Separation av spenat tylakoida proteinkomplex av infödda grön gelelektrofores och bandet karakterisering med Time-Correlated Single Photon Counting

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att separera solubilized tylakoida komplex med infödda grön gelelektrofores. Grön gel band kännetecknas därefter av tid korrelerade Single Photon Counting (TCSPC) och grundläggande steg för dataanalys finns.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Schwarz, E., Blanchard, G. Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting. J. Vis. Exp. (144), e58470, doi:10.3791/58470 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ljus reaktionerna fotosyntes utförs av en serie pigmenterade proteinkomplex i tylakoida membran. Det stökiometri och organisationen av dessa komplex är högdynamiska på både långa och korta tidsskalor på grund av processer som anpassa fotosyntesen till förändrade miljöförhållanden (dvs. icke-fotokemiska snabbkylning, tillståndsövergångar, och den långsiktiga svar). Historiskt har dessa processer har beskrivits spectroscopically när det gäller förändringar i klorofyll fluorescens och spektroskopi förblir en viktig metod för att övervaka fotosyntetiska parametrar. Det finns ett begränsat antal sätt där den underliggande protein complex dynamiken kan visualiseras. Här beskriver vi en snabb och enkel metod för högupplösta separation och visualisering av tylakoida komplex, inbyggda grön gelelektrofores. Denna metod är tillsammans med tid-korrelerade enda fotonen räkna för detaljerad karakterisering av klorofyll fluorescens egenskaper band separeras på grön gel.

Introduction

Fotosyntetiska organismer måste hela tiden anpassa sin fysiologi till förändrade miljöförhållanden att maximera sin produktivitet och framgångsrikt konkurrera med grannar1. Detta gäller särskilt maskinens ansvarar för ljus reaktionerna fotosyntes, som omgivande ljus villkor kan fluktuera med tre tiopotenser mellan skuggor och fullt solljus. Miljöfaktorer såsom torka, kyla eller värmestress kan dessutom minska tillgängligheten av koldioxid för kol fixering, som är naturliga elektron diskbänken för produkter av ljus reaktionerna. Växter måste, därför skörda och utnyttja solstrålning så effektivt som möjligt samtidigt behålla möjligheten att skingra överskott ljus energi som behövs. Medan photooxidative skador fortfarande uppstår rutinmässigt under alla ljusförhållanden2,3, misslyckande att hantera absorberas exciteringsenergi framgångsrikt kan leda till katastrofala cellskador och döden. Flera adaptiva mekanismer finns som tillåter fotosyntetiska apparaten stämmas både förändringar i rådande miljöförhållanden och övergående fluktuationer (dvs. över både långa och korta tidsskalor)4. Dessa inkluderar långsiktiga svar (LTR) och icke-fotokemiska kylning (NPQ). NPQ är i sig anses omfatta minst tre andra komponent fenomen, inklusive tillståndsövergångar (qT), släcka snabbt inducerbara energi (qE) och photoinhibition (qI)5.

Dessa processer var ursprungligen observerade och definieras i hög grad genom spektroskopiska fenomen [t.ex. NPQ refererar till en droppe i observerade klorofyll fluorescens (kylning av klorofyll fluorescens) som inte beror på en ökning av andelen Fotokemi]6. Termen ”state transitions” på samma sätt avser observerade ändringen i det relativa beloppet av fluorescens från PSI och PSII7. Medan de spektroskopiska tekniker som har möjliggjort en uppräkning av dessa fenomen [i synnerhet pulsamplitud modulerade (PAM) fluorescens-spektroskopi] och fortsätta att vara ett viktigt medel för observation och dissekera fotosyntetiska processer i vivo, en hel del av biokemi som krävs för att klarlägga mekanismerna bakom dessa spektroskopiska observationer. Statliga övergångar, innebär exempelvis en fosforylering/Defosforylering cykel av LHCII proteiner av STN7 kinase och TAP38/PPH1 fosfatas, respektive8,9,10. Denna cykel justerar fysiska distributionen av LHCII antennen mellan de två fotosystem genom att flytta en del av LHCII trimerer från PSII PSI, därmed förändra absorptionen tvärsnitt av fotosystem11,12. Komponenten qE i NPQ omvandlar snabbt överflödig excitation energi till värme genom violaxanthin/zeaxantin epoxidering/de-epoxidering cykeln och proteinet PsbS agerande. PsbS exakta roll i denna process är fortfarande inte helt klarlagt13. Komponenten qI i NPQ, photoinhibition, är allmänt tillskrivs skada till D1 proteinet av PSII. Restaurering av full fotosyntetiska kompetens kräver en genomarbetad reparationsprocessen fixar skadade PSII photocenters. PSII reparera cykeln innebär migration av PSII komplex ur den granal stackar, demonteringen av komplexen, byte av skadade D1 proteiner, ihopsättning av PSII komplexen och förflyttning av PSII komplex tillbaka till den granal stackar14. Den exakta innebörden av photoinhibition och PSII åldrad hud är fortfarande föremål för intensiv granskning15.

Svårigheten att studera fenomen som stat övergångar eller PSII reparation uppstår delvis från det faktum att det finns inte ett enkelt sätt att visualisera komplexa biokemiska system mekanik. Den klassiska biochemical tillvägagångssätt att förstå en process är att först skilja dess komponenter så att de kan karakteriseras i isolering. Infödda gelelektrofores uppstod från framgångsrika insatser på 1980-talet att separera och karakterisera de fotosystem komplex från tylakoida membran med fler förberedande metoder (nämligen sackaros gradient centrifugering och kromatografi)16. De tvättmedel system utvecklat för att försiktigt solubilize de infödda komplex från tylakoida membranen anpassades snart till elektroforetisk separationsmetoder, framför allt genom Allen och Staehelin17 och och Peter och Thornber18, ger upphov att infödda grön gelelektrofores. Samtidigt som företräder enda ur en mängd olika tekniker i den experimentella arsenalen, infödda sida har ett antal attraktiva egenskaper som har gjort det en allmänt sysselsatta metod i fotosyntesen forskning. Infödda sida är relativt snabb och enkel, kräver lite specialutrustning, samtidigt som den ger hög upplösning separation av ett stort antal tylakoida komplex samtidigt. Detta gör infödda sida ett praktiskt verktyg för att studera tylakoida dynamics och, när de kombineras med STANDARDSIDA i den andra dimensionen samt en mängd tvättmedel och buffert-system, ett mångsidigt system för att hitta och karakterisera nya tylakoida komplex.

Som sagt, har infödda grön geler haft ett rykte om att vara en opålitlig teknik, särskilt i oerfarna händer, eftersom det är lätt att producera dåliga resultat bestående av fuzzy, smetig geler med några band. Problemet var löst, delvis, med införandet av blå-native sida19. Coommassie färgämnet i BN buffert systemet gör protein separation mer robust. Därför, BN-sida är ofta en enklare och mer tillförlitlig teknik för en relativ nybörjare att ställa in och kan ge hög upplösning separationer av tylakoida komplex. Av dessa skäl blivit BN-sida vald analysmetod för de flesta arbete i det här fältet. Medan BN-sidan är i allmänhet långsammare att köra än gröna gelelektrofores, dess huvudsakliga nackdelen är att den coommassie färgämnet färgning stör identifiering av svag klorofyll-innehållande band, samtidigt också göra nedströms spektroskopiska karakterisering problematiska.

Den biokemiska informationen tillhandahålls av infödda geler och 2D SDS-PAGE kan stärkas kraftigt när de kombineras med data från spektroskopiska tekniker. Oavsett systemets sysselsatt, centrala problem med att använda inhemska geler för att identifiera komplex är att identifieringen alltid kan ifrågasättas (dvs. proteinerna som finns i ett band kunde alltid representerar comigrating komplex eller komponenter, snarare än en enstaka fysiologiskt autentiska komplex). Spektroskopiska karakterisering ger biofysiska information om pigmenten i grön gel band och kan användas för att bestämma vilka typer av komplex de sannolikt kommer att innehålla. Klorofyll fluorescensen är särskilt användbart i detta sammanhang på grund av de ofta dramatiskt olika spektra och fluorescens livstider som är karakteristiska för olika fotosyntetiserande pigment-proteinkomplex. Medan enkla steady state 77K fluorescens spectra har historiskt sett varit användbar för att bekräfta identiteter för infödda gel komplex, kan moderna tid-korrelerade single photon counting (TCSPC) ge mycket mer information. TCSPC tillåter inte bara karakterisering av komplex baserat på fluorescens livstider, men också möjliggör en detaljerad beskrivning av energiöverföring mellan spektrala komponenter i ett komplex. Denna typ av karakterisering allt viktigare som användning av olika inhemska gel system sprider och ny förmodad komplex upptäcks, möjliggör identifiering av proteinkomplex autentiseras bättre och tillhandahålla nya biofysiska information om hur dessa komplex fungerar.

I detta dokument ger vi en metod som gör det möjligt för dem som har liten eller ingen erfarenhet med infödda gelelektrofores att uppnå hög kvalitet upplösning av infödda tylakoida komplex i syfte att undersöka mekaniken i ljus reaktioner fotosyntesen. Denna grundläggande teknik kan sedan utökas de experimenter's eget gottfinnande att förbättra resultat eller utvidga tillämpligheten till andra arter. Sedan beskriver vi processen för att utsätta infödda grön gel band för TCSPC, samt några steg för grundläggande analys och presentation av data som tillhandahålls av tekniken. Kopplingen av infödda gelelektrofores med TCSPC analys sträcker sig nyttan av dessa gel system genom att tillhandahålla autentisering och biofysiska karakterisering av proteinkomplex inom banden. Grön gel systemet beskrivs här baseras på som utvecklats av Allen och Staehelin17 med vissa modifieringar och är samma som används i Schwarz et al. 20. detta system är en av många men har specifika funktioner som är användbara för denna metod. Det är snabb nog så att tylakoida isolering, gelelektrofores och TCSPC analys bekvämt kan utföras på en dag, undanröja potentiella problem för förvaringen och nedbrytning. Vi tycker också att denna metod är robust i händerna på oerfarna användare, samtidigt som det ger resultat som sträcker sig från bra till överlägsen, beroende på graden av optimering.

Det är viktigt att komma ihåg att de komplex som visualiseras på en native gel beror på både tvättmedel och buffert-system som används, samt på biologin av organismen under utredning. Olika rengöringsmedel och buffert system separera företrädesvis olika typer av komplex, och en given fotosyntetiska organismer har olika komplex från andra organismer, inte alla som kommer att närvara under en viss omständighet. Systemet beskrivs här är särskilt lämpad för studiet av PSI megacomplexes, som beskrivs i Schwarz et al. 20, men det faller på den mer destabiliserande änden av spektrumet för de som studerar PSII megacomplexes. För en omfattande studie av de olika tvättmedel och buffert system som används i inhemska gelelektrofores av tylakoida proteiner, är det rekommenderat att granska Järvi et al. 21 och Rantala o.a. 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. stamlösningar förberedelse för hälla infödda grön geler

  1. Förbereda en 4 x buffertlösning med koncentrerad för att lösa geler som består av 40% glycerol, 200 mM glycin och 100 mM Tris buffrad till pH 8,3.
  2. Förbereda en 4 x koncentrerad buffertlösning för stapling geler som består av 40% glycerol, 200 mM glycin och 100 mM Tris buffrad till pH 6,3.
  3. Lagra dessa buffertar vid 4 ° C att förhindra tillväxt av mögel.
    Obs: Buffertar är stabila i månader vid 4 ° C, så beredning av 100-200 mL varje buffert för fortsatt användning rekommenderas.
  4. Förbereda 1 L 10 x kör buffert innehållande 250 mM Tris HCl pH 8,3, 1.92 M glycin och 1% SDS. Lagra 10 x körs buffert på bänkmonterade.

2. stamlösning förberedelse för isolering och lösbarhet av Thylakoids

  1. Bereda 100 mL TMK homogenisering buffert innehållande 50 mM Tris buffert (pH 7), 10 mM MgCl2och 10 mM KCl och förvaras vid 4 ° C.
    Obs: Detta är det huvudsakliga buffert för homogenisering och manipulera tylakoida prover. Alternativt, koncentrerad stamlösningar kan förberedas och utspädd som behövs (Tris buffert, MgCl2och KCl kan alla lätt lagras på bänkmonterade som 1 M koncentrat).
  2. Förbereda stamlösningar av tylakoida lösbarhet rengöringsmedel, B-decyl maltoside (DM) och n-octyl B-d-glukosid (OG), genom att lösa varje tvättmedel i TMK buffert på 20% w / v. frysa vid-20 ° C i 1 mL portioner.
  3. Förbered tylakoida lösbarhet buffert (SB), som också är provet lastning bufferten.
    1. Första make TMK-glycerol buffert genom att kombinera 7 mLs TMK buffert och 3 mLs glycerol.
    2. Tillsätt 100 μL av DM stamlösning och 100 μL av OG stamlösning till 800 μL av TMK-glycerol buffert. Lagra denna SB fungerande lösning, som innehåller 2% DM och 2% OG, fryst vid-20 ° C i 1 mL portioner.
      Obs: Varje alikvot kan Tinas och frysas efter behov.

3. hälla grön Mini geler för senare användning

  1. Bered separata stapling och lösa gel lösningar i 15 mL disponibla provrör.
    Obs: De volymer som är tillräckliga för en enda mini gel med 1,5 mm plåt distanser.
    1. För att göra stapling gellösningen, kombinera 1,25 mL av 4 x stapling gel buffert, 0,5 mL av 40% akrylamid stamlösning (39:1 C) och 3.25 mL vatten att ge 5 mL 4% akrylamid i 1 x stapling buffert. För att lösa gellösningen kombinera 1.875 mL av 4 x lösa buffert, 0,94 mL av 40% akrylamid stamlösning (39:1 C) och 4,7 mL vatten att ge 7,5 mL 5% akrylamid i 1 x lösa buffert.
  2. Häll den lösa gel.
    1. Tillsätt 50 μL av 10% ammonium persulfatoxidation (APS) att lösa gellösningen, sedan tillsätt 10 μL TEMED, cap röret, och vänd försiktigt flera gånger för att blanda. Häll omedelbart gellösningen mellan gel plattorna, lämna ca 1 cm mellan toppen av lösa gel och botten av kam tänderna för stapling gelen.
    2. Försiktigt Pipettera 100% etanol på toppen av lösa gelen till nivå gelen.
      Obs: Om gelen inte anges inom 15 min, färska APS lösning bör göras eller nya TEMED bör användas.
    3. Efter att gelen har polymeriseras (gränssnittet mellan gel och etanolen kommer att vara synlig och kommer inte att flytta när gelen är tippade), Häll av etanol och blot med ett absorberande papper.
  3. Häll stapling gelen.
    1. Lägg till 25 μL 10% APS att stapla gellösningen, lägga till 5 μL TEMED, sedan cap och Invertera att blanda på samma sätt som lösa gelen. Häll gellösningen ovanpå lösa gelen tills utrymmet mellan plattorna är helt fylld och infoga en 10-bra kam.
      Obs: När du är redo att användas, ta bort kammen från gelen och skölj brunnarna med vatten, att se till att brunnarna är raka och obehindrad av gel. Gelen kan lagras med kammen på plats vid 4 ° C i minst flera dagar.

4. isolering av rå tylakoida membran från spenat blad

Obs: Alla åtgärder bör genomföras på ice använder pre kyld utrustning och buffertar. Dim belysning rekommenderas också. Beroende på de experimenter's diskretion och de biologiska processerna under studien, bör proteashämmare eller fosfatas hämmare tillsättas färska TMK buffertar före homogenisering.

  1. Helt homogenisera bladspenat i TMK buffert med ett glas Dounce Homogenisatorer.
    Obs: Cirka 1 till 2 mL buffert är normalt tillräckligt för en liten baby spenat blad. Ett enda baby spenat blad kan vanligtvis ge tillräckligt med material för att ladda flera brunnar på en 1.5 mm mini gel.
  2. Filtrera rå leaf Homogenatet för att avlägsna olösliga skräp.
    1. För att göra en enkel filtrering enhet, skär en grannlaga uppgift torka i halv och vik den in i inkvarterar. Packa det grannlaga uppgift torka i botten av en 5 mL engångsspruta och pre våt torka med TMK buffert.
    2. Använd sprutkolven tryck överflödigt buffert ur det grannlaga uppgift torka och se till att torka filtret trycks fast längst ned på sprutan efter kolven avlägsnas.
    3. Pipettera leaf Homogenatet på mitten av filtret torka och använd kolven för att passera filtret Homogenatet. Samla de filtrerade Homogenatet i ett 1,5 mL centrifugrör.
  3. Centrifugera Homogenatet vid 5 000 x g i 10 minuter vid 4° C till pellet olösligt material, inklusive tylakoida membran. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 mL av TMK buffert.
  4. Normalisera mängden klorofyll i varje prov genom att justera volymen för varje återsuspenderade tylakoida prov så att varje prov innehåller samma totala mängden klorofyll, som beskrivs nedan.
    Obs: Detta gör att varje prov att vara solubilized i samma volym av tvättmedel och minimerar variationen i lösbarhet på grund av skillnader i pellet volym.
    1. Extrahera klorofyll från varje prov av återsuspenderade tylakoida membran, ta en 50 μL alikvotens i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör och lägga till 950 μL av metanol i den. Förslut röret och blanda genom att vända flera gånger.
    2. Centrifugera metanol/klorofyll extraktet vid 10 000 x g i 10 min till pellet utfällda proteiner.
    3. Bestämma klorofyllet koncentration av pigment innehållande supernatanten enligt Porra et al. 23. ta absorbansen avläsningar på 652 och 665 nm med en spektrofotometer och en 1 cm kyvetten. Bestäm totala klorofyll koncentrationen med hjälp av ekvationen nedan:
      Chls en + b (μg/mL) = 22,12 (Abs 652 nm) + 2,71 (Abs 665 nm)
    4. Med klorofyll koncentration mätningar som en guide, avlägsna och kassera några volym från varje prov, som krävs, så att varje tub innehåller samma totala mängden klorofyll.
  5. Re pellet tylakoida membran genom centrifugering vid 5 000 x g i 10 min. ta bort och Kassera supernatanten. Var försiktig med att ta bort alla supernatanten utan aspirera någon av pelleten.

5. lösbarhet av tylakoida membran för lastning på infödda geler

  1. Tina en alikvot av TMK 30% glycerol rengöringslösning (SB) och Invertera flera gånger för att blanda. Håll det på is.
  2. Lös tylakoida pelleten genom att lägga lämplig volym av SB att ge klorofyll koncentrationen 1 mg/mL.
    Obs: Denna koncentration är en utgångspunkt för att hitta de optimala lösbarhet villkor, som bestäms empiriskt. Klorofyll koncentrationen måste hållas samma mellan prover att tillåta giltiga jämförelser.
  3. Pipettera upp och ner flera gånger och var noga med att undvika skumbildning av provet. Håll på isen att tillåta tylakoida prover till solubilize.
    Obs: Solubilize i minst 10 minuter. Lösbarhet tid bör vara tillräckligt lång för att skillnaden i lösbarhet tid mellan prover minimeras.
    Exempel: Om 3 minuter krävs att solubilize alla prover, då cirka 30 minuter bör tillåtas för lösbarhet.
  4. Centrifugera solubilized thylakoids vid 10 000 x g vid 4 ° C till pellet olösligt material.
    Obs: Solubilized tylakoida prover är stabila på is i timmar, men lagring vid-70 ° C bör undvikas, eftersom frysning-tining cykler kan resultera i en förlust av megacomplex band.

6. separation av Solubilized tylakoida proteiner med infödda gelelektrofores

  1. Ladda den solubilized tylakoida supernatant bereddes i steg 5,4 direkt på infödda gelen förberett tidigare. För en 1,5 mm gel, Ladda 15 μL solubilized tylakoida per brunn.
  2. Kör infödda gröna gelen i huvudsak på samma sätt som SDS-PAGE geler med 1 x kör buffert. Kör gelen vid 100 V och placera hela gel tanken på våt is under hela körningen till mildra resistiv uppvärmning av gelen.
    Obs: Gelen bör kräva ca 2 timmar för gratis pigmentet framtill migration att nå botten av gelen (figur 1).

7. excision av Thylakoid Complex band från infödda grön geler

Obs: Excising den specifika bandet av intresse från gelen är nödvändigt att tillåta bandet att placeras i strålgång och förhindra herrelösa fluorescens från närliggande komplex samlas.

  1. Ta bort gelen från elektrofores cell och skölj kör bufferten off gel plattorna med destillerat vatten. Avlägsna topplattan från gelen och skölj gelen med destillerat vatten.
  2. Gelet på glas bottenplattan och placera i gel och plattan på is. När inte i använda, hålla gelen i mörkret och täck med en plastfolie att förhindra det från att torka ut.
  3. Med gelen kvar på glasskivan, punktskatt varje band av intresse när du är redo för TCSPC analys. Punktskatt band rent med en vass skalpell eller rakblad och ta hand att exciderad bandet innehåller inget kontaminerande band material.

8. insamling av rumstemperatur Steady-State fluorescens Spectra

  1. För varje komplex som ska analyseras av TCSPC, tas en rumstemperatur fluorescens spektrum mellan 600 och 800 nm med en fluorescens spektrometer.
    Obs: Excitation våglängden brukade samla in detta spektrum måste matcha den våglängd som används för TCSPC.

9. TCSPC grön Gel band

Obs: Se figur 2 för en skildring av den TCSPC setup.

  1. Smörgås på gel segmentet mellan två glasskivor mikroskopi. Använd maskeringstejp, placeras på vardera änden av en av mikroskopi bilderna och vikta över flera gånger, för att skapa distanser så att bilderna kan hållas ihop ordentligt utan att komprimera gel segmentet.
    Obs: Detta kommer att skapa en bana för laserstrålen att passera mellan objektglas och genom en gel-slice.
  2. Lägga till en liten mängd vatten i gel segmentet vid kanten av glas bilder att skapa ett smidigt gränssnitt som kommer att minska signal spridning.
  3. Clamp den gel bilden smörgås i sökvägen balken så att strålen träffar gel segmentet genom den öppna kanten av pläterar, möjliggör fluorescens utsläpp vara genom sidan av glas glasen där gelen är inklämt, vinkelrät beam.
    Obs: Excitation våglängden används beror på experimentet. En våglängd av 435 nm kommer att uppväcka både klorofyll a och klorofyll b, medan 465 nm kommer företrädesvis att excitera klorofyll b. I detta fall, 435 nm användes som magnetisering våglängden.
  4. Samla 10 000 totalt datapunkter med jämna mellanrum fluorescens utsläpp spektrum för varje komplex. Till exempel samla data varje 10 nm, börjar på 680 nm och slutar vid 750 nm.
    Obs: Förbereda flera gel band för varje komplex studeras så färska provet är tillgänglig i händelse av att fotoblekning förhindrar tillräcklig signal collection.

10. TCSPC (dataanalys)

  1. För en given komplex, först normalisera topphöjden av varje decay kurva för alla våglängder samlas in.
    Obs: Detta steg är inte nödvändigt för byggandet av DAS men tillåter decay kurvor ska överlagras och jämförs visuellt med varandra som en första inspektion av data.
  2. Svans-match varje decay kurva till steady-state fluorescens spektrumet av anläggningen som beskrivs nedan.
    1. Välja en tidpunkt efter vilken decay signalen har planat ut, vanligtvis efter några nanosekunder.
    2. För varje våglängd, normalisera decay kurvan så att signal intensiteten på den valda tidpunkt är lika med värdet av steady-state fluorescens spektrum vid denna våglängd (dvs. värden för alla våglängder tillsammans på den valda tidpunkt kommer att återskapa steady-state fluorescens spektrumet).
  3. Bygga förfall-associate spectra (DAS) från svans-matchade decay kurvorna, som beskrivs nedan.
    1. Punkter från svans-matchade decay kurvor med hjälp av data och bygga en rad tomter graphing fluorescensintensiteten vs. våglängd vid regelbundna tidsintervall (t.ex. varje 10 ps). Till exempel uppförs DAS på 50 ps av plottning värdet av varje decay kurva på 50 ps vs. våglängd.
    2. Överlagra alla förfall-associerade spektra att skapa en tomt av vattenfall-stil som visar förfalla av fluorescens spektrumet över tiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representativa resultat för gröna gelelektrofores presenteras i figur 1. Lane 1 innehåller ett exempel på perfekt resultat för grön gelelektrofores av spenat thylakoids, där ett maximalt antal tydliga, skarpa gröna band är synliga. Dessa resultat är något atypiska, delvis eftersom inte alla de band som uppträder hos lane 1 finns normalt i ett givet prov. Ytterligare prov rensning, i form av kloroplast isolering innan tylakoida lösbarhet och gradient gel-elektrofores (4-7% akrylamid) är också normalt krävs för att uppnå optimalt resultat. Körfält 2 och 3 närvarande mer typiska resultat som uppnåtts med hjälp av protokollet som beskrivs här i samband med en 5% icke-toning gel. Lanes 4, 5 och 6 ger ett exempel på dåliga resultat på grund av ökande grad av under-lösbarhet av tylakoida provet. Lane 7 ger ett exempel på typiska resultat som uppnåtts med Arabidopsis thylakoids istället för spenat. Observera att för Arabidopsis megacomplex band överst på gelen tenderar att lösas dåligt jämfört med dem i spenat.

En grafisk skildring av TCSPC installationen används för att samla data från infödda grön gel band visas i figur 2. Figur 3 visar det typiska bearbetningsflödet för början analys efter TCSPC data har samlats som beskrivs i steg 10. När TCSPC data samlas representerar varje kurva vid en viss våglängd ett godtyckligt antal datapunkter, eller ”räknar”. När dessa kurvor överdras med en another, som visas i figur 3A, kurvorna kan inte jämföras med varandra direkt eftersom de representeras inte på samma skala och kan inte alla vara registrerade till tid samma utgångspunkt. Det första steget i dataanalys är därför att jämföra varje kurva till dess motsvarande instrument svar funktion (IRF). Toppen av IRF för en given kurva är inställd på tiden t = 0, och den ledande kanten på motsvarande fluorescens decay kurvan är inställd att överlappa den ledande kanten på IRF, som visas i figur 3B. Detta anger alla kurvor till samma tid registret för senare analys.

Det är inte nödvändigt för byggandet av DAS, tillåter normalisera alla kurvor till samma topphöjd på denna punkt en användbar jämförelse mellan kurvor ska göras som en första analys av data. I figur 3 cvisas samma decay kurvor för LHCII presenteras i figur 3A efter registreringen, som i figur 3B, och topp höjd normalisering. Som kan ses i figur 3D, kan peak-normaliserade decay kurvor från olika komplex sedan att överlagras med varandra vid en viss våglängd, vilket gör att skillnaderna i beteende mellan komplexen till visualiseras. LHCII har exempelvis en karakteristiskt långlivat fluorescens som sönderfaller långsamt, medan PSI fluorescens är starkt kylda, ruttnande mycket snabbt. Band 5 fluorescens decay kurvan ger ett intressant exempel på mycket suggestiv data, delvis eftersom det är tydligt bifasisk. Inledande fluorescens decay kurvan för Band 5 komplexa följer i samma takt som PSI för cirka 500 ps ännu sönderfaller ännu snabbare därefter. Spännande resultat av detta slag kan analyseras mer i detalj genom att konstruera förfall-associerade spectra (DAS).

I figur 4visas representativa DAS vattenfall tomter för LHCII och Band 5 komplexa. Byggandet av DAS kräver först att förfalla kurvor för en given svans-matchas till rumstemperatur fluorescens spektrumet för anläggningen, som beskrivs i steg 11.2. Resultaten av svans-matchande decay kurvor för LHCII visas i figur 4A. DAS är sedan tillverkade av dessa kurvor som beskrivs i steg 11,3. DAS för LHCII konstruerades från förfall kurvor visas i figur 4A och resultaten presenteras i figur 4B. DAS mellan 0 och 100 ps var utelämnas för tydlighetens skull, och bara presenteras varje 100 ps därefter på grund av karakteristiskt långsamt förfalla för isolerade LHCII. DAS för LHCII är känd för avsaknaden av dynamiska funktioner, och formen på LHCII fluorescens spektrumet är detsamma som de signal förfaller över tid. Sönderfallet av fluorescens spektrumet är också försenad, som kräver 100 ps att nå maximal fluorescens. Detta antyder, såsom kan förväntas för isolerade ljus skörd proteinkomplex, att energi överförs inte mellan energiskt distinkta pigment inom komplexet som fluorescens sönderfaller. Undantaget från detta är förskjutningen i spektrumet som inträffar under de första 100 ps, förmodligen på grund av initiala omfördelning av exciteringsenergi i hela komplexet.

DAS för Band 5 komplexa visas i figur 4 c, konstrueras på ett liknande sätt som visas för LHCII. Band 5 ger en lärorik kontrast till LHCII på flera sätt. Jämfört med LHCII, sönderfaller fluorescens från Band 5 mycket snabbare att nå maximal intensitet i endast 30 ps och förfalla till mindre än 20% av inledande intensitet efter 500 ps. Fluorescens spektrumet av bandet 5 komplexa uppvisar också ett antal intressanta dynamics som de utsläpp sönderfaller. Jämföra spektra på 0 och 60 ps visar tydligt en ökning i fluorescens vid 720 nm på bekostnad av fluorescens vid 680 och 710 nm. Därefter toppen vid 680 nm förskjutningar mot 690 nm och breddar, medan toppen vid 720 nm skiftar tillbaka mot 710 nm (t.ex., jämför 60 ps till 500 ps). Data av denna typ hjälper till att utesluta förekomst av osammanhängande LHCII antenn proteiner samtidigt som bevis för energiöverföring från LHCII till PSI antennen och så småningom PSI kärnan.

Dessa dynamics föreslår också att det är sannolikt att vara olösta toppar runt 680 nm, 690 nm, 710 nm och 720 nm. Dessa data ger därför ett exempel där spektrala funktioner bättre kunde lösas genom att samla TCSPC data närmare mellanrum (t.ex. varje 5 nm i stället för varje 10 nm). Även i avsaknad av högre spektral upplösning, dock är DAS för Band 5 komplexa ett exempel på bevis för energiöverföring mellan flera fluorescerande arter i ett komplex. Det verkar också vara en snabbt ruttnande topp ovanför 740 nm, vilket tyder på att uppgifter också bör insamlas över ett bredare spektrum att inkludera ytterligare spektrala funktioner.

Figure 1
Figur 1: representant grön gel resultat. Grön gel band utsätts för TCSPC analys är märkta PSI-LHCII (fotosystem jag LHCII megacomplexes), PSI (fotosystem I LHCI), Band 5 (PSI-LHCII komplex), PSII-LHCII (fotosystem II och tillhörande ljus-skörd komplex II), PSII (fotosystem II kärna Complex), och LHCII (ljus-skörd komplex II). Lane 1 visar en idealisk banding mönster som härrör från kloroplast isolering innan lösbarhet och gröna gelelektrofores på en 4-7% akrylamid gradient gel. Körfält 2 och 3 visar genomsnittliga resultaten från enkla tylakoida isolering och elektrofores på en icke-lutningen 5% akrylamid gel. Lanes 4-6 visar ökande svårighetsgrad av under-lösbarhet. Lane 7 visar representativa resultat för Arabidopsis använder simple protocol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk av tid-korrelerade enda photon counting instrument. Ljuskällan är en passivt läge-låst NdYVO4 -laser som pumpar en hålighet dumpade dye laser. 5-ps pulser på variabel upprepning priser och våglängder karakteriseras med hjälp av en autocorrelator. Pulserna delas, med en portion ska en referens fotodiod och resten spännande provet. Prov utsläpp samlas in med hjälp av ett Mikroskop mål och polariserade komponenter upptäcks med hjälp av två upptäckt kanaler. Prov utsläpp är tid matchas med upptäckt elektroniken anges, där CFD = konstant andel diskriminator, TAC = tid-till-amplitud converter och MCA = Multi-Channel analyzer. Tidsupplösning bestäms från funktionen instrument svar (ca. 40 ps). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: representativa TCSPC rådata och normaliserade fluorescens förfalla kurvor. (A) överlagring av TCSPC rådata för LHCII. TCSPC data samlades varje 10 nm mellan 670 nm och 740 nm (B) A representativa kurvan visar registreringen av fluorescens data till instrumentet svar funktion (IRF). (C) LHCII data från (A) normaliserad till en maximal topphöjden 1 efter alla kurvor var registrerade till deras respektive IRFs. (D) överlagring av fluorescens decay kurvor på 680 nm för PSI, PSII, PSII-LHCII, LHCII och Band 5. Alla decay kurvor var normaliserade till en maximal topphöjd av 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: byggandet av vattenfall-stil DAS. (A) svans matchande av förfall kurvor för LHCII i förberedelserna för byggandet av DAS tomter. (B) DAS tomter för LHCII för tiden t = 0, för varje 100 ps från 100 till 500 ps, och på 1000 ps. (C) DAS tomter till Band 5 varje 30 ps från t = 0 till 210 ps och varje 100 ps därefter till 500 ps. För båda (B) och (C), tid = 0 definieras av IRF, vilket är 40 ps. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En framgångsrik tylakoida lösbarhet och infödda gel kör kommer att resultera i resolutionen av flera distinkta synliga gröna band på gel utan betydande snedvridning eller smetar av banden. Överbelastning av gel, en hög tvättmedel koncentration, en Felaktiga prov pH, oupplösta material, Kör gelen alltför snabbt eller vid för hög temperatur, och ett felaktigt hällde gel är alla faktorer som kan bidra till dåligt löst tylakoida komplex. Samtidigt optimera villkoren i gelen själv (t.ex., akrylamid gradient koncentrationer), det kan bidra till att maximera resolutionen av band av intresse. Det är vår erfarenhet att lösbarhet villkor och biologin av själva provmaterialet är de viktigaste faktorerna som bidrar till kvalitet och kvantitet av tylakoida komplex löst på infödda grön geler. Det är viktigt att komma ihåg att inte alla komplex kommer att närvara under alla biologiska förhållanden.

Infödda grön geler hälls i huvudsak på samma sätt som normala SDS-PAGE mini geler. Geler kan hällas på morgonen och är redo att använda senare samma dag, eller de kan lagras vid 4 ° C i flera dagar med kammen i gel och inga betydande förändringar i prestanda. Standard, lättillgänglig 39:1 C akrylamid lösningar kan användas att hälla båda stapling och lösa gelerna. Så kallade ”stora porer” geler kan göras med högre acrylamide:bis-akrylamid nyckeltal (t.ex., 100: 1 C) för att öka separationen av megacomplexes överst på gelerna, men vi upptäcker att detta också tenderar att resultera i mindre kraftigt löst band. I vår erfarenhet uppnås högsta bandet upplösning (med det största antalet band separerade) vid lägre C förhållandet och med en linjär akrylamid koncentration gradient av 5-7%. Men om en övertoning som tidigare inte är tillgänglig, mycket tillfredsställande bandet separation och upplösning kan uppnås med lösa gel koncentration av cirka 5% akrylamid. Det är viktigt att elektrofores utföras vid relativt låg spänning att minska uppvärmning av gelen, som kan denaturera komplexen, och tillåta native komplex att skilja från varandra med hög upplösning.

Metoden för tylakoida isolering ges här är snabb men relativt ”smutsiga” (dvs. det inte försöker separera kloroplaster från andra organeller eller tylakoida membran från andra cellmembran). Detta är tillräckligt för att visualisera tylakoida komplex och efterföljande fluorescens-baserade mätningar, eftersom endast klorofyll som innehåller proteiner visualiseras. Det bör noteras som för andra nedströms tillämpningar (t.ex., andra dimension identifiering av SDS-PAGE och protein), icke-tylakoida proteiner kommer att närvara. Det bör också noteras att den bästa upplösningen uppnås vid kloroplaster isoleras innan lösbarhet, förmodligen på grund av borttagning av olösligt material innan lösbarhet. När följande metoden beskrivs här, andra homogenisering metoder såsom en mixer kan användas, men ett glas Dounce Homogenisatorer är snabba och effektiva och tillåter alla homogeniserade blad material som behålls kvantitativt. Förhållandet mellan buffert-till-blad material verkar inte vara viktigt, att vår kunskap. Ca 2 mL buffert för en hälften av baby spenat blad är en bekväm utgångspunkt men kan justeras baserat på experimentella behov.

Lämpliga förhållandet lösbarhet buffert till klorofyll är avgörande för optimering av grön gel prestanda och bör bestämmas av försöksledaren för en given växtarter eller experiment. Ordentlig lösbarhet kommer att resultera i en klar, djup smaragdgröna supernatant ovanför en vit stärkelse pellet. Ett lager av grönt material ovanpå den vita pelleten visar att thylakoids har varit under-solubilized. Under-lösbarhet måste undvikas, eftersom det kommer att resultera i dålig migration på gel, inklusive smetar av banden, och kommer inte att ge ett korrekt banding mönster. Tylakoida pellets tillverkas av denna metod bör vara lätt att resuspendera och solubilize. Vid kompakt pellets som inte kan vara resuspended snabbt och homogeneously rekommenderas en alternativ metod. Prover kan först vara resuspended i halva volymen av TMK-glycerol buffert, som sedan läggs en extra halv-volym av TMK-glycerol buffert innehåller en 2 X koncentration av rengöringsmedel.

Överdriven lösbarhet bör också undvikas, eftersom det kan resultera i förlust av tätheten av några megacomplex band. Dessutom, det är inte möjligt att göra för över lösbarhet genom att läsa en större volym av provet på gelen - vi har funnit att fylla på mer än 15 μL av provet per brunn på en 1.5 mm gel minskar kvaliteten på separation; även om detta kan vara önskvärt för att visualisera komplex med låg överflöd. Omvänt, fylla på mindre än 15 μL kan förbättra bandet upplösning och minska smetning men kommer att reducera synbarheten av några låg densitet band. I allmänhet både ökad proteinkoncentration och ökad tvättmedel koncentration bidra till bandet distorsion och gel smetar.

För tid-korrelerade single photon counting (TCSPC) analys av de gröna gel komplex, skall excitation och utsläpp våglängder väljas av experimenter efter eget gottfinnande. För våra syften, valt excitation våglängden var 435 nm, vilket kommer att uppväcka både klorofyll a och klorofyll b. olika våglängder kan, emellertid, användas för att excitera specifika klorofyller eller andra pigment mer selektivt (t.ex. en magnetisering våglängd ca 465 nm kommer företrädesvis att excitera klorofyll b). Likaså en fluorescens emissionsspektrum som täcker ett område från 680 till 740 nm valdes baserat på rapporterade utsläpp spektra för LHCII, PSI och PSII. Därför omfattar denna region alla relevanta spektrala funktioner av intresse för våra syften. Våglängd intervallen där uppgifterna samlas in är också upp till bedömning av experimenter. Kortare intervall, t ex varje 5 nm i stället för varje 10 nm, gör det möjligt att konstruera en mer detaljerad förfall-associerade spektrum, men detta kräver mer tid och kan inte vara nödvändigt. Däremot kan längre intervall misslyckas med att lösa relevanta spektrala Detaljer.

Helt enkelt överliggande normaliserade fluorescens decay kurvor från olika komplex kan ge avslöjande information om dessa komplex. Fluorescens från LHCII, exempelvis är karakteristiskt långlivade, medan fluorescens från PSI sönderfaller mycket snabbare. Försiktighet iakttas vid denna tidpunkt att undersöka data mot funktionen instrument svar (IRF) för att säkerställa att den observerade decay kineticsen är temporally löst från svarstiden för instrumentet.

Att konstruera förfall-associerade spectra (DAS) från TCSPC data skapar en mycket mer detaljerad bild av energiöverföring mellan chromophores inom en komplex än vad som är möjligt från att helt enkelt titta på isolerade decay kurvor. När konstruera DAS, är svans matchning av TCSPC förfall kurvorna till steady-state fluorescens spektrumet nödvändig eftersom intensiteten av signal som samlas in av TCSPC är godtycklig. På lång tidpunkter såsom 5.000 ps, men är fluorescensintensiteten vid en viss våglängd (”tail” av förfall) samma som distansträning fluorescensintensiteten för det våglängden. Steady state fluorescens spektrumet kan därför användas för att normalisera alla de TCSPC sönderfaller så att deras svansar är likvärdiga med distansträning spektrumet. Detta ger sann relativa intensiteten av fluorescens signal för varje decay kurva. Hela serien av DAS, när överdrog tillsammans i vattenfall tomt stil, ger en grafisk skildring av förfalla av fluorescens spektrumet över tid. Om tomterna utförs till tillräckligt lång tidpunkter (att svansar av förfall kurvor) kommer vattenfall tomten förfalla ända till steady state fluorescens spektrum. Den tidigaste tidpunkten, däremot, bestäms av funktionen svar instrumentets TCSPC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Finansiering och stöd tillhandahölls av Institutionen för kemi vid Michigan State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycine Sigma G8898
Tris base Sigma #648310
SDS Sigma L3771
Decyl Maltoside Sigma D7658 n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside Sigma O8001
Acrylamide BioRad 161-0148 37.5/1 C 40% solution
TEMED BioRad 161-0800
Ammonium Persulfate BioRad 161-0700
Magnesium Chloride Sigma M2670
Potassium Chloride Sigma P9333

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamori, W. Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress. Journal of Plant Research. 129, (3), 379-395 (2016).
  2. Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions). Plant Physiology. 103, (1), 181-189 (1993).
  3. Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance. Journal of Biological Chemistry. 268, (34), 25476-25482 (1993).
  4. Dietze, lL., Bräutigam, K., Pfannschmidt, T. Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants. FEBS Journal. 275, (6), 1080-1088 (2008).
  5. Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. Regulation of light harvesting in green plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).
  6. Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).
  7. Williams, W. P. Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis. Nature. 225, (5239), 1214-1217 (1970).
  8. Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7. Nature. 433, (7028), 892-895 (2005).
  9. Shapiguzov, A., et al. The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, (10), 4782-4787 (2010).
  10. Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow. Public Library of Science Biology. 8, (1), (2010).
  11. Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 136, (1), 25-29 (1983).
  12. Minagawa, J. State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast. Biochimica et Biophysica Acta. 1807, (8), 897-905 (2011).
  13. Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage. Plant Physiology. 170, (4), 1903-1916 (2016).
  14. Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II. Biochemical Journal. 388, (Pt 1), 159-168 (2005).
  15. Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition. Trends in Plant Science. (2018).
  16. Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes. Plant Physiology. 78, (3), 606-613 (1985).
  17. Allen, K. D., Staehelin, L. A. Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system. Analytical Biochemistry. 194, (1), 214-222 (1991).
  18. Peter, G. F., Thornber, J. P. Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins. Journal of Biological Chemistry. 266, (25), 16745-16754 (1991).
  19. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
  20. Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants. Photosynthesis Research. 136, (1), 107-124 (2018).
  21. Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, (2), 207-214 (2011).
  22. Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, (5), 951-962 (2017).
  23. Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975, (3), 384-394 (1989).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics