Bildgebung Zelle Interaktion in Trachealen Schleimhaut während der Influenza-Virus-Infektion mit Intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie

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Immunology and Infection

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Summary

In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur zwei-Photon intravitalen Bildgebung und Zelle Interaktionsanalyse in der murinen trachealen Schleimhaut nach Infektion mit Influenza-Virus führen. Dieses Protokoll wird für Forscher Immunzelle Dynamik bei Atemwegsinfektionen relevant sein.

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Palomino-Segura, M., Virgilio, T., Morone, D., Pizzagalli, D. U., Gonzalez, S. F. Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58355, doi:10.3791/58355 (2018).

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Abstract

Die Analyse der Zell-Zell oder Zelle-Pathogen Interaktion in Vivo ist ein wichtiges Instrument zum Verständnis der Dynamik der Immunantwort auf eine Infektion. Zwei-Photonen-Mikroskopie intravitalen (2P-IVM) ermöglicht die Beobachtung des Zell-Interaktionen im tiefen Gewebe in lebenden Tieren, bei gleichzeitiger Minimierung der Immunofluoreszenz während der Bildaufnahme generiert. Bisher wurden verschiedene Modelle für 2P-IVM der lymphatischen und nicht-lymphatischen Organe beschrieben. Bildgebung der Atmungsorgane bleibt jedoch eine Herausforderung durch die Bewegung der Atemzyklus des Tieres zugeordnet.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur in-Vivo Immunzelle Interaktionen in der Luftröhre von Mäusen mit 2P-IVM mit Influenza-Virus infiziert zu visualisieren. Zu diesem Zweck entwickelten wir eine benutzerdefinierte Image Plattform, die die chirurgische Exposition und Intubation der Trachea, gefolgt von der Übernahme von dynamischen Bildern von Neutrophilen und dendritischen Zellen (DC) in der Schleimhaut-Epithel enthalten. Darüber hinaus detaillierte wir die notwendigen Schritte zur Grippe intranasale Infektion und Flow durchflusszytometrischen Analyse von Immunzellen in der Luftröhre führen. Zu guter Letzt haben wir Neutrophilen sowie DC Motilität und deren Wechselwirkungen im Laufe eines Films analysiert. Dieses Protokoll ermöglicht für die Erzeugung von stabilen und helle 4-D-Bilder für die Beurteilung der Zell-Zell-Interaktionen in der Luftröhre.

Introduction

Zwei-Photonen-Mikroskopie intravitalen (2P-IVM) ist eine effektive Methode zur Echtzeit imaging von Zell-Zell-Interaktionen, wie sie in ihrer natürlichen Umgebung1vorkommen. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass es die Untersuchung von zellulären Prozessen eine größere Tiefe der Probe (500 µm bis 1 mm ermöglicht) im Vergleich zu anderen herkömmlichen bildgebenden Techniken2. Zum gleichen Zeitpunkt minimiert den Verbrauch von zwei niederenergetischen Photonen durch die zwei-Photonen-Laser erzeugt die Foto-Gewebeschäden in typischer Weise mit dem Bild Erwerb Prozess2verbunden. Während des letzten Jahrzehnts ist 2P-IVM angewendet worden, um verschiedene Arten von Zell-Zell-Interaktionen in mehreren Disziplinen3,4,5zu studieren. Diese Studien wurden besonders relevant zu untersuchen Immunzellen, die sich durch ihre hohe Dynamik und die Bildung von prominenten Kontakte nach erzeugten Signale von anderen Zellen und Umwelt auszeichnen. 2P-IVM wurde auch angewendet, um die Wechselwirkungen zwischen Erreger und Wirt6zu studieren. In der Tat hat bisher gezeigt, dass einige Krankheitserreger die Art und Dauer der Kontakte zwischen Immunzellen behindern, infolgedessen die Immunantwort7verändern können.

Die Schleimhaut der Atemwege ist die erste Website, in der die Immunantwort gegen Krankheitserreger in der Luft ist,8erzeugt. In Vivo Analyse der Erreger-Wirt-Interaktionen in diesem Gewebe ist daher entscheidend für die Einleitung der Wirt Abwehrmechanismen während der Infektion zu verstehen. 2 P-IVM der Atemwege ist jedoch anspruchsvoll vor allem durch die Artefakte produziert von den Atemzyklus des Tieres, die den Prozess der Bildaufnahme beeinträchtigt. Vor kurzem wurden verschiedene chirurgische Modelle für bildgebende murinen Luftröhre9,10,11,12 und Lunge13,14,15beschrieben, 16. Trachealen 2P-IVM-Modelle stellen eine ausgezeichnete Einrichtung, die erste Phase der die Immunreaktion in den oberen Atemwegen zu visualisieren, während Lungen-Alveolen 2P-IVM Modelle besser geeignet sind, um der späten Phase der Infektion zu studieren. Die entwickelten Lunge Modelle präsentieren eine Einschränkung verbunden mit der Anwesenheit von luftgefüllten Alveolen, die optische Eindringtiefe des Lasers zu beschränken und die Darmschleimhaut des Hämoglobin Atemwege unzugänglich für in-Vivo imaging17 . Umgekehrt erleichtert die Struktur der Luftröhre, gebildet durch eine kontinuierliche Epithel Bildaufnahme.

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die eine detaillierte Beschreibung der auszuführenden Influenza-Infektion, chirurgische Vorbereitung der Tiere und 2P-IVM der Luftröhre erforderlichen Schritte enthält. Darüber hinaus beschreiben wir eine bestimmte Versuchsanordnung zur Visualisierung von Neutrophilen und dendritischen Zellen (DC), zwei Arten von Immunzellen, die eine wichtige als Vermittler der Abwehrmechanismus gegen Influenza Virus18,19 Rolle . Schließlich beschreiben wir ein Verfahren zur Neutrophilen-DC Interaktionen zu analysieren. Diese Kontakte haben gezeigt, dass DC-Aktivierung zu modulieren und anschließend auf die Immunantwort gegen Krankheitserreger20auswirken.

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Protocol

Alle tierische Verfahren, die mit Mäusen, in Übereinstimmung mit dem Bundesamt für Veterinärwesen Richtlinien und tierischen Protokolle durchgeführt wurden wurden von den örtlichen Tierarzt Behörden genehmigt.

1. Influenza-Infektion CD11c-YFP Mäuse

  1. Biologische Sicherheit
    Hinweis: Die Maus angepasst-Stamm von A/Puerto Rico/8/34 H1N1 Influenza (PR8) war in befruchteten Eiern gewachsen, gereinigt und titriert als zuvor beschriebenen21. Alles, was die Schritte, die mit infizierten Tieren oder biologischen Proben wurden im Rahmen eines Biosafety Schrank nach Biosafety Niveau (BSL) 2 Bedingungen.
    1. Reinigen Sie das Biosafety-Kabinett mit 70 % Ethanol-Lösung vor und nach der Behandlung der Infektion.
    2. Entsorgen Sie alle Abfallstoffe produziert während dieses Vorgangs nach richtig, die Biosicherheits-Richtlinien (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). Entsorgen Sie feste Abfälle in autoklavierbar Lagerplätze und kontaminierte Flüssigkeiten in Plastiktüten mit 70 % igem Ethanol-Lösung oder einem medizinischen Desinfektionsmittel gefüllt.
  2. Intranasale Infektion mit dem Influenza
    HINWEIS: B6. CG-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c-YFP)22 auf C57BL/6J Hintergrund wurden in dieser Studie verwendet. Mäuse wurden in bestimmten Pathogen-freies Einrichtung am Institut für Forschung in der Biomedizin beibehalten.
    1. Legen Sie maximal 5 Alter und Geschlecht-abgestimmt (sechs bis acht Wochen alten) CD11c-YFP Mäusen pro Käfig. Warten Sie mindestens zwei Tage für Mäuse Akklimatisierung zu Wohnverhältnissen vor der Infektion.
    2. Tauen Sie PR8 Lager ab und bereiten Sie die entsprechenden Verdünnung mit kalten 1 X Dulbeccos Phosphat-Puffer Kochsalzlösung ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid (PBS) geändert, um eine Endkonzentration von 200 Plaque bildende Einheiten (PFU) zu erhalten in 30 µL. halten Sie Virus Verdünnung auf dem Eis während des gesamten Verfahrens.
      Hinweis: Titration von jeder Charge des Influenza-Virus vor der Verwendung wird empfohlen, eine präzise Infektion Dosis zu gewährleisten.
    3. Eine Dosis von Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) intraperitoneale Injektion (i.p.) mit einer 26 G Nadel 1 mL Spritze.
    4. Warten Sie, bis die Maus vollständig betäubt (vollständiger Verlust der aufrichtenden und Pedal Rückzug Reflex) ist. Tiefe Anästhesie ist notwendig für eine optimale Infektion, da nicht vollständig narkotisierten Mäuse werden schlucken oder das Virus Inokulum, was zu Schwankungen in der Infektion Dosis zu vertreiben.
    5. Platzieren Sie die narkotisierten Maus in Rückenlage. Sammle 15 µL des Inokulums Virus. Setzen Sie die PIPETTENSPITZE in der Nähe der Maus linke Nasenloch und verzichten Sie das virale Inokulum tropfenweise zu. Wie Tropfen inhaliert werden müssen, pipette sie nicht direkt in die Nase Hohlraum.
    6. Warten Sie 2 – 5 min und setzen Sie die PIPETTENSPITZE mit den verbleibenden 15 µL des Inokulums Virus in das rechte Nasenloch.
      Hinweis: Zur Vermeidung von Erstickungsgefahr verzichten Sie, kleine Tropfen in ca. 20 s-Intervallen.
    7. Überprüfen Sie, ob die Maus richtig atmet und legen Sie sie in einem Käfig in seitlichen Dekubitus. Überwachen Sie Maus Atmung und Anästhesie Recovery (ca. 60 min nach Induktion).
      Hinweis: Es ist möglich, mehr als 1 Maus gleichzeitig zu infizieren. In diesem Fall virale Inokulum in das linke Nasenloch alle Mäuse in einer Sequenz zu verwalten, für 2 – 5 min warten und dann das Virus in das rechte Nasenloch zu verwalten. Zur Vermeidung von Variabilität zwischen einzelnen Personen infizieren Sie nicht mehr als 3 Mäuse zur gleichen Zeit.
    8. Tiergesundheit-Status und Gewicht-Verlust täglich zu überwachen.
    9. Einschläfern Sie Mäuse nach der humane Endpunkt durch die Behörde-Richtlinien bestimmt. Die Euthanasie-Methode muss von den Tierversuchen Behörden genehmigt werden und ethischen Vorschriften einzuhalten. Nach zwei-Photonen-Experimenten einschläfern Sie Mäuse durch Verabreichung einer Überdosis von Ketamin/Xylazin gefolgt von zervikale Dislokation. Verwenden Sie in den anderen Experimenten CO2 Einatmen als Methode zur Sterbehilfe.
      Hinweis: Um die virale Titer von infizierten Luftröhre, 50 % Gewebekultur Infektionsdosis (TCID50) Assay oder Real-Time Polymerase-Kettenreaktion zu messen kann (RT-PCR) Assay als zuvor beschriebenen23durchgeführt werden.
  3. Bewertung der Neutrophilen Rekrutierung in der Luftröhre durch Durchflusszytometrie
    Hinweis: Dieser Teil des Protokolls ist optional. Ziel ist es, Neutrophilen Rekrutierung in trachealen Schleimhaut nach Influenza-Infektion zu bewerten.
    1. Infizierte und nicht infizierte kontrollmäusen am 3. Tag nach der Infektion (p.i.) durch CO2 Inhalation einschläfern.
      Hinweis: Um trachealen Schäden zu vermeiden, vermeiden Sie die Verwendung von zervikale Dislokation, Tiere einzuschläfern. Darüber hinaus empfiehlt sich die Perfusion der euthanasierten Mäuse zur Vermeidung von Kontaminationen aus Blut neutrophile.
    2. Sprühen Sie den Maus-Hals mit 70 % igem Ethanol-Lösung und führen Sie einen Hautschnitt mit Chirurgische Schere von der Brust bis zum Kinn.
    3. Trennen Sie die Speicheldrüsen mit Pinzette und Aussetzen der Luftröhre.
    4. Die Muskeln um die Luftröhre mit Zange und Schere zu sezieren.
      Hinweis: Dieser Schritt muss sorgfältig ausgeführt werden, da die Luftröhre während des Eingriffs leicht beschädigt werden könnte.
    5. Halten der Luftröhre mit Pinzette und lösen Sie vorsichtig die Speiseröhre, indem Dissektion.
    6. Halten Sie den Brustraum Teil der Luftröhre mit der Pinzette, einen Einschnitt machen Sie am Anfang des Bronchialbaumes. Lösen Sie dann die Luftröhre vom Kehlkopf und entfernen Sie vorsichtig alle Muskulatur Links.
    7. Legen Sie die Orgel in einem 1,5 mL Röhrchen mit RPMI 1640 + HEPES Medium (RPMI) auf Eis.
    8. Bereiten die Enzym-Mischung für die Luftröhre Verdauung, mit 0,26 Einheiten/mL der Kollagenbildung (I und II) und 0,2 mg/mL der DNase I RPMI.
    9. Ort der seziert Luftröhre in einem 6-Well-Platte mit 1 mL der Enzym-Gemisch.
    10. Schneiden Sie die Orgel in kleine Stücke mit Hilfe von Pinzetten und Scheren. Halten Sie die Platte auf dem Eis während dieses Schritts.
    11. Inkubation bei 37 ° C für 45 Minuten. Während dieser Zeit schütteln Sie die Platte alle 15 Minuten.
    12. Stoppen Sie die Enzym-Verdauung durch Zugabe von 1 mL der FACS waschen Puffer (2 mM EDTA und 2 % Hitze-inaktivierten Filter sterilisiert fetalen bovine Serum (FBS)) mit PBS-Puffer.
    13. Aufschwemmen der Lösung mit einer 1-mL-Pipette dazu beitragen, um die teilweise unverdaute Teile des Gewebes zu distanzieren.
    14. Übertragen Sie die Lösung zu einem anderen Brunnen indem man den Inhalt durch ein 40 µm-Sieb. Dann zerschlagen Sie vorsichtig die restlichen Stücke des Organs auf das Sieb mit einer 2 mL Spritzenkolben gefangen.
      Hinweis: Smashing teilweise unverdaute Teile der Luftröhre über das Sieb ist ein wichtiger Schritt, um eine optimale Anzahl von Zellen während der durchflusszytometrischen Analyse zu erhalten.
    15. Waschen Sie den Brunnen und das Sieb mit FACS Wasch-Puffer und Übertragung der Suspension in der 5 mL-Tube auf Eis gehalten.
    16. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 166 X g für 5 min bei 4 ° C. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 100 µL FACS waschen Puffer.
    17. Fahren Sie fort mit Antikörper für die Durchflusszytometrie Oberfläche Beflecken. Kurz, blockieren Sie Fc-Rezeptoren der isolierten Zellen unter Verwendung eines Antikörpers gegen CD16/32, gefolgt von Oberfläche Beflecken. Um neutrophile korrekt zu identifizieren, sollte der Flow Cytometry Panel die folgenden Antikörper enthalten: αLy6G, αCD11b, αCD45 sowie eine Lebensfähigkeit zu färben, abgestorbenen Zellen auszuschließen.
    18. Den gesamten Inhalt der Proben auf einem Durchflusszytometer ausführen und Analysieren der Daten.
      1. Um eine optimale Anzahl von Immunzellen zu erhalten, führen Sie die einzelnen Zellsuspension mit einer Geschwindigkeit nicht höher als 3.000 Veranstaltungen/s. Dies reduziert die Anzahl der Ereignisse während der Erfassung ausgeschlossen. Unter Verwendung dieses Protokolls, sollte es möglich, 1 bis 2 Millionen Zellen pro Luftröhre zu erhalten.

(2) Isolation und Injektion von Neutrophilen

Hinweis: In diesem Verfahren, B6.129 (ICR)-Tg (CAG-ECFP) CK6Nagy/J Mäusen (CK6-ECFP) waren verwendeten24. Diese Tiere express GFP in allen Zelltypen unter der menschlichen β-Aktin-Promoter. Alternativ ist es auch möglich mit Mäusen C57BL/6J Zellen zu isolieren und Färben sie gemäß dem Protokoll im Schritt 2.6 beschrieben. Die Reinigung und Handhabung der Neutrophilen erhöht ihren Aktivierungsstatus, möglicherweise verändern ihre wandernden und funktionellen Eigenschaften.

  1. Einschläfern des Tieres durch CO2 Einatmen.
  2. Oberschenkelknochen und Schienbeine zu entfernen und leicht zu reinigen mit Pinzette.
  3. Schneiden von Knochen Epiphysen und spülen Sie das Knochenmark mit einer 1 mL Spritze gefüllt mit sterilen kaltem PBS in einer 50 mL-Tube auf Eis gehalten.
  4. Aufschwemmen der Zellen mit einer 18 G-Nadel und die Zellsuspension mit einem 40 µm-Sieb filtern. Einmal waschen mit PBS bei 110 X g für 5 min bei 4 ° C und Zellen in 2 mL kaltem PBS aufzuwirbeln.
  5. 100 % verdünnen Percoll 9:1 in 10 X PBS und bereiten gradient Percoll 72 %, 64 % und 52 % mit 1 X PBS-Lösungen. Sorgfältig Schicht 2 mL eines jeden der drei Steigungen in der 15 mL Tube, ausgehend von den meisten konzentriert man.
    1. Fügen Sie vorsichtig 2 mL Knochenmark Zellsuspension auf Steigungen und Zentrifuge bei 1.100 X g für 30 min bei Raumtemperatur (RT) ohne Beschleunigungs- und Bremsvorgänge.
  6. Sorgfältig entfernen Sie das Band an der Schnittstelle zwischen 64 und 72 % und einmal bei 200 X g für 5 min bei 4 ° C mit kaltem PBS waschen. Aufschwemmen Sie Zellen in einem Volumen von 100 μl PBS und halten sie auf dem Eis. Die Reinheit der Neutrophilen wird voraussichtlich mehr als 90 % betragen.
  7. Optional, Label Neutrophilen mit einer Zelle Verbreitung Kit mit der Hersteller-Protokoll. Die Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 10 μM in einem Volumen von 1 mL der Farbstoff hinzu, bei 37 ° C für 30 min inkubieren Sie und waschen Sie (166 X g, 5 min).
  8. Zellkonzentration mit Hilfe eines Hemocytometer zu schätzen und intravenös 5 x 106 Zellen in einem maximalen Volumen von 100 μL in die zuvor infizierten CD11c-YFP+ -Mäuse mit einer 26 G Nadel 1 mL Spritze, 12 h vor der Bildgebung zu injizieren.

3. Vorbereitung der Maus für die Bildgebung

  1. Anästhesie
    1. Infizierten CD11c-YFP+ -Mäuse am Tag 3 Pi gemäß Schritt 1.2.3 zu betäuben.
    2. Wenn Mäuse tief betäubt sind, bereiten Sie einen Katheter für Anästhesie neu dosieren.
      1. Entfernen Sie eine 30 G-Nadel aus einer Spritze mit Pinzette.
      2. Stechen Sie die Nadel auf ein 20 cm Stück PE-10 medizinische Silikon Schlauch.
      3. Legen Sie eine 30 G Nadel Spritze gefüllt mit Ketamin/Xylazin-Mischung auf der anderen Seite des Rohres.
      4. Entfernen Sie die Luft im Inneren der Röhre.
    3. Bereiten Sie einen 20 G Katheter verbunden zu einem Schlauch von einer Sauerstoff insufflieren Maschine, automatische Lüftung (Abbildung 1Aich) beizubehalten. Setzen Sie ihn auf einem Atem-Verhältnis von 130 Schläge pro Minute (b.p.m.) mit einem Tidalvolumen von 0,2 mL mit 100 % Sauerstoff Gasversorgung.
  2. Bereiten Sie die Maus für die Chirurgie
    1. Halten Sie die Maustaste auf einem speziellen maßgeschneiderte chirurgische Brett (Abbildung 1AIi-Iii) über eine beheizte Platte oder eine chirurgische Wärmebank bei 37 ° C für die Zeit der Operation festgelegt.
    2. Rasieren die Haare aus dem Hals der Maus einen elektrischen Rasierapparat mit einer Enthaarungscreme (Abbildung 1 bich).
    3. Platzieren Sie den Mauszeiger über die Kunststoff Maus positionellen (Abbildung 1AIi-a), halten die Koepfe außerhalb der positionellen (Abbildung 1 bIi) einen Winkel zu erstellen, die die Intubation der Trachea erleichtert.
    4. Fixieren Sie die Vorderbeine, die Pfoten und die Rute mit chirurgischen Klebeband, Befeuchten Sie Maus Augen mit einem Gel Vitamin A angereichert und Desinfizieren Sie den Maus-Hals (Abbildung 1 bIi).
  3. Chirurgie
    1. Richtig autoklaviert Elemente, nämlich, Schere, mikrochirurgische Schere und Zange vorbereiten.
    2. Führen Sie einen kleinen Schnitt auf der lange mediale Achse des Halses, ca. 1 cm lang, im mittleren Bereich zwischen der oberen Brust und die Linie, die durch den unteren Punkt des Unterkiefers (Abb. 1 bIii).
    3. Seitlich zu verschieben, die Hautflecken und die Speicheldrüsen und Visualisieren der Luftröhre, durch die Muskeln bedeckt. Dann zerlegen Sie die trachealen Muskeln sorgfältig mit der Pinzette (Abbildung 1 bIii).
    4. Die Maus mit einem Katheter Intubation und künstliche Beatmung (Abbildung 1 biv) starten.
      Hinweis: Der Katheter besteht aus einem externen Kunststoff Teil schützt die trachealen Schleimhaut und eine innere Eisen-Nadel. Das Vorhandensein der Nadel ist die ideale Lösung zu erweitern und die Luftröhre zu stabilisieren und seine Exposition zu regulieren. Künstliche Beatmung durch den Katheter wird richtiges Atmen der Maus garantieren.
    5. Sofort beginnen Sie die künstliche Beatmung Monitor Maus atmen.
    6. Befestigen Sie den Katheter Höhe und Ausrichtung mit einem chirurgischen Haken (Abbildung 1 bV) an die spezifischen Stab auf die chirurgischen Kammer (Abbildung 1AIi-b) angeschlossen. Setzen Sie die Luftröhre auf gleicher Höhe des Kinns.
    7. Einkreisen der Luftröhre mit Vaseline und bedecken Sie es mit ein paar Tropfen des vorgewärmten PBS, ausreichende Flüssigkeitszufuhr, die Orgel (Abbildung 1 bvi) zu gewährleisten.
    8. Montieren Sie das Deckglas auf der Vorbereitung. Kleben Sie für diesen Schritt ein Deckglas auf einem Metallhalter (Abbildung 1 bVii), die an den XYZ-Übersetzer (Abbildung 1AIi-c) geschraubt werden. Anpassen des XYZ-Übersetzers um das Deckglas auf die chirurgische Vorbereitung zu platzieren.
    9. Legen Sie den Katheter für die Verwaltung der Narkose intraperitoneal (Abbildung 1 bViii).
    10. 50 % der Initialen Dosis von Ketamin/Xylazin-Mischung alle 30 min. zu injizieren.
      Hinweis: Erneut Dosierung von 50 % auf 25 % der ursprünglichen Ketamin/Xylazin-Mischung ist eine sichere und gültige alternative25. Da dieses Protokoll terminal ist und eine strenge Immobilisierung des Tieres während des gesamten Verfahrens erforderlich ist, verwenden Sie jedoch höhere Dosierungen ein tief chirurgische Flugzeug der Narkose aufrechtzuerhalten.

4. in Vivo Zeitraffer Imaging

Hinweis: Bildaufnahme erfolgte mit einem aufrecht zwei-Photonen-Mikroskop, ausgestattet mit zwei Ti:Sa-Lasern, temperaturgeführte Inkubation Kammer und ein 25 X / NA 1.1 Wasser eintauchen Ziel. Die Photomultiplier (PMT) verwendet für die Bildaufnahme waren entweder Hybrid Detektoren oder hohe Empfindlichkeit GaAsP.

  1. Platzieren Sie die chirurgische Board mit der narkotisierten Maus innerhalb der Mikroskop-Inkubation-Kammer (37 – 38 ° c vorgewärmt) und Tropfen Sie einen Wasser auf das Deckglas.
  2. Zentrum finden Sie fokussieren und die trachealen Gewebe.
  3. Stellen Sie die Scan-Frequenz bis 800 Hz mit 520 x 520 Pixel, ein Sichtfeld von 440 x 440 μm2 und Zeile durchschnittlich 1.
    1. Melodie Ti:Sa Laser, 830 nm second harmonic Generation (SHG) von Kollagen mit einer indikativen Leistung an der Quelle von 150 begeistern mW. Melodie den zweiten Ti:Sa-Laser bei 920 nm mit 94 mW an der Quelle, CFP und YFP begeistern.
    2. Aufbau der 3D und Zeitraffer Akquisitionsmodus mit gleichzeitiger Anregung
      Hinweis: Halten Sie die Laserleistungen so gering wie möglich zu Immunofluoreszenz und Phototoxizität zu minimieren.
  4. Rekord Fluoreszenz über zwei Kanäle in nicht descanned Modus mit einem master dichroitischen Spiegel bei 560 nm. In der Konstellation in diesem Protokoll verwendeten, ein zweite Dichroitischer Spiegel teilen das Signal bei 495 nm trennen Kanal 1 (Emission Filter 475/50) von Kanal 2 (Emission Filter 525/50) (Abbildung 2A). Diese Konfiguration sammelt SHG Licht von Kollagen in den ersten Kanal, während GFP Emission in beiden Kanälen 1 und 2 erhobenen ist und YFP wird nur in Kanal 2 gesammelt.
  5. Definieren Sie einen Bereich 50 μm entlang der Z-Achse mit einer Schrittweite von 3 μm (Voxel Größe 0,86 μm X 3 μm). Datensatz Bilder alle 30 s für eine Gesamtdauer von 30 Minuten.
  6. Auf Wunsch erwerben Sie mehrere Regionen. Vor der Ausführung weitere Akquisitionen, Vitalfunktionen überprüfen und Wiedereinleitung Anästhesie durch den Katheter bei Bedarf (siehe Schritt 3.3.10).
  7. Am Ende den imaging-Prozess einschläfern Sie die Maus durch Ketamin/Xylazin-Überdosis gefolgt von zervikale Dislokation.

5. Bild-Verarbeitung und quantitativen Analyse der Neutrophilen-DC Motilität und Interaktion

Hinweis: In diesem Protokoll wurde eine spezielle imaging-Software für die Datenanalyse der Mikroskopie verwendet.

  1. Nachdem 4D Bildaufnahme abgeschlossen ist, übertragen Sie die Dateien (Daten und Metadaten) auf einer Arbeitsstation mit ausreichend computational Ressourcen (vorgeschlagen Mindest-Systemanforderungen: 32 GB RAM, schnelle solid-state-Laufwerke, aktuelle CPU, GPU, die auf der Grundlage gewidmet eine massiv parallele Architektur).
  2. Öffnen Sie die Dateien in der imaging-Software.
  3. Spielen Sie das Video und sicherzustellen Sie, dass die Zellen von Interesse deutlich sichtbar sind und bildgebenden Artefakte fehlen.
    Hinweis: dazu, sicherzustellen, dass sowohl die Bewegung der Probe und der helligkeitsvariation sind ausreichend beschränkt. In der Tat handelt es sich um Herausforderungen für die automatische Analyse-26. Wenn die Bewegung der Probe zwischen angrenzenden Frames zu hoch ist, gelten Sie eine Drift-Korrektur-Methode, beispielsweise mit Hilfe des SHG-Kanals als eine feste Referenz. Dies ermöglicht besseres Maß der Bewegung der Zellen und nicht die Bewegung der Probe. Darüber hinaus im Beisein von hellen Hintergrund oder Schmutz, beschneiden Sie die rekonstruierten Oberflächen mit Volumen als ein Selektionsparameter.
  4. Generieren Sie eine Co-Lokalisierung-Kanal speziell für GFP+ Zellen, um das Signal zwischen GFP und das Kollagen (SHG) zu trennen. Bezeichnen Sie zu diesem Zweck ein gating Polygon (Abb. 2 bich), die nur die Voxel haben eine positive Intensität in den grün-Kanal und in den blauen Kanal auswählt.
    Hinweis: Dieses Verfahren variieren je nach eingestellten Filter des Mikroskops und die Färbung der Zellen. Es kann erreicht werden, indem Sie nur Voxel mit ausreichender Intensität im grünen und blauen Kanal auswählen. Die Funktionalität "Coloc" ist unter den verfügbaren Tools lässt sich anhand der Intensität Schnittstellenüberwachung ns1-Kanal automatisch zu berechnen. Darüber hinaus können Methoden basierend auf Computerlernen für diesen Schritt mit der Aufsicht von einem erfahrenen27verwendet werden.
  5. Erkennen und verfolgen von GFP+ Zellen, mit automatischen Flächenrückführung und tracking-(Oberfläche Tool) über den entsprechenden Co-Lokalisierung-Kanal.
    Hinweis: Manuelle Kuration von eventuellen Tracking-Fehlern und Ausgrenzung von Tracks mit einer Dauer kürzer als eine definierte Schwelle (d.h., 150 s) können erforderlich sein.
  6. Generieren Sie eine Co-Lokalisierung-Kanal speziell für CD11c-YFP+ Zellen, um CFP und YFP Signale zu trennen. Bezeichnen Sie zu diesem Zweck ein gating Polygon (Abb. 2 bIi), die nur die Voxel eine positive Intensität in den grün-Kanal, sondern eine geringe Intensität in den blauen Kanal auswählt.
    Hinweis: repräsentative mikrographen zeigt die Signale von Kanal 1, Kanal 2 Co Lokalisierung Kanal für GFP, Co Lokalisierung Kanal für YFP und die Kombination aller Kanäle finden Sie in Abbildung 2 bIii.
  7. Rekonstruieren Sie die Oberfläche der CD11c-YFP+ Zellen zu und verfolgen Sie ihre Position im Laufe der Zeit (Oberflächen-Werkzeug).
    Hinweis: Manuelle Korrektur von eventuellen Tracking-Fehlern ist nicht erforderlich für diesen Schritt. Tatsächlich aufgrund der komplexen räumlich-zeitliche Dynamik der DC ist rekonstruieren ihre genaue Oberfläche aus 2P-IVM-Daten eine herausfordernde Aufgabe, die mit verfügbaren Segmentierung Software erreicht werden kann. Unter den Gründen, die diese Aufgabe schwierig machen, erlauben dünne Vorsprünge und Helligkeitsschwankungen nicht für die Nutzung von bestimmten Bildverarbeitungs-Techniken, wie glätten Filter oder statische Schwellwerte. Darüber hinaus in einem Netzwerk von DC ist es schwierig, einzelne Zellen basierend nur auf ihr Aussehen in 2P-IVM Daten trennen. Aus diesen Gründen, anstatt zu versuchen eine genaue Segmentierung durch Software-Parameter optimieren schlagen wir nicht genaue Oberflächen von DC zu rekonstruieren. Dann behandeln Sie die möglichen Fehler durch robuste Metriken wie in 5.8 beschrieben.
  8. Zellwanderung zu messen.
    1. Exportieren Sie die klassische Migration Maßnahmen für GFP+ und CD11c-YFP+ Zellen. Unter diesen zeigt "Track Geschwindigkeit bedeutet" wandernden Durchschnittsgeschwindigkeit der Zellen während der "track Geradheit" Direktionalität der Zellen anzeigt. Diese Maßnahmen können als eine Tabellenkalkulationsdatei von imaging-Software exportiert werden.
    2. In der exportierten Tabellenkalkulationsdateien berechnen die "korrigierten Track Geradheit" (auch als korrigierte Entbindung Verhältnis bezeichnet) für GFP+ und CD11c-YFP+ Zellen, die ist definiert als "Track Geradheit" multipliziert mit der Quadratwurzel der "Dauer-track" dividiert durch die Quadratwurzel aus der Videodauer. Diese Maßnahme ist robuster als "track Geradheit" im Beisein von kurzer28 Titel, stammen zum Beispiel von Tracking-Fehlern.
      Hinweis: mit dieser Maßnahme können nur Videos von der gleichen Länge verglichen werden.
  9. Zelle Interaktion zu messen.
    1. Definieren Sie einen Kontakt zwischen einer GFP+ -Zelle und einer CD11c-YFP+ -Zelle, wenn ihre Entfernung (am nächsten Voxel) kleiner oder gleich als ein Schwellenwert (d. h. 2 μm).
      Hinweis: Diese Schwelle sollte ausreichend strenge, einen Kontakt zu erkennen, nur wenn Zellen in der Nähe sind. Wir empfehlen jedoch, um diese Schwelle größer als 0, im Idealfall N-mal größer als der Voxel-Radius zu halten (N > 2), weil Rand glätten die Rekonstruktion der Zellen kleiner als die tatsächliche Zellengröße machen kann.
    2. Zählen Sie die Anzahl und die Dauer der Kontakte zwischen GFP+ und CD11c-YFP+ Zellen. In der imaging-Software kann dies zum Beispiel durch die Ausführung einer "kiss and run" Plug-in erfolgen. Diese Maßnahmen können als eine Tabellenkalkulationsdatei von der Registerkarte "Statistik" exportiert werden.
  10. Importieren Sie die zuvor berechneten Maßnahmen in einer Statistik-Software, generieren Sie die Grundstücke zu und durchführen Sie statistische Tests.

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Representative Results

In dieser Arbeit beschriebenen wir einem detaillierten Protokoll in Vivo zu studieren die Motilität und die Wechselwirkungen zwischen Neutrophilen und DC während der Influenza-Infektion in murinen Luftröhre (Abb. 3A). Zu diesem Zweck isoliert wir GFP+ Neutrophilen (92 % Reinheit; Abb. 3 b) von CK6-ECFP übertragen Mäuse und wir adoptively sie in eine CD11c-YFP Maus mit Grippe infiziert. Danach führten wir 2P-IVM der Luftröhre am 3. Tag p.i. Zu diesem Zeitpunkt haben wir eine klare Rekrutierung von Neutrophilen Granulozyten in den infizierten Bereich beobachtet, dargestellt durch durchflusszytometrischen Analyse (Abbildung 3). Das 2P-IVM-Protokoll erfordert die Verwendung einer bestimmten chirurgischen Board und ein Sauerstoff-Lieferant für Nager (Abbildung 1A). Lieferung von Sauerstoff durch eine Kanüle in die Luftröhre eingelegt half das Tier atmet, erleichtert die Exposition der Luftröhre und kontrolliert die Orgel Bewegung Atmung (Abbildung 1 b) zugeordnet. Im Anschluss an diese Versuchsanordnung erwarben wir stabile 4D Bilder in Vivo in der infizierten Luftröhre während eines Zeitraums von 30 min (Abbildung 3DFilm 1).

Die Analyse der erworbenen 4D Bilder durch spezielle imaging-Software erlaubt, die Wanderung von Zellen zu messen und zu quantifizieren, die räumlich-zeitliche Dynamik der Neutrophilen und DC. Bezug auf Zelle Motilität beobachteten wir signifikante Unterschiede zwischen der Bewegung der DC und der eingestellten Neutrophilen, die eine deutlich höheren Geschwindigkeit als die letzteren (Abb. 4A) zeigte. Dieses Ergebnis bestätigt die dynamische Natur der Neutrophilen, zuvor als höchst bewegliche Zellen in der Lage, die Migration in Richtung einer lockstoffgradient Quelle29beschrieben. Bezug auf Direktionalität schlossen wir, dass komplexe Morphologie des DC ergab häufige Fehler in Zelle nachverfolgen, welche wiederum Tracks mit verminderte Dauer und erhöhte Abweichung der gemessenen gerichtetes Verhalten (Abbildung 4 b) produziert. Aus diesem Grund berechnet wir eine robuste Metrik, die Direktionalität unter Berücksichtigung der Dauer der Strecke messen kann. Mit dieser Metrik, beobachteten wir einen signifikanten Unterschied in der Richtwirkung der Neutrophilen Vs DC (Abbildung 4).

Darüber hinaus erlaubt die Berechnung des Abstandes zwischen Neutrophilen und DC zu erkennen und ihre Kontakte im Laufe der Zeit zu analysieren. In diesem experimentellen Modell beobachteten wir einige Neutrophilen, die mehrere kurze Kontakte mit DC und anderen gebildet, die keiner Kontakt im abgebildeten Zeitraum (Abbildung 4). Darüber hinaus konnten wir studieren die gesamte Positionierung der untersuchten Zellen (Abb. 4E), die Studie von der durchschnittlichen Trend des Abstandes zwischen Neutrophilen und DC im Laufe der Zeit während der Untersuchung des Trends in bestimmten Zellen erlaubt, charakterisieren die Verhalten von jeder einzelnen Zelle (Abbildung 4FMovie 2).

Figure 1
Abbildung 1: Ausrüstung und Schritte für 2P-IVM der murinen Luftröhre. (Ai) Die tragbaren Tier Anästhesiesystem verantwortlich für die automatisierte Belüftung ist mit einer Pumpe verbunden, die Sauerstoff zur Maus liefert. Frontansicht (Aii) und Seitenansicht (Aiii) die maßgeschneiderte chirurgische Board für die trachealen Modell verwendet. Der Vorstand setzt sich aus Metall Bühne mit einer Kunststoff-Maus positionellen (Aii-a), einen Stab für die Abhaltung einer beweglichen Schelle (Aii-b) und eine Geldbuße abstimmbaren XYZ Übersetzer (Aii-c). (B) aufeinander folgenden Schritten des trachealen chirurgische Modells: (Bi)-Haarentfernung von der OP-Bereich (Bii) Positionierung der narkotisierten Maus in der chirurgischen Board (Biii) chirurgische Exposition von der Luftröhre (Biv ) Intubation mit einem Katheter mit künstliche Beatmung, (Bv) Fixierung des Katheters, (Bvi) Zugabe von PBS zur exponierten Trachea (Bvii) Montage des Deckglases und (Bviii) Platzierung des Katheters mit Anästhesie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: fluoreszierende Signalerkennung während 2P-IVM. (A) schematische Darstellung der Mikroskop-Erkennung filter-Set-up und entsprechenden Kanäle. Dichroitische Spiegel auf 560 nm trennt blau/grün rot/weit rot Emissionen. Zusätzliche dichroitischen Spiegel bei 495 nm wird verwendet, um den verschiedenen Teilregionen das Emissionsspektrum weiter zu erkennen. Kanal 1 beschäftigt einen Hybrid-Detektor (Emission Filter 475/50), während Kanal 2 verwendet hohe Empfindlichkeit GaAsP PMT (Emission Filter 525/50). (B) repräsentative Scatter Dot Grundstücke 2P Signale zeigen die gating-Strategie für die Generation der ns1 Kanäle für die Identifizierung des Signals aus der GFP (Bi) und YFP (Bii) Fluorophore. (Biii) Repräsentative mikrographen zeigt die spezifische Signale von Kanal 1 (Ch 1, dunkelblau), Kanal 2 (CH2, grüne) Co Lokalisierung Kanal für GFP (hellblau), der Co-Lokalisierung-Kanal für YFP (gelb) und die Kombination aller Kanäle (Ch 1 + Ch 2 + GFP + YFP). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Intravitalen 4D Bildgebung von Neutrophilen und DC in eine Grippe infiziert Luftröhre. (A) schematische Übersicht des Protokolls. (B) repräsentative Fluss durchflusszytometrischen Streudiagramm zeigt den Prozentsatz der Neutrophilen im Hinblick auf insgesamt CD45 + Zellen in eine Zellsuspension aus murinen Knochenmark mit der Percoll-gradient-Methode isoliert. (C) repräsentative Fluss durchflusszytometrischen Scatterplots mit einem Anstieg in der Häufigkeit der Neutrophilen Granulozyten in Tracheas von nicht infizierten Mäusen verglichen mit Mäusen, die mit Influenza-Virus am 3. Tag p.i. (D) (linken) anatomische Bild von einem Murine infiziert Luftröhre zeigt das Gebiet für die Bildaufnahme ausgewählt. (Rechte Abbildung) Repräsentative 3D Projektion von einem 2P-IVM Schliffbild zeigt der Flächenrückführung von Neutrophilen (hellblau) und DC (gelb) zusammen mit ihren Tracks am 3. Tag p.i. SHG Signal in dunkel blau dargestellt ist. Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Charakterisierung von Neutrophilen und DC Migration und Interaktion Dynamik in Grippe infiziert Luftröhre. Repräsentative Darstellungen zeigen die Laufbandgeschwindigkeit bedeutet (A), Geradheit (B) verfolgen und korrigiert Track Geradheit (C), definiert durch Beltman und Kollegen (2009)28, der Neutrophilen und DC in der Luftröhre am 3. Tag p.i. mit Influenza-Virus. Die korrigierte Strecke Geradheit Messung zeigt Robustheit um tracking-Fehlern. (D) 2D Histogramm zeigt die Häufigkeit der Neutrophilen nach der Anzahl der Kontakte mit DC und die mittlere Kontaktdauer. (E) durchschnittliche Entfernung von Neutrophilen in die nächste DC während der Dauer des Films. (F) (links) Analyse des Abstandes eines Vertreters Neutrophilen zum nächsten DC rechtzeitig. Die gestrichelte rote Linie zeigt den Abstand Grenzwert zu bedenken, dass eine Neutrophilen ein Kontakt mit einem DC aufgebaut. (Richtige i-Iii) Mikrographen erworben zu verschiedenen Zeitpunkten, die Migration von einer Neutrophilen (hellblau) in Richtung eines DC (gelb) darstellt. Zelle Spuren werden als bunte Linie dargestellt, die Farbe von blau zu rot wechselt, Zeit zu vertreten. SHG-Signal von fibrillary Kollagen ist in Dunkelblau angezeigt. Maßstabsleiste = 50 µm. In allen Figuren sind die dargestellten Daten repräsentativ für mindestens drei unabhängigen Experimenten. Ergebnisse werden wie meine ± SD Statistiken von Welch Test gegeben. NS p > 0,05; p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Movie 1
Movie 1: Neutrophile und DC Dynamik in der Luftröhre während der Influenza-Infektion. 30 min Zeitraffer 3D Bild zeigt Interaktion Dynamik zwischen Neutrophilen (hellblau) und DC (gelb), sowie ihre jeweiligen Tracks in Bezug auf das kollagennetz (dunkelblau) der Luftröhre. Repräsentative Neutrophilen-DC-Interaktionen sind durch weiße Pfeile angedeutet. Zelle Spuren werden als bunte Linie dargestellt, die Farbe von blau zu rot wechselt, Zeit zu vertreten. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)

Movie 2
Movie 2: Repräsentative kurzfristige Neutrophilen-DC-Interaktion in der Luftröhre während der Influenza-Infektion. 30 min Zeitraffer 3D Bild zeigt eine repräsentative Interaktion zwischen einem Neutrophilen (hellblau) und einem DC (gelb) und ihre jeweiligen Tracks. Zelle Spuren werden als bunte Linie dargestellt, die Farbe von blau zu rot wechselt, Zeit zu vertreten. SHG-Signal von Kollagen ist in Dunkelblau angezeigt. Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)

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Discussion

Dieses Werk stellt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von 4D Bilder zeigen die Migration der adoptively übertragenen Neutrophilen und ihrer Wechselwirkungen mit DC während einer Influenza-Infektion in der Maus Luftröhre. Die beschriebenen 2P-IVM-Modell werden Immunzelle Dynamik während einer Infektion in den Atemwegen zu studieren.

Vor kurzem, wurden mehrere Modelle basieren auf der Visualisierung von Zelldynamik in den Atemwegen entwickelten9,10,11,12,13,14,15 ,16. In-Vivo Bildgebung der Lunge ist jedoch nach wie vor schwierig, unter Berücksichtigung der anatomischen Position dieses Organs und die technischen Schwierigkeiten, die Bewegung während der Atmung Zyklus30zu minimieren. Um diese Probleme zu überwinden, haben einige Autoren die Verwendung einer speziell angefertigten kreisförmige Schöpfraum vorgeschlagen, die operativ in den Brustkorb13,14eingefügt werden muss. Dieses Verfahren erfordert jedoch eine invasive Intervention, die die Ergebnisse, vor allem in diesen Studien gefährden könnten, die auf der Untersuchung der Entzündungsreaktion konzentriert haben. Darüber hinaus präsentieren die Lunge chirurgische Modelle eine Einschränkung für die Tiefenmassage Bildgebung aufgrund der Lichtbrechung durch die Luft in die Alveolen17entstanden. Umgekehrt haben verschiedene trachealen Modelle vor kurzem eingesetzt worden, um Zelldynamik in die Atemwege Epithel zu studieren. Bildgebung dieses Organs stellt klare Vorteile im Vergleich zu Lunge, wie z. B. die eine relativ einfache Operation erforderte zu entlarven und die Orgel sowie die höhere Erreichbarkeit der trachealen Epithel zu immobilisieren. Das vorgeschlagene Modell der Trachealkanüle ist auch relevant für die Einleitung der Reaktion gegen Atemwege Krankheitserreger, wie Influenza-Virus, zu untersuchen, da die Luftröhre einer der ersten Orte der Virusreplikation im Verlauf einer Grippe-Infektion-8 ist.

Interessanterweise, veröffentlichte eine Studie zeigt einer Alternative Intubation-freie Verfahren zur Bildgebung der Luftröhre in letzter Zeit hat12. Diese Methode zeichnet sich durch eine verminderte Entzündung und zeigt klare Vorteile im Studium, wo die Mucociliarity Funktion der epithelialen Zellen aufbewahrt werden muss. Jedoch diese Methode garantiert keine ausreichenden Stabilität und der Erwerb von heller Signale erforderlich, Zell-Zell-Kontakte in einer Reihe von wenigen µm. umgekehrt studieren in das aktuelle Protokoll vorgestellte Methode bietet bessere Immobilisierung der Orgel Dank der Intubation und ermöglicht die Erkennung von stärkeren Fluoreszenz-Signale durch die kürzere Distanz zwischen Orgel und dem Deckglas12.

Gewebe Immobilisierung während in Vivo 2P-IVM Bildaufnahme zu erreichen, ist der wichtigste Schritt zur optimalen Datengenerierung. Einige entscheidende Maßnahmen, die dazu, die Stabilität der vorgestellten Methode beitragen gehören: eine geeignete Maus Narkose; eine richtige Maus Intubation; und eine chirurgische Exposition der Luftröhre, die ermöglicht einen einfachen Zugang zur Orgel durch das Deckglas. Darüber hinaus stärkt die richtige Anzahl von Zellen (idealerweise 30 pro Gesichtsfeld) imaging die erzielten Ergebnisse. Die Einstellung der optimalen Anzahl von Zellen hängt zu einem großen Teil die Virusinfektion Dosis sehr stark durch die ordnungsgemäße Verwaltung des viralen Inokulums beeinflusst ist.

Ein weiterer wichtiger Schritt des Protokolls ist die chirurgische Exposition der Luftröhre. Verschiedene können Maßnahmen, um die Schäden an der Orgel während der Operation zu minimieren. Beispielsweise sollte die Luftröhre mit chirurgischen Instrumenten nicht direkt berührt werden. Stattdessen sollte ausgesetzt werden, durch die Manipulation nur das umliegende Gewebe (Haut, Speicheldrüsen und Muskeln). Wenn unbedingt notwendig, sollte die Luftröhre mit ungespitzten Gegenstände behandelt werden. Darüber hinaus sollten Anstrengungen zur Vermeidung von Schäden der Blutgefäße erfolgen. Zu guter Letzt um Orgel Austrocknung zu verhindern, ist es auch wichtig, unmittelbar nach der Operation mit einer PBS abgedeckt.

Trotz der einzigartigen Vorteile dieser Methode gegenüber den zuvor beschriebenen Verfahren zur Visualisierung der Immunzelle Interaktionen in der trachealen Schleimhaut stellt die Verwendung dieses Modells einige Einschränkungen. Wie oben beschrieben, kann das Vorhandensein von Entzündungen bei der trachealen Operation einen Nachteil darstellen, wenn Immunantworten zu studieren. Um diese Einschränkung zu umgehen, ist es möglich, Anti-inflammatory Drogen vor der Einleitung des Verfahrens zu verwalten. Eine weitere Einschränkung dieses Modells bezieht sich auf das Vorhandensein eines starken Autofluoreszenz-Signals bestehenden in den Atemwegen, die vor allem durch die ansässigen Zellen und die Schleimschicht entsteht. Diese unspezifischen Fluoreszenz erzeugt Artefakte, die die Analyse behindern könnten. Darüber hinaus möglicherweise irreführende Berechnung des Parameters Track Geradheit generiert werden, wenn Vergleich Zelle verfolgt von unterschiedlicher Dauer und wenn Spuren von kurzer Dauer26zu Tracking-Fehlern führen. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir eine Strafe Koeffizient Behebung Track Geradheit angewandt. Diese Korrektur soll die Auswirkungen von Miss-Tracking-Ergebnisse28zu minimieren.

Ein wesentlicher Aspekt der 2P-IVM Experimente ist die Möglichkeit zur Wiederverwendung Mäuse, die Chirurgie und Bildbearbeitung unterzogen wurden. Die in-Vivo imaging hier beschriebenen Protokoll erfordert keine Euthanasie oder Orgel Tiersammlung, wodurch die Möglichkeit, sich zu erholen und Wiederverwendung Mäuse nach der Operation für andere Verfahren. Verwenden beispielsweise eine einzelne Maus Luftröhre Bildgebung zu anderen Zeitpunkt durchführen Punkte drastisch die Zahl der insgesamt Tiere benötigt in einem Experiment verringern könnten, das Tier Reduzierung Prinzip zu unterstützen. Darüber hinaus könnte es auch interindividuelle Variabilität reduzieren. Allerdings müssen tierische Verwertung und Wiederverwendung Folgen des Tierschutzes, die die Verwaltung der richtige Analgetika und Antibiotika, um die Tiere während der Recovery-Zeit enthält. Alle diese Verfahren müssen im Tierversuch Protokoll enthalten und von den örtlichen Tierarzt Behörden genehmigt.

Das beschriebene Protokoll kann für die Untersuchung von anderen Immunzellen Arten leicht angepasst werden. Beispielsweise könnte Isolation und Injektion (fluoreszierende oder gebeizt) Erreger-spezifischen T-Zellen, T-Zell-Aktivierung-Dynamik-31 sowie ihre Interaktion mit anderen Zellen wie trachealen DC studieren verwendet werden. In ähnlicher Weise könnte die Darstellung von Blut oder Lymphgefäße einen interessanten Ansatz, die Rekrutierung von Entzündungszellen in die Trachealkanüle Gewebe im Verlauf der Infektion zu studieren darstellen. Darüber hinaus konnte 2P-IVM der Luftröhre auch angewendet werden, um die Dynamik der Immunantwort auf andere zerstreute Krankheitserreger zu untersuchen. Daher wird die Verwendung von transgenen fluoreszierende zerstreute Krankheitserreger wie Streptococcus Pneumoniae32, erstellen neue Möglichkeiten, um ihre Interaktionen mit dem Immunsystem zu untersuchen. Obwohl dieses Verfahren konzentriert sich auf die Messung der Dynamik von Immunzellen bei Infektion, kann es auch zu verschiedenen Bereichen, einschließlich Krebs, Asthma, oder Wundheilung angewendet werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Schweizerischen Nationalfonds (SNF) Stipendien (176124, 145038 und 148183), der Europäischen Kommission Marie Curie Wiedereingliederungsbeihilfe (612742) und SystemsX.ch nach einer Finanzierungsmöglichkeit für D.U.P (2013/124).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gigasept instru AF Schülke & Mayr GmbH 4% solution
CD11c-YFP mice Jackson Laboratories 008829 mice were bred in-house
CK6-ECFP mice Jackson Laboratories 004218 mice were bred in-house
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D8537-500ML
10x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D1408-500ML
Percoll PLUS Sigma E0414-1L Store at 4°C
Ketamin Labatec Labatec Pharma 7680632310024 Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture
Rompun 2% (Xylazin) Bayer 6293841.00.00 Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture
26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak BD Plastipak 305501
30 G, 0.3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes BD 324826
Falcon 40 µm Cell Strainer Corning 352340
2 mL Syringes BD Plastipak 300185
Microlance 3x 18 G needles BD 304622
Introcan Safety 20 G (catheter) Braun 4251652.01
6 Well Cell Culture Cluster Costar 3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1x) ThermoFisher Scientific 42401-018 Store at 4°C
Liberase TL Research Grade Roche 5401020001 Store at -20 °C / collagenase (I and II) mixture
DNAse I Amresco (VWR) 0649-50KU Store at -20 °C
CellTrace Violet stain ThermoFisher Scientific C34557 Store at -20 °C
EDTA Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106 Store at -20 °C
PE-10 Micro Medical Tubing 2Biological Instruments SNC #BB31695-PE/1
Surgical Plastic Tape M Plast
Viscotears Bausch & Lomb Store at RT
Plasticine Ohropax
High Tolerance Glass Coverslip 15 mm Round Warner Instruments 64-0733
SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System Kent Scientific SS-01
Nuvo Lite mark 5 GCE medline 14111211
MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) Tem Sega
SURGICAL BOARD University of Bern
TrimScope II Two-photon microscope LaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:Sa lasers Coherent Inc.
25X NA 1.05 water immersion objective Olympus XLPLN25XWMP2
The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller Life imaging Services
Imaris 9.1.0 Bitplane Imaging software
GraphPad Prism 7 GraphPad Statistical software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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