कम सीरम शर्तों के तहत कार्डियक जनक कोशिकाओं में Endothelial विभेद की प्रेरण

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Developmental Biology

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Summary

इस प्रोटोकॉल कार्डियक जनक कोशिकाओं के लिए एक endothelial भेदभाव तकनीक का वर्णन । यह विशेष रूप से कैसे सीरम एकाग्रता और कोशिका बोने घनत्व endothelial भेदभाव क्षमता को प्रभावित पर केंद्रित है ।

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Mochizuki, M., Della Verde, G., Soliman, H., Pfister, O., Kuster, G. M. Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions. J. Vis. Exp. (143), e58370, doi:10.3791/58370 (2019).

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Abstract

कार्डियक जनक कोशिकाओं (CPCs) चोट के बाद कार्डियक पुनर्जनन के लिए चिकित्सीय क्षमता हो सकती है । वयस्क स्तनधारी दिल में, आंतरिक CPCs अत्यंत दुर्लभ हैं, लेकिन विस्तारित CPCs सेल थेरेपी के लिए उपयोगी हो सकता है । उनके उपयोग के लिए एक शर्त के लिए विभिंन हृदय में परिभाषित और कुशल प्रोटोकॉल का उपयोग कर वंश में एक नियंत्रित तरीके से अंतर करने की क्षमता है । इसके अलावा, पर इन विट्रो विस्तार में , CPCs रोगियों या पूर्व नैदानिक रोग मॉडल से पृथक रोग तंत्र की जांच के लिए उपयोगी अनुसंधान उपकरण की पेशकश कर सकते हैं ।

वर्तमान अध्ययन CPCs की पहचान करने के लिए विभिन्न मार्कर का उपयोग करें । हालांकि, उन सभी को मानव में व्यक्त नहीं कर रहे हैं, जो कुछ नैदानिक अध्ययन के शोधों के प्रभाव को सीमित करता है । भेदभाव प्रोटोकॉल है कि चाहे अलगाव तकनीक और मार्कर अभिव्यक्ति के लागू कर रहे है मानकीकृत विस्तार और सेल थेरेपी प्रयोजन के लिए CPCs के भड़काने के लिए अनुमति देगा । यहां हम वर्णन है कि एक कम भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) एकाग्रता और कम सेल घनत्व की स्थिति के तहत CPCs की भड़काना CPCs के endothelial भेदभाव की सुविधा । माउस और चूहे CPCs के दो विभिंन उपआबादी का प्रयोग, हम बताते है कि laminin एक और निंनलिखित प्रोटोकॉल के तहत इस प्रयोजन के लिए fibronectin से उपयुक्त सब्सट्रेट: संवर्धन के बाद 2-3 दिनों के लिए पूरक शामिल है कि multipotency बनाए रखने और ३.५% FBS के साथ, CPCs पर laminin पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं < 60% संगम और में कल्चरल पूरक-FBS के कम सांद्रता के साथ नि: शुल्क मध्यम (०.१%) endothelial विभेदक माध्यम में भिंनता से पहले 20-24 घंटे के लिए । क्योंकि CPCs एक विषम आबादी हैं, सीरम सांद्रता और गर्मी बार संबंधित सीपीसी उपजनसंख्या के गुणों के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । इस पर विचार, तकनीक CPCs के अंय प्रकार के रूप में अच्छी तरह से लागू किया जा सकता है और एक उपयोगी विधि की क्षमता और भेदभाव के तंत्र की जांच और कैसे वे रोग से प्रभावित जब संबंधित रोग मॉडल से अलग CPCs का उपयोग कर रहे है प्रदान करता है ।

Introduction

हाल के अध्ययनों वयस्क स्तनधारी दिल1,2,3में निवासी कार्डिएक जनक कोशिकाओं (CPCs) के अस्तित्व का समर्थन है, और CPCs कार्डियक चोट4के बाद सेल थेरेपी के लिए एक उपयोगी स्रोत हो सकता है, 5. इसके अलावा, विस्तारित CPCs दवा स्क्रीनिंग के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रदान कर सकते है और रोग तंत्र की जांच जब दुर्लभ cardiomyopathies, या संबंधित रोग मॉडल6,7से रोगियों से अलग ।

CPCs वयस्क दिल से अलग स्टेम/जनक सेल विशेषताओं1,2,3,8 के रूप में वे multipotent, clonogenic हैं, और स्वयं के नवीकरण के लिए क्षमता है । हालांकि, वहां कई अलग है (उप) CPCs की आबादी अलग सतह मार्कर प्रोफाइल प्रदर्शन, सहित, उदाहरण के लिए, सी किट, Sca-1, और दूसरों, या अलग अलगाव तकनीकों (तालिका 1) द्वारा प्राप्त की । कई संस्कृति और भेदभाव प्रोटोकॉल स्थापित किया गया है1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. इन प्रोटोकॉल ज्यादातर वृद्धि कारक और सीरम सामग्री है, जो संवर्धन के प्रयोजन के अनुसार समायोजित कर रहे है और जो परिणाम और परिणामों में अंतर करने के लिए नेतृत्व कर सकते है के संबंध में भिंनता, भेदभाव दक्षता सहित ।

मार्कर-आधारित आइसोलेशन तकनीक:

CPCs एक विशिष्ट सतह मार्कर अभिव्यक्ति के आधार पर अलग किया जा सकता1,2,8,9,10,11,12,13 ,१४,१५,१६,१७,१८. पिछले अध्ययनों से सुझाव है कि सी-किट और Sca-1 निवासी CPCs1,11,14,19,20को अलग करने के लिए सबसे अच्छा मार्कर हो सकता है । क्योंकि इन मार्करों में से कोई भी वास्तव में CPCs के लिए विशिष्ट है, विभिंन मार्करों के संयोजन आमतौर पर लागू कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, CPCs एक्सप्रेस कम स्तर के सी-किट21, सी-किट भी अंय सेल प्रकार द्वारा व्यक्त की है, सहित मस्तूल कोशिकाओं22, endothelial कोशिकाओं23, और टेम स्टेम/जनक कोशिकाओं24। एक अतिरिक्त समस्या यह है कि सभी मार्करों सभी प्रजातियों में व्यक्त कर रहे है नहीं है । यह Sca-1 के लिए मामला है, जो माउस में नहीं बल्कि मानव25में व्यक्त करता है । इसलिए, प्रोटोकॉल है कि अलगाव मार्कर से स्वतंत्र है का उपयोग नैदानिक परीक्षणों और मानव नमूनों का उपयोग कर अध्ययन को देखने में लाभप्रद हो सकता है ।

मार्कर-स्वतंत्र आइसोलेशन तकनीक:

वहां सीपीसी अलगाव की कई प्रमुख तकनीक है, जो मुख्य रूप से सतह मार्कर अभिव्यक्ति के स्वतंत्र हैं, लेकिन जो विशिष्ट मार्कर के लगातार चयन से परिष्कृत किया जा सकता है के रूप में सकारात्मक उप आवश्यक (भी तालिका 1देखें) । (1) पक्ष जनसंख्या (सपा) तकनीक मूलतः टेम स्टेम कोशिकाओं के एक आदिम आबादी में विशेषता के आधार पर किया गया है डीएनए डाई Hoechst ३३३४२26 एटीपी द्वारा बाध्यकारी कैसेट (एबीसी)27ट्रांसपोर्टरों द्वारा समाप्ति । कार्डिएक सपा कोशिकाओं अलग समूहों द्वारा अलग किया गया है और रिपोर्ट2,8,13,14के बीच कुछ मामूली मतभेदों के साथ मार्करों की एक किस्म व्यक्त करने के लिए रिपोर्ट । (2) कॉलोनी बनाने इकाई fibroblast कोशिकाओं (CFU-Fs) मूल रूप से एक mesenchymal stromal सेल (एमएससी) के आधार पर परिभाषित किया गया है-जैसे phenotype । पृथक MSCs व्यंजन पर संस्कृति के लिए कॉलोनी गठन प्रेरित कर रहे हैं । ऐसी कॉलोनी बनाने वाली एमएससी-CFU-एफएस की तरह वयस्क दिल से अलग किया जा सकता है और कार्डियक वंश15में अंतर करने में सक्षम हैं । (3) Cardiosphere-व्युत्पन्न कोशिकाओं (सीडीसी) ऊतक बायोप्सी या explants28,29,30,31से बढ़ी कोशिकाओं के समूहों से व्युत्पंन एकल कोशिकाओं रहे हैं । यह हाल ही में दिखाया गया है कि ज्यादातर CD105+/CD90-/c-kit- सेल अंश प्रदर्शित cardiomyogenic और पुनर्अपक्षय क्षमता३२

यहां, सपा-चूहों से अलग CPCs का उपयोग कर, हम endothelial वंश के कुशल प्रेरण चूहे CPCs और माउस SP-CPCs३३में एक पिछले अध्ययन के आधार पर के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । प्रोटोकॉल कोशिका घनत्व के संबंध में संस्कृति और विस्तार तकनीक के लिए विशिष्ट रूपांतरों, माध्यम के सीरम सामग्री, और सब्सट्रेट शामिल हैं । यह न केवल माउस सपा के लिए लागू किया जा सकता है CPCs लेकिन प्रयोजन के लिए CPCs के विभिंन प्रकार के लिए एक बढ़ाना से एक भाग्य स्विच प्रेरित करने के लिए एक endothelial-सीपीसी प्रतिबद्ध, यह इन कोशिकाओं या यंत्रवत के लिए उनके उपयोग के इन विट्रो अध्ययन में प्रत्यारोपण के ध्यान में रखना ।

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Protocol

सेल अलगाव प्रयोजन के लिए चूहों के उपयोग की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार और स्विस पशु संरक्षण कानून के साथ था और स्विस गुआंगज़ौ के अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

नोट: Sca के अलगाव-1+/CD31- SP-CPCs माउस दिल से अनिवार्य रूप से पहले कुछ संशोधनों के साथ३४ वर्णित के रूप में किया गया था । सामग्री और रिएजेंट इस्तेमाल के लिए, सामग्री की तालिकादेखें । सभी प्रयोगों के लिए, कार्डियक SP-CPCs चूहों से अलग परिलक्षित, पारित कर रहे थे, और एक सेल लाइन तरह तरीके से इस्तेमाल किया । इस अध्ययन के लिए 7-20 अंश का उपयोग किया गया ।

1. टिशू वडा

नोट: चूहों का उपयोग करने वाले सभी प्रयोग दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुसार किए जाने चाहिए. यह प्रोटोकॉल चार चूहों का उपयोग करता है । संस्कृति प्लेटों कि व्यास में १०० मिमी P100 और संस्कृति प्लेटों के रूप में वर्णित हैं कि ६० मिमी व्यास में प्रोटोकॉल के निम्नलिखित भागों के लिए P60 के रूप में वर्णित हैं.

  1. pentobarbital intraperitoneally (आईएफसआई) के २०० मिलीग्राम/किलो के साथ प्रत्येक माउस सुई और जब तक यह पूरी तरह से anesthetized है इसकी प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए पैर की अंगुली पिंचing द्वारा रुको ।
  2. ७०% इथेनॉल के साथ छाती पोंछ । वक्ष गुहा को बेनकाब करने के लिए कैंची से त्वचा और वक्ष दीवार को काट लें ।
  3. संदंश के साथ दिल उठा और यह कैंची का उपयोग कर आधार पर काट दिया । दिल को 25 मिलीलीटर (P60 के लिए 5 मिलीलीटर) के साथ कोल्ड फास्फेट के P100 में रखें-बफर खारा (पंजाब) (P100 प्रति तीन से पांच दिल या एक से दो दिलों प्रति P60) ।
  4. संदंश के साथ दिल पंप करने के लिए गुहाओं से बाहर रक्त बाहर निकालने के लिए (आंकड़ा 1a) ।
  5. कपड़े धोने के लिए ठंडे पंजाबियों के 25 मिलीलीटर (P60 के लिए 5 मिलीलीटर) के साथ एक P100 में दिल रखो । छोटी कैंची का उपयोग कर atria निकालें । दिल को दो अनुदैर्ध्य टुकड़ों में काट लें और उन्हें फिर से धोकर आइस-कोल्ड पंजाबियों (25 एमएल/P100, 5 एमएल/P60) में डालें ।
  6. ठंड पंजाबियों के 25 मिलीलीटर (P60 के लिए 5 मिलीलीटर) के साथ एक नए P100 के लिए टुकड़े हस्तांतरण । छोटे कैंची (आंकड़ा 1b) का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में टुकड़े काट । 1 मिलीग्राम/एमएल collagenase बी की एक बूंद जोड़ें हांक संतुलित नमक समाधान में पतला (HBSS) और एक बाँझ उस्तरा ब्लेड (चित्रा 1C) के साथ अच्छी तरह से छोटे टुकड़े कीमा ।

2. पाचन

  1. 1 मिलीग्राम/एमएल collagenase बी के P60 के लिए 10 मिलीलीटर (२.५ एमएल जोड़ें) कदम १.६ से पकवान के लिए समाधान ।
  2. collagenase बी एक ३७ डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1 डी) में एक झुका (के बारे में 30 डिग्री) P100 (या P60) में कीमा बनाया हुआ दिल के टुकड़ों से युक्त समाधान रखो ।
  3. 30 मिनट की एक अधिकतम के लिए कीमा बनाया हुआ दिल टुकड़े की मशीन; homogenize बार एक पाश्चर पिपेट के माध्यम से उंहें हर 10 मिनट में गर्मी (चित्रा 1E) के दौरान गुजर ।
    नोट: यह १.३ कदम के लिए कुल में गर्मी के 30 मिनट से अधिक नहीं महत्वपूर्ण है ।

3. निस्पंदन

  1. कीमा बनाया हुआ और homogenized दिल के टुकड़ों को 2% FBS के साथ पूरक शीत HBSS के 10 मिलीलीटर (5 मिलीलीटर P60 के लिए) जोड़ें ।
    नोट: HBSS 2% FBS शमन collagenase बी गतिविधि के साथ पूरक ।
  2. फिल्टर के माध्यम से दिल के टुकड़े १०० µm फिल्टर के माध्यम से अपच ऊतक निकालने के लिए और ४७० x g पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (RT) (चित्रा 1F, पीले फिल्टर) में केंद्रापसारक ।
  3. supernatant त्यागें और 5 मिलीलीटर में गोली resuspend (P60 के लिए 3 मिलीलीटर) लाल रक्त कोशिका lysis बफर के, और बर्फ पर कभी मिलाते के साथ 5 मिनट के लिए गोली गर्मी ।
  4. पंजाबियों के (P60 के लिए 5 मिलीलीटर) जोड़ें (lysis प्रतिक्रिया को रोकने के लिए) और एक ४० µm फिल्टर के माध्यम से नमूना फ़िल्टर अवशिष्ट cardiomyocytes (चित्रा 1F, नीले फिल्टर) सहित बड़ी कोशिकाओं को बाहर करने के लिए ।
  5. (ब्रेक के बिना) आरटी में 5 मिनट के लिए ४७० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और गोली को 10% FBS सहित DMEM के 1 मिलीलीटर में resuspend ।
  6. एक hemocytometer के साथ एक aliquot में कोशिकाओं गिनती । 10% FBS सहित DMEM के साथ कोशिकाओं resuspend, 1 x 106 कोशिकाओं के एक अंतिम सेल एकाग्रता पर लक्ष्य/
    नोट: मोटे तौर पर 5 x 106 cardiomyocyte-और एरिथ्रोसाइट-घट कोशिकाओं माउस प्रति अनुमान किया जा सकता है ।
  7. दो ट्यूबों में कोशिकाओं को वितरित (चित्रा 2): ट्यूब एमें, verapamil के साथ Hoechst ३३३४२ धुंधला के लिए १.५ मिलीलीटर जोड़ें; ट्यूब बीमें, Hoechst ३३३४२ धुंधला के लिए १८.५ मिलीलीटर जोड़ें और दाग और सॉर्ट करने के लिए आगे बढ़ना (चरण ४.१ और ४.२) कार्डियक एसपी कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा ।

4. प्रवाह Cytometry द्वारा कार्डियक एसपी कोशिकाओं की छंटाई

नोट: Verapamil बहुऔषध प्रतिरोध (एमडीआर) एबीसी ट्रांसपोर्टर गतिविधि अवरुद्ध द्वारा Hoechst समाप्ति रोकता है । Hoechst ३३३४२ एक डीएनए बाध्यकारी डाई कि कोशिका चक्र का पता लगाने के लिए जीवित कोशिकाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में यह डीएनए सामग्री के साथ संबद्ध है । Hoechst-३३३४२-बाहर निकालना कक्ष दोनों उत्सर्जन चैनल (४५० एनएम, Hoechst ब्लू, ६५० एनएम, Hoechst लाल), कि है, Hoechst के एक तरफ, "मुख्य जनसंख्या" को बनाए रखने के Hoechst कम भाग में दिखाई देते हैं, उंहें अपने नाम दे "पक्ष जनसंख्या" । एसपी कोशिकाओं जनक गुणों के साथ कोशिकाओं में समृद्ध और बहुऔषध प्रतिरोधी एबीसी ट्रांसपोर्टरों की एक उच्च अभिव्यक्ति (जैसे MDR1 और ABCG2 के रूप में) दिखा रहे हैं । Hoechst ३३३४२ प्रोटोकॉल के निंनलिखित भागों के लिए Hoechst के रूप में लिखा है । आदर्श परिणामों के लिए हल्की-संवेदनशील सामग्रियों की रक्षा करना जरूरी है ।

  1. उपस्थिति और verapamil की अनुपस्थिति में Hoechst के साथ धुंधला
    1. verapamil जोड़ें (८३.३ µ मीटर के अंतिम एकाग्रता के साथ) और Hoechst (5 µ जी के अंतिम एकाग्रता के साथ) सेल समाधान के लिए 106 कोशिकाओं. ट्यूब Aके लिए, Verapamil और Hoechst का उपयोग करें; ट्यूब बीके लिए, केवल Hoechst का उपयोग करें । ९० मिनट के लिए एक पानी में स्नान (३७ डिग्री सेल्सियस) में गर्मी और ट्यूबों हर 20 मिनट (चित्रा 1G) वापस ।
    2. 5 मिनट के लिए RT पर ४७० x g में ट्यूबों के केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और HBSS में प्रत्येक गोली resuspend (1 x 106 कोशिकाओं/
    3. ट्यूब बी से एकल दाग और नकारात्मक नियंत्रण के लिए एक १.५ मिलीलीटर aliquot ले लो (चित्रा 2): (i) fluorescein isothiocyanate (FITC)-संयुग्मित विरोधी Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-संयुग्मित anti-CD31; (iii) सना हुआ कक्ष (ऋणात्मक नियंत्रण) ।
      नोट: Isotype नियंत्रण आइसोलेशन प्रोटोकॉल को सेट करने के लिए उपयोग किया जाता है ।
    4. ट्यूब A और B और एकल-धुंधला और नकारात्मक नियंत्रण aliquots पर 5 मिनट के लिए आर टी Hoechst और verapamil बाहर धोने के लिए आरटी में ।
    5. supernatant त्यागें और ट्यूब के छर्रों एक और (iii) नकारात्मक नियंत्रण HBSS के २५० µ एल में resuspend और छंटाई जब तक अंधेरे में बर्फ पर उंहें रखने के लिए ।
    6. HBSS के २०० µ एल में ट्यूब बी की गोली resuspend और (मैं, द्वितीय) की गोली HBSS के १०० µ एल में एकल दाग aliquots । जोड़ें FITC-संयुग्मित anti-Sca-1 (०.६ µ g/107 कक्ष) और APC-संयुग्मित विरोधी CD31 (०.२५ µ g/107 कक्ष) । बर्फ पर 30 मिनट के लिए छर्रों गर्मी और उन्हें अंधेरे में समय-समय पर हिला ।
    7. ट्यूबों के लिए HBSS के 2 मिलीलीटर जोड़ें । 5 मिनट के लिए RT पर ४७० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक ।
    8. supernatant त्यागें और HBSS के 1 मिलीलीटर के साथ सभी छर्रों resuspend और ऊपर के रूप में केंद्रापसारक । supernatants को त्यागें । HBSS के २०० µ एल में एकल दाग aliquots की गोली resuspend । HBSS (20 x 106 कोशिकाओं/एमएल) में ट्यूब बी की गोली resuspend ।
    9. बर्फ पर नमूने रखें और छंटाई जब तक प्रकाश से संरक्षित ।
  2. प्रवाह cytometry के साथ सॉर्ट करना
    1. तैयार बाँझ १.५ मिलीलीटर छँटाई ट्यूबों के साथ ५०० µ एल सहित HBSS के 2% FBS.
    2. 7-aminoactinomycin डी (7-AAD) के साथ कोशिकाओं दाग (०.१५ µ जी/106 कोशिकाओं) 10 मिनट के लिए बर्फ पर मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए ।
    3. हृदय सपा निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग कर क्रमबद्ध करें: उत्तेजित Hoechst ३५० एनएम (यूवी) उत्तेजना का उपयोग कर, एक 450/50 एनएम बैंड-पास फिल्टर (Hoechst ब्लू) और एक 670/30 एनएम बैंड-पास फिल्टर (Hoechst लाल) के साथ प्रतिदीप्ति उत्सर्जन इकट्ठा, और १०० µm और दबाव के एक नोजल आकार का उपयोग 15 psi.
    4. विश्लेषण के लिए, रिकॉर्ड 5 x 105 घटनाओं छंटाई नमूनों के लिए और 1 x 105 घटनाओं के लिए नकारात्मक नियंत्रण, verapamil नियंत्रण, और एक दाग नमूने ।
      नोट: कार्डिएक SP ०.५%-2% (चित्रा1) के आसपास है, लेकिन प्रयोगशालाओं और अलग के बीच भिन्न हो सकते हैं । Sca-1+/CD31- अंश कुल कार्डियक SP (figure 1I) का 1%-11% के आसपास है, लेकिन प्रयोगशालाओं और अलग के बीच भिन्न हो सकते हैं । Sca-1+/CD31- sp-CPCs प्रोटोकॉल के निम्न भागों के लिए sp-CPCs के रूप में लिखे गए हैं ।

5. पृथक सपा की प्राथमिक संस्कृति-CPCs

नोट: इस प्रोटोकॉल में तीन भिंन प्रकार के मीडिया का उपयोग किया गया था । वे मध्यम 1 के रूप में संदर्भित कर रहे है (Noseda एट अलके अनुसार.) 8, मध्यम 2, और मध्यम 3 और उनकी रचना के बारे में सामग्री की तालिका में वर्णित हैं ।

  1. उपयोग करने से पहले मध्यम 1 से ३७ ° तक गर्म और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए केंद्रापसारक नीचे शांत । 4 डिग्री सेल्सियस और 6 मिनट के लिए ४७० एक्स जी पर छंटाई ट्यूबों केंद्रापसारक और मध्यम 1 में कोशिकाओं resuspend ।
  2. एक गैस-पारगंय P60 डिश पर कोशिकाओं को मध्यम से 4 मिलीलीटर 1 के साथ रखें । मध्यम प्रत्येक 3 डी जब तक कोशिकाओं ७०%-८०% संगम तक पहुंच चुके है बदलें ।
    नोट: चरण ५.२ लगभग 2-3 सप्ताह लग सकते हैं ।

6. सपा का विस्तार और विभेद-CPCs

  1. सेल संस्कृति
    1. संस्कृति 3 एक्स 105 सपा-मध्यम 1 के 8 मिलीलीटर में एक T75 कुप्पी में CPCs ।
    2. ३७ ° c पर मशीन सपा-CPCs 5% सह2 के साथ ७०% तक-८०% संगम, माध्यम बदल हर 2-3 डी ।
      नोट: कक्ष संख्या CPCs उपयोग किया गया, दोहरीकरण समय, और कक्ष का आकार के प्रकार के अनुसार संशोधित किया जाना चाहिए ।
  2. सपा-सीपीसी विकास और विभिन्न सीरम सांद्रता के तहत व्यवहार्यता
    1. संस्कृति सपा-CPCs के लिए 2-3 डी के साथ T75 कुप्पी में 8 मिलीलीटर मध्यम 1. ध्यान से मध्यम महाप्राण और गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) HBSS के 5 मिलीलीटर के साथ धीरे कुल्ला ।
    2. सेल मशीन में 5 मिनट के लिए Trypsin-EDTA के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं का इलाज, Trypsin गतिविधि को रोकने के लिए मध्यम 1 के 5 मिलीलीटर जोड़ें, और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण ।
    3. आरटी में 5 मिनट के लिए ४७० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
    4. मध्यम 1 या मध्यम 2 में कोशिकाओं resuspend (वंश प्रेरण माध्यम) और प्लेट २.५ एक्स 105 सपा-CPCs विभिंन सीरम सांद्रता युक्त मध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ P60 व्यंजन पर ।
    5. मध्यम 1 या मध्यम 2 में संवर्धन के 2 डी के बाद एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में मृत कोशिकाओं के संग्रह के लिए कदम 6.2.4 के पकवान से मध्यम इकट्ठा ।
    6. चरण 6.2.2 के रूप में अनुयाई कक्षों को Trypsinize और चरण 6.2.5 की 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल सस्पेंशन एकत्रित करें । आरटी में 5 मिनट के लिए ८४० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
    7. महाप्राण supernatant और सेल गिनती के लिए मध्यम 1 या मध्यम 2 के 1 मिलीलीटर जोड़ें । दाग सपा-trypan नीले (०.४%) और गिनती trypan ब्लू पॉजिटिव (मृत) और trypan ब्लू-नकारात्मक (व्यवहार्य) कोशिकाओं के साथ CPCs ।
      नोट: कक्ष व्यवहार्यता (step 6.2.7) को कुल कक्ष संख्या के संबंध में trypan-नीला ऋणात्मक कक्ष संख्या के रूप में दिया जाता है ।
  3. endothelial विभेदन की प्रेरण
    1. 10 µ g/laminin (LN) या fibronectin (एफ एन) के साथ एक (6 अच्छी तरह से) संस्कृति प्लेट कोट ।
      1. 10 µ जी/LN या F12 मध्यम (या पंजाब) के साथ एफ एन के एक सब्सट्रेट समाधान करें । प्रत्येक अच्छी तरह से समाधान सब्सट्रेट के 2 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए थाली बनाए रखें ।
      2. महाप्राण थाली से समाधान और यह प्रयोग जब तक प्रत्येक अच्छी तरह से पंजाब के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. चरण 6.1.2 से कोशिकाओं से मध्यम महाप्राण, उंहें गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) HBSS के 5 मिलीलीटर के साथ धीरे कुल्ला, उंहें 5 मिलीलीटर के साथ Trypsin-EDTA के 5 मिनट के लिए सेल मशीन में, Trypsin गतिविधि को रोकने के लिए मध्यम 1 के 5 मिलीलीटर जोड़ें, और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण ।
    3. supernatant महाप्राण पर 5 मिनट के लिए ४७० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक और सेल गिनती के लिए मध्यम 2 जोड़ें ।
    4. बीज 8 x 104 मध्यम 2 के 3 मिलीलीटर के साथ लेपित थाली पर प्रति कोशिकाओं और 20-24 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए मध्यम 3 के माध्यम से 3 मिलीलीटर बदलें ।
      नोट: हम एक कम सीरम एकाग्रता युक्त मध्यम का उपयोग करने की सिफारिश-और पूरक के बिना-पहले 20-24 एच के लिए । हम < 60% सेल संगम (यानी, चरण 6.3.4 के सेल संख्या सेल आकार और विकास दर के आधार पर समायोजित किया जाना है) का उपयोग करने की सिफारिश की ।
    5. संस्कृति 21 डी के लिए कोशिकाओं और मध्यम हर 3 डी बदल जाते हैं ।
    6. उंहें वॉन Willebrand फैक्टर (vWF) और प्रदर्शन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में एक endothelial मार्कर के साथ दाग द्वारा विभेदित कोशिकाओं के endothelial प्रकृति की जांच करें ।
      1. पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने और आरटी पर 2 मिनट के लिए ३.७% formaldehyde में कोशिकाओं को ठीक ।
      2. Permeabilize 30 मिनट के लिए ddH2ओ (या पंजाब) में ०.१% ट्राइटन एक्स के साथ कोशिकाओं को और 10% बकरी सीरम के साथ 1 ज आरटी पर ब्लॉक ।
      3. 4 डिग्री सेल्सियस पर ४८ ज के लिए विरोधी वॉन Willebrand फैक्टर एंटीबॉडी (1:100) के साथ कोशिकाओं की मशीन
      4. हर बार 10 मिनट के लिए, पंजाबियों की 1 मिलीलीटर के साथ 3x कोशिकाओं धो लो । उंहें Alexa Fluor ५४६ बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500) के लिए 1 ज पर अंधेरे में आरटी के साथ मशीन ।
      5. फिर 3x धो 10 मिनट प्रत्येक के लिए, पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ । 4 ' 6 के साथ सेल नाभिक दाग-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI; 1:500) 5 मिनट के लिए आर टी में अंधेरे में ।
      6. धो कोशिकाओं 3x, 5 मिनट प्रत्येक के लिए, पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ । कोशिकाओं माउंट और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान
        नोट: संवर्धन स्थितियों (सब्सट्रेट, मध्यम, पूरक एजेंट, और FBS एकाग्रता) चरण ६.१ और ६.३ के चित्रा 3में वर्णित हैं ।
  4. ट्यूब गठन की परख
    1. एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स तैयार (जैसे, Matrigel, फिर से मैट्रिक्स के रूप में भेजा) प्लेट ।
      1. 4 डिग्री सेल्सियस पर मैट्रिक्स गल रातोंरात ।
      2. कोट बर्फ पर मैट्रिक्स के १०० µ एल के साथ एक ९६-अच्छी तरह से थाली ।
        नोट: यह मैट्रिक्स में किसी भी बुलबुले से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । प्लेटों को बर्फ पर लेपित होना मैट्रिक्स के jellification से बचने के लिए है ।
      3. 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर थाली बनाए रखें ।
    2. महाप्राण (कदम 6.3.5 के पूरा होने के बाद) कोशिकाओं से मध्यम, धीरे से कुल्ला (३७ डिग्री सेल्सियस) HBSS की 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं, और उंहें Trypsin-EDTA के साथ 5 सेल मशीन में मिनट के लिए इलाज । मध्यम 3 जोड़ें Trypsin गतिविधि को रोकने के लिए और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण ।
    3. महाप्राण supernatant पर 5 मिनट के लिए ४७० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक, मध्यम 3 की 1 मिलीलीटर, और धीरे प्लास्टिक जोड़ें ।
    4. ३५ µm कक्ष छलनी वाले कक्षों को फ़िल्टर करें, यदि कक्ष समेकित हैं.
    5. कोशिकाओं और बीज गिनती 2 x 103 से 4 x 103 कोशिकाओं को १०० µ एल में मध्यम 3 के प्रत्येक मैट्रिक्स में अच्छी तरह से लेपित । 16 ज के लिए सेल मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेट रखें ।
    6. 2x आवर्धन पर एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ एक तस्वीर ले लो ।
      नोट: एक अपूर्ण trypsinization के मामले में, 7-8 मिनट की एक अधिकतम करने के लिए Trypsin-EDTA के लिए जोखिम समय लंबा ।

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Representative Results

माउस SP-CPC आइसोलेशन:

इस अध्ययन में, हम माउस CPCs एसपी phenotype के अनुसार पृथक इस्तेमाल किया, जबकि चूहे CPCs से परिणाम संशोधित कर रहे है और अनुमति के साथ एक पिछली रिपोर्ट से जोड़ा (चित्रा 8)३३

उच्च और कम सेल घनत्व के तहत और अलग सीरम सांद्रता के साथ सेल प्रसार:

हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि कार्डिएक वंश मार्करों के mRNA अभिव्यक्ति पहले 24 एच संवर्धन कदम के भीतर बदल दिया है । यह ज्ञात है कि extracellular मैट्रिक्स endothelial विभेद३५सहित सेल भाग्य फैसलों को प्रभावित करता है । CPCs के endothelial वंश प्रतिबद्धता की सुविधा के लिए उपयुक्त परिस्थितियों का पता लगाने के लिए, हम एफ एन और LN (दोनों 10 µ जी/एमएल) एक 6-अच्छी तरह से प्लेट (विकास क्षेत्र: ९.६ सेमी2/well) इस अध्ययन में इस्तेमाल किया । क्योंकि कोशिका चक्र और सेल भाग्य फैसले बारीकी से जुड़े हुए हैं, हम हालत है कि कोशिका मृत्यु के अभाव में एक कम सेल प्रसार दर प्रदर्शित की मांग कर रहे हैं, के रूप में ऐसी हालत सेल प्रसार से भेदभाव को प्रतिबिंबित कर सकते हैं । हम इसलिए, निंनलिखित शर्तों और सेल प्रसार दरों की तुलना में लागू: सेल घनत्व के लिए, उच्च (८०%-९०%) प्रवाह और कम (< 60%), और सीरम एकाग्रता के लिए, सामांय संस्कृति की स्थिति (इस अध्ययन में ३.५% FBS) और कम सीरम अटी (≤ ०.१% FBS). सबसे पहले, हम कम सेल घनत्व हालत का परीक्षण किया । वहां सेल व्यवहार्यता और ln और एफ एन के बीच ३.५% FBS के साथ कम सेल घनत्व में प्रसार के कोई महत्वपूर्ण मतभेद थे, ०.१% FBS के साथ एक कम सेल घनत्व जबकि ln पर कमी सेल प्रसार से पता चला एक एफ एन लेकिन सेल मौत में कोई वृद्धि की तुलना में ( चित्रा 4) । इसके विपरीत, उच्च कोशिका घनत्व शर्तों के तहत, दोनों ३.५% और ०.१% की सीरम सांद्रता कोशिका प्रसार में कोई अंतर नहीं दिखाया और कोशिका मृत्यु में दो सब्सट्रेट (चित्रा 5) के बीच.

इन परिणामों से संकेत मिलता है कि ०.१% सीरम के साथ LN पर कम सेल घनत्व सीपीसी व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना प्रसार कम हो जाती है ।

Endothelial विभेदक माध्यम में कोशिका आकृति में परिवर्तन:

हालांकि आगे के अध्ययन के लिए महत्व और अंतर्निहित तंत्र को समझने की आवश्यकता होती है, कोशिका के आकार में परिवर्तन के लिए उपयुक्त संस्कृति की स्थिति का एक संकेतक के रूप में विशिष्ट परिवर्तन संस्कृतियों में जल्दी पर देखा जा सकता है दिखाई देते हैं, जिसमें endothelial विभेदन सफल होने वाला है (चित्रा ६). के रूप में चित्र 6में सफेद डैश्ड हलकों में दिखाया गया है, endothelial विभेद माध्यम में 7-14 d के भीतर, सफल संस्कृतियों कोशिकाओं है कि बड़े और अन्य कोशिकाओं को आकृति विज्ञान में अलग थे निहित. दिलचस्प है, इन कोशिकाओं को भेदभाव चरण के अंत की ओर गायब हो और भी कम संख्या में दिखाई दिया और उच्च में बाद में समय अंक में LN और एफ एन पर घनत्व संस्कृतियों । जबकि हम आगे इन कोशिकाओं विशेषताएं नहीं था, इस प्रोटोकॉल पता चलता है ट्रैकिंग सेल आकार हर 2-3 डी जब तक दिन के आसपास 14 । यदि ऐसी कोई कोशिकाएं दिखाई नहीं देती हैं, तो बीजों की कोशिकाओं की संख्या में कमी आनी चाहिए ।

एक ट्यूब गठन परख के साथ Endothelial क्षमता का मूल्यांकन:

ट्यूब गठन परख एक उपयोगी तकनीक को विभेदित कोशिकाओं के ट्यूब गठन की क्षमता को मापने के द्वारा CPCs के endothelial भेदभाव की दक्षता का मूल्यांकन है । इसलिए हम, वर्णित शर्तों के अनुसार विभेदित कोशिकाओं के साथ ट्यूब गठन परख प्रदर्शन किया । दिलचस्प है, सफल ट्यूब गठन लगातार कम घनत्व पर चढ़ाया और ln पर विभेदित कोशिकाओं द्वारा दिखाया गया था, ट्यूब के गठन के ज्यादातर एक उच्च घनत्व (चित्रा 7A) पर LN पर चढ़ाया कोशिकाओं में विफल रहे, जबकि । इसी तरह, ट्यूब गठन ज्यादातर कोशिकाओं में असफल था सेल घनत्व के एफ एन पर कल्चरित है, हालांकि एक कम घनत्व में एफ एन पर विभेदित कोशिकाओं को कभी-कभार गठन मामूली ट्यूबों, सेल हालत पर निर्भर करताहै (जैसे, अलग और/ गद्यांश संख्या, चित्रा 7B). कोशिकाओं की endothelial प्रकृति की पुष्टि करने के लिए, coverslips पर चढ़ाया कोशिकाओं को वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार अंतर किया गया और vWF के लिए दाग । फिर, vWF अभिव्यक्ति और अधिक सजातीय और अधिक CPCs में स्पष्ट किया गया था एन एफ (चित्रा 7C, डी) की तुलना में LN पर विभेदित । 8 चित्रा ट्यूब गठन परख से परिणाम के रूप में पिछले अध्ययन के लिए प्रदर्शन के रूप में एक ही प्रोटोकॉल के तहत चूहे CPCs का उपयोग यहां३३वर्णित दिखाता है । इन परिणामों से पता चलता है कि ट्यूब गठन LN पर विभेदित कोशिकाओं में और अधिक कुशल है के रूप में एफ एन जब कम सेल घनत्व की स्थिति में और कम सीरम के साथ (०.१% FBS) endothelial विभेदक मध्यम में भिंनता से पहले 20-24 ज के लिए मढ़वाया । इन परिणामों का सुझाव है कि इस प्रोटोकॉल विभिंन प्रकार के सेल और प्रजातियों के स्वतंत्र के लिए उपयोगी हो सकता है ।

Figure 1
चित्र 1: पृथक माउस दिलों और प्रतिनिधि प्रवाह से एक cardiomyocyte-समाप्त सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए विशिष्ट आइसोलेशन चरणों का चित्रण कार्डियक एसपी की cytometry readouts. () इस पैनल छोटे संदंश का उपयोग कर लागू दोहराया मामूली दबाव के माध्यम से हृदय गुहाओं से अवशिष्ट रक्त के इंजेक्शन से पता चलता है. () इस पैनल छोटे कैंची का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में दिलों की कटाई दिखाती है । () यह पैनल दिल के टुकड़ों का नख़रेबाज़ एक रेजर ब्लेड का इस्तेमाल करके दिखाता है । () यह पैनल ३७ डिग्री सेल्सियस पर झुका प्लेटों में collagenase बी के साथ कीमा बनाया हुआ दिल की गर्मी से पता चलता है । () यह पैनल मशीनी कदम के दौरान एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर कीमा बनाया हुआ दिल का homogenization दिखाता है । () यह पैनल एक १०० µm फिल्टर (पीला) और एक ४० µm फिल्टर (नीले) अपच ऊतक अवशेषों और cardiomyocytes को हटाने के लिए के माध्यम से पचा ऊतक की फ़िल्टरिंग दिखाता है । () इस पैनल के कोमल उत्क्रमण से पता चलता है एक ५० एमएल शंकु ट्यूब युक्त cardiomyocyte-घट कोशिका निलंबन और Hoechst के अलावा के बाद प्रकाश सुरक्षा के लिए टिन पंनी में लपेटन । () इस पैनल के प्रतिनिधि प्रवाह से पता चलता है cytometry readouts की उपस्थिति और अनुपस्थिति में Hoechst-सना हुआ कोशिकाओं एबीसी ट्रांसपोर्टर अवरोधक verapamil के लिए सपा की पहचान के लिए । (I) इस पैनल में एसपी का प्रतिनिधि डॉट प्लाट दिखा कोशिकाओं के अनुसार CD31 और Sca-1 Sca की पहचान के लिए धनात्मकता-1+/CD31- उपअंश. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: नमूना तैयारी कार्डियक सपा छँटाई करने के लिए अग्रणी की योजनाबद्ध सिंहावलोकन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: endothelial वंश प्रेरण और भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: माउस सपा-सीपीसी प्रसार जब LN और एफ एन पर अलग सीरम सांद्रता के तहत एक कम सेल घनत्व पर चढ़ाया । (A और B) ये पैनल 2 दिन में सेल नंबर दिखाते हैं । (सी और डी) इन पैनलों 2 दिन में व्यवहार्यता दिखाओ । डेटा मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में दिखाया जाता है (SEM); N = 5; विभिंन मार्ग; * छात्र का टी-टेस्ट करके पी < ०.०५ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: माउस सपा-सीपीसी प्रसार जब LN और एफ एन पर अलग सीरम सांद्रता के तहत एक उच्च कोशिका घनत्व पर चढ़ाया । (A और B) ये पैनल 2 दिन में सेल नंबर दिखाते हैं । (सी और डी) इन पैनलों 2 दिन में व्यवहार्यता दिखाओ । डेटा मतलब ± SEM के रूप में दिखाया जाता है; N = 5; विभिंन मार्ग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: अंतर प्रक्रिया के दौरान 14 और 17 डी में सेल आकृति विज्ञान । यह आंकड़ा उज्ज्वल क्षेत्र (BF) माउस सपा के चित्र से पता चलता है-CPCs LN पर वरीयता प्राप्त या एफ एन-एक कम (कम) या एक उच्च (उच्च) सेल घनत्व के साथ और मध्यम 2 के लिए 20 के लिए एच-लेपित व्यंजन, 14 या 17 डी के लिए मध्यम 3 द्वारा पीछा किया. सफेद डैश्ड हलकों निशान गोल आकार कोशिकाओं बुद्धि युक्त क्षेत्रों h एक बड़ा सेल आकार । इमेजिंग उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ प्रदर्शन किया गया था । आवर्धन = 2x; स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 7
चित्रा 7: सपा के endothelial भेदभाव के बाद ट्यूब गठन और vWF धुंधला-LN और एफ एन पर CPCs । (A और B) इन पैनलों ट्यूब गठन दिखाते हैं । (सी और डी) इन पैनलों vWF धुंधला दिखा । कोशिकाओं को 10 µ g/LN-या एफ एन-लेपित व्यंजन एक कम या उच्च कोशिका घनत्व के साथ और 20 एच के लिए मध्यम 2 के साथ, 21 डी के लिए मध्यम 3 द्वारा पीछा किया, और फिर Trypsin के साथ काटा और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर वरीयता प्राप्त थे । सभी चित्र 16 ज के बाद लिया गया । इमेजिंग उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी और आवर्धन के साथ प्रदर्शन किया गया था = 2x पैनलों A और Bके लिए इमेजिंग फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और आवर्धन के साथ किया जाता है = 10x पैनलों के लिए सी और डी पैनलों A और C दिखाएं LN-लेपित व्यंजन । पैनलों बी और डी एन-लेपित व्यंजन दिखाएं । स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 8
चित्रा 8: चूहा CPCs के endothelial विभेद के बाद ट्यूब गठन । चूहा CPCs 10 µ जी पर एक कम सेल घनत्व पर वरीयता प्राप्त/LN-या एफ एन-लेपित व्यंजन के साथ ०.१% FBS-युक्त F12 मध्यम के लिए 20 एच, एक और 21 डी द्वारा मध्यम 3 में पीछा किया, और फिर Trypsin के साथ काटा गया । एक ९६-अच्छी प्लेट पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर, 4 x 104 कोशिकाओं मध्यम 3 के १०० μL में वरीयता प्राप्त थे । इमेजिंग उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ प्रदर्शन किया गया था । आवर्धन = 2x; स्केल बार = ५० µm । यह आंकड़ा एक पिछले अध्ययन३३के आधार पर संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रजातियों अलगाव, पता लगाने मार्कर संदर्भ
मानव, चूहा, माउस c-संच+/Lin-, c-संच+/CD45-, c-संच+/CD45-/CD31- Beltrami, सेल २००३; Bolli, नुकीला २०११; एलिसन, सेल २०१३; स्मिथ, नात Protoc २०१४; Vicinanza, कोशिका मृत्यु अलग २०१७
Mongrel कुत्तों लिन-, प्लस: सी-किट+, MDR1+ या Sca-1+ linke, PNAS २००५
माउस Sca-1+ ओह, PNAS २००३
माउस ओर जनसंख्या, प्लस: Abcg2+, Sca-1+/CD31-, Sca-1+/PDGFRa+ Hierlihy, FEBS लेट् २००२; मार्टिन, देव बियोल २००४; Pfister, Circ Res २००५; Noseda, नात कम्यून २०१५
माउस कॉलोनी बनाने इकाई-fibroblast, प्लस: CD45-, CD31-, Sca-1+, PDGFRa+ Pelekanos, स्टेम सेल Res २०१२
माउस, चूहा, मानव Isl-1+ *, plus: CD31-, c-kit-, Sca-1-, Gata4+, nkx 2.5+ Laugwitz, प्रकृति २००५; बु, प्रकृति २००९
* आइएसएल-1 भ्रूण या भ्रूण मायोकार्डियम में पाया जाता है, वयस्क दिल में नहीं ।

तालिका 1: आइसोलेशन तकनीक और कार्डियक जनक कोशिकाओं के मार्कर.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के लाभ:

इस प्रोटोकॉल CPCs के एक endothelial भेदभाव तकनीक प्रदान करता है । हमने पाया है कि एक कम सीरम एकाग्रता और कम सेल घनत्व endothelial भेदभाव की क्षमता में सुधार, जिससे LN इन शर्तों के तहत एफ एन से अधिक उपयुक्त सब्सट्रेट साबित हो सकता है । हम CPCs के दो अलग प्रकार: चूहा CPCs, जो एक सेल लाइन में इस्तेमाल किया गया तरह ढंग का इस्तेमाल किया, और माउस सपा-CPCs, जो अलग और विस्तारित थे । विशेष रूप से, प्रोटोकॉल CPCs के दोनों प्रकार के लिए लागू किया गया था । वर्तमान तकनीक वैज्ञानिकों को अलग और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से और नैदानिक रोग मॉडल से प्राथमिक CPCs का विस्तार करने की अनुमति, साथ ही मनुष्यों से28,३६। पृथक CPCs पर इस प्रोटोकॉल का उपयोग न केवल रोग तंत्र की जांच करने के लिए उपयोगी हो सकता है, लेकिन यह भी उपंयास चिकित्सीय लक्ष्यों की खोज के लिए ।

CPCs कोशिका चिकित्सा के लिए नैदानिक परीक्षण में वर्तमान में कर रहे हैं4,5, जिससे कोशिकाओं रोगियों से अलग कर रहे हैं और वापस प्रत्यारोपण के बाद इन विट्रो प्रवर्धन. इस संबंध में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को प्रत्यारोपण से पहले ऐसी CPCs की भिंनता क्षमता बढ़ाने के लिए रणनीतियों की पहचान करने में मदद मिल सकती है । हालांकि, सेल थेरेपी अभी भी कम प्रतिधारण, अस्तित्व, और प्रत्यारोपित कोशिकाओं के engraftment के कारण सीमित प्रभावकारिता से ग्रस्त है । यंत्रवत इन विट्रो में इस प्रोटोकॉल पर या रूपांतरों के आधार पर अध्ययन क्षमता को भेदभाव की प्रक्रिया ड्राइविंग आणविक तंत्र की एक बेहतर समझ में योगदान है-विशेष रूप से, कोशिका घनत्व से संबंधित तंत्र , सब्सट्रेट, और विकास कारकों । नए इस तरह के अध्ययन से प्राप्त ज्ञान अंततः सेल reprogramminging के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और सीधे निवास CPCs प्रभाव को चोट के बाद अंतर लागू होता है ।

इस प्रोटोकॉल की सीमाएं:

पृथक प्राथमिक CPCs विषम आबादी है कि कोशिका के आकार और कोशिका वृद्धि अलगाव के आधार पर दर के संबंध में अलग phenotypes दिखा रहे हैं, यहां तक कि जब एक ही मार्करों और समान अलगाव तकनीक का उपयोग कर । इसलिए, निम्नलिखित तीन बिंदुओं को परिभाषित करने की जरूरत है: (1) कोशिका आकार के अनुसार कोशिका बोने की संख्या, (2) आदर्श सीरम एकाग्रता (< 0.5%), और (3) पहले कदम के लिए मशीन समय (वंश की प्रेरण) एक बहुत कम सीरम एकाग्रता के साथ. यहां, हम सेल घनत्व के आधार पर भिंनता दक्षता में अंतर दिखाते हैं । हालांकि, हालांकि हम कम सीरम (०.१% FBS) बनाम संस्कृति सीरम सांद्रता (३.५% FBS) की तुलना में, हम < 0.5% FBS सीमा के भीतर अंय सांद्रता की जांच नहीं की । इसके अलावा, अलगाव मार्करों इस्तेमाल किया और प्रजातियों पर निर्भर करता है, वंश प्रतिबद्धता की प्रेरण की क्षमता भिंन हो सकते हैं । इसलिए, प्रोटोकॉल प्रत्येक कक्ष प्रकार के लिए ऑप्टिमाइज़ किया जाना चाहिए ।

औषधीय और आनुवंशिक अवरोध/प्रेरण तकनीक इस प्रोटोकॉल के साथ रोग तंत्र की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बजाय आनुवंशिक रूप से संशोधित या रोग पशु मॉडल की । इस मामले में, प्रोटोकॉल को बदल दिया जाना चाहिए: कम सीरम युक्त माध्यम के साथ उपचार से पहले, कोशिकाओं विशिष्ट रिएजेंट या आनुवंशिक उपकरण के साथ इलाज किया जाएगा । एक परिणाम के रूप में, कोशिकाओं को और अधिक असुरक्षित कोशिकाओं की तुलना में कमजोर हो सकता है । पहले चरण में कम सीरम का उपयोग करना इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण बिंदु है । इसलिए, सीरम एकाग्रता और पहले कदम के लिए गर्मी समय की एक सावधान सत्यापन सेल प्रसार धीमा जबकि सीरम अभाव के तहत व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है कि इस प्रोटोकॉल एक सफलता या नहीं हो सकता है ।

सारांश:

संक्षेप में, पशु मॉडल से पृथक CPCs हृदय रोग और पुनर्जनन अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करते हैं । विस्तार पर, मानव CPCs भी सीधे सेल थेरेपी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हम, यहां, कुशल endothelial वंश प्रेरण और कोशिका घनत्व और सीरम सांद्रता के सावधान रूपांतरों के आधार पर CPCs के भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल का लाभ CPCs के विभिंन प्रकार के लिए अपनी प्रयोज्यता है और अपनी क्षमता के अध्ययन के लिए एक आधार योगदान करने के लिए और/या अंय उपंयास कार्डिएक पुनर्जनन उपकरण की स्थापना ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों के प्रयोगों के दौरान उसके मददगार समर्थन के लिए वेरा Lorenz का शुक्र है और चिकित्सा विभाग (DBM), विश्वविद्यालय और विश्वविद्यालय अस्पताल बेसल से फ्लो Cytometry सुविधा से कर्मचारियों । इस काम के रहने के द्वारा समर्थित था बेसल विश्वविद्यालय से ट्रैक कार्यक्रम पर (to Michika Mochizuki) । Gabriela एम Kuster स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 310030_156953) से एक अनुदान द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Culture medium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) ThermoFisher #12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham Merck #D8437
Penicillin-Streptomycin (P/S) ThermoFisher #15140122
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071 3.5% (0.1% for lineage induction)
L-Glutamine  ThermoFisher #25030 Final concentration 2 mM
Glutathione Merck #G6013
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech #AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Peprotech #AF-100-18B
B27 Supplement ThermoFisher #17504044
Cardiotrophin 1  Peprotech #250-25
Thrombin Diagontech AG, Switzerland #100-125
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) ThermoFisher #14170
0.05 % Trypsin-EDTA ThermoFisher #25300
T75 Flask Sarstedt #83.3911
Endothelial differentiation  
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit Lonza #CC-3162
Ham's F-12K (Kaighn's) Medium ThermoFisher #21127
Laminin  Merck #L2020
Fibronectin  Merck #F4759 Dilute in ddH2O
6 Well Plate Falcon #353046
Formaldehyde Solution Merck #F1635 Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)
Triton X-100 Merck #93420 0.1% in ddH2O
Normal Goat Serum (10%) ThermoFisher #50062Z
Anti-von Willebrand Factor antibody Abcam #ab6994 1:100 in 10% goat serum
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 ThermoFisher #A11010 1:500 in 10% goat serum
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) ThermoFisher #62247 1:500 in ddH2O 
SlowFade Antifade Kit ThermoFisher #S2828
BX63 widefield microscope Olympus
Tube formation
96 Well Plate Falcon #353072
5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap Falcon #352235
Matrigel Growth Factor Reduced Corning #354230
IX50 widefield microscope Olympus
Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 
Reagents
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. in house hospital pharmacy #9077862 Working solution: 200 mg/kg
Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) ThermoFisher #20012
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) ThermoFisher #14175 Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS  for quenching Collagenase B activity 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate ThermoFisher #331885 Prepare DMEM + 10% FBS  + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining
Penicillin-Streptomycin  (P/S) ThermoFisher #15140122
HEPES 1 M ThermoFisher #15630080 Final concentration 25 mM
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071
RBC LysisBuffer (10X) BioLegend #420301/100mL Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter
Collagenase B Merck #11088807001 Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter
bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) Merck #B2261 Prepare 1 mg/mL in ddH2O
Verapamil-hydrochloride  Merck #V4629 Final concentration 83.3 µM 
APC Rat Anti-Mouse CD31 BD Biosciences #551262 0.25 µg/107cells
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) BD Biosciences #557405 0.6 µg/107cells
7-Aminoactinomycin D (7-ADD) ThermoFisher #A1310 0.15 µg/106cells
APC rat IgG2a k Isotype Control BD Biosciences #553932 0.25 µg/107cells
FITC Rat IgG2a k Isotype Control BD Biosciences #554688 0.6 µg/107cells
Material
Needles 27G Terumo #NN-2719R
Needles 18G Terumo #NN-1838S
Single Use Syringes 1 mL sterile CODAN #62.1640
Transferpipette 3.5 mL Sarstedt #86.1171.001
Cell Strainer 40 µm blue BD Biosciences  #352340
Cell Strainer 100 µm yellow BD Biosciences #352360
Lumox Dish 50 Sarstedt #94.6077.305
Culture Dishes P100 Corning #353003
Culture Dishes P60 Corning #353004
Mouse
Line Age Breeding
C57BL/6NRj / male 12 weeks in house
Product Name Company Catalogue No.
Reagents
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) ThermoFisher #12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham Merck #D8437
Penicillin-Streptomycin  (P/S) ThermoFisher #15140122
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071
L-Glutamine  ThermoFisher #25030
Glutathione Merck #G6013
B27 Supplement ThermoFisher #17504044
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech #AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Peprotech #AF-100-18B
Cardiotrophin 1  Peprotech #250-25
Thrombin Diagontech AG, Switzerland  #100-125
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit Lonza #CC-3162
Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. 
Product Name Medium 18 Medium 2 Medium 3
Reagents Culture Lineage induction Endothelial diff.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 35% 35%
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham 65% 65%
Penicillin-Streptomycin  (P/S) 1% 1%
Fetal Bovine Serum (FBS) 3.5% ≤0.1%
L-Glutamine  2 mM 2 mM
Glutathione 0.2 nM 0.2 nM
B27 Supplement 1.3%
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) 6.5 ng/mL
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) 13 ng/mL
Cardiotrophin 1  0.65 ng/mL
Thrombin 0.0005 U/mL All necessary components included in the kit
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit All necessary components included in the kit

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References

  1. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114, (6), 763-776 (2003).
  2. Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530, (1-3), 239-243 (2002).
  3. Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107, (2), 255 (2012).
  4. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, (9806), 1847-1857 (2011).
  5. Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379, (9819), 895-904 (2012).
  6. Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132, (4), 537-543 (2008).
  7. Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, (2), 232-243 (2009).
  8. Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930 (2015).
  9. Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102, (25), 8966-8971 (2005).
  10. El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98, (1), 125-135 (2013).
  11. Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154, (4), 827-842 (2013).
  12. Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100, (21), 12313-12318 (2003).
  13. Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265, (1), 262-275 (2004).
  14. Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97, (1), 52-61 (2005).
  15. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8, (1), 58-73 (2012).
  16. Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433, (7026), 647-653 (2005).
  17. Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460, (7251), 113-117 (2009).
  18. Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, (7), 1662-1681 (2014).
  19. Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279, (12), 11384-11391 (2004).
  20. Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138, (1), 40-49 (2010).
  21. Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24, (12), 2101-2116 (2017).
  22. Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142, (4), 965-974 (1993).
  23. Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90, (1), 148-155 (1997).
  24. Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174, (1), 63-71 (1991).
  25. Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33, (7), 836-843 (2005).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183, (4), 1797-1806 (1996).
  27. Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103, (8), 825-835 (2008).
  28. Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95, (9), 911-921 (2004).
  29. Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4, (9), e7195 (2009).
  30. Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study. PLoS One. 6, (10), e25669 (2011).
  31. Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13, (7), 864-872 (2011).
  32. Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3, (5), e001260 (2014).
  33. Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6, (10), (2017).
  34. Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
  35. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324, (5935), 1673-1677 (2009).
  36. Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1, (6), 472-493 (2016).

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