للمعلمة الاستقامة المسار عند الخلية مقارنة المسارات لمدد مختلفة، وعندما تتبع أخطاء إدخال المسارات لمدة قصيرة26. للتغلب على هذه المشكلة، قمنا بتطبيق معامل عقوبة لتصحيح المسار الاستقامة. تصحيح هذا يهدف إلى تقليل تأثير تتبع ملكة جمال في نتائج28.

أحد جوانب الهامة للتجارب ف 2-ناقلات الأمراض هو إمكانية إعادة استخدام الفئران التي خضعت لعملية جراحية والتصوير. في فيفو التصوير البروتوكول المذكورة هنا لا يتطلب جمع القتل الرحيم أو الجهاز الحيوان، مما يترك إمكانية لاستعادة وإعادة استخدام الفئران بعد عملية جراحية لإجراءات أخرى. باستخدام ماوس واحدة، على سبيل المثال، للقيام بتصوير القصبة الهوائية في وقت مختلف النقاط هائلة يمكن إنقاص عدد إجمالي الحيوانات اللازمة في تجربة، ودعم مبدأ الحد من الحيوان . وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أيضا أن يقلل التباين بين الأفراد. ولكن الحيوان الانتعاش وإعادة استخدامها يجب اتباع معايير الرفق بالحيوان التي تشمل إدارة المخدرات مسكن مناسب، والمضادات الحيوية للحيوانات أثناء وقت الاسترداد. يجب تضمين البروتوكول التجارب الحيوانية جميع هذه الإجراءات ومعتمدة من قبل السلطات البيطرية المحلية.

وصف البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لدراسة أنواع الخلايا المناعية الأخرى. على سبيل المثال، قد تستخدم العزل وحقن الخلايا التائية الخاصة بالعوامل الممرضة (الفلورسنت أو الملون) لدراسة ديناميات تنشيط الخلية تي31 ، فضلا عن تفاعلها مع خلايا أخرى مثل العاصمة الرغامى. على نحو مماثل، يمكن أن تمثل التصور من الدم أو الأوعية اللمفاوية نهج مثيرة لاهتمام لدراسة تجنيد الخلايا الملتهبة في أنسجة القصبة الهوائية وأثناء الإصابة. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تطبيق ف 2-ناقلات الأمراض من القصبة الهوائية لدراسة ديناميات الاستجابة المناعية لغيرها من مسببات الأمراض المحمولة جوا. ولذلك، استخدام مسببات الأمراض المحمولة جوا الفلورسنت المحورة وراثيا، مثل العقدية الرئوية32، سيخلق فرصاً جديدة لدراسة تفاعلها مع الجهاز المناعي. على الرغم من أن هذا الإجراء يركز على قياس ديناميات الخلايا المناعية أثناء الإصابة، يمكن تطبيقه أيضا في مختلف الميادين بما في ذلك السرطان، والربو، أو التئام الجروح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيده هذا العمل منح المؤسسة الوطنية السويسرية (SNF) (176124 و 145038 و 148183) والأوروبية اللجنة ماري كوري إعادة الإدماج المنحة (612742)، و SystemsX.ch للحصول على منحة إلى D.U.P. (2013/124).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gigasept instru AF Schülke & Mayr GmbH 4% solution
CD11c-YFP mice Jackson Laboratories 008829 mice were bred in-house
CK6-ECFP mice Jackson Laboratories 004218 mice were bred in-house
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D8537-500ML
10x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D1408-500ML
Percoll PLUS Sigma E0414-1L Store at 4°C
Ketamin Labatec Labatec Pharma 7680632310024 Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture
Rompun 2% (Xylazin) Bayer 6293841.00.00 Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture
26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak BD Plastipak 305501
30 G, 0.3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes BD 324826
Falcon 40 µm Cell Strainer Corning 352340
2 mL Syringes BD Plastipak 300185
Microlance 3x 18 G needles BD 304622
Introcan Safety 20 G (catheter) Braun 4251652.01
6 Well Cell Culture Cluster Costar 3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1x) ThermoFisher Scientific 42401-018 Store at 4°C
Liberase TL Research Grade Roche 5401020001 Store at -20 °C / collagenase (I and II) mixture
DNAse I Amresco (VWR) 0649-50KU Store at -20 °C
CellTrace Violet stain ThermoFisher Scientific C34557 Store at -20 °C
EDTA Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106 Store at -20 °C
PE-10 Micro Medical Tubing 2Biological Instruments SNC #BB31695-PE/1
Surgical Plastic Tape M Plast
Viscotears Bausch & Lomb Store at RT
Plasticine Ohropax
High Tolerance Glass Coverslip 15 mm Round Warner Instruments 64-0733
SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System Kent Scientific SS-01
Nuvo Lite mark 5 GCE medline 14111211
MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) Tem Sega
SURGICAL BOARD University of Bern
TrimScope II Two-photon microscope LaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:Sa lasers Coherent Inc.
25X NA 1.05 water immersion objective Olympus XLPLN25XWMP2
The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller Life imaging Services
Imaris 9.1.0 Bitplane Imaging software
GraphPad Prism 7 GraphPad Statistical software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2, (12), 932-940 (2005).
  2. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21, (11), 1369-1377 (2003).
  3. Fein, M. R., Egeblad, M. Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging. Disease Models & Mechanisms. 6, (3), 580-593 (2013).
  4. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13, (11), 1433-1440 (2010).
  5. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).
  6. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336, (6089), 1676-1681 (2012).
  7. Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10, (5), 353-364 (2010).
  8. Pulendran, B., Maddur, M. S. Innate Immune Sensing and Response to Influenza. Life Science Journal. 6, (4), 23-71 (2014).
  9. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways. Science. 349, (6252), (2015).
  10. Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American journal of respiratory cell and molecular biology. 47, (6), 864-868 (2012).
  11. Kretschmer, S., et al. Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96, (8), 918-931 (2016).
  12. Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Scientific Reports. 7, (1), 694 (2017).
  13. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature. 8, (1), 91-96 (2011).
  14. Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live Imaging of the Lung. Current Protocols in Cytometry. 60, (1), (2012).
  15. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104, (2), 338-346 (2008).
  16. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82, (2), 864-872 (2014).
  17. Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95, (6), 506-513 (2017).
  18. Lambrecht, B. N., Hammad, H. Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology. Annual Review of Immunology. 30, (1), 243-270 (2012).
  19. Camp, J. V., Jonsson, C. B. A role for neutrophils in viral respiratory disease. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
  20. van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN. The Journal of experimental medicine. 201, (8), 1281-1292 (2005).
  21. Gonzalez, S. F., et al. Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes. Nature Immunology. 11, (5), 427-434 (2010).
  22. Lindquist, R. L., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nature immunology. 5, (12), 1243-1250 (2004).
  23. Li, H., et al. Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells. Cellular and Molecular Immunology. 10, (2), 159-164 (2013).
  24. Tran Cao, H. S., et al. Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for "technicolor" cancer imaging. Journal of Cellular Biochemistry. 107, (2), 328-334 (2009).
  25. Jaber, S. M., et al. Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53, (6), 684-691 (2014).
  26. Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. In press (2018).
  27. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. 230-233 (2011).
  28. Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9, (11), 789-798 (2009).
  29. Keller, H. U. Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes. Cell motility. 3, (1), 47-60 (1983).
  30. Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital Microscopy. Immunity. 21, (3), 315-329 (2004).
  31. Lambert Emo, K., et al. Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen. PLOS Pathogens. 12, (9), e1005881 (2016).
  32. Kjos, M., et al. Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of bacteriology. 197, (5), 807-818 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics