Met behulp van de FishSim animatie Toolchain te onderzoeken vis gedrag: een Case-studie over de keuze van de partner-kopiëren In Sailfin Mollies

Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Met behulp van de roman FishSim animatie Toolchain, presenteren we een protocol voor niet-invasieve visuele manipulatie van voorlichting van het publiek in het kader van het partner-keuze kopiëren in sailfin mollies. FishSim Animatie Toolchain biedt een easy-to-use-raamwerk voor het ontwerp, de animatie en de presentatie van computer-geanimeerde vis stimuli voor gedrags experimenten met live test vis.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gierszewski, S., Baker, D., Müller, K., Hütwohl, J. M., Kuhnert, K. D., Witte, K. Using the FishSim Animation Toolchain to Investigate Fish Behavior: A Case Study on Mate-Choice Copying In Sailfin Mollies. J. Vis. Exp. (141), e58435, doi:10.3791/58435 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In het laatste decennium, computer animaties voor dierlijk gedrag onderzoek in dienst gestegen vanwege haar vermogen om niet-gebeurt manipuleren het uiterlijk en gedrag van visuele stimuli, in vergelijking met het manipuleren van levende dieren. Hier presenteren we de FishSim animatie Toolchain, een software-kader ontwikkeld om onderzoekers te voorzien van een easy-to-use-methode voor de uitvoering van 3D computer animaties in behavioral experimenten met vis. De toolchain biedt sjablonen als u wilt maken virtuele 3D stimuli van vijf verschillende vissoorten. Prikkels zijn aanpasbaar in zowel de weergave en grootte, gebaseerd op foto's genomen van levende vis. Meerdere prikkels kunnen worden geanimeerd door opname zwemmen paden in een virtuele omgeving met behulp van een video game controller. Het vergroten van normalisatie van het gesimuleerde gedrag, kan het pad bespeelde zwemmen verschillende prikkels worden overgespeeld. Meerdere animaties kunnen later worden georganiseerd in afspeellijsten en gepresenteerd op monitoren tijdens experimenten met levende vis.

In een case-studie met sailfin mollies (Poecilia latipinna) geven we een protocol over hoe doe een stuurman-keuze kopiëren experiment met FishSim. Wij gebruikt deze methode om te maken en animeren van virtuele mannetjes en vrouwtjes van de Virtuele Maquette en vervolgens presenteerde deze focal vrouwtjes om in te wonen een binaire keuze-experiment. Onze resultaten tonen aan dat computeranimatie kan worden gebruikt om te simuleren van virtuele vis in een experiment stuurman-keuze kopiëren te onderzoeken van de rol van vrouwelijke gravid plekken als een indicatie van de kwaliteit voor een vrouwelijke model in de stuurman-keuze kopiëren.

Toepassing van deze methode is niet beperkt tot kopiëren stuurman-keuze-experimenten, maar kan worden gebruikt in de verschillende experimentele designs. Toch zijn bruikbaarheid is afhankelijk van de visuele mogelijkheden van de studie-soorten en eerst moet valideren. Globaal, computer animaties bieden een hoge mate van controle en standaardisatie in experimenten en dragen het potentieel om te 'verminderen' en 'Vervang' live stimulans dieren alsmede over 'verfijnen' experimentele procedures.

Introduction

Onlangs, met behulp van moderne technieken voor het creëren van kunstmatige stimuli, zoals computer animaties en virtual reality, oogstte populariteit in onderzoek1. Deze methoden bieden verschillende voordelen in vergelijking met klassieke experimentele benaderingen met live stimulans dieren1,2. Computeranimatie kan niet-invasieve manipulatie van de verschijning (grootte, kleur) en gedrag van virtuele stimulans proefdieren. Bijvoorbeeld, werd de chirurgische verwijdering van het zwaard in mannelijke groene swordtails (Xiphophorus helleri) partner voorkeuren in vrouwtjes3 testen teruggegeven geen onnodige met behulp van computeranimatie in een latere studie over deze soorten4. Bovendien kunnen computer animaties maken fenotypen die slechts zelden worden aangetroffen in natuur5 Morfologische kenmerken van virtuele dieren kunnen zelfs buiten het natuurlijke verspreidingsgebied van die soorten4worden gewijzigd. Met name, is de mogelijke systematische manipulatie van gedrag een groot voordeel van computeranimatie, want het is bijna onmogelijk met levende dieren6,7.

Verschillende technieken bestaan tot nu toe voor het maken van computer animaties. Eenvoudige tweedimensionale (2D) animaties meestal afkomstig zijn uit een afbeelding van een stimulus verplaatsen in slechts twee dimensies en met gemeenschappelijke software zoals MS PowerPoint8 of Adobe After Effects9kunnen worden gemaakt. Driedimensionale (3D) animaties, waarvoor meer geavanceerde 3D-graphics software modellering, kunnen de prikkel moet worden verplaatst in drie dimensies, toenemende mogelijkheden voor realistische en complexe fysieke beweging6,7 , 10 , 11 , 12. zelfs virtuele realiteit designs die simuleren van een 3D-omgeving waar levende dieren navigeren zijn gebruikte13,14. In een recente review Chouinard-Thuly et al. 2 deze technieken één voor één te bespreken en wijzen op voor- en nadelen over hun uitvoering in onderzoek, die met name afhankelijk van het bestek van de studie en de visuele capaciteiten van het proefdier (zie "Bespreking"). Bovendien, Powell en Rosenthal15 adviseren over passende proefopzet en welke vragen kan worden aangesproken door gebruik te maken van kunstmatige prikkels in dierlijk gedrag onderzoek.

Aangezien maken van computeranimatie kan moeilijk en tijdrovend, ontstond de behoefte aan software te vereenvoudigen en standaardiseren het proces van animatie ontwerp. In deze studie, introduceren we de gratis en open-source FishSim animatie Toolchain16 (korte: FishSim; https://bitbucket.org/EZLS/fish_animation_toolchain/), een multidisciplinaire aanpak voor het combineren van biologie en informatica om deze behoeften. Vergelijkbaar met de eerder gepubliceerde gereedschap anyFish17,18, de ontwikkeling van de toolchain gevolgd het doel om onderzoekers te voorzien van een easy-to-use-methode voor de uitvoering van geanimeerde 3D prikkels in experimenten met vis. Onze software bestaat uit een set van instrumenten die kunnen worden gebruikt om: (1) het maken van 3D virtuele vis (FishCreator), (2) animatie de zwemmen paden van de virtuele vissen met een video game controller (FishSteering), en (3) structureren en presenteren vooraf opgenomen animaties op monitoren te leven focal vis (FishPlayer). Onze toolchain biedt verschillende functies die zijn vooral handig voor het testen van in een binaire keuze situatie maar ook van toepassing op andere experimentele designs. Bovendien, de mogelijke animatie van twee of meer virtuele vis kunt de simulatie van scholende of verkering. Animaties zijn niet gebonden aan een specifieke stimulus maar met andere stimuli waardoor het kan veranderen het uiterlijk van een stimulans, maar haar gedrag constant kunnen worden overgespeeld. Het open-source karakter van de toolchain, evenals het feit dat het is gebaseerd op het besturingssysteem van de robot ROS (www.ros.org), hoge modulariteit van het systeem en bieden bijna eindeloze mogelijkheden om externe feedback apparaten (als de controller of een tracking systeem) en aan te passen de toolchain aan iemands eigen behoeften in onderzoek. Naast de sailfin molly, vier andere soorten worden momenteel bruikbaar: de Atlantische molly Poecilia mexicana, de guppy Poecilia reticulata, de Driedoornige stekelbaars Gasterosteus aculeatus en een cichlid Haplochromis spp. Nieuwe soorten kunnen worden gemaakt in een 3D grafische tool (b.v., Blender, www.blender.org) modellering. Te illustreren de werkstroom met FishSim en een protocol over hoe doe een experiment stuurman-keuze kopiëren met computeranimatie, we een casestudy met sailfin mollies uitgevoerd.

Keuze van de partner is een van de belangrijkste beslissingen die dieren in de geschiedenis van hun leven maken. Dieren geëvolueerd verschillende strategieën voor het vinden van de beste paring partners. Zij zich beroepen op persoonlijke informatie bij de beoordeling van potentieel paring partners zelfstandig, eventueel volgens vooraf bepaalde genetische voorkeuren voor een bepaalde fenotypische trait19,20. Ze kunnen echter ook observeren de keuze van de partner van soortgenoten en daarmee gebruik maken van overheidsinformatie21. Indien de waarnemer vervolgens besluit om te kiezen van de dezelfde mate (of het hetzelfde fenotype) als de waargenomen conspecific — het "model" — eerder gekozen, heet dit partner-keuze kopiëren (hierna afgekort als MCC)22,23. Stuurman-keuze kopiëren is een vorm van sociaal leren en, vandaar, een niet-zelfstandige stuurman-keuze strategie24, die is waargenomen in beide gewervelde dieren25,26,27,28, 29 en ongewervelden30,31,32. Tot nu toe MCC overwegend in vis werd bestudeerd en wordt gevonden onder laboratorium voorwaarden33,34,35,,36,,37,38 zowel in de Wild39,40,41,42. Stuurman-keuze kopiëren is vooral waardevol voor een individu als twee of meer potentiële paring partners zijn blijkbaar qua kwaliteit, en de keuze van een "goede" stuurman — in termen van het maximaliseren van fitness — is moeilijk te maken van43. De kwaliteit van een vrouwelijke model zelf kan beïnvloeden of focal vrouwtjes haar keuze of niet44,45,46,47kopiëren. Respectievelijk de vrouwelijke kwaliteit van "goed" of "slecht" model is toegeschreven aan haar min of meer verkeert in de stuurman keuze, bijvoorbeeld met betrekking tot de grootte en leeftijd44,45,46, of doordat haar een conspecific of een heterospecific-47. In sailfin mollies die de keuze van de partner van soortgenoten39,48,49,50,51 kopieert, bleek dat de focal vrouwtjes zelfs de afwijzing van een man52 kopiëren . Aangezien MCC wordt beschouwd als een belangrijke rol spelen in de evolutie van de fenotypische eigenschappen evenals speciatie en kruising21,23,53,,54, de gevolgen van het kopiëren van een " valse"keuze kan worden enorm bij het verminderen van de geschiktheid van de kopieermachine55. Als een persoon beslist te kopiëren van de keuze van een ander individu, dat het is belangrijk om te beoordelen of de waargenomen model een betrouwbare bron van informatie, dat wil zeggen is, dat het model zelf is het maken van een "goede" keuze als gevolg van hem of haar wordt goed ervaren in stuurman keuze. Hier rijst de vraag: welke visuele functies kunnen een betrouwbaar model kopiëren vanuit in sailfin molly vrouwtjes karakteriseren?

Een duidelijke visuele functie in vrouwelijke sailfin mollies en andere Poeciliids is de gravid plek (ook bekend als 'anale spot', 'brood patch' of 'zwangerschap ter plaatse'). Dit darkly gepigmenteerde gebied in hun anale regio is afgeleid van de melanization van het weefsel voering de ovariële OSS-56. De grootte en de aanwezigheid van de gravid ter plaatse zijn variabele over conspecific vrouwtjes en verdere individueel kunnen veranderen tijdens de progressie van ovariële cycli56,57. Gravid plekken kunnen dienen om de mannetjes aan te trekken en gonopodial richting voor interne inseminatie58 of als een middel van reclame vruchtbaarheid59,60te vergemakkelijken. Gezien de koppeling tussen de gravid plek en een vrouw reproductieve status, wij voorspeld dat de gravid vlek als een teken van model vrouwelijke kwaliteit fungeert door informatie te verstrekken over haar reproductieve stand te observeren focal vrouwtjes. We onderzochten twee alternatieve hypothesen. Ten eerste, als de gravid plek een algemene teken voor looptijd, zoals voorspeld door Farr en Travis59 is, duidt het een vermoedelijk betrouwbare en ervaren model ten opzichte van een onvolwassen model (zonder de plek). Hier, hebben focal vrouwtjes meer kans om te kopiëren van de keuze van een model met een plek, maar niet die van een model zonder een plek. Ten tweede, als de gravid plek markeert niet-ontvankelijkheid als gevolg van al broedsels, zoals voorspeld door Sumner et al. ontwikkelen 60, het model is vermoedelijk minder betrouwbaar omdat niet-ontvankelijke vrouwtjes zou worden beschouwd als minder kieskeurig. In dit geval zal focal vrouwtjes hun keuze maar van modellen zonder vlek niet kopiëren. Tot nu toe heeft de rol van de gravid plek voor MCC in sailfin molly vrouwtjes nooit zijn getest, noch experimenteel gemanipuleerd.

We FishSim gebruikt voor het uitvoeren van een experiment MCC door virtuele stimulans mannetjes en vrouwtjes van de Virtuele Maquette over computer-monitoren in plaats van met behulp van live stimulus en model vis zoals gebruikt in de klassieke experimentele procedure49,50 ,51,61. De algemene bruikbaarheid van onze software is eerder gevalideerd voor het testen van hypothesen over de keuze van de partner in sailfin mollies12. Hier, we hebben getest of de afwezigheid of de aanwezigheid van een gravid plek in Virtuele Maquette vrouwtjes is van invloed op de keuze van de partner van het observeren van levende focal vrouwtjes. Eerst laten we focal vrouwtjes acclimatiseren aan de test tank (Figuur 1.1) en laat ze kiezen tussen twee verschillende virtuele stimulans mannetjes in een eerste stuurman-multiple-choice test (Figuur 1.2). Daarna, tijdens de observatieperiode, de voorafgaande niet mijn voorkeur virtuele man werd gepresenteerd samen met de vrouw van een virtueel model (Figuur 1.3). In een latere tweede stuurman-keuze test koos focal vrouwtjes weer tussen de dezelfde mannetjes (Figuur 1.4). We geanalyseerd of focal vrouwtjes had gekopieerd en de keuze van de partner van de waargenomen model vrouw door haar partner-keuze besluit in de eerste en tweede stuurman-keuze test vergelijken. We twee verschillende experimentele behandelingen waarin we visueel gemanipuleerd de kwaliteit van de Virtuele Maquette vrouw uitgevoerd. Tijdens de observatieperiode presenteerde we ofwel het voorafgaande niet mijn voorkeur virtuele mannetje (1) samen met de vrouw van een virtueel model met een gravid plek ("spot" behandeling); of (2) samen met de vrouw van een virtueel model zonder een gravid vlek ("geen spot" behandeling). Bovendien, in een besturingselement zonder elk model vrouwelijk, of wij getest focal vrouwtjes koos consequent wanneer geen openbare informatie werd verstrekt.

Figure 1
Figuur 1. Algemeen overzicht van de belangrijkste experimentele stappen voor een experiment van de MCC met behulp van virtuele vis prikkels. (1) acclimatisatie periode. (2) eerste stuurman-multiple-choice test: live focal vrouwtje kiest tussen virtuele stimulans mannetjes. (3) observatieperiode: focal vrouw horloges de voorafgaande niet mijn voorkeur man samen met een Virtuele Maquette vrouw met gravid plek. (4) tweede stuurman-keuze test: het focal vrouwtje kiest weer tussen virtuele stimulans mannetjes. In dit voorbeeld kopieert ze de keuze van het model. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De uitgevoerde experimenten en de behandeling van de vissen werden in overeenstemming met de wetgeving van de German Animal Welfare (Deutsches Tierschutzgesetz), en goedgekeurd door de interne dierenwelzijn officer Dr. Urs Gießelmann, Universiteit van Siegen en de regionale autoriteiten ( Kreisveterinäramt Siegen-Wittgenstein; Nummer vergunning: 53,6 55-05).

1. virtuele vis Design

Opmerking: Een lijst van de vereiste hardware en software in de lijst van aanvullende materialen vinden. Een gedetailleerde beschrijving van de algemene functionaliteit van FishSim en extra tips en trucs kan worden gevonden in de User Manual (https://bitbucket.org/EZLS/fish_animation_toolchain/).

  1. Voorbereiding van vrouwelijk lichaam texturen met en zonder gravid plek
    1. Start GIMP en Klik op Bestand >> Open te openen van het vrouwelijk lichaam textuur beeld "PLF_body_6. PNG"van de modellen van de map in de map"fishsim_animation_toolchain". Gebruik deze foto als een referentie voor alle nieuw gemaakte vrouwelijk lichaam structuren met gravid plek. Selecteer de donkere gravid spot gebied in de afbeelding van de referentie met het gratis selectiegereedschap en snijd het (Klik op Bewerken >> gesneden).
      Opmerking: GIMP (verkrijgbaar bij www.gimp.org) is een gratis foto bewerkgereedschap, vergelijkbaar met Adobe Photoshop, die kan worden gebruikt voor het bewerken van digitale foto's en afbeeldingen.
    2. Een tweede vrouwelijk lichaam textuur bestand openen in GIMP (bijvoorbeeld "PLF_body_7.png") en de plek gebied naar de tweede lichaam structuur overdragen invoegen (Bewerken >> plakken in) voorafgaande snijden ter plaatse gebied als een nieuwe drijvende laag. Pas de positie van de gravid plek in de tweede foto en samenvoegen lagen door te klikken op Laag >> laag anker.
      Opmerking: Zorgen dat het gebied van de gravid ter plaatse dezelfde grootte en dezelfde positie op elke vrouw virtueel model (Figuur 2 heeft)!
    3. Exporteren (Bewerken >> exporteren als) de nieuwe "spot" structuur onder een nieuwe naam (bijvoorbeeld PLF_body_7_S. png) in de map van de modellen . Sluit geopende alle vensters van de afbeelding in GIMP.
      Opmerking: Breng andere wijzigingen (bijvoorbeeld schalen) niet aan de textuur bestanden sinds ze specifiek worden bewerkt om later op de 3D vis toegewezen.
    4. Maak een tweede lichaam textuur zonder een gravid plek, met behulp van de dezelfde oorspronkelijke vrouwelijk lichaam structuurbestand een tweede keer (bijvoorbeeld "PLF_body_7.png"). Nu, betrekking hebben op reeds bestaande gravid vlekken in het oorspronkelijke bestand met behulp van GIMP.
    5. Open de textuur van het vrouwelijk lichaam in GIMP en selecteer het gereedschap Kloonstempel. Selecteer het patroon van de omliggende buikstreek (zonder donkere pigmentatie) door op Ctrl + Klik met de linkermuisknop te drukken en gebruik deze selectie ter dekking van bestaande donkere pigmentatie door schilderij overheen met het kloon-gereedschap (afbeelding 2).
    6. Exporteren van de nieuw opgerichte "geen spot" textuur onder een nieuwe naam (bijvoorbeeld PLF_body_7_NS.png) in de map van de modellen . Sluit GIMP.

Figure 2
Figuur 2: Exemplar afbeeldingen van vrouwelijk lichaam texturen vóór (origineel) en na het manipuleren voor de "spot" en "geen spot" behandeling met behulp van de beeldbewerking gereedschap GIMP. De gestippelde cirkel markeert het gebied dat werd gemanipuleerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Het gezichtspunt aanpassen en het instellen van de "scene" voor animatie
    1. FishSim beginnen met het selecteren van het FishSim pictogram in de launcher op de linkerkant van het bureaublad. Configureer de resolutie voor het monitoren van de presentatie en klik op starten.
      Opmerking: Het is aanbevolen om de volgende aanpassingen (stappen 1.2.2\u20121.2.4) op het scherm van een van de presentatie monitoren (als monitor afmetingen en resoluties afwijken).
    2. Druk op F1 op het toetsenbord om van weergavemodus te bewerkingsmodus (schakelen tussen het weergeven en bewerken van modus door herhaaldelijk op F1te drukken).
      Opmerking: Overschakelen naar de bewerkingsmodus kunt de werkbalk voor bewerken boven aan het venster. De scène zoals gezien in de weergavemodus toont wat zal worden gepresenteerd op het scherm tijdens de experimenten.
    3. Aanpassen van het gezichtspunt zodat deze overeenkomen met de afmetingen van de beeldschermen presentatie door de camerahoek aan te passen. Draaien van de camera door de linkermuisknop ingedrukt te houden en de cursor. De camera van de pan door de rechter muisknop en verplaatsen van de cursor. In-en uitzoomen door de muis in het midden (of beide muisknoppen) en verplaatsen van de cursor.
    4. Camera-instellingen in de werkbalk voor bewerken (camerapictogram van de) en klik op kopiëren naar statische cam om in te stellen van het gezichtspunt. Klik op bestand >> opslaan van scène opslaan van de aangepaste scène als de nieuwe standaard-scène. Voor deze, overschrijft het bestand "default_scene.scene" in de scènes -map van de map FishSim .
      Opmerking: De standaard-scène wordt weergegeven bij elke start van FishSim en als de eerste scène in FishPlayer. In FishPlayer fungeert de scène van de standaard ook als een pauze tijdens experimenten (figuur 3A). De scène aan te passen moet worden gedaan slechts eenmaal.

Figure 3
Figuur 3: Screenshots van een scène in FishSim. (A) de standaardwaarde lege scène zonder een vis, (B) een scène toont een man alleen, (C) een scène tonen dat dezelfde man samen met een vrouwelijk model met een plek, en (D) een scène toont de identieke mannelijke en de vrouwelijke identiek model zonder een plek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Ontwerp van een virtuele mannelijke stimuli voor de presentatie tijdens de keuze van de partner-tests
    Opmerking: Virtuele mannelijke stimuli die later zullen worden geanimeerd en gepresenteerd om te leven van focal vrouwtjes tijdens stuurman-keuze tests voor te bereiden.
    1. Zoniet al open, beginnen FishSim. Druk op F1 om de bewerkingsmodus te activeren.
    2. Klik op bestand >> lading vis model uit het drop-downmenu and load de standaard mannelijke sailfin molly sjabloon "default_PLM.x" door deze te selecteren uit de map modellen.
    3. Links Dubbelklik op de geladen vis om deze te selecteren. Het zal worden gemarkeerd in een mesh. Klik op het pictogram van de versnelling op de werkbalk te openen van de vis-toolset. Een doos zal omhoog knallen met de bewerkingsopties gebruikt voor het aanpassen van de virtuele man. Untick Toon gaas voor een beter overzicht van de vis.
    4. Wijzig de naam mannelijke.
      Opmerking: De naam van het mannetje is belangrijk en de "rol" het zal later tijdens de animatie vertegenwoordigt. Deze naam mag niet identiek zijn voor elk gemaakte virtuele mannetje dat later tijdens de experimenten zal worden gebruikt.
    5. Veranderen van de schaal (afmetingen) van de man door het veranderen van de waarden voor x, y, en z, indien nodig en klikt u op toepassen.
    6. Het mannetje de textuur bewerken door te klikken op texturen in de Toolbox bewerken. Klik op een eigenschap van de vis (lichaam, dorsal, caudal) om het te veranderen.
      Opmerking: Het vak Kies een textuur voor zal opduiken met alle .png-bestanden die kunnen worden gebruikt als structuren. Texturen worden weergegeven met namen zoals vermeld in de map van de modellen .
    7. Klik op een textuur weergegeven in de lijst (rechts), en het zal rechtstreeks worden weergegeven en vervangen door de voorafgaande textuur op de vis.
    8. Wanneer het gewenste mannetje wordt gemaakt, klikt u op toepassen onder Config in de Toolbox bewerken, en klik op opslaan van vis naar schijf. Sla het nieuwe mannetje als "Male_A.fish" in de map van de modellen .
    9. Bovendien, het opslaan van de hele scène (bestand >> opslaan scène) met inbegrip van dat een man in de map van de scènes . Hier, het is aanbevolen om gebruik van de naam "Male_A_alone.scene" (figuur 3B).
    10. Klik op bestand >> Load scène laden de standaardwaarde lege scène en herhaal stappen 1.3.2 te 1.3.9 tot zoveel verschillende virtuele mannetjes desgewenst Maakuweigen training elk opgerichte mannelijke onder een unieke naam in de map van de modellen en als een nieuw .scene-bestand in de map van de scène .
  2. Ontwerp virtueel model vrouwelijke vissen presentatie tijdens de observatieperiode
    1. Klik op bestand >> Load scène voor het laden van de standaard-scène. Volg stap 1.3.1 en klik op bestand >> lading vis model voor het laden van de vrouwelijke standaardsjabloon "default_PLF.x" uit de map modellen .
    2. Links Dubbelklik op het geladen vrouwtje te selecteren en openen van de vis-toolset. Wijzig de naam "vrouwelijk". De schaal van het vrouwtje indien nodig zoals beschreven in stap 1.3.5.
      Opmerking: Naam en schalen moet voor de doeleinden van dit experiment identiek voor alle vrouwen.
    3. Vervang de standaard vrouwelijk lichaam textuur met de eerder gemaakte "spot"-body textuur (vermeld in het vak aan de rechterkant) zoals beschreven in stappen 1.3.6 aan 1.3.7.
    4. Klik op toepassen onder Config in de Toolbox bewerkenen vervolgens wilt opslaan vissen om te schijf door te klikken op Opslaan en maak een bestand "Female_1S.fish" (S = plek).
    5. Klik op bestand >> Load scène voor het laden van de standaard-scène. Herhaal stap 1.4.1 tot en met 1.4.4 maken ten minste één (of zoveel als nodig) identiek model vrouwelijke maar zonder de gravid ter plaatse en noem deze "Female_1NS.fish" (NS = geen plek). Elke vis opslaan in de map van de modellen .
      Opmerking: De observatieperiode van het MCC-experiment moeten scènes met inbegrip van één man en één vrouw worden gemaakt en opgeslagen.
    6. Klik op bestand >> Load scène om te laden de standaardwaarde lege scène. Klik op bestand >> lading vis model aan een virtuele mannelijke "Male_A.fish" uit de modellen map invoegen. Klik op bestand >> lading vis model weer toe te voegen de virtuele model vrouwelijke "Female_1S.fish" naar de scène. De positie van elke vis wijzigen door een wijziging van hun x-, y- en z-coördinaten zodat hun lichamen elkaar niet overlappen.
      Opmerking: Een vis uit de scène verwijderen door op het tweemaal te klikken en op Delete te drukken op het toetsenbord.
    7. Sla de scene met inbegrip van mannelijke en vrouwelijke model door te klikken op bestand >> opslaan scène als "Male_A_with_Female_1S.scene" (Figuur 3 c).
    8. Herhaal stap 1.4.6 aan 1.4.7 maken drie extra scènes voor: (1) Male_A met Female_1NS (Zie afbeelding 3D), (2) Male_B met Female_1S en (3) Male_B met Female_1NS.

2. animatie van virtuele vis Stimuli

Opmerking: Elke soort animatie die nodig zijn voor het experiment moet worden voorbereid slechts eenmaal met een voorbeeldige mannelijke scène en een voorbeeldige Opmerking scène (mannelijke en vrouwelijke vormen). Tijdens het animeren, een zwemmen pad voor elke vis wordt gemaakt die later kan worden overgespeeld door geen vis, zolang de naam identiek is (zie stap 1.3.4).

  1. Virtuele mannelijke animaties voor presentatie tijdens de keuze van de partner-tests
    Opmerking: Bereiden van twee animaties van een virtuele man: (1) een pad zwemmen met een duur van 7,5 min, en (2) een pad zwemmen met een duur van 5 min.
    1. Sluit de gaming controller (bijvoorbeeld Sony Play Station 3) op de USB-poort van de operationele computer.
    2. Open FishSim en klik op bestand >> Load scène voor het laden van de scène van een man uit de map scènes, bijvoorbeeld "Male_A_alone.scene". Start FishSteering door te klikken op het pictogram van de FishSteering .
    3. De controller-instellingen configureren in een afzonderlijk venster.
      Opmerking: FishSim en FishSteering gelijktijdig worden uitgevoerd en vis kan worden gestuurd in de weergavemodus, zoals tijdens experimenten, of in de bewerkingsmodus door op F1te drukken.
    4. Animatie van de (mannelijke) vis, selecteren uit het drop-down menu van het deelvenster voor Besturing . Model namen hier komen overeen met de naam gegeven in de Toolbox bewerken (zie stap 1.3.4).
    5. Klik op beginnen met het plaatsen en gebruik van de controller om de vis op een startpositie in de virtuele tank. Klik op Stop plaatsen.
    6. Start de opname van de vissen zwemmen pad door te klikken op opnemen. Met de controller kunt u de vissen rond de scène.
      Opmerking: De duur van de opname wordt gegeven in de lagere juiste hoek van de stuurinrichting paneel.
    7. Klik op opname stoppen. Klik op Opslaan om het zwemmen pad opslaan als een .bag-bestand (een "record") op het station (bijvoorbeeld op het bureaublad). Kies de naam van het bestand om de duur van de record, bijvoorbeeld "7_30_min_male_alone.bag" te geven.
      Opmerking: Nadat de opname is gestopt, is het niet mogelijk de totale duur weer bewerken.
    8. Bewerken van de opname toe te voegen van de beweging van de rugvin van het mannetje naar mannelijke verkering-gedrag wordt nagebootst tijdens stuurman-keuze proeven. Selecteer de rugvin in het drop-down menu in de Edit -functie (slechts één functie kan tegelijk worden bewerkt).
    9. Selecteer Start bewerken en het volledige zwemmen pad zal worden overgespeeld. Druk op de L1-knop op de controller aan de orde stellen van de rugvin op specifieke punten in de tijd. Klik op Opslaan om de bewerkte versie van het zwemmen pad opslaan als een nieuwe . tas-bestand.
    10. Herhaal stap 2.1.8 en 2.1.9 maar selecteer het gonopodium toe te voegen van de beweging. De definitieve versie voor later gebruik opslaan in FishPlayer. Nauwe FishSteering.
      Opmerking: Het is aanbevolen tas-bestanden voor elke bewerking onder een unieke naam op te slaan. Door dit is het altijd mogelijk om terug te komen naar een eerdere versie van de animatie als er iets in het bewerkingsproces misgaat.
  2. Virtuele mannelijke en model vrouwelijke animatie voor de presentatie tijdens de observatieperiode
    Opmerking: Een animatie met een virtuele mannetje en het vrouwtje van de Virtuele Maquette in verkering, dus seksueel interactie met elkaar, met een totale duur van 10 minuten voor te bereiden.
    1. Open FishSim. Druk op F1 voor Voer de bewerkingsmodus geactiveerd en klik op bestand >> Load scène om te laden van een scène met mannelijke en vrouwelijke, bijvoorbeeld "Male_A_with_Female_1S.scene". Start FishSteering.
    2. Selecteer mannelijke en vrouwelijke afwisselend in te plaatsen (door te klikken op Start/Stop plaatsen) de feitelijke tank.
    3. Voor de opname, de vrouwelijke vissen eerst selecteren uit het drop-down menu van het deelvenster voor Besturing en een pad zwemmen met een duur van 10 min volgt 2.1.5 tot en met 2.1.6 maken.
      Opmerking: Het pad van het zwemmen van slechts één vis tegelijk kan worden opgenomen. Na de eerste vis animeren, kan het zwemmen-pad van de tweede vis worden opgenomen met behulp van de functie bewerken terwijl de eerder gestuurde vis zal worden overgespeeld naast voor de gehele duur van de animatie.
    4. Klik op opname stoppen en Opslaan het pad zwemmen op het station, bijvoorbeeld als "10_00_min_male_with_female.bag". Vervolgens bewerken achtereenvolgens van het mannetje zwemmen pad, beweging van de rugvin en gonopodium beweging zoals beschreven in stappen 2.1.8 aan 2.1.10. Sla de definitieve versie voor later gebruik in FishPlayer.

3. voorbereiding van de animatie afspeellijsten voor de MCC-Experiment

Opmerking: Gebruik FishPlayer om animaties over twee monitoren om te leven van focal vrouwtjes. Schik de afspeellijst voor elk beeldscherm afzonderlijk te simuleren van de procedure van het MCC experiment (Figuur 1). Het instrument bestaat uit een hoofdvenster toont de record afspeellijst voor elke monitor (Figuur 4) en een aparte animatie venster voor elke presentatie monitor.

  1. Algemene functionaliteit en rangschikking van scènes en records
    1. Sluit alle vensters en open FishPlayer door te klikken op het bijbehorende pictogram. Configureren van de instellingen voor het gebruik met twee monitoren voor presentatie (links en rechts) en klik op starten.
      Opmerking: De scène van de standaard gemaakt in stap 1.2.4 (opgeslagen in scenes/default_scene.scene) wordt altijd geladen en weergegeven op beide monitoren als de startende scène en tijdens een pauze commando.
    2. Vermeldingen toevoegen aan de afspeellijst voor elk beeldscherm afzonderlijk. Klik toevoegen belasting scène om toe te voegen van de scène van bijvoorbeeld mannelijke A, van de scènes in de FishSim map. Klik op Add spelen record om een record toevoegen vanuit het station, bijvoorbeeld de 7,5 min-record voor een man alleen.
      Opmerking: De scène en het volgende verslag zal vervolgens worden gekoppeld door de software en de virtuele man afgebeeld in de scène wordt geanimeerd als omschreven in de desbetreffende record.
    3. Klik op Add pauze als de opdracht van een pauze voor een bepaalde duur (minuten/seconden) toont de standaard scène zonder vis als een doorbraak voor de vis verwerken tussen records wilt toevoegen.
      Opmerking: Pauze duur moet in het algemeen afhankelijk van de tijd die nodig is voor de vis verwerken. Klik op een item en sleep om de volgorde in de lijst te wijzigen. Geselecteerde posten zijn gemarkeerd in het rood. Een vermelding uit de afspeellijst verwijderen door het item te selecteren en te klikken op selectie verwijderen.
    4. Klik op Play/Stop om te starten en stoppen van een presentatie. Stop eindigen altijd de volledige playlist, bijvoorbeeld er is geen manier om te pauzeren in het midden van een afspeellijst die voorheen uitgevoerd.
      Opmerking: Afspeellijsten zal altijd start van het eerste item en uitvoeren van boven naar beneden. Daarom is de juiste volgorde van alle inzendingen moet worden ingesteld voordat het experiment en daarna zonder te stoppen de presentatie kan niet worden gewijzigd. Een timer aan de onderkant van het venster toont de duur en de werkelijke tijd van de huidige afspeellijst.
  2. Afspeellijst arrangement voor de twee behandelingen en de controle van de MCC-experiment
    Opmerking: In termen van de post-regeling, het MCC-experiment is gesplitst in twee delen: (1) de eerste stuurman-multiple-choice test, en (2) de observatieperiode gevolgd door de tweede stuurman-keuze test. Daarom moeten afspeellijsten voor elke behandeling en de controle moeten worden gerangschikt in twee verschillende orders.
    1. Wanneer u het experiment uitvoert, moet u eerst, een afspeellijst voorbereiden voor de keuze van de eerste stuurman-test.
    2. Ten tweede, in het proces van het lopende experiment, door de rangschikking van de afspeellijst voor de latere waarnemingsperioden en de tweede stuurman-keuze test volgens welke virtuele man werd verkozen door het focal vrouwtje in de keuze van de eerste stuurman-test te wijzigen.
  3. Specifieke afspeellijst regeling voor de "spot" behandeling
    1. Voor de eerste stuurman-keuze test in behandeling 1, bestel de afspeellijst precies zoals afgebeeld in figuur
    2. Na de eerste stuurman-keuze test, pauze voor de berekening van die virtuele reu werd aangewezen (zie stap 5,9 hieronder). Herschikken dan de playlists voor de observatieperiode, waarin openbare informatie wordt verstrekt aan de focal wijfje door aan te tonen van het voorafgaande niet mijn voorkeur mannetje samen met het vrouwtje model.
    3. De afspeellijst voor observatie en de volgende tweede stuurman-keuze test volgens Figuur 5regelen.
    4. Voor de observatieperiode, door de 10-min record (mannelijke en model vrouw samen) te koppelen met een scène die de voorafgaande voorkeur alleen mannelijke tonen.
      Opmerking: In dit geval alleen het zwemmen pad van de man wordt weergegeven en, omdat het ontbreekt in de scène, de Virtuele Maquette vrouwelijke afwezig zal zijn.
    5. Voor de afspeellijst met het mannetje niet mijn voorkeur, door de 10-min-record te koppelen aan de scène met inbegrip van het voorafgaande niet mijn voorkeur mannetje samen met het vrouwtje model. Kies de scènes met inbegrip van een vrouwelijk model met een gravid plek (S) voor deze behandeling.
      Opmerking: In tegenstelling tot 3.3.2, hier de identieke record zal worden overgespeeld maar nu het model vrouwtje is zichtbaar.

Figure 4
Figuur 4: Screenshot toont de afspeellijsten die FishPlayer voor de linker- en monitoren in het eerste deel (d. w. z., de eerste stuurman-keuze test) van het experiment van MCC. Afspeellijst posten worden gerangschikt als nodig is voor de test van de eerste stuurman-keuze in 1 behandeling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Screenshot toont de afspeellijsten die FishPlayer voor de linker- en monitoren in het tweede deel (observatieperiode en tweede stuurman-keuze test) van het experiment van MCC. Afspeellijst posten worden gerangschikt als nodig is voor de observatieperiode en de tweede stuurman-keuze test in 1 behandeling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Specifieke afspeellijst regeling voor de behandeling van "geen plek"
    1. Voor behandeling 2, bestel de afspeellijsten zoals beschreven voor behandeling 1 (figuren 4 en 5), maar in plaats daarvan gebruiken de scène met inbegrip van het vrouwtje van de Virtuele Maquette zonder een gravid vlek (NS) tijdens de observatie.
  2. Specifieke afspeellijst regeling voor de controle op consistentie van de keuze
    Opmerking: In het besturingselement voor keuze consistentie zijn afspeellijst posten voor de keuze van de partner-test identiek aan behandelingen 1 en 2 (Figuur 4). Tijdens de observatieperiode, echter geen openbare informatie wordt verstrekt aan focal wijfjes en, vandaar, geen vrouwelijke model is zichtbaar.
    1. Volgorde van de afspeellijsten, zoals afgebeeld in Figuur 5 , maar de scènes voor elke man alleen samen met de 10-min-record combineren.
      Opmerking: In dit geval alleen het pad naar het zwembad van de mannelijke vis getoond, en omdat het ontbreekt in de scène, de vrouwelijke model afwezig zal zijn aan beide zijden.

4. experimentele opstelling

  1. Plaats twee computer schermen elk op tegenovergestelde uiteinden van de tank van een test. Aanpassen van de schermen om de meeste van de glazen wanden van de tank van de test en 1,5 cm ruimte tussen de schermen en de wanden van de tank. Zorgen voor verlichting naar de tank vloeit van bovenaf.
  2. Bedek de bodem van de tank met een dun laagje grind en vullen met water geschikt is voor levende vis op de hoogte van de schermen. Markeer een keuze zone met een verticale lijn op 20 cm diepte van elk uiteinde aan de buitenkant van de tank. Een acryl glazen cilinder en twee stopwatches bij de hand hebt.
  3. De monitoren aansluiten op de stroomvoorziening en de operationele computer, geplaatst ten minste 1 m afstand van de test-tank, bijvoorbeeld op een tafeltje (Figuur 6).

Figure 6
Figuur 6: experimentele opstelling voor de MCC-experiment met computeranimatie. De operationele computer verbindt met twee presentatie monitors (Monitor 1 en 2) die replay animaties focal vrouwtjes leven in de tank van de test. Ter illustratie, zijn beide LCD-monitoren schuin om aan te tonen van een geanimeerde scène. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

5. het uitvoeren van de MCC-Experiment

Opmerking: Volg de onderstaande uit te voeren van een proces van behandeling 1, 2, behandeling of het besturingselement MCC experiment met behulp van een levende focal danseres experimentele procedure (Zie Figuur 1).

  1. Open FishPlayer op de operationele computer en regelen van de afspeellijsten die voor de eerste stuurman-multiple-choice test als bijvoorbeeld beschreven voor behandeling 1 (Figuur 4). Check die de monitoren voor presentatie worden uitgevoerd en dat zij de standaardwaarde lege scène tonen.
  2. Plaats een levende focal vrouwtje in de tank van de test. Laat haar vrij zwemmen en acclimatiseren aan de tank en de presentatie van de lege tanks op beide monitoren voor een periode van 20 min.
  3. Na acclimatisatie, plaats het focal vrouwtje in een heldere acryl cilinder in het midden van de tank van de test de afspeellijsten op beide monitoren tegelijk uitvoeren door te klikken op spelen, te beginnen met de eerste stuurman-keuze te waarborgen van een gelijke afstand tot beide monitoren test.
    Opmerking: Het focal vrouwtje is toegestaan om zowel virtuele stimulans mannen uit in de cilinder voor ongeveer 2,5 min te kijken.
  4. Voordat de teller op 02:30 min, langzaam gaan aan de experimentele tank en laat de focal vrouwelijk uit de cilinder door het opheffen van het voorzichtig recht uit het water, bijvoorbeeld om 02:15 min.
    Opmerking: Hier, de exacte timing is afhankelijk van de afstand van de operationele computer tot de test-tank en moet worden bepaald tijdens voorafgaande test loopt. Het is essentieel om te handelen langzaam en voorzichtig om te voorkomen dat het benadrukken van de vis. Aangezien vis zeer snel handelen kan, wordt aangeraden al een stopwatch bij de hand tijdens het loslaten van het vrouwtje om direct start tijdmeting van de vereniging (zie stap 6.1).
  5. Terug naar de operationele computer. Observeren van de focale vrouwelijke en hebben twee stopwatches dichtbije maatregel vereniging tijd elke virtuele stimulans mannetje (zie stap 6.1).
    Opmerking: Het focal vrouwtje mag vrij zwemmen en kiezen tussen beide mannen gedurende 5 minuten.
  6. Stoppen met het meten van vereniging tijd wanneer de teller op 07:30 min. De vermelding van de pauze zal dan lopen voor 1,5 min. Gebruik de pauze zoals verwerkingstijd, weer, plaats het focal vrouwtje in de cilinder en noteer de tijd voor elke virtuele man op een gegevensblad.
    Opmerking: Na de pauze, de tweede 07:30 minuten vermelding zal beginnen en de focal vrouw kunt kijken zowel mannetjes 02:30 minuten. Mannelijke positie is nu overgeschakeld tussen links en rechts te controleren voor een mogelijke kant bias in focal vrouwtjes (zie stap 6.3).
  7. Voordat de teller op 11:30 min, vrij van de focale vrouwelijk uit de cilinder. Maatregel vereniging tijd voor de volgende 5 min.
  8. Stoppen met het meten van vereniging tijd wanneer de teller op 16:30 min. De pauze-post een looptijd van 1 min. Gebruik deze verwerkingstijd te plaatsen het focal vrouwtje in de cilinder.
  9. Noteer vereniging tijden voor de tweede meting. Voor elke man, houdt (voor en na de mannen waren overgestapt) vereniging tijden van beide helften van de eerste stuurman-keuze test samenvatten. Bereken of het brandpunt vrouwtje had een vooroordeel kant en die man was verkozen door het focal vrouwtje (Zie stappen 6.1 tot 6.3).
    Opmerking: Het is geen probleem als het pauze is voltooid voordat de berekening wordt gedaan, omdat wij overgaan tot de volgende stap de afspeellijst moet te bereiken van het einde en stoppen.
  10. Herschikken van de afspeellijsten (doen niet sluiten FishPlayer!) zoals afgebeeld in Figuur 5 (afhankelijk van de huidige behandeling), zodat de voorafgaande voorkeur man zal alleen worden geanimeerd tijdens de observatieperiode en het voorafgaande niet mijn voorkeur mannetje samen met de Virtuele Maquette vrouwelijke geanimeerd.
    Opmerking: Wijzigingen in de afspeellijsten zijn niet zichtbaar voor het focal vrouwtje.
  11. Klik op Play om door te gaan met dat het tweede deel van het experiment en de vermeldingen van boven naar beneden te beginnen met de 10-min observatieperiodezal worden overgespeeld.
    Opmerking: Tijdens de observatieperiode, de focal vrouw blijft in de cilinder maar is kundig voor Wake beide presentaties.
  12. Na de observatieperiode, een pauze van 0,5 min begint. Voordat de teller op 10:30 min, laat de focal vrouwelijk uit de cilinder en beginnen met de tweede stuurman-keuze test met de 5-min-record voor elke man. Maatregel vereniging tijden voor de volgende 5 min.
  13. Stoppen met het meten van vereniging tijd wanneer de teller op 15:30 min. De vermelding van de pauze zal vervolgens uitgevoerd voor 1,5 min. plaats het focal vrouwtje in de cilinder en noteer de gemeten tijd voor elke virtuele man.
    Opmerking: Na de pauze, de volgende 7:30 min vermelding zal beginnen en de focal vrouw kunnen kijken naar beide mannen (waarvan de positie is weer overgeschakeld tussen links en rechts) voor 2,5 min.
  14. Voordat de teller op 19:30 min, de focal vrouwelijk uit de cilinder release en meten van de tijd van de vereniging voor de laatste 5 min.
  15. Stoppen met het meten van vereniging tijd wanneer de teller op 24:30 min en beëindigen van het experiment. Noteer vereniging tijden voor beide virtuele mannetjes en ga verder met de analyse.

6. gegevens meting

  1. Vereniging tijd meten tijdens het eerste en het tweede deel (voor en na de prikkels zijn overgestapt) van elke partner-keuze test, als het focal vrouwtje is toegestaan om te kiezen tussen de twee mannetjes.
    Opmerking: Beginnen met meten wanneer het vrouwtje kruist de lijn de keuze zone met haar hoofd en operculum te beperken. Stoppen met meten wanneer haar hoofd en operculum buiten de zone van de keuze zijn.
  2. Samenvatten van vereniging tijd gemeten voor elke man in de eerste en tweede deel van een stuurman-keuze testen en stel vast welke reu werd aangewezen.
    Opmerking: De voorkeur man wordt bepaald als de één dat het focal vrouwtje bezig geweest met meer dan 50% van de totale tijd ze in beide keuze zones binnen een stuurman-multiple-choice test bracht. P.a., vereniging tijd is vaak omgezet in voorkeur scores (relatieve stuurman-keuzewaarde), die is gedefinieerd als de tijd van een focale vrouw met een man die gedeeld door de tijd dat ze met beide mannen in de keuze van de partner-zones doorgebracht.
  3. Bereken of focal vrouwtjes kant overhellen Toon tijdens de eerste stuurman-keuze test en vooringenomen vrouwtjes uitsluiten in de uiteindelijke analyse.
    Opmerking: Focal vrouwtjes worden beschouwd als kant-bevooroordeeld als ze bezig geweest met meer dan 90% van de totale tijd (beide helften van de keuze van de eerste stuurman-test) in dezelfde keuze zone, zelfs nadat de mannelijke positie was overgeschakeld. Haar keuze voor een man wordt dan beschouwd als kant bevooroordeeld en het proces wordt beëindigd.
  4. Elk focal vrouw standaard lengte (SL) worden gemeten.
    Opmerking: Om te verhinderen dat vis tijdens experimenten wordt benadrukt, zijn altijd gemeten na de beëindiging van een experimentele proces.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Naar aanleiding van het protocol, hebben we gebruikt FishSim om computer animaties van virtuele sailfin molly mannetjes en vrouwtjes te maken. We verder de toolchain gebruikt om animaties te focal vrouwtjes leven in een binaire keuze situatie voor het uitvoeren van een experiment van de MCC volgens de experimentele procedure die is beschreven in Figuur 1 en stap 5 van het protocol.

Om te bepalen of focal vrouwtjes gekopieerd de keuze van de Virtuele Maquette vrouw, tijdsopname we een focale vrouw vereniging voor elke man binnen de eerste en tweede stuurman-keuze test tijdens de experimenten. Verschillende parameters zijn doorgaans geanalyseerd met behulp van vereniging tijd verkregen in de eerste en de tweede stuurman-keuze test voor elke behandeling en het besturingselement voor de consistentie van de keuze. Hoe de gegevens worden geanalyseerd is niet gebonden aan een specifieke statistische toets maar kan gebeuren op verschillende manieren (bijvoorbeeld parametrische/non-parametrische tests, herhaalde maatregelen ANOVA, statistische modellen) en kunnen afhankelijk van de structuur van de definitieve gegevens. We hebben voor onze data-analyse, R 3.2.2 gebruikt62. We geüpload de ruwe gegevens die we gekregen in ons experiment evenals de R-code die we voor onze analyse te Figshare gebruikt (doi: 10.6084/m9.figshare.6792347).

In de huidige studie we 15 verschillende Virtuele Maquette vrouwtjes met een gravid plek voor behandeling 1 en identieke 15 model vrouwen zonder een plek voor behandeling 2. Alle model vrouwtjes had een virtuele standaard lengte (SL) van 50 mm. De relatieve gravid plek oppervlakte bedroeg 4,7% van de totale lichaamsoppervlakte (met uitzondering van vinnen; zoals gemeten met ImageJ v1.51j8) voor alle vrouwen in 1 behandeling. Verder maakten we 30 verschillende virtuele stimulans mannetjes gepresenteerd tijdens stuurman-keuze tests, zodat voor 15 unieke mannelijke stimuli paringen. Stimulans mannen hadden een virtuele SL tussen 41-45 mm. We 15 proeven uitgevoerd voor elke behandeling en het besturingselement voor de consistentie van de keuze. We testten een aantal 55 live focal vrouwtjes afstammeling van wild sailfin mollies gevangen op Mustang eiland in de buurt van Corpus Christi, TX, Verenigde Staten in 2014. Alle focal wijfjes waren volwassen volwassenen en slechts eenmaal werden getest. Twee vrouwen moesten worden uitgesloten als gevolg van technische problemen tijdens de test. Een vrouw werd uitgesloten moeten benadrukken aangezien zij niet aan de testsituatie acclimatiseren en was te bang om te voeren ofwel keuze zone. Het besturingselement voor de vooringenomenheid van de kant tijdens focal vis (protocol stap 6.3) vereist dat wij verder zeven vrouwen van de definitieve analyse als gevolg van hun kant bias in de keuze van de eerste stuurman-test uitsluiten. Over het geheel genomen we geanalyseerd totaal n = 15 focal vrouwtjes voor elke behandeling en de controle. Focal vrouwen hadden een gemiddelde SL van 32 ± 5 mm in behandeling 1, 33 ± 5 mm in behandeling 2 en 33 ± 3 mm in het besturingselement voor de consistentie van de keuze. Wij ten opzichte van de standaard lengte (SL) van focal vrouwtjes over behandelingen en de controle met behulp van een Kruskal Wallis rangschikking som test voor het openbaren van onafhankelijke gegevens die SL niet tussen behandelingen en het besturingselement verschillen (Kruskal Wallis rangschikking som test: n = 45, df = 2, χ2 = 0.329, p = 0.848).

De belangrijkste parameter gemeten in een experiment van de MCC is de focal vrouw vereniging tijd voor elke man (protocol stap 6.1). Vereniging tijd is een indirecte maat van vrouwelijke metgezel voorkeur in vis63,64,,65,66 en een gevestigde maatregel te bepalen mate keuze in sailfin mollies wanneer geen direct contact is voorzien van12,48,61,67,68. Voor elke behandeling en de controle, wij voor het eerst gebruikt vereniging tijd om te analyseren of de kiezen motivatie tussen stuurman-keuze proeven verschilden. Het kiezen van motivatie wordt gedefinieerd als de totale tijd een focale vrouw in beide keuze zones binnen een stuurman-multiple-choice test doorgebracht. Echter is een verandering in het kiezen van de motivatie niet noodzakelijkerwijs een verandering in de voorkeur voor een man. Als motivatie te kiezen aanzienlijk tussen de twee proeven van de stuurman-keuze verschilt is het gebruik van voorkeur scores in plaats van absolute vereniging tijd, voor verdere analyse om vergelijkbaarheid binnen en tussen behandelingen (zie protocol stap 6.2 verplicht ). In onze studie, motivatie van focal vrouwtjes vóór en na observatie van een virtueel model vrouw seksueel interactie met een mannetje kiezen niet van elkaar verschillen in behandeling 1 (Wilcoxon ondertekend rangschikking test: n = 15, V = 44, p = 0.379) en in het besturingselement voor keuze consistentie ( Wilcoxon ondertekend rangschikking test: n = 15, V = 42, p = 0,33). Kiezen van motivatie was echter aanzienlijk hoger na observatie van een virtueel model vrouw zonder gravid vlek seksueel interactie met een man in behandeling 2 (Wilcoxon ondertekend rangschikking test: n = 15, V = 22, p = 0,03).

De belangrijkste determinant van of MCC opgetreden is een aanzienlijke toename van de tijd besteed/voorkeur scores voor het voorafgaande niet mijn voorkeur mannetje van de eerste naar de tweede stuurman-keuze test22. Overgedragen aan een natuurlijke situatie, verhoogt een toename van de tijd doorgebracht met het voorafgaande niet mijn voorkeur mannetje, dus de kans dat een vrouw zal paren met die man. Dus, de belangrijkste analyse ten opzichte van de absolute tijden of de scores van de voorkeur voor het voorafgaande niet mijn voorkeur mannetje tussen de twee proeven van de stuurman-keuze. Deze analyse moet voor elke behandeling en het besturingselement afzonderlijk worden gedaan. Omdat in onze studie, kiezen motivatie in behandeling 2 verschilden, wij voorkeur scores voor de aanvankelijk niet mijn voorkeur stimulans man, in plaats van absolute vereniging tijd, gebruikt om te bepalen of deze scores gewijzigd tussen de eerste en tweede stuurman-keuze testen wanneer openbare informatie werd verstrekt, in vergelijking met de behandeling van de controle in die voorlichting van het publiek afwezig was.

Hiervoor passen we een lineaire gemengd effect (LME) model met de lme-functie van de 'nlme' pakket69 met voorkeur score voor het voorafgaande niet mijn voorkeur mannetje (pref_NP) als de afhankelijke variabele. Wij opgenomen stuurman-multiple-choice test (Mtest: M1, M2) en behandeling (behandeling: ter plaatse, geen plek, controle) als vaste factoren evenals focal vrouw standaard lengte (SL) als een covariate. Verantwoordelijk voor het ontwerp van de herhaalde maatregelen, werd focal vrouwelijke identiteit (ID) opgenomen als een willekeurigheidsfactor. We waren vooral geïnteresseerd in of het effect van stuurman-multiple-choice test onder behandelingen verschilde; daarom dat we een interactie tussen de keuze van de partner-test en de behandeling opgenomen in ons model. Wij twee orthogonale vergelijkingen voor "behandeling" met behulp van de functie contrasten70uitgevoerd. Wij stellen de contrasten van het model (1) te vergelijken het besturingselement tegen het gemiddelde van alle behandelingen in welk een virtueel model vrouw werd gepresenteerd tijdens de observatie [control >> (spot, geen plek)], en (2) voor een vergelijking van de behandeling een virtueel model vrouwelijke met tonen plek tegen dat zonder een plek (plek >> geen plek). Een plot van de gestandaardiseerde storingswaarden van een factor tegen de ingerichte waarden bleek heteroscedasticity van de resterende afwijkingen voor "Mtest". Dus, we ook een functie van de gewichten met behulp van de klasse van de varIdent van de lme-functie te voorzien in afwijkingen van de verschillende voor elk niveau van "Mtest"71,72. We gebruikten de R pakket 'phia'73 voor een post hoc analyse met Holm-Bonferroni correctie van belangrijke interactie termen. We geïnspecteerd model veronderstellingen (Q/Q-Staanplaatsen, storingswaarden, storingswaarden tegen ingerichte waarden) voor alle modellen visueel74. Verder vergeleken we de verdeling van de storingswaarden tegen een normale verdeling met behulp van Shapiro-Wilk normaliteit proeven. De gegeven p-waarden werden beschouwd als belangrijke als p ≤ 0,05.

De resultaten van deze analyse worden gegeven in figuur 7A en tabellen 1 en 2. We vonden een belangrijke interactie tussen M2 en het contrast "[control >> (spot, geen plek)]" voor voorkeur scores van het voorafgaande niet mijn voorkeur mannetje (LME: df = 42, t =-2.74, p = 0.009). Voorkeur scores waren echter niet beïnvloed door focal vrouwelijke SL. Verder post-hoc analyse van de term interactie bleek een significant verschil van de scores van de voorkeur van het voorafgaande niet mijn voorkeur mannetje in M2 in behandeling 1 (plek: df = 1, χ2 = 30.986, p < 0.001) en behandeling 2 (geen plek: df = 1, χ2 = 19.957, p < 0.001) maar niet voor het besturingselement (χ2-test: df = 1, χ2 = 2.747, p = 0.097). Hier, onze resultaten tonen aan dat, zoals voorspeld voor MCC, voorkeur scores voor het voorafgaande niet mijn voorkeur virtuele mannetje aanzienlijk verhoogd van M1 naar M2 nadat focal vrouwtjes had ingediend met de keuze van de gesimuleerde partner van de vrouw van een Virtuele Maquette. We vonden dit effect in beide behandelingen maar niet in het besturingselement voor de consistentie van de keuze. In plaats daarvan in het besturingselement waar geen vrouwelijke model aanwezig tijdens de observatieperiode was, waren focal vrouwtjes consistent in hun keuze van de partner voor een man.

Factoren Lagere Schatting Bovenste SE DF t-waarde p-waarde
(Snijpunt) 0.046 0.339 0.632 0.145 42 2,336 0.024
M2 0.207 0.296 0.384 0.044 42 6.750 < 0,001
Controle → (spot, geen plek) -0.041 -0.012 0,017 0.014 41 -0.852 0.4
Ter plaatse → geen plek -0.093 -0.043 0,008 0,025 41 -1,715 0.094
SL -0.012 -0.003 0.006 0.004 41 -0.747 0.459
M2 x [controle → (spot, geen plek)] -0.148 -0.085 -0.023 0.031 42 -2,743 0.009
M2 x (spot → geen plek) -0.067 0.042 0,15 0.054 42 0.777 0.441

Tabel 1. LME schat voor effecten op de scores van de voorkeur voor het voorafgaande niet mijn voorkeur virtuele mannetje. Voorkeur score voor de voorafgaande niet mijn voorkeur virtuele mannelijke stimulus was de afhankelijke variabele in. Gezien zijn schattingen ± standaardafwijking en lower/upper betrouwbaarheidsintervallen, vrijheidsgraden, t- en p-waarden voor elke vaste factor. Snijpunt schattingen vertegenwoordigen de grote gemiddelde van alle behandelingen. Orthogonale vergelijkingen van behandelingen krijgen. Als behandelingen worden gecombineerd haakjes, worden gemiddelde waarden van deze behandelingen gebruikt in de vergelijkingen. Het snijpunt verwijzingscategorie voor factor "M2" is "M1". Significant p-waarden (p < 0,05) zijn in vet gedrukt. M1 = eerste stuurman-keuze test, M2 = tweede stuurman-keuze test, SL = standaard lengte van focal vrouwtjes. 90 waarnemingen met n = 15 focal vrouwtjes per behandeling.

Willekeurigheidsfactor Variantie SD
ID ((snijpunt)) 1.464x10-10 1.21x10-5
Residuele 1.859x10-2 0.1364

Tabel 2. LME variantie onderdelen voor focal vrouwelijke-ID. Variantie en standaarddeviatie voor de willekeurige effect "focal vrouwelijke ID" en de verschillen worden gegeven.

Figure 7
Figuur 7 : resultaten van de virtuele MCC experimenteren manipuleren model vrouwelijke kwaliteit door de visuele afwezigheid of de aanwezigheid van een gravid plek. (A) voorkeur scoort voor de man van de (voorafgaande) niet mijn voorkeur virtuele stimulans in M1 en M2 voor zowel het besturingselement als behandelingen. (B) verandering van de voorkeur van M1 tot M2 (het kopiëren van score) voor het voorafgaande niet mijn voorkeur virtuele mannetje in de behandelingen en de controle. De stippellijn ziet u geen verandering in de voorkeur, positieve waarden tonen een toename in voorkeur en negatieve waarden geven een afname van de voorkeur. Grey dots in A en B verbeelden onbewerkte gegevens van elk focal vrouw. (C) het aantal stuurman-keuze omkeringen in M2 voor elke behandeling en de controle. M1 = eerste stuurman-keuze test, M2 = tweede stuurman-keuze test, ns = niet significant, * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. N = 15 voor zowel het besturingselement als behandelingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Voor het verkrijgen van aanvullende informatie over of een kopiëren effect zou kunnen meer of minder sterk afhankelijk van de respectievelijke behandeling zijn, was een vergelijking tussen het kopiëren van partituren en het aantal terugboekingen van de stuurman-keuze tussen de verschillende behandelingen en de controle uitgevoerd. Dus we verder geanalyseerd of kopiëren scores voor het voorafgaande niet mijn voorkeur mannetje over behandelingen verschilden. De kopiëren score voor een mannelijke beschrijft de verandering in de vrouwelijke voorkeur voor een mannetje van de eerste naar de tweede stuurman-keuze test. De kopiëren score wordt bepaald door de score van de voorkeur van een man in de tweede stuurman-keuze test minus de score van dat dezelfde man in de keuze van de eerste stuurman-test. Kopiëren scores variëren tussen -1 en + 1 en kunnen fungeren als positieve of negatieve waarden waarin negatieve waarden een afname van de voorkeur en positieve waarden een toename van de voorkeur voor die man beschrijven. Hier, we passen een LME met kopiëren (copy_NP) als de afhankelijke variabele, behandeling als een vaste factor, focal vrouwelijke SL als een covariate en focale vrouw ter plaatse gebied als een willekeurigheidsfactor score. Hier, we uitgevoerd de dezelfde twee orthogonale vergelijkingen voor "behandeling" zoals hierboven beschreven.

Zoals we laten zien in figuur 7B en tabellen 3 en 4, vonden we een aanzienlijk hogere score voor het voorafgaande niet mijn voorkeur mannetje kopiëren in behandelingen met een vrouwtje van de Virtuele Maquette in vergelijking met het besturingselement (LME: df = 20, t =-2.833, p = 0,01), maar geen significante verschil tussen behandelingen (LME: df = 20, t = 0.618, p = 0.544). Kopiëren scores waren niet beïnvloed door focal vrouwelijke SL.

Vaste factoren Lagere Schatting Bovenste SE DF t-waarde p-waarde
(Snijpunt) -0.889 -0.081 0.727 0.389 21 -0.208 0.837
Controle → (spot, geen plek) -0.153 -0.088 -0.023 0.031 20 -2.833 0,01
Ter plaatse → geen plek -0.079 0.033 0.146 0.054 20 0.618 0.544
SL -0.013 0.011 0,035 0.011 20 0.991 0.333

Tabel 3. LME schat voor effecten over het kopiëren van de scores voor het voorafgaande niet mijn voorkeur virtuele mannetje. Kopiëren score voor de voorafgaande niet mijn voorkeur virtuele mannelijke stimulus was de afhankelijke variabele in. Gezien zijn schattingen ± standaardafwijking en lower/upper betrouwbaarheidsintervallen, vrijheidsgraden, t- en p-waarden voor elke vaste factor. Snijpunt schattingen vertegenwoordigen de grote gemiddelde van alle behandelingen. Orthogonale vergelijkingen van behandelingen krijgen. Als behandelingen worden gecombineerd haakjes, worden gemiddelde waarden van deze behandelingen gebruikt in de vergelijkingen. Significant p-waarden (p ≤ 0,05) zijn in vet gedrukt. SL = standaard lengte van focal vrouwtjes. 45 waarnemingen met n = 15 focal vrouwtjes per behandeling.

Willekeurigheidsfactor Variantie SD
spot_area ((snijpunt)) 0.028 0.166
Residuele 0,075 0.275

Tabel 4. LME variantie componenten voor vrouwelijke plek focusgebied. Variantie en standaarddeviatie voor de willekeurige effect "spot_area" en de verschillen worden gegeven.

Bovendien, we getest of het aantal focal vrouwen die hun eerste stuurman voorkeur in M2 omgekeerd over behandelingen verschilden. Stuurman-keuze omkering is gedefinieerd als of er is een verandering in de voorkeur voor een mannetje (van minder dan 50% tot meer dan 50% van de tijd in beide zones keuze) van de eerste naar de tweede stuurman-keuze test. Stuurman-keuze omkering wordt geteld als een "ja" (voorkeur voor een man is veranderd) of een "nee" (voorkeur voor een man niet hebt gewijzigd). Hier, wij uitgevoerd een post hoc paarsgewijs G-test met de R pakket 'RVAideMemoire'75 met correctie voor meerdere testen. Als we laten in Figuur 7 c zien, focal vrouwtjes van elf van de 15 omgekeerd de keuze van hun partner in behandeling 1 en tien vrouwtjes omgekeerd de keuze van hun partner in behandeling 2. Aan de andere kant, werden slechts twee terugboekingen waargenomen in het besturingselement. Daarmee was het aantal focal vrouwen die hun eerste stuurman keuze ten gunste van het voorafgaande niet mijn voorkeur mannetje in M2 omgekeerd aanzienlijk groter in beide behandelingen ten opzichte van het besturingselement (post hoc paarsgewijze G-test: Spot vs. control, p = 0.002; geen plek vs. control, p = 0.003) maar niet significant verschillend tussen behandelingen 1 en 2 (Post-hoc paarsgewijze G-test: ter plaatse vs. geen plek, p = 0,69).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De gravid plek in sailfin molly vrouwtjes werd eerder beschreven om te dienen als een middel van vruchtbaarheid advertentie naar conspecific mannen59,60. Of een gravid plek kan ook informeren conspecific vrouwtjes in het kader van partner keuze had niet getest tot nu toe. In de huidige case study onderzochten we de mogelijke rol van een gravid plek als een bron van overheidsinformatie voor de observatie van conspecific vrouwtjes in het kader van MCC. Onze studie toont aan dat de gravid plek niet een teken van de vrouwelijke kwaliteit model voor live focal vrouwen lijkt bij de beslissing om het kopiëren van de keuze van de partner van de vrouw van een virtueel model voor een virtuele man. Focal vrouwtjes gekopieerd de keuze van een vrouwtje van de Virtuele Maquette voor een voorafgaande niet mijn voorkeur virtuele man ongeacht of het model vrouwtje had een gravid plek of niet. We vonden geen verschil in scores noch het nummer van de stuurman-keuze terugboekingen tussen de twee behandelingen, die aangeeft dat het kopiëren effect ook even sterke of het model vrouwtje had een gravid plek was of niet kopiëren. Wanneer geen openbare informatie werd verstrekt in het besturingselement (geen model vrouwelijke aanwezig), waren focal vrouwen consistent zijn in de keuze van hun partner. Dit ondersteunt dat de waargenomen wijziging van voorkeur binnen behandelingen kan worden verklaard door de aanwezigheid van de Virtuele Maquette vrouw alleen, voldoende openbare voorlichting voor het kopiëren van de keuze van de partner van anderen.

Hoewel de algemene aanwezigheid en de omvang van de gravid ter plaatse worden geacht moet worden gekoppeld aan de vrouwelijke reproductieve cyclus, met de plek wordt grootste voorafgaand aan de bevalling en kleinste of afwezig na bevalling60, systematische visuele waarnemingen van de ontwikkeling van gravid vlekken in individuele vrouwtjes ontbreken nog steeds. Variatie in gravid plek grootte kunnen bovendien hoge tussen individuele vrouwtjes met vlekken ook wordt volledig afwezig in volwassen, gravid vrouwtjes60. Hoewel sailfin molly vrouwtjes meest ontvankelijk kort na bevalling59,76 zijn, zij in staat om op te slaan van sperma voor verscheidene maanden57zijn. Daarom, wijfjes moeten altijd voor de beste kwaliteit stuurman kieskeurig. Met betrekking tot onze case study over MCC en de geteste hypothesen concluderen we dat een gravid plek kan niet een geldige indicator van de vrouwelijke kwaliteit model te observeren conspecific vrouwtjes. Informatie over de reproductieve toestand van de vrouw van een model dat een observerende vrouwtje kan eventueel krijgen lijkt niet belangrijk bij de keuze voor het kopiëren van haar keuze of niet, ten minste onder sailfin mollies.

Met name toont onze studie een zeer gestandaardiseerde procedure voor visuele manipulatie van openbare inlichtingen in MCC experimenten met behulp van computer geanimeerde vis. In tegenstelling tot een eerdere studie door Benson77, die levende vis geïnjecteerd met tattoo inkt te manipuleren gravid vlekken, biedt onze methode een volledig niet-invasieve alternatief voor visuele manipulatie. We beschreven in detail de procedure over hoe te maken en animeren van virtuele sailfin mollies in FishSim. Verder toonden we hoe computeranimatie kan worden gebruikt voor het aannemen van de experimentele procedure van een klassieker MCC experimenteren met virtuele vis voor de presentatie naar live test vis in een binaire keuze situatie.

Naar aanleiding van het protocol identificeren we verschillende kritische stappen moeten specifieke aandacht om de juiste behandeling van onze toolchain en het succes van het experiment. Aangezien computer animaties zijn gemaakt en gepresenteerd met behulp van computers en apparaten zoals computerschermen, de technische apparatuur altijd moet goed genoeg zijn om ervoor te zorgen een soepele verwerking van de algemene workflow en, het belangrijkst, het afspelen van de animatie (stap 2, 3 en 5). Wanneer u twee of meer beeldschermen voor presentatie van stimuli, is hun technische specificaties moet identiek zijn. Bij het gebruik van onze software, de monitorresolutie instellen moet altijd die van de presentatie monitoren (zie stap 1.2.1.). Instellen van de scène (stap 1.2.), alsmede het ontwerp (stappen 1.3. en 1.4.) en animatie (stap 2) van virtuele stimuli moet altijd gebeuren op een monitor die later gebruikt voor stimulans presentatie tijdens experimenten om de juiste afmetingen.

In dit protocol, dat we ons concentreren op de noodzakelijke stappen voor het maken van één set van vis stimuli (stappen 1.3. en 1.4.) voor het gebruik in een proces van een behandeling (stap 5). Hier, zou wij willen wijzen erop dat het is belangrijk om meerdere verschillende vis prikkels en/of animaties om rekening voor pseudoreplication15,78,79 die invloed op de mogelijke interpretatie van de gegevens te verkregen tijdens experimenten. Met onze toolchain is het gemakkelijk om te maken van verschillende vis stimuli aanbieden van mogelijkheden tot gebruik van een unieke set van stimuli voor elk experimenteel onderzoek. Het totale aantal stimuli nodig is over het algemeen afhankelijk van de beoogde steekproefgrootte voor elke behandeling (zie "Representatieve resultaten" sectie voor informatie over onze casestudy).

Met onze toolchain wilden wij bieden een snel en gemakkelijk-aan-maak animatieproces met behulp van een video game controller (stap 2). Daarmee wordt het algemene zwemmen gedrag van de virtuele vissen automatisch gegenereerd, op basis van video's van live sailfin mollies80zwemmen. Zwemmen gedrag (met inbegrip van verkeer van vinnen en gonopodium) is, daarom, afgestemd op het gebruik met virtuele stimuli van sailfin mollies in bepaalde en live-peiling vis in het algemeen. Naast live-bevattende vis biedt een extra sjabloon voor een Driedoornige stekelbaars extra functies voor soortspecifieke verkeer, zoals de verhoging/verlaging van de dorsale en ventrale stekels.

Animatie functies die op dit moment onze toolchain mogelijk niet voldoende voor elke gedragspatroon en de vissoorten. Dit, echter, is aan de gebruiker en hangt af van de geteste onderzoeksvraag. Verder moet de animatie met FishSteering (stap 2) een beetje praktijk vooraf om te wennen aan de functies van de gaming-controller. Daarom is de animatieproces is waarschijnlijk de meest tijdrovende stap van het protocol. Een domeincontroller van een ander merk kan hier worden gebruikt maar de functionaliteit misschien niet zo glad en de functies van de knoppen (zoals vermeld in de gebruikershandleiding) kunnen afwijken of geheel afwezig. Tijdens de animatieproces, kan slechts één functie van een virtuele prikkel (bijvoorbeeld positie, vinnen, gonopodium) tegelijk worden geanimeerd. Eerst kunnen zwemmen verplaatsing (positie) en daarna extra functies (bijvoorbeeld vinnen) worden toegevoegd onafhankelijk. Het is raadzaam om elke stap afzonderlijk opslaan. Dit biedt het voordeel dat de gebruiker de mogelijkheid om terug te komen naar een eerdere versie van de animatie wilt wijzigen van een specifieke functie, heeft bijvoorbeeld het zwemmen pad constant te houden, maar de beweging van de rugvin ten opzichte van een eerdere versie wijzigen. Vooral wanneer het animeren van meer dan één vis (stap 2.2.), de volgorde in welke vis prikkels zijn geanimeerd is zeer belangrijk en moet vooraf worden bepaald. Hier, is het wellicht nuttig om te verwijzen naar de biologie van de geteste soort. In onze casestudy gesimuleerd we het gedrag van de verkering van sailfin mollies waarin een man in het algemeen een vrouwelijke81 volgt. Vandaar, wij eerst het zwemmen pad van de virtuele vrouw gemaakt en toegevoegd van het pad naar de virtuele man door het volgen van het vrouwtje.

Bij het uitvoeren van de experimentele procedure (stap 5) is de timing cruciaal voor het succes van het experiment. De tijden / duur wij als bedoeld in het protocol (stap 5) afgeleid van eerdere studies met sailfin mollies. Zij moeten worden beschouwd als suggesties en zijn niet verplicht voor het algemene succes van de experimentele maar toch strak tijdens de procedure moeten worden gevolgd. Acclimatisatie tijd kan variëren tussen vissoorten en zelfs individuen en moet over het algemeen zo lang als de focal vis moet de hele test tank verkennen en acclimatiseren aan zijn nieuwe omgeving. Wij vastbesloten de juiste pauze duur lengte in opleiding loopt van de experimentele procedure. De pauze moet ten minste zo lang als de tijd die nodig is voor het vangen van de vis met de cilinder, evenals lopen naar en uit de test tank en operationele computer vrij te geven de vis uit de cilinder. Hier, variëren de tijden mogelijk afhankelijk van de specifieke experimentele situatie in elke lab en de geteste vissoorten. In ieder geval de experimentator individueel tijden kan veranderen / duur ofwel door het instellen van een ander tijdstip in FishPlayer (zie stap 3.1. 3.) of door animatiereeksen te maken met een andere lengte (zie stap 2.1).

De experimentator kan verbeteren het meten van vereniging tijd voor elke partner-keuze test door de implementatie van een geautomatiseerd tracking-systeem, maar het moet kunnen volgen in real-time. Hier, willen we er ook op wijzen dat er geen mogelijkheid is van het hebben van een blinde waarnemer en dus blind analyse wanneer na de procedure voor het testen van Mijn Klantencentrum. Aangezien de experimentator kan niet weten welke virtuele mannelijke stimulans zal worden verkozen door de focal vrouwelijke vóór de test, hij of zij moet zich bewust zijn van de focale vis keuze om de volgorde van animatiereeksen dienovereenkomstig wijzigen (zie stap 3.2 en 5.10).

Het protocol dat wij hier beschrijven is specifiek voor het ontwerp van onze studie op MCC in sailfin mollies. De toolchain kan echter ook worden gebruikt in combinatie met andere experimentele designs met maximaal vier monitoren voor presentatie. In het algemeen, computer animatie tools bieden een breed scala aan oplossingen voor het bestuderen van verschillende vragen over vis gedrag als partner keuze, scholende besluiten of de detectie van predator en prooi, met behulp van kunstmatige visuele stimuli. Algemene technische en conceptuele overwegingen voor het gebruik van computeranimatie in dierlijk gedrag onderzoek moeten zorgvuldig worden beoordeeld voordat u het gebruikt in experimenten2,15. Het belangrijkste voor de beslissing of computer animatie benaderingen kunnen worden geïmplementeerd in onderzoek betreft de visuele mogelijkheden van de geteste vissoorten en of het reageert natuurlijk naar virtuele stimuli gepresenteerd op monitor pagina's. Vooral bij het testen van het effect van kleur aspecten, moet worden opgemerkt dat monitor pagina's alleen kleuren als RGB-waarden verbeelden en dat dit zou kunnen belemmeren of beperken van onderzoek mogelijkheden, hoewel RGB-kleur uitgang kan inderdaad82 aangepast. Voor sommige vissoorten, een beperking zeker mogelijk dat monitoren niet UV-golflengtes uitzenden doen of dat aan de andere kant, bepaalde typen monitor zijn sterk gepolariseerd die misschien wel een beperking met vis wordt gevoelig voor gepolariseerd licht bijvoorbeeld in kwesties van partner keuze83. Een validatie voor de effectiviteit van gepresenteerde stimuli als computer animaties daarom moet vóór de proef hypothesen2,12,15,84,85.

In de toekomst nieuwe ontwikkelingen in dierlijke tracking en actie erkenning zou kunnen maken het mogelijk te maken van interactieve virtuele stimuli die reageren in real-time naar levende vis en simuleren van overeenkomstige gedrag te verhogen massaal realisme om vis te observeren 86. dankzij de modulariteit van de onderliggende ROS, externe apparaten zoals camera's kunnen geïntegreerd worden in de toolchain, mits de gebruiker voldoende programmering vaardigheden heeft. Een eerste succesvolle poging bleek dat FishSim in het algemeen kan worden gebruikt om te simuleren van interactieve virtuele vissen prikkels in het verlengde van een 3D real-time tracking systeem87,88,89. Tijdens het evenement wetenschap mededeling "Molly knows best" (https://virtualfishproject.wixsite.com/em2016-fisch-orakel), we waren in staat om aan te tonen dat de virtuele vissen kunnen worden geprogrammeerd om Volg levende focal vis op scherm en het uitvoeren van de balts gedrag volgens een vooraf gedefinieerde algoritme. Verder, dergelijke real-time tracking-systemen kunnen worden gebruikt voor het meten van de vereniging tijd automatisch om te verbeteren van de experimentele procedure. Deze functie is nog niet opgenomen in de huidige versie van FishSim maar is onderworpen aan de toekomstige ontwikkeling.

Kortom, is het gebruik van computeranimatie in dierlijk gedrag onderzoek een veelbelovende aanpak wanneer conventionele methoden invasieve behandeling van levende dieren vereisen zou naar het manipuleren van de expressie van een visuele trait of gedragspatroon. Computer animaties manipuleren zorgt voor een hoge mate van controle en standaardisatie vergeleken met live test vis, vooral aangezien biedt ook oplossingen om te manipuleren van gedrag die zeer beperkt of zelfs onmogelijk in levende vissen is. Verder, in overeenstemming met het 3V-principe en soortgelijke richtsnoeren voor het gebruik van dieren in onderzoek en onderwijs van90,91, deze techniek draagt het potentieel om te 'verminderen' en 'Vervang' levende dieren alsmede over 'verfijnen' experimental procedures in onderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (WI 1531/12-1 KW en SG) en KU 689/11-1 KDK KM en JMH. We bedanken de DAAD stijgen Duitsland-programma voor de verlening en het organiseren van een stage undergraduate onderzoek tussen SG en DB (financiering-ID: 57346313). We zijn dankbaar Mitacs voor financiering van DB met een opkomst-Globalink Research Stage Award (FR21213). Wij vriendelijk dank Aaron Berard voor het uitnodigen van ons om de FishSim aan de lezers JoVE, evenals Alisha DSouza en drie Anoniem reviewers voor hun waardevolle opmerkingen over een vorige versie van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hardware
2x 19" Belinea LCD displays Belinea GmbH, Germany Model 1970 S1-P 1280 x 1024 pixels resolution
1x 24" Fujitsu LCD display Fujitsu Technology Solutions GmbH, Germany Model B24-8 TS Pro 1920 x 1080 pixels resolution
Computer Intel Core 2 Quad CPU Q9400 @ 2.66GHz x 4, GeForce GTX 750 Ti/PCIe/SSE2, 7.8 GiB memory, 64-bit, 1TB; keyboard and mouse
SONY Playstation 3 Wireless Controller Sony Computer Entertainment Inc., Japan Model No. CECHZC2E USB-cable for connection to computer
Glass aquarium 100 cm x 40 cm x 40 cm (L x H x W)
Plexiglass cylinder custom-made 49.5 cm height, 0.5 cm thickness, 12 cm diameter; eight small holes (approx. 5 mm diameter) drillt close to the end of the cylinder lower the amount of water disturbance while releasing the fish
Gravel
2x OSRAM L58W/965 OSRAM GmbH, Germany Illumination of the experimental setup
2x Stopwatches
Name Company Catalog Number Comments
Software
ubuntu 16.04 LTS Computer operating system; Download from: https://www.ubuntu.com/
FishSim Animation Toolchain v.0.9 Software download and user manual (PDF) from: https://bitbucket.org/EZLS/fish_animation_toolchain
GIMP Gnu Image Manipulation Program (version 2.8.22) Download from: https://www.gimp.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Witte, K., Gierszewski, S., Chouinard-Thuly, L. Virtual is the new reality. Current Zoology. 63, (1), 1-4 (2017).
  2. Chouinard-Thuly, L., et al. Technical and conceptual considerations for using animated stimuli in studies of animal behavior. Current Zoology. 63, (1), 5-19 (2017).
  3. Basolo, A. L. Female preference for male sword length in the green swordtail, Xiphophorus helleri (Pisces: Poeciliidae). Animal Behaviour. 40, (2), 332-338 (1990).
  4. Rosenthal, G. G., Evans, C. S. Female preference for swords in Xiphophorus helleri reflects a bias for large apparent size. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, (8), 4431-4436 (1998).
  5. Schlupp, I., Waschulewski, M., Ryan, M. J. Female preferences for naturally-occurring novel male traits. Behaviour. 136, (4), 519-527 (1999).
  6. Campbell, M. W., Carter, J. D., Proctor, D., Eisenberg, M. L., de Waal, F. B. M. Computer animations stimulate contagious yawning in chimpanzees. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 276, (1676), 4255-4259 (2009).
  7. Woo, K. L., Rieucau, G. The importance of syntax in a dynamic visual signal: recognition of jacky dragon displays depends upon sequence. Acta Ethologica. 18, (3), 255-263 (2015).
  8. Balzarini, V., Taborsky, M., Villa, F., Frommen, J. G. Computer animations of colour markings reveal the function of visual threat signals in Neolamprologus pulcher. Current Zoology. 63, (1), 45-54 (2017).
  9. Tedore, C., Johnsen, S. Visual mutual assessment of size in male Lyssomanes viridis jumping spider contests. Behavioral Ecology. 26, (2), 510-518 (2015).
  10. Watanabe, S., Troje, N. F. Towards a “virtual pigeon”: a new technique for investigating avian social perception. Animal Cognition. 9, (4), 271-279 (2006).
  11. Culumber, Z. W., Rosenthal, G. G. Mating preferences do not maintain the tailspot polymorphism in the platyfish Xiphophorus variatus. Behavioral Ecology. 24, (6), 1286-1291 (2013).
  12. Gierszewski, S., Müller, K., Smielik, I., Hütwohl, J. -M., Kuhnert, K. -D., Witte, K. The virtual lover: variable and easily guided 3D fish animations as an innovative tool in mate-choice experiments with sailfin mollies - II. Validation. Current Zoology. 63, (1), 65-74 (2017).
  13. Thurley, K., Ayaz, A. Virtual reality systems for rodents. Current Zoology. 63, (1), 109-119 (2017).
  14. Stowers, J. R., et al. Virtual reality for freely moving animals. Nature. 14, (10), 995 (2017).
  15. Powell, D. L., Rosenthal, G. G. What artifice can and cannot tell us about animal behavior. Current Zoology. 63, (1), 21-26 (2017).
  16. Müller, K., Smielik, I., Hütwohl, J. -M., Gierszewski, S., Witte, K., Kuhnert, K. -D. The virtual lover: variable and easily guided 3D fish animations as an innovative tool in mate-choice experiments with sailfin mollies-I. Design and implementation. Current Zoology. 63, (1), 55-64 (2017).
  17. Veen, T., et al. anyFish: an open- source software to generate animated fish models for behavioural studies. Evolutionary Ecology Research. 15, (3), 361-375 (2013).
  18. Ingley, S. J., et al. anyFish 2. 0: An open-source software platform to generate and share animated fish models to study behavior. SoftwareX. 3, 13-21 (2015).
  19. Bakker, T. C. M., Pomiankowski, A. The genetic basis of female mate preferences. The Journal of Evolutionary Biology. 8, (2), 129-171 (1995).
  20. Andersson, M., Simmons, L. W. Sexual selection and mate choice. Trends in Ecology & Evolution. 21, (6), 296-302 (2006).
  21. Danchin, É, Giraldeau, L. -A., Valone, T. J., Wagner, R. H. Public information: From nosy neighbors to cultural evolution. Science. 305, (5683), 487-491 (2004).
  22. Pruett-Jones, S. Independent Versus Nonindependent Mate Choice: Do Females Copy Each Other? The American Naturalist. 140, (6), 1000-1009 (1992).
  23. Witte, K., Kniel, N., Kureck, I. M. Mate-choice copying: Status quo and where to go. Current Zoology. 61, (6), 1073-1081 (2015).
  24. Witte, K., Nöbel, S. Learning and Mate Choice. Fish Cognition and Behavior. Brown, C., Laland, K. N., Krause, J. Blackwell Publishing Ltd. 81-107 (2011).
  25. Waynforth, D. Mate Choice Copying in Humans. Human nature. 18, (3), 264-271 (2007).
  26. Galef, B. G., White, D. J. Evidence of social effects on mate choice in vertebrates. Behavioural Processes. 51, (1-3), 167-175 (2000).
  27. Kniel, N., Dürler, C., Hecht, I., Heinbach, V., Zimmermann, L., Witte, K. Novel mate preference through mate-choice copying in zebra finches: sexes differ. Behavioral Ecology. 26, (2), 647-655 (2015).
  28. Kniel, N., Schmitz, J., Witte, K. Quality of public information matters in mate-choice copying in female zebra finches. Frontiers in Zoology. 12, 26 (2015).
  29. Kniel, N., Müller, K., Witte, K. The role of the model in mate-choice copying in female zebra finches. Ethology. 123, (6-7), 412-418 (2017).
  30. Mery, F., et al. Public Versus Personal Information for Mate Copying in an Invertebrate. Current Biology. 19, (9), 730-734 (2009).
  31. Dagaeff, A. -C., Pocheville, A., Nöbel, S., Loyau, A., Isabel, G., Danchin, E. Drosophila mate copying correlates with atmospheric pressure in a speed learning situation. Animal Behaviour. 121, 163-174 (2016).
  32. Monier, M., Nöbel, S., Isabel, G., Danchin, E. Effects of a sex ratio gradient on female mate-copying and choosiness in Drosophila melanogaster. Current Zoology. 64, (2), 251-258 (2018).
  33. Dugatkin, L. A., Godin, J. -G. J. Reversal of female mate choice by copying in the guppy (Poecilia reticulata). Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249, 179-184 (1992).
  34. Widemo, M. S. Male but not female pipefish copy mate choice. Behavioral Ecology. 17, (2), 255-259 (2006).
  35. Heubel, K. U., Hornhardt, K., Ollmann, T., Parzefall, J., Ryan, M. J., Schlupp, I. Geographic variation in female mate-copying in the species complex of a unisexual fish, Poecilia formosa. Behaviour. 145, (8), 1041-1064 (2008).
  36. Bierbach, D., et al. Male fish use prior knowledge about rivals to adjust their mate choice. Biology Letters. 7, (3), 349-351 (2011).
  37. Munger, L., Cruz, A., Applebaum, S. Mate choice copying in female humpback limia (Limia nigrofasciata, family Poeciliidae). Ethology. 110, (7), 563-573 (2004).
  38. Frommen, J. G., Rahn, A. K., Schroth, S. H., Waltschyk, N., Bakker, T. C. M. Mate-choice copying when both sexes face high costs of reproduction. Evol Ecol. 23, (3), 435-446 (2009).
  39. Witte, K., Ryan, M. J. Mate choice copying in the sailfin molly, Poecilia latipinna, in the wild. Animal Behaviour. 63, (5), 943-949 (2002).
  40. Goulet, D., Goulet, T. L. Nonindependent mating in a coral reef damselfish: evidence of mate choice copying in the wild. Behavioral Ecology. 17, (6), 998-1003 (2006).
  41. Alonzo, S. H. Female mate choice copying affects sexual selection in wild populations of the ocellated wrasse. Animal Behaviour. 75, (5), 1715-1723 (2008).
  42. Godin, J. -G. J., Hair, K. P. E. Mate-choice copying in free-ranging Trinidadian guppies (Poecilia reticulata). Behaviour. 146, 1443-1461 (2009).
  43. Nordell, S. E., Valone, T. J. Mate choice copying as public information. Ecology Letters. 1, (2), 74-76 (1998).
  44. Vukomanovic, J., Rodd, F. H. Size-Dependent Female Mate Copying in the Guppy (Poecilia reticulata): Large Females are Role Models but Small Ones are not. Ethology. 113, (6), 579-586 (2007).
  45. Dugatkin, L. A., Godin, J. -G. J. Female mate copying in the guppy (Poecilia reticulata): age-dependent effects. Behavioral Ecology. 4, 289-292 (1993).
  46. Amlacher, J., Dugatkin, L. A. Preference for older over younger models during mate-choice copying in young guppies. Ethology Ecology & Evolution. 17, (2), 161-169 (2005).
  47. Hill, S. E., Ryan, M. J. The role of model female quality in the mate choice copying behaviour of sailfin mollies. Biology Letters. 2, (2), 203-205 (2006).
  48. Gierszewski, S., Keil, M., Witte, K. Mate-choice copying in sailfin molly females: public information use from long-distance interactions. Behavioral Ecology and Sociobiology. 72, (2), 26 (2018).
  49. Schlupp, I., Marler, C., Ryan, M. J. Benefit to male sailfin mollies of mating with heterospecific females. Science. 263, (5145), 373-374 (1994).
  50. Schlupp, I., Ryan, M. J. Male sailfin mollies (Poecilia latipinna) copy the mate choice of other males. Behavioral Ecology. 8, (1), 104-107 (1997).
  51. Witte, K., Ryan, M. J. Male body length influences mate-choice copying in the sailfin molly Poecilia latipinna. Behavioral Ecology. 9, (5), 534-539 (1998).
  52. Witte, K., Ueding, K. Sailfin molly females (Poecilia latipinna) copy the rejection of a male. Behavioral Ecology. 14, (3), 389-395 (2003).
  53. Verzijden, M. N., ten Cate, C., Servedio, M. R., Kozak, G. M., Boughman, J. W., Svensson, E. I. The impact of learning on sexual selection and speciation. Trends in Ecology & Evolution. 27, (9), 511-519 (2012).
  54. Varela, S. A. M., Matos, M., Schlupp, I. The role of mate-choice copying in speciation and hybridization. Biological Reviews. 93, (2), 1304-1322 (2018).
  55. Nöbel, S., Danchin, E., Isabel, G. Mate-copying for a costly variant in Drosophila melanogaster females. Behavioral Ecology. ary095 (2018).
  56. Norazmi-Lokman, N. H., Purser, G. J., Patil, J. G. Gravid Spot Predicts Developmental Progress and Reproductive Output in a Livebearing Fish, Gambusia holbrooki. PLoS One. 11, (1), e0147711 (2016).
  57. Constantz, G. D. Reproductive biology of poeciliid fishes. Ecology and Evolution of livebearing fishes (Poeciliidae). Meffe, G. K., Snelson, F. F. Prentice Hall. 33-50 (1989).
  58. Peden, A. E. Variation in Anal Spot Expression of Gambusiin Females and Its Effect on Male Courtship. Copeia. 1973, (2), 250-263 (1973).
  59. Farr, J. A., Travis, J. Fertility Advertisement by Female Sailfin Mollies, Poecilia latipinna (Pisces: Poeciliidae). Copeia. 1986, (2), 467-472 (1986).
  60. Sumner, I. T., Travis, J., Johnson, C. D. Methods of Female Fertility Advertisement and Variation among Males in Responsiveness in the Sailfin Molly (Poecilia latipinna). Copeia. 1994, (1), 27-34 (1994).
  61. Witte, K., Noltemeier, B. The role of information in mate-choice copying in female sailfin mollies (Poecilia latipinna). Behavioral Ecology and Sociobiology. 52, (3), 194-202 (2002).
  62. R Development Core Team. R: a language and environment for statistical computing. Available from: http://www.r-project.org (2015).
  63. Bischoff, R. J., Gould, J. L., Rubenstein, D. I. Tail size and female choice in the guppy (Poecilia reticulata). Behavioral Ecology and Sociobiology. 17, (3), 253-255 (1985).
  64. Forsgren, E. Predation Risk Affects Mate Choice in a Gobiid Fish. The American Naturalist. 140, (6), 1041-1049 (1992).
  65. Berglund, A. Risky sex: male pipefishes mate at random in the presence of a predator. Animal Behaviour. 46, (1), 169-175 (1993).
  66. Kodric-Brown, A. Female choice of multiple male criteria in guppies: interacting effects of dominance, coloration and courtship. Behavioral Ecology and Sociobiology. 32, (6), 415-420 (1993).
  67. Witte, K., Klink, K. B. No pre-existing bias in sailfin molly females, Poecilia latipinna, for a sword in males. Behaviour. 142, (3), 283-303 (2005).
  68. Nöbel, S., Witte, K. Public Information Influences Sperm Transfer to Females in Sailfin Molly Males. PLoS One. 8, (1), e53865 (2013).
  69. Pinheiro, J., Bates, D., DebRoy, S., Sarkar, D., Team, R. C. nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models. Available from: http://cran.r-project.org/package=nlme (2015).
  70. Crawley, M. J. The R Book. John Wiley & Sons, Ltd. (2007).
  71. Pinheiro, J. C., Bates, D. M. Mixed-Effects Models in S and S-PLUS. Springer-Verlag. New York. (2000).
  72. Zuur, A., Ieno, E. N., Walker, N., Saveliev, A. A., Smith, G. M. Mixed Effects Models and Extensions in Ecology with R. Springer. New York. (2009).
  73. De Rosario-Martinez, H. phia: Post-Hoc Interaction Analysis. Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/RVAideMemoire (2015).
  74. Korner-Nievergelt, F., Roth, T., von Felten, S., Guélat, J., Almasi, B., Korner-Nievergelt, P. Bayesian Data Analysis in Ecology Using Linear Models with R, BUGS, and Stan. Elsevier Science. (2015).
  75. Hervé, M. RVAideMemoire: Testing and Plotting Procedures for Biostatistics. Available from: https://cran.r-project.org/package=RVAideMemoire%0A (2017).
  76. Travis, J. Ecological genetics of life history traits in poeciliid fishes. Ecology and Evolution of livebearing fishes (Poeciliidae). Meffe, G. K., Snelson, F. F. Prentice Hall. 185-200 (1989).
  77. Benson, K. E. Enhanced Female Brood Patch Size Stimulates Male Courtship in Xiphophorus helleri. Copeia. 2007, (1), 212-217 (2007).
  78. Hurlbert, S. H. Pseudoreplication and the design of ecological field experiments. Ecological Monographs. 54, (2), 187-211 (1984).
  79. McGregor, P. K. Playback experiments: design and analysis. Acta Ethologica. 3, (1), 3-8 (2000).
  80. Smielik, I., Müller, K., Kuhnert, K. D. Fish motion simulation. ESM 2015-European Simulation and Modelling (EUROSIS) Conference Proc. 392-396 (2015).
  81. Baird, R. C. Aspects of social behavior in Poecilia latipinna (Lesueur). Revista de Biología Tropical. 21, (2), 399-416 (1974).
  82. Tedore, C., Johnsen, S. Using RGB displays to portray color realistic imagery to animal eyes. Current Zoology. 63, (1), 27-34 (2017).
  83. Calabrese, G. M., Brady, P. C., Gruev, V., Cummings, M. E. Polarization signaling in swordtails alters female mate preference. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (37), 13397-13402 (2014).
  84. Qin, M., Wong, A., Seguin, D., Gerlai, R. Induction of social behavior in zebrafish: live versus computer animated fish as stimuli. Zebrafish. 11, (3), 185-197 (2014).
  85. Scherer, U., Godin, J. -G. J., Schuett, W. Validation of 2D-animated pictures as an investigative tool in the behavioural sciences A case study with a West African cichlid fish, Pelvicachromis pulcher. Ethology. 123, (8), 560-570 (2017).
  86. Butkowski, T., Yan, W., Gray, A. M., Cui, R., Verzijden, M. N., Rosenthal, G. G. Automated interactive video playback for studies of animal communication. The Journal of Visualized Experiments. (48), 2374 (2011).
  87. Müller, K., Gierszewski, S., Witte, K., Kuhnert, K. -D. Where is my mate? Real-time 3-D fish tracking for interactive mate-choice experiments. ICPR 2016-23rd International Conference for Pattern Recognition; VAIB 2016, Proc. 1-5 (2016).
  88. Müller, K., Schlemper, J., Kuhnert, L., Kuhnert, K. -D. Calibration and 3D ground truth data generation with orthogonal camera-setup and refraction compensation for aquaria in real-time. IEEE 2014 International Conference on Computer Vision Theory and Applications (VISAPP). 3, 626-634 (2014).
  89. Müller, K., Hütwohl, J. M., Gierszewski, S., Witte, K., Kuhnert, K. D. Fish Motion Capture with Refraction Synthesis. Journal of WSCG. In press (2018).
  90. ASAB Guidelines for the treatment of animals in behavioural research and teaching. Animal Behaviour. 135, I-X (2018).
  91. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. Methuen and Co. Ltd. London. (1959).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics