Индукция эндотелиальной дифференцировки в клетках сердечной Progenitor в условиях низкой сыворотки

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Этот протокол описывает метод эндотелиальной дифференцировки клеток сердечной прародителя. Он особенно фокусируется на влияние эндотелиальной дифференцировки потенциал сывороточной концентрации и плотности заполнения ячейки.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Mochizuki, M., Della Verde, G., Soliman, H., Pfister, O., Kuster, G. M. Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions. J. Vis. Exp. (143), e58370, doi:10.3791/58370 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Сердца прогениторных клеток (CPC) могут иметь терапевтический потенциал для сердца регенерации после травмы. В самом взрослых млекопитающих внутренние цены за клик крайне скудны, но расширенная цены за клик может быть полезным для клеточной терапии. Предпосылкой для их использования является их способность дифференцироваться в различных сердца линий, используя протоколы определены и эффективно контролируемым образом. Кроме того после расширения в пробирке , СКПК изолированы от пациентов или модели доклинической болезни могут предложить плодотворное исследовательских инструментов для исследования механизмов болезни.

Текущие исследования используют различные маркеры для определения цены за клик. Однако не все из них выражаются в организме человека, который ограничивает поступательное воздействие некоторых доклинических исследований. Дифференциация протоколы, которые применяются независимо от изоляции технику и маркер выражения позволит стандартизированных расширения и грунтовки CPC для цели терапии клеток. Здесь мы опишем, что грунтовка СКПК условиях низкой плода бычьим сывороточным (ФБС) концентрации и плотность низкая клеток облегчает эндотелиальной дифференциации ставок CPC. Использование двух различных субпопуляций мыши и крысы CPC, мы покажем что Ламинин является более подходящий субстрат чем фибронектин для этой цели под следующий протокол: после культивирования для 2-3 дня в среде, включая добавки, поддерживать multipotency и с 3,5% FBS, цены за клик посеян на Ламинин в < 60% слияния и культивировали в дополнение свободной среды с низкой концентрацией FBS (0,1%), 20-24 часов до дифференциации в среде эндотелиальной дифференцировки. Потому что цена за клик гетерогенной популяции, концентрации в сыворотке и инкубации раз может потребоваться корректироваться в зависимости от свойства соответствующих КПК субпопуляция. Учитывая это техника может применяться для других типов ставок CPC также и предоставляет полезный метод исследовать потенциал и механизмы дифференциации и как они страдают от болезни, при использовании CPC, изолированных от соответствующих болезней модели.

Introduction

Недавние исследования поддерживают существование клетки-предшественники-резидентов сердца (CPC) в взрослых млекопитающих сердца1,2,3, и цены за клик может быть полезным источником для клеточной терапии после травмы сердца4, 5. Кроме того, расширенный CPC может обеспечить плодотворные модели для скрининга наркотиков и исследование механизмов болезни при изоляции от пациентов с редкими кардиомиопатии, или от соответствующих болезней модели6,7.

СКПК изолированы от взрослых сердца имеют стволовых/прогениторных клеток характеристики1,2,3,8 , поскольку они Multipotent с, колониеобразования, и имеют возможности для самообновления. Однако есть много различных (суб) населения СКПК экспонируется различные поверхности маркер профилей, включая, например, c комплект, Sca-1 и другие, или извлекается путем изоляции различных методов (Таблица 1). Некоторые культуры и дифференциации протоколы были установленным1,2,8,9,10,11,12, 13,14,,1516,17,18. Эти протоколы отличаются главным образом в том, что касается фактора роста и сыворотки содержания, которые корректируются в соответствии с целью культивирования и которые могут привести к различиям в результаты и результаты, включая дифференциацию эффективности.

Методы изоляции на основе маркера:

СКПК могут быть изолированы на основе конкретной поверхности маркер выражения1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,,1516,17,18. Предыдущие исследования показывают, что c комплект и Sca-1 может быть лучшим маркеры, чтобы изолировать резидентов СКПК1,11,14,19,20. Поскольку ни один из этих маркеров является поистине специфичным для CPC, обычно применяются комбинации различных маркеров. Например в то время как цены за клик Экспресс низкий уровень c комплект21, c комплект также выражается в другие типы клеток, включая тучные клетки22, эндотелиальные клетки23и гемопоэтических стволовых/прогениторных клеток24. Дополнительной проблемой является тот факт, что не все маркеры выражаются через всех видов. Это случай для Sca-1, который выражает в мыши, но не в человека25. Таким образом используя протоколы, которые являются независимыми от изоляции маркеров может быть выгодным с учетом клинических испытаний и исследования с использованием человеческих образцов.

Маркер независимые изоляции методы:

Существует несколько основных методов изоляции КПК, которые являются главным образом независимо от поверхности маркер выражения, но который может быть уточнен подряд отбор конкретных маркер позитивных подфракций, при необходимости (см. также таблицу 1). (1 населения (SP) техника сторона первоначально было охарактеризовано в примитивных населения гемопоэтических стволовых клеток, основанный на способности измеряем ДНК краситель Hoechst 3334226 АТФ привязки кассеты (ABC) транспортеров27. Сердечной клетки SP были изолированы различными группами и сообщил, чтобы выразить различные маркеры с некоторые незначительные различия между доклады2,8,,1314. (2) блок формирование колонии фибробластов клетки (CFU-Fs) первоначально были определены основанные на мезенхимальных стромальных клеток (MSC)-как фенотипа. Изолированные MSCs культивированный на блюда для стимулирования формирования колонии. Такие колонии формирование MSC-как кое-Fs могут быть изолированы от взрослых сердца и способны дифференцироваться в сердечной линий15. (3) Cardiosphere производные клетки (CDC) представляют собой отдельные ячейки, производные от кластеры клеток, выращенных из биопсии ткани или эксплантах28,,2930,31. Недавно было показано, что главным образом CD105+/CD90/c-kit клетки часть экспонатов cardiomyogenic и восстановительной потенциальных32.

Здесь используя SP-СКПК изолированы от мышей, мы предоставляем протокол для эффективной индукции эндотелиальной линии, основанный на предыдущем исследовании СКПК крысы и мыши SP-СКПК33. Протокол содержит конкретные адаптации к культуре и расширения техника связи плотность клеток, содержание сыворотки средних и субстрата. Он может применяться не только к мыши SP-CPC, но различные виды ставок CPC для цели побудить судьба переход от комнатного эндотелия, совершенные КПК, будь то с учетом пересадки этих клеток или их использования в механистической в vitro исследования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Использование мыши для целей изоляции клеток в соответствии с руководство по уходу и использования лабораторных животных и с швейцарский закон о защите животных и была одобрена швейцарскими кантональными властями.

Примечание: Изоляции Sca-1+/CD31SP-клик от сердца мыши по существу было сделано как описано34 с некоторыми изменениями. Для материалов и реагентов, используемых см. Таблицу материалов. Для всех экспериментов сердечной SP-CPC, изолированные от мышей были усиливается, пассированные и используется в ячейки строки похожа на. Для этого исследования были использованы отрывки 7-20.

1. Подготовка тканей

Примечание: Все эксперименты, используя мышь должна осуществляться в соответствии с руководящими принципами и правилами. Этот протокол использует четыре мышей. Культуры пластин, которые составляют 100 мм в диаметре, описаны как P100 и культуры пластин, которые являются 60 мм в диаметре, описаны как P60 для следующих частей протокола.

  1. Придать каждой мыши с 200 мг/кг Пентобарбитал внутрибрюшинно (и.п.) и подождать до тех пор, пока он полностью под наркозом, проверив свой ответ до пят щипать.
  2. Протрите грудь с 70% этиловом спирте. Вырежьте кожу и грудной стенки с ножницами подвергать грудной полости.
  3. Поднимите сердце с щипцами и разрезать его на базу, используя ножницы. Положите сердце в P100 с 25 мл (5 мл для P60) из холодной фосфат амортизированное saline (PBS) (три-пять сердца за P100) или один-два сердца за P60.
  4. Сердце насос пинцетом извлечь кровь из полости (рис. 1A).
  5. Положите сердце в P100 с 25 мл (5 мл для P60) из холодной PBS для стирки. Удаление предсердия, используя маленькие ножницы. Нарезать сердце два продольных и мыть их снова в ледяной PBS (25 мл/P100, 5 мл/P60).
  6. Куски передать новым P100 с 25 мл (5 мл для P60) холодной PBS. Вырежьте куски на более мелкие куски, используя маленькие ножницы (рис. 1B). Добавить каплю 1 мг/мл коллагеназы B разводят в Хэнк сбалансированного солевого раствора (HBSS) и фарш маленькие кусочки тщательно с стерильные лезвия бритвы (рис. 1 c).

2. пищеварение

  1. Добавьте 10 мл (2,5 мл P60) 1 мг/мл раствора B коллагеназы блюдо из шага 1.6.
  2. Наносят раствор коллагеназы B, содержащий молотое сердце штук в наклонном (около 30°) P100 (или P60) в инкубаторе 37 ° C (рис. 1 d).
  3. Инкубировать фарш сердце пьес для максимум 30 мин; однородный многократно передавая их через пипетку Pasteur каждые 10 минут во время инкубации (Рисунок 1E).
    Примечание: Важно, чтобы не превышать 30 минут инкубации в общей сложности для шага 1.3.

3. Фильтрация

  1. Добавить 10 мл (5 мл для P60) из холодной HBSS дополнена 2% FBS фарша и гомогенизированное сердце штук.
    Примечание: HBSS дополнена 2% FBS утоляет коллагеназы B деятельность.
  2. Фильтровать части сердца через 100 мкм фильтр для удаления непереваренных ткани и центрифуги на 470 x g 5 мин при комнатной температуре (RT) (Рисунок 1F, желтый фильтры).
  3. Отменить супернатант Ресуспензируйте гранулы в 5 мл (3 мл для P60) буфера lysis красных кровяных клеток и инкубировать Пелле за 5 мин с случайные встряхивания на льду.
  4. Добавить 10 мл (5 мл для P60) PBS (чтобы остановить реакция лизиса) и фильтра образца через 40 мкм фильтр для исключения больших клеток, включая остаточные кардиомиоцитов (Рисунок 1F, синий фильтры).
  5. Центрифуга трубки на 470 x g 5 мин на RT (без тормозов). Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл DMEM, включая 10% FBS.
  6. Подсчитать ячейки в Алиготе с Горяева. Ресуспензируйте клетки с DMEM, включая 10% FBS, направленный на окончательное ячейки концентрации 1 х 106 клеток/мл.
    Примечание: Клетки cardiomyocyte и эритроцитов обедненный 5 x 10-6 могут быть ориентировочно на мышь.
  7. Распределить клетки в две пробирки (Рисунок 2): в метро A, добавить 1,5 мл для Hoechst 33342 пятнать с верапамилом; в метро Bдобавить 18,5 мл для окрашивания Hoechst 33342 и приступить к пятно и сортировать клетки сердечной SP (шаги 4.1 и 4.2) проточной цитометрии.

4. сортировка клеток сердечной SP проточной цитометрии

Примечание: Верапамил угнетает Hoechst измеряем, блокируя множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) ABC транспортер активности. Hoechst 33342 является ДНК связывающих красителем, который может использоваться для обнаружения клеточного цикла, как это коррелирует с содержанием ДНК в живых клетках. Экструзионно Hoechst 33342 клетки появляются в нижней части Hoechst обоих каналов выбросов (450 Нм, синий Hoechst; 650 нм, "Хёхст" красный), то есть в сторону Хехст-сохранения «основное население», давая им их имя «сторона населения». SP клетки обогащаются в клетках с прародителем свойствами и показать высокое выражение с множественной лекарственной устойчивостью ABC транспортеров (например MDR1 и ABCG2). Hoechst 33342 записывается как Hoechst для следующих частей протокола. Важно защитить светочувствительных материалов для идеальных результатов.

  1. Окрашивание с Hoechst в присутствии и отсутствии верапамил
    1. Добавьте в решение ячейки верапамил (с конечной концентрации 83.3 мкм) и Хехст (с конечной концентрации 5 мкг/106 клеток). Для метро Aиспользуйте верапамил и Hoechst; только для трубки B, использования Хёхст. Инкубируйте на водяной бане (при 37 ° C) 90 мин и вернуться трубы каждые 20 мин (рис. 1 g).
    2. Центрифуга для трубы на 470 x g 5 мин на RT. удалить супернатант и Ресуспензируйте каждой гранулы в HBSS (1 х 106 клеток/мл).
    3. Возьмите 1,5 мл аликвота для одного stainings и отрицательного контроля от трубки B (рис. 2): (i) флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-конъюгированных анти Sca-1; (ii) аллофикоцианин (APC)-конъюгированных анти CD31; (iii) nonstained клетки (отрицательный контроль).
      Примечание: Изотипа элементы управления используются здесь для настройки протокола изоляции.
    4. Центрифуга трубы A и B и аликвоты сингл окрашивание и отрицательный контроль на 470 x g 5 мин на RT для мытья Хехст и верапамил.
    5. Отменить супернатант и Ресуспензируйте окатышей, трубки A и (iii) отрицательный контроль в 250 мкл HBSS и держать их на льду в темноте до сортировки.
    6. Ресуспензируйте Пелле трубки B в 200 мкл HBSS и Пелле (i, ii) сингл окрашивание аликвоты в 100 мкл HBSS. Добавьте FITC-конъюгированных анти Sca-1 (0,6 мкг/107 клеток) и БТР конъюгированных анти CD31 (0,25 мкг/107 клеток). Инкубировать гранулы для 30 минут на льду и встряхнуть их время от времени в темноте.
    7. Добавьте 2 мл HBSS трубы. Центрифуга для трубы на 470 x g 5 мин на RT.
    8. Отменить супернатант и Ресуспензируйте все окатышей с 1 мл HBSS и центрифуги как выше. Выбросите supernatants. Ресуспензируйте Пелле аликвоты сингл окрашивание в 200 мкл HBSS. Ресуспензируйте Пелле трубки B в HBSS (20 x 106 клеток/мл).
    9. Храните образцы на льду и защищены от света до сортировки.
  2. Сортировка с проточной цитометрии
    1. Подготовить стерильные 1,5 мл, Сортировка труб с 500 мкл HBSS, включая 2% FBS.
    2. Пятно клетки с 7-aminoactinomycin D (7-AAD) (0,15 мкг/106 клеток) на льду за 10 мин, чтобы исключить мертвые клетки.
    3. Сортировать сердца SP, используя следующие параметры: возбуждают Hoechst, используя 350 Нм (УФ) возбуждения, собирать флуоресценции выбросов с 450/50 Нм-полосовой фильтр (Hoechst синий) и 670/30 Нм-полосовой фильтр (Hoechst красный) и использовать размер сопла 100 мкм и давление 15 psi.
    4. Для анализа, запись 5 x 105 событий для сортировки образцов и 1 x 105 для отрицательного контроля, верапамил управления и одного окрашивание образцов.
      Примечание: Сердца, SP составляет около 0,5% - 2% (рис. 1 H) но может варьироваться между лабораториями и изоляты. Sca-1+/CD31 фракция составляет около 1% - 11% от всего сердца SP (Рисунок 1I), но может варьироваться между лабораториями и изоляты. SCA-1+/CD31SP-клик записываются как SP-клик для следующих частей протокола.

5. основной культуры изолированных SP-CPC

Примечание: Три различных видов средств массовой информации были использованы в настоящем Протоколе. Они называются средних 1 (согласно Нозеда и др.) 8, среднего 2 и 3 средних и являются описанные в Таблица материалов относительно их состава.

  1. Разогреть средний 1 до 37 ° C перед использованием и охладить вниз центрифуге до 4 ° C. Центрифуга для сортировки трубы при 4 ° C и 470 x g 6 мин и Ресуспензируйте клеток в 1 средний.
  2. Положите клетки на газопроницаемой P60 блюдо с 4 мл 1 среднего. Измените носитель каждые 3 d, до тех пор, пока клетки достигли слияния 70% - 80%.
    Примечание: Шаг 5.2 может занять около 2-3 недели.

6. расширение и дифференциация SP-CPC

  1. Культура клеток
    1. 3 x 105 SP-CPC в 8 мл 1 среднего в колбе T75 культуры.
    2. Инкубируйте SP-СКПК при 37 ° C с 5% CO2 до 70% - 80% слияния, изменив носитель каждые 2-3 d.
      Примечание: Номер ячейки должна быть изменена согласно типа CPC используется, удвоение время и размер ячейки.
  2. SP-КПК роста и жизнеспособности под различными в сыворотке
    1. Культура SP-цены за клик для 2-3 d в T75 колбы с 8 мл 1 среднего. Тщательно аспирационная среднего и осторожно промыть 5 мл теплой (37 ° C) HBSS.
    2. Лечить клетки с 5 мл за 5 мин в инкубаторе клетки трипсина-ЭДТА, добавить 5 мл 1 среднего остановить активности трипсина и передать 15 мл суспензии клеток.
    3. Центрифуга клетки на 470 x g 5 мин на RT.
    4. Ресуспензируйте клетки в средних 1 или 2 средних (линии индукции средний) и пластины 2,5 x 105 SP-клик на P60 блюда с 3 мл среды, содержащие различные в сыворотке.
    5. Соберите средства от блюдо шаг 6.2.4 для коллекции мертвых клеток в 15 мл трубку после 2 d культивирования в средних 1 или 2 средних.
    6. Trypsinize адэрентных клеток как шаг 6.2.2 и собирать суспензию клеток в 15 мл пробирку шаг 6.2.5. Центрифуга клетки на 840 x g 5 мин на RT.
    7. Аспирационная супернатант и добавьте 1 mL для клеток подсчета среднего 1 или 2 средних. Пятно SP-клик с Трипановый синий (0,4%) и количество Трипановый синий позитивные (мертвых) и Трипановый синий отрицательных (жизнеспособных) клеток.
      Примечание: Жизнеспособность клеток (шаг 6.2.7) дается как отрицательные клетки Трипановый синий номер по отношению числа общей ячейки.
  3. Индукция эндотелиальной дифференцировки
    1. Precoat (6-ну) культуры плита с 10 мкг/мл Ламинин (LN) или фибронектина (FN).
      1. Сделайте субстрат раствор, содержащий 10 мкг/мл LN или FN с F12 среднего (или PBS). Добавьте 2 мл раствора субстрата в каждой скважине. Поддерживать пластину для 30 минут при 37 ° C.
      2. Аспирационная решение от плиты и добавить 2 мл PBS в каждой скважине до его использования.
    2. Аспирационная среднего из клеток из шага 6.1.2, промойте их мягко с 5 мл теплой (37 ° C) HBSS, относиться к ним с 5 мл за 5 мин в инкубаторе клетки трипсина-ЭДТА, добавить 5 мл 1 среднего остановить активности трипсина и передать 15 мл суспензии клеток.
    3. Центрифуга клетки на 470 x g 5 мин на RT. аспирата супернатант и добавить 2 средних для подсчета клеток.
    4. Семян 8 х 104 клетки на хорошо на пластину с покрытием с 3 мл 2 средних и держать его при 37 ° C для 20-24 ч. изменения средних по 3 мл 3 средних.
      Примечание: Мы рекомендуем использовать средства, содержащие низкий сывороточной концентрации — и без добавки — для первых 20-24 ч. Мы рекомендовали использовать < слияния клеток 60% (т.е., мобильный номер шага 6.3.4 должен корректироваться в зависимости от клеток размер и темпы роста).
    5. Культура клетки для 21 d и изменить носитель каждые 3 d.
    6. Проверить эндотелиальной характер дифференцированных клеток путем пятнать их с маркера эндотелиальной например Виллебранда фактор (vWF) и исполняющая микроскопии флуоресцирования.
      1. Вымыть клетки с 1 мл раствора PBS и исправить ячейки 3,7% формальдегида на 2 мин на RT.
      2. Разрушения клеток с 0.1% тритон X ddH2O (или PBS) за 30 мин и блокировать его с 10% козьего сыворотки для 1 h на RT.
      3. Инкубировать клетки с анти фон Виллебранда фактор антитела (1: 100) в течение 48 часов при температуре 4 ° C
      4. Вымыть клетки 3 x с 1 мл PBS, 10 минут каждый раз. Инкубируйте их с Alexa Fluor 546 коза анти кролик вторичное антитело (1: 500) за 1 ч на RT в темноте.
      5. Вымойте снова 3 x, для 10 минут каждый, с 1 мл раствора PBS. За 5 минут на RT в темноте пятно клеточных ядер с 4'6-diamidino-2-phenylindole, дигидрохлорид (DAPI; 1: 500).
      6. Вымыть клетки 3 x, 5 минут каждый, с 1 мл раствора PBS. Смонтировать клетки и хранить их на 4 ° C
        Примечание: Культивирования условий (субстрат, средний, дополнительных реагентов и концентрации FBS) шагах 6.1 и 6.3 описаны в рисунке 3.
  4. Трубка формирования пробирного
    1. Подготовить матрицу базальной мембраны (например, Matrigel, отныне именуемой матрицей) плита.
      1. Оттепель в матрице при температуре 4 ° C на ночь.
      2. Герб 96-луночных плита с 100 мкл матрицы на льду.
        Примечание: Важно избежать любые пузыри в матрице. Плиты должны быть покрыты на льду, чтобы избежать гелеобразования матрицы.
      3. Поддерживать пластины при 37 ° C за 30 мин.
    2. Аспирационная среднего из клеток (после завершения шага 6.3.5), Осторожно промойте клетки с 5 мл теплой (37 ° C) HBSS и относиться к ним с трипсина-ЭДТА на 5 мин в инкубаторе ячейки. Добавьте 3 средних остановить активность трипсина и передать 15 мл суспензии клеток.
    3. Центрифуга клетки на 470 x g 5 мин на RT. аспирата супернатанта, осторожно добавьте 1 mL 3 средних и пипетки.
    4. Фильтр клетки с 35 мкм фильтр клеток, если клетки суммируются.
    5. Подсчитать количество ячеек и семян 2 x 103 -4 x 103 клеток в 100 мкл средний 3 в каждой матрицы покрытием хорошо. Держите пластины при 37 ° C в инкубаторе ячейки для 16 h.
    6. Сделайте снимок с микроскопом ярко поля при 2-кратном.
      Примечание: В случае неполной trypsinization, продлить время экспозиции для трипсина-ЭДТА максимум 7-8 мин.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мышь SP-КПК изоляции:

В этом исследовании мы использовали клик мыши изоляции согласно СП фенотип, тогда как результаты от крыс СКПК изменения и добавлены из предыдущего доклада с разрешения (рис. 8)33.

Пролиферации клеток высокой и низкой плотности и разных в сыворотке:

Наши предыдущие исследования показали, что выражение mRNA сердечной lineage маркеров изменилась в течение первых 24 ч культивирования шаг. Известно, что внеклеточного матрикса влияет на решения судьбы клеток, включая эндотелиальной дифференцировки35. Для изучения подходящих условий для облегчения эндотелиальной линии обязательства CPC, мы использовали FN и LN (оба 10 мкг/мл) на табличке, 6-а (область роста: 9,6 см2/а) в этом исследовании. Потому что клеточного цикла и ячейки решения судьбы тесно связаны, мы ищем состояния, показывающий степень распространения низкий клеток в отсутствие клеточной смерти, таким образом условие может отражать переход от пролиферации клеток к дифференциации. Мы, таким образом, применяются следующие условия и сравнить темпы распространения клеток: плотность клеток, confluency высокий (80% - 90%) и низкого (< 60%) confluency и для сывороточной концентрации, условий нормальной культуры (в этом исследовании 3,5% FBS) и низкой сыворотки условия (≤0.1% FBS). Во-первых мы проверили состояние плотности низкого клеток. Там было никаких существенных различий жизнеспособность клеток и распространения в плотность низкая клеток с 3,5% FBS между LN и FN, тогда как плотность низкая клеток с 0.1% FBS показал снижение пролиферации на LN, по сравнению с FN, но не увеличение гибели клеток ( Рисунок 4). Напротив плотность условиях высокой клеток, концентрации в сыворотке крови 3,5% и 0,1% показал никаких различий в клеточной пролиферации и в смерти клетки между двумя субстратов (рис. 5).

Эти результаты показывают, что плотность низкая клеток на LN с 0.1% сыворотки уменьшается распространения не затрагивая жизнеспособность КПК.

Изменения в форме ячеек в среде эндотелиальной дифференцировки:

Хотя требующие дальнейшего исследования, чтобы понять значение и основные механизмы, изменения в форме ячеек появляются быть показателем условий подходящих культуры как конкретные изменения могут наблюдаться на раннем этапе в культурах, в котором эндотелия дифференциация собирается быть успешным (рис. 6). Как показано в белой пунктирной кругах в Рисунок 6, в течение 7-14 d в среде эндотелиальной дифференцировки, успешно культур содержит клетки, которые были большие и разные в морфологии на другие ячейки. Интересно, что эти клетки исчезли в конце этапа дифференциации и также появилась в меньшее число и в позднее время моменты высокой плотности культур на LN и FN. в то время, как мы делали не далее характеризуют эти клетки, этот протокол предполагает Отслеживание форме ячеек каждые 2-3 d примерно до 14 день. Если ячейки не отображается, следует понизить количество клеток семенами.

Оценка эндотелиальной способности с Assay формирования трубки:

Assay формирования трубка является полезным методом для оценки эффективности эндотелиальной дифференцировки CPC путем измерения потенциала формирования трубки дифференцированных клеток. Мы, таким образом, выполнять трубки формирования assay клетки дифференцируются в зависимости от описанных условий. Интересно, что успешный трубку последовательно показали клетки покрытием при низкой плотности и дифференцированных по LN, трубку главным образом не в клетках покрытием на LN на высокой плотности (рис. 7A), в то время как. Аналогично, трубку в основном неудачным в клетках, культивируемых на FN независимо от того, плотность ячеек, хотя клетки дифференцированы на FN на низкой плотности иногда образуется элементарные трубы, в зависимости от состояния клеток (например, изолировать и/или проход номер, рис. 7B). Чтобы подтвердить характер эндотелиальных клеток, клеток, покрытие на coverslips были продифференцированы согласно описанной протокол и витражи для vWF. Опять же выражение vWF было более однородной и более выраженным в СКПК дифференцированно по LN, по сравнению с FN (рис. 7 cD). Рисунок 8 показывает, что результаты от формирования пробирного трубки в исполнении для предыдущих исследований с использованием крыса клик по одному протоколу как здесь описано33. Эти результаты показывают, что формирование трубка является более эффективным в клетках, дифференцированных по LN по сравнению с FN когда позолоченными условиях низкой сотовый плотности и низкой сывороткой (0,1% FBS) для 20-24 ч до дифференциации в среде эндотелиальной дифференцировки. Эти результаты показывают, что этот протокол может быть полезным для различных типов клеток и независимо от видов.

Figure 1
Рисунок 1: Иллюстрация конкретных изоляции шаги для получения клетки cardiomyocyte истощены подвеска от сердца изолированных мыши и представитель потока цитометрии отсчетов сердца SP. (A) Эта группа показывает выброса остаточных крови из полости сердца через повторил небольшое давление, применяется с использованием малых щипцами. (B) Эта группа показывает резки сердца на мелкие кусочки, используя маленькие ножницы. (C) Эта группа показывает, фарша части сердца с помощью лезвия бритвы. (D) Эта группа показывает инкубации фарш сердца с коллагеназы B в наклонных пластин при 37 ° C. (E) Эта группа показывает гомогенизации фарша сердца с помощью пипетки Пастера на этапе инкубации. (F) этой группы показывает, фильтрация переваривается ткани через 100 мкм фильтром (желтый) и 40 мкм фильтром (синий) для удаления остатков непереваренной ткани и кардиомиоцитов. (G) Эта группа показывает нежный разворота конические Тюбик 50 мл, содержащие клетки cardiomyocyte истощены подвеска и упаковка в жестяной фольги для легких защиты после добавления "Хёхст". (H) Эта группа показывает представитель поток цитометрии отсчетов Хехст окрашенных клеток в наличие и отсутствие верапамил ингибитор ABC транспортер для идентификации SP. (я) Эта группа показывает представитель точка участок SP клетки согласно CD31 и Sca-1 позитивность для идентификации Sca-1+/CD31 субфракции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Схематичный обзор пробоподготовки, ведущих к сердечной сортировки SP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: протокол эндотелиальной линии индукции и дифференциация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: распространение мыши SP-КПК при покрытием на плотность низкая клеток при различных сыворотке LN и FN. (A и B) Эти панели показывают число клеток в день 2. (C и D) Эти панели показывают жизнеспособность в день 2. Данные отображаются в виде среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM); N = 5; различные ходы; p < 0,05, студента t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: мышь SP-КПК распространения когда покрытием на плотность высокой клеток при различных сыворотке LN и FN. (A и B) Эти панели показывают число клеток в день 2. (C и D) эти панели показывают жизнеспособность в день 2. Данные отображаются в виде среднее ± SEM; N = 5; различные ходы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: морфология на 14 и 17 d во время процесса дифференцировки клеток. Эта цифра показывает ярко поле (BF) изображения мыши SP-СКПК посеян на LN-FN-покрытием или блюда с низким (Low) или плотность высокий (High) клеток и среднего 2 для 20 h, следуют 3 средних для 14 или 17 d. белой пунктирной Круги помечают районы, содержащие круглые клетки Вит h больший размер ячейки. Изображения была выполнена с ярко поле микроскопии. Увеличение = 2 X; шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: труба формирования и vWF пятная после эндотелиальной дифференцировки SP-клик на LN и FN. (A и B) Эти панели показывают формирования трубки. (C и D) Эти панели показывают vWF пятнать. Клетки были посеяны на 10 мкг/мл LN-FN-покрытием или блюд с низким или высоким клетки плотности и среднего 2 на 20 h, следуют 3 средних для 21 d и затем собирают с трипсина и посеян на матрице базальной мембраны. Все фотографии были приняты после 16 ч. Изображения была выполнена с ярко поле микроскопии и масштаб = 2 X для панелей A и B. Визуализация выполняется с флуоресцентной микроскопии и увеличение = 10 X для панелей C и D. Групп A и C Показать LN-покрытием блюда. Панели, B и D показывают FN-покрытием блюда. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: трубка формирования после эндотелиальной дифференцировки крыса СКПК. СКПК крысы были осеменены на плотности низкого клеток на 10 мкг/мл LN-FN-покрытием или блюд с 0.1% среднего FBS-содержащих F12 для 20 h, последовали еще 21 d 3 средних и затем собирают с трипсином. На матрице базальной мембраны на 96-луночных тарелку 4 x 104 клетки были посеяны в 100 мкл средний 3. Изображения была выполнена с ярко поле микроскопии. Увеличение = 2 X; в баре шкалы = 50 мкм. Этот показатель изменяется на основе предыдущего исследования33. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Виды Изоляция, обнаружение маркеров Ссылка
Человека, крыса, мышь c комплект+/Lin-, /CD45 c комплект+-, c комплект+/CD45 /CD31 Белтрами, ячейка 2003; Bolli, Lancet 2011; Эллисон, сотовый 2013; Смит, Nat Protoc 2014 г.; Vicinanza, смерть клетки отличаются 2017
Беспородных собак Линь-, плюс: c комплект+, MDR1+ или Sca-1+ Линке, PNAS 2005
Мышь SCA-1+ Ох PNAS 2003
Мышь Стороны населения, плюс: Abcg2+, Sca-1+/CD31-, /PDGFRa Sca-1++ Hierlihy, FEBS латыш 2002; Мартин, Dev биол 2004; Пфистер, Circ Res 2005; Нозеда, Nat ЖК 2015
Мышь Колонии формовочный блок фибробластов, плюс: CD45-, CD31-, Sca-1+, PDGFRa+ Pelekanos, стволовых клеток Res 2012
Мышь, крысы, человека ISL-1+ *, плюс: CD31-, c комплект-, Sca-1-, Gata4+, Nkx2.5+ Laugwitz, природа 2005; Бу, природа 2009
* Isl-1 находится в миокарде эмбриона или плода, не в сердце взрослого человека.

Таблица 1: Методы изоляции и маркеры сердечной прогениторных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Преимущества этого протокола:

Этот протокол обеспечивает метод эндотелиальной дифференцировки CPC. Мы обнаружили, что низкий сывороточной концентрации и плотность низкая клеток может повысить эффективность эндотелиальной дифференцировки, whereby LN, оказался более подходящий субстрат чем FN в этих условиях. Мы использовали два различных типа CPC: Крыса цены за клик, которые были использованы в ячейки строки как манере и мышь SP-клик, которые были изолированы и расширена. В частности, протокол был применимо к обоим типам ставок CPC. тока методы позволяют ученым изолировать и расширению основной СКПК от генетически модифицированных мышей, а также модели доклинической болезни и люди28,36. Используя этот протокол на изолированных цены за клик может быть полезным для расследования не только болезни механизмов, но и к исследованию новых терапевтических целей.

Цены за клик в настоящее время клинических испытаний для клетки терапии4,5, при котором клетки изолированы от больных и пересаженные обратно после усиления в пробирке . В этой связи протокол, представленные здесь могли бы помочь определить стратегии для повышения дифференциация потенциал таких ставок CPC до пересадки. Однако клеточной терапии все еще страдает от ограниченной эффективности из-за низкой удержания, выживания и приживления пересаженных клеток. Механистический в vitro исследования на основе этого протокола или их адаптации имеют потенциал, чтобы способствовать более глубокому пониманию молекулярных механизмов вождения процесс дифференциации в частности, механизмы, относящиеся к плотность ячеек , субстрат и факторы роста. В конечном итоге новые знания, полученные от таких исследований могут использоваться для перепрограммирования клетки и применяется непосредственно влиять резидентов СКПК дифференцировать после травмы.

Ограничения настоящего Протокола:

Изолированные первичных CPC являются разнородных популяций, которые показывают разные фенотипы размер ячейки и темпы роста клеток в зависимости от изоляции, даже при использовании же маркеры и метод изоляции идентичны. Таким образом, необходимо определить следующие три момента: (1) клетки посева номеров согласно размер ячейки, (2) идеальный сывороточной концентрации (< 0,5%) и (3 время инкубации для первого шага (индукция линии) с очень низким сывороточной концентрации. Здесь мы покажем различия в эффективности дифференциация в зависимости от плотности клеток. Однако хотя мы сравнивали низкие сыворотки (0,1% FBS) против культуры концентрации в сыворотке крови (3,5% FBS), мы не рассматривать другие концентрации в < 0,5% FBS диапазон. Кроме того в зависимости от используемых маркеров изоляции и видов, эффективности индукции происхождение обязательства могут отличаться. Таким образом протокол должен быть оптимизирован для каждого типа клеток.

Фармакологические и генетические ингибирование/индукции методы могут использоваться для изучения механизмов болезни с настоящим Протоколом, вместо генетически модифицированные или болезни животных моделей. В этом случае, протокол должен быть изменен: перед началом лечения с низким сыворотка содержащих среднего, клетки будут рассматриваться с конкретными реагентов или генетических инструменты. Как следствие клетки могут быть более уязвимы, чем nontreated клетки. Использование низкой сыворотки на первом шаге является ключевым моментом в этом протоколе. Таким образом тщательной проверки сыворотке концентрацию и инкубации время для первого шага для тормозит пролиферацию клеток при сохранении жизнеспособности в сыворотке лишение имеет решающее значение для ли этот протокол может быть успешным или нет.

Резюме:

В резюме изолированные СКПК от животных моделей обеспечивают ценный инструмент для сердечной болезни и регенерации исследований. После расширения человека цены за клик может также непосредственно использоваться для клеточной терапии. Мы, здесь, предоставляют протокол для эффективного эндотелиальной линии индукции и дифференциация ставок CPC на основе тщательной адаптации плотности и Сыворотка концентрации клеток. Преимуществом этого протокола является его применимость к различным типам ставок CPC и свой потенциал в плане основы для изучения и/или создания других инструментов Романа сердечной регенерации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы благодарят вера Лоренц за ее полезные поддержку во время экспериментов и сотрудников из объекта потока цитометрии от Департамента биомедицины (ДБМ), университета и Университетская больница в Базеле. Эта работа была поддержана пребывание на дорожке программы из Базельского университета (Michika Мотидзуки). Gabriela M. Кастер поддерживается грант от Швейцарский Национальный научный фонд (Грант номер 310030_156953).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Culture medium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) ThermoFisher #12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham Merck #D8437
Penicillin-Streptomycin (P/S) ThermoFisher #15140122
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071 3.5% (0.1% for lineage induction)
L-Glutamine  ThermoFisher #25030 Final concentration 2 mM
Glutathione Merck #G6013
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech #AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Peprotech #AF-100-18B
B27 Supplement ThermoFisher #17504044
Cardiotrophin 1  Peprotech #250-25
Thrombin Diagontech AG, Switzerland #100-125
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) ThermoFisher #14170
0.05 % Trypsin-EDTA ThermoFisher #25300
T75 Flask Sarstedt #83.3911
Endothelial differentiation  
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit Lonza #CC-3162
Ham's F-12K (Kaighn's) Medium ThermoFisher #21127
Laminin  Merck #L2020
Fibronectin  Merck #F4759 Dilute in ddH2O
6 Well Plate Falcon #353046
Formaldehyde Solution Merck #F1635 Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)
Triton X-100 Merck #93420 0.1% in ddH2O
Normal Goat Serum (10%) ThermoFisher #50062Z
Anti-von Willebrand Factor antibody Abcam #ab6994 1:100 in 10% goat serum
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 ThermoFisher #A11010 1:500 in 10% goat serum
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) ThermoFisher #62247 1:500 in ddH2O 
SlowFade Antifade Kit ThermoFisher #S2828
BX63 widefield microscope Olympus
Tube formation
96 Well Plate Falcon #353072
5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap Falcon #352235
Matrigel Growth Factor Reduced Corning #354230
IX50 widefield microscope Olympus
Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 
Reagents
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. in house hospital pharmacy #9077862 Working solution: 200 mg/kg
Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) ThermoFisher #20012
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) ThermoFisher #14175 Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS  for quenching Collagenase B activity 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate ThermoFisher #331885 Prepare DMEM + 10% FBS  + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining
Penicillin-Streptomycin  (P/S) ThermoFisher #15140122
HEPES 1 M ThermoFisher #15630080 Final concentration 25 mM
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071
RBC LysisBuffer (10X) BioLegend #420301/100mL Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter
Collagenase B Merck #11088807001 Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter
bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) Merck #B2261 Prepare 1 mg/mL in ddH2O
Verapamil-hydrochloride  Merck #V4629 Final concentration 83.3 µM 
APC Rat Anti-Mouse CD31 BD Biosciences #551262 0.25 µg/107cells
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) BD Biosciences #557405 0.6 µg/107cells
7-Aminoactinomycin D (7-ADD) ThermoFisher #A1310 0.15 µg/106cells
APC rat IgG2a k Isotype Control BD Biosciences #553932 0.25 µg/107cells
FITC Rat IgG2a k Isotype Control BD Biosciences #554688 0.6 µg/107cells
Material
Needles 27G Terumo #NN-2719R
Needles 18G Terumo #NN-1838S
Single Use Syringes 1 mL sterile CODAN #62.1640
Transferpipette 3.5 mL Sarstedt #86.1171.001
Cell Strainer 40 µm blue BD Biosciences  #352340
Cell Strainer 100 µm yellow BD Biosciences #352360
Lumox Dish 50 Sarstedt #94.6077.305
Culture Dishes P100 Corning #353003
Culture Dishes P60 Corning #353004
Mouse
Line Age Breeding
C57BL/6NRj / male 12 weeks in house
Product Name Company Catalogue No.
Reagents
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) ThermoFisher #12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham Merck #D8437
Penicillin-Streptomycin  (P/S) ThermoFisher #15140122
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071
L-Glutamine  ThermoFisher #25030
Glutathione Merck #G6013
B27 Supplement ThermoFisher #17504044
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech #AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Peprotech #AF-100-18B
Cardiotrophin 1  Peprotech #250-25
Thrombin Diagontech AG, Switzerland  #100-125
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit Lonza #CC-3162
Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. 
Product Name Medium 18 Medium 2 Medium 3
Reagents Culture Lineage induction Endothelial diff.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 35% 35%
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham 65% 65%
Penicillin-Streptomycin  (P/S) 1% 1%
Fetal Bovine Serum (FBS) 3.5% ≤0.1%
L-Glutamine  2 mM 2 mM
Glutathione 0.2 nM 0.2 nM
B27 Supplement 1.3%
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) 6.5 ng/mL
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) 13 ng/mL
Cardiotrophin 1  0.65 ng/mL
Thrombin 0.0005 U/mL All necessary components included in the kit
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit All necessary components included in the kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114, (6), 763-776 (2003).
  2. Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530, (1-3), 239-243 (2002).
  3. Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107, (2), 255 (2012).
  4. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, (9806), 1847-1857 (2011).
  5. Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379, (9819), 895-904 (2012).
  6. Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132, (4), 537-543 (2008).
  7. Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, (2), 232-243 (2009).
  8. Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930 (2015).
  9. Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102, (25), 8966-8971 (2005).
  10. El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98, (1), 125-135 (2013).
  11. Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154, (4), 827-842 (2013).
  12. Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100, (21), 12313-12318 (2003).
  13. Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265, (1), 262-275 (2004).
  14. Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97, (1), 52-61 (2005).
  15. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8, (1), 58-73 (2012).
  16. Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433, (7026), 647-653 (2005).
  17. Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460, (7251), 113-117 (2009).
  18. Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, (7), 1662-1681 (2014).
  19. Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279, (12), 11384-11391 (2004).
  20. Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138, (1), 40-49 (2010).
  21. Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24, (12), 2101-2116 (2017).
  22. Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142, (4), 965-974 (1993).
  23. Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90, (1), 148-155 (1997).
  24. Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174, (1), 63-71 (1991).
  25. Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33, (7), 836-843 (2005).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183, (4), 1797-1806 (1996).
  27. Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103, (8), 825-835 (2008).
  28. Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95, (9), 911-921 (2004).
  29. Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4, (9), e7195 (2009).
  30. Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study. PLoS One. 6, (10), e25669 (2011).
  31. Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13, (7), 864-872 (2011).
  32. Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3, (5), e001260 (2014).
  33. Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6, (10), (2017).
  34. Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
  35. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324, (5935), 1673-1677 (2009).
  36. Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1, (6), 472-493 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics