Distinction fondée sur la morphologie entre sain et pathologique des cellules utilisant des transformations de Fourier et Self-Organizing Maps

* These authors contributed equally
Cancer Research
 

Summary

Ici, nous fournissons un workflow qui permet l’identification des cellules saines et pathologiques, basé sur leur forme en 3-dimensions. Les auteurs décrivent le processus d’utilisation des lignes de projection 2D basés sur les surfaces 3D pour former une carte Self-Organizing qui fournira l’objective de regroupement des populations cellulaires étudiés.

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Kriegel, F. L., Köhler, R., Bayat-Sarmadi, J., Bayerl, S., Hauser, A. E., Niesner, R., Luch, A., Cseresnyes, Z. Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps. J. Vis. Exp. (140), e58543, doi:10.3791/58543 (2018).

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Abstract

L’apparence et les mouvements des cellules immunitaires sont entraînés par leur environnement. En réaction à une invasion de pathogènes, les cellules immunitaires sont recrutés sur le site de l’inflammation et sont activées afin d’éviter une propagation de l’invasion. Cela se reflète également par des changements dans le comportement et l’aspect morphologique des cellules immunitaires. Dans les tissus cancéreux, des changements de morphokinetic similaires ont été observés dans le comportement des cellules microgliales : microglie intra-tumorale ont des formes moins complexes 3 dimensions, ayant des processus cellulaires moins ramifié et se déplacer plus rapidement que ceux en bonne santé tissus. L’examen de telles propriétés morphokinetic nécessite des techniques de microscopie 3D complexe, qui peuvent être extrêmement difficiles lors de l’exécution longitudinalement. Par conséquent, l’enregistrement d’une forme 3D statique d’une cellule est beaucoup plus simple, car cela ne nécessite pas de mesures intravitale et peut être réalisée sur des tissus excisés ainsi. Toutefois, il est essentiel de posséder des outils d’analyse qui permettent la description rapide et précise des formes 3D et permet la classification diagnostique d’échantillons de tissu sain et pathogènes basée uniquement sur des informations statiques, axés sur la forme. Nous présentons ici un outil qui analyse les composantes discrètes de la transformée de Fourier de l’esquisse d’un ensemble de projections 2D du 3D cell surfaces via Self-Organizing Maps. L’application des méthodes d’intelligence artificielle permet à notre infrastructure de se renseigner sur les diverses formes de cellule, telle qu’elle est appliquée à des échantillons de tissu de plus en plus, tandis que le flux de travail reste simple.

Introduction

Rapide, simple et précise de détermination de l’état pathologique des tissus biologiques est le plus haut intérêt dans la recherche biomédicale. Modèles murins fournissent les moyens d’étudier un éventail d’états pathologiques, tels que des réactions immunitaires ou le développement du cancer, en combinaison avec 3D complexes et des techniques de microscopie de 4D (3 dimensions spatiales et temps). Études en microscopie peuvent être effectué via intravitale ou tissus excisés 2 photons microscopie, microscopie à lumière-feuille et - à une profondeur de tissu limitée d’environ 100 µm-par microscopie confocale. Afin d’avoir des informations temporelles sur le comportement des cellules dans des conditions physiologiques ou pathologiques, il est nécessaire de surveiller le tissu pour une longue période de temps, ce qui nécessite généralement intravitale imagerie1,2 . Naturellement, l’applicabilité de cette technique est limitée à des modèles animaux en raison de son caractère invasif. Techniques non invasives sont également disponibles à des applications humaines, y compris une variété de méthodes de tomographie (MSOT, CT, etc.), mais toutes ces méthodes n’ont pas le nécessaire spatial - et souvent-résolution temporelle à étudier le comportement au niveau cellulaire.

Informations statiques concernant l’apparition de cellules soient accessibles plus facilement via 3D diverses techniques d’imagerie exécutée sur excisés des échantillons de tissus. Ici, le comportement cinétique des cellules n’est pas mesuré, donc il est nécessaire d’adopter des techniques d’analyse de roman qui sont en mesure de déterminer l’État pathogène des cellules examinées fondée uniquement sur leur morphologie3. Une telle approche a été utilisée pour lier les formes cellulaires et textures de tissus au comportement pathologique4,5,6.

Dans la nouvelle technique décrite ici, les cellules sont reconstruits en tant que surfaces 3D et leurs formes sont caractérisées par les projections de la 3D-à-2D et axée sur la transformée de Fourier successifs périphérie-forme analyse7,8. En réduisant les dimensions de 3 à 2, le problème est simplifié. Il est aussi possible de caractériser les surfaces de la cellule en 3D en appliquant l’analyse d’harmoniques sphériques, comme cela a été fait pour des images médicales9. Cependant, harmoniques sphériques ne gèrent pas les formes nettes et robustes bien, exigeant une grille multi-échelles pour être mis en place sur la sphère unité. En outre, le nombre de composantes harmoniques sphériques nécessaire peut être grand (50-70), avec les calculs sous-jacents très exigeant et les résultats difficiles à interpréter10,11,12.

Avec notre méthode nouvellement proposée, la tâche est réduit à une série de descriptions de forme 2D, où le nombre des projections 2D incombe à l’analyste et peut être ajusté selon la complexité de la forme 3D. Les projections sont générées automatiquement par un script Python qui s’exécute à l’intérieur d’un outil d’animation 3D. Les projections en 2D sont décrites par les composants de transform (DFT) de transformée de Fourier discrètes de leur périphérie, calculée par un plugin de13 de Fidji qui est fourni ici dans le cadre de notre progiciel. La DFT est appliqué ici afin de décomposer le complex contour de la cellule en une série de fonctions sin et cos. De cette façon, nous pouvons décrire le contour avec un relativement petit nombre de composants DFT, réduisant ainsi la complexité du problème (pour plus de détails voir section équations). Les composants DFT sont placés dans une carte de Self-Organizing formés (SOM14), où l’existence de la forme de grappes peuvent être objectivement testé8. SOMs offrent un outil d’apprentissage compétitif et sans surveillance sur le terrain de l’intelligence artificielle. Ils se composent d’un tableau lié de neurones artificiels qui communiquent entre eux via une fonction de distance pondérée de quartier. Le système neuronal répond au premier élément de l’ensemble de données d’entrée et les neurones dont la réponse est le plus fort sont « regroupés » plus près de l’autre. Que le système neuronal reçoit plus d’entrée, neurones de données qui répondent à plusieurs reprises fortement commencent à se former une grappe bien définie au sein du système. Après une formation adéquate sur un gros dataset qui contient des informations de forme 2D sous forme d’un ensemble de composants DFT, composants DFT de n’importe quelle cellule individuelle peuvent être mis dans le SOM formé et révèlent si la cellule probablement appartient aux bien-portants ou le groupe de cellules pathogènes. Nous attendons de ces outils pour devenir un excellent ajout aux méthodes de diagnostics cliniques et scientifiques.

Protocol

1. exigences du protocole

  1. Obtenir des données de haute résolution deconvolved en trois dimensions (3D) microscopie deconvolved en conformité avec le critère de Nyquist, avec un intervalle d’échantillonnage au moins deux fois la plus haute fréquence spatiale de l’échantillon pour obtenir une image de haute résolution.
  2. Utiliser un logiciel de rendu 3D pour la reconstruction de surfaces et d’exportation.
  3. Utiliser un logiciel d’animation 3D capable d’exécuter les scripts Python (le script Python peut être téléchargé depuis le dépôt github : https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis) pour créer des projections 2D.
  4. Fidji13 permet d’analyser les projections 2D et extraire les composants de la DFT.
    1. Utilisez la distribution actuelle des Fidji. S’il existe déjà une version installée de Fidji, assurez-vous que la version installée est la plus récente. Ceci peut être facilement réalisé en exécutant l' aide | Option de mise à jour .
    2. Utiliser le Contour actif plugin15, qui peut être téléchargé à partir http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start et doit être copié dans le dossier plugins.
    3. Télécharger le plugin d’ombre Fidji du dépôt github et copie dans le dossier plugins.
  5. Utiliser un logiciel de mathématiques computationnelles capable de calculer Self-Organizing Maps.

2. reconstruire l’Image 3D.

Remarque : Pour des fins de test, un ensemble de données exemple est fourni dans le dépôt github (voir ci-dessus).

  1. Lancez le logiciel de reconstruction 3D et ouvrir les données d’image 3D.
  2. Créer une Surface 3D des objets (tous).
    1. Sélectionnez l’option vue 3D et cliquez sur Surfaces. Cliquez sur le bouton Next (cercle bleu avec un triangle blanc) de procéder à l’Assistant de création de surface.
    2. Sélectionnez le canal de l’image pour la reconstruction de surface.
    3. Appliquer une fonction de lissage afin d’éviter les surfaces poreuses.
      1. Choisissez une valeur de lissage qui ne cache pas les détails de la surface, mais évite les surfaces poreuses.
    4. Sélectionnez une méthode de seuillage pour trouver les surfaces.
      1. Utiliser un seuil d’intensité absolue lorsque les objets sont bien séparées de l’arrière-plan et ont un niveau de luminosité sensiblement uniforme.
      2. Appliquer un seuil de contraste local lorsque les objets varient dans leur intensité mais peuvent encore être séparés du contexte local et les autres objets qui les entourent. Définir la zone de recherche locale seuil selon la valeur du diamètre attendue des objets reconstitués.
    5. Filtrer les surfaces reconstituées selon des paramètres morphologiques d’intérêt, par exemple, volume, sphéricité, rapport surface-volume, etc.et terminer la reconstruction de surface.
  3. Enregistrer et exporter les surfaces générées dans un format qui est compatible avec le logiciel d’animation 3D qui sera utilisé à l’étape suivante.

3. transformer la 3D reconstruit de surfaces en 2D projections

  1. Lancez Blender et allez dans l’onglet sortie dans la fenêtre de droite. Sélectionnez le format TIFF dans le menu déroulant et réglez la profondeur de couleur de 8 bits RGBA.
  2. Basculez en Mode script et ouvrez le fichier de script fourni « GUI_AutoRotate.py » du référentiel fourni avec ce travail (https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis).
  3. Cliquez sur exécuter le Script. Choisissez le dossier des fichiers wrl lorsque invité à intervenir.
  4. Si nécessaire, créer des rotations plus lorsque vous travaillez avec des surfaces plus complexes : allez dans le GUI et définissez la zone de Rotations à une valeur supérieure à 6.
    Remarque : Une rotation 6 angles différents peut être suffisante pour distinguer les différentes populations cellulaires. Il est déconseillé de créer moins de six rotations par surface, à cause de la perte potentielle d’informations.
  5. Exécutez le script en cliquant sur le bouton de rotation dans l’interface GUI. Sauver les projections des surfaces individuelles dans le même dossier qui a été utilisé comme dossier d’entrée (étape 2.3). Par défaut, les images sont enregistrées dans un 8 bits Tiff format (voir étape 2.1), qui est le format requis par le plugin Fidji ombre.

4. Trouvez la périphérie et calculer les composantes de la transformée de Fourier à l’aide de Fidji.

  1. Ouvrez des Fidji et sélectionner la teinte dans le menu Plugins. Commencez avec les valeurs par défaut et d’affiner les paramètres plus tard. Cliquez sur OK lorsque vous êtes prêt à exécuter le programme.
    1. Choisissez une valeur Seuil de Gradient pour le seuillage de l’image d’entrée.
    2. Choisissez le nombre d’itérations. Plus la valeur de Nombre d’itérations , la plus précise la reconstruction de la périphérie. Pour les formes plus simples, un nombre inférieur est généralement suffisant.
    3. Utilisez le paramètre Nombre de dilatations pour déterminer combien plus le masque de départ est comparé à la cellule réelle. Des formes plus complexes ont généralement besoin pas de dilatation plus conclusion appropriée de périphérie.
    4. Cochez la case de Fond sombre si les formes projetées sont plus lumineux que le fond.
    5. Activez la case à cocher Afficher le résultat intermédiaire uniquement lorsque vous utilisez un dataset petit test pour déterminer la performance d’ombre. Activer cette option pour les plus grands ensembles de données diminue l’efficacité computationnelle et pourrait éventuellement mettre fin à un système avec peu de mémoire vidéo.
    6. Cochez la case Sauvegarder les tableaux de résultat à exploiter les résultats de l’ombre comme une entrée pour l’étape 5. Si la case est cochée, tous les résultats sont sauvegardés dans des fichiers csv individuels. Un résumé de la sortie de données est toujours généré dans un fichier appelé « Result_collection_of_all_DFT_calculations.csv ».
  2. Sélectionnez le dossier de données d’entrée qui contient les fichiers TIFF créés à l’étape 3.
  3. Fournir le dossier de données de sortie.
  4. Cliquez sur OK pour démarrer le plugin.

5. Self-Organizing Maps

Remarque : Réseaux SOM ne sont en mesure de classer les données lorsqu’ils sont formés sur un gros dataset qui contient une entrée de tous les types de cellules attendus et les conditions. À des fins de démonstration, tel un groupe de données est fourni et vous trouverez dans notre dépôt (« AllCells_summary_normalised.csv » de https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis

  1. Suivre ces directives, s’il n’y a aucune SOM qualifié disponible encore pour les données d’entrée ; dans le cas contraire, passez à l’étape 5.2.
    1. Démarrer un logiciel mathématique informatique capable d’effectuer des classifications de réseau neuronal.
    2. Sélectionnez un fichier de données à utiliser pour la formation du réseau SOM. Cet ensemble de données doit contenir toutes les conditions expérimentales afin de former le SOM sur les types de cellules particulières et des conditions expérimentales.
      Remarque : Il est également possible d’utiliser le AllCells_summary_normalised.csv fourni pour tester le système.
    3. Commencer la formation et attendre jusqu'à ce que la formation est terminée avant de continuer. Par défaut, le script est défini à exécuter 2000 itérations (« époques »).
      Remarque : Le nombre d’itérations dépend du taux d’apprentissage du SOM. Selon les données d’entrée, il est conseillé de tester plusieurs fois supérieurs et inférieurs des époques et observer la stabilité de la structure du SOM. Lorsque vous utilisez le script fourni, le nombre d’itérations peut être modifié sous la ligne 32. La taille de réseau peut être changée en ligne 34 (par défaut qu'il est fixé à 12 par 12).
    4. Une fois la formation terminée, examinez la topologie du réseau (distances voisin, plans d’entrée, visites de l’échantillon, etc.). Le réseau est désormais formé et peut être sauvegardé pour une utilisation future.
  2. Charger dans le modèle SOM, lorsque vous utilisez une carte déjà formée (cela peut provenir soit d’étape 5.1, ou provenant d’autres sources) afin de regrouper un ensemble de données.
    1. Importez le fichier csv doit être testé avec préchargé som formés. Sélectionnez la sortie csv du Plugin ombre de l’étape 4 lors de l’utilisation des données établies par le plugin de l’ombre.
      Remarque : Il est également possible d’utiliser les fichiers de données d’exemple « InteractingCells_summary_normalised.csv », « MobileCells_summary_normalised.csv » ou « PhagocytosingCells_summary_normalised.csv » qui sont fournis via github.
    2. Une fois terminée la classification, évaluer les résultats de la SOM comme au point 5.1.5.
      1. Examiner le hitmap généré à partir du fichier csv. Chaque cellule de la carte indique combien de fois le dataset « hits » cette cellule particulière du SOM formés. Quand un groupe de cellules sont regroupées dans une petite zone de cette carte, cela indique que le dataset est assez homogène. Plusieurs clusters indiquera que les sous-groupes probables existent dans le dataset.
      2. Examiner les distances de poids du quartier. Zones de cette carte qui sont bien séparées correspondent à des groupes d’objets qui se comportent très différemment du point de vue de la SOM. Avec des composants DFT comme données d’entrée, cela signifie que ces groupes de cellules ont des formes très dissemblables, des surfaces 3D correspondants.
      3. Examiner les plans de poids pour plus d’informations sur la contribution de chaque élément du vecteur caractéristique. En cas d’utilisation les 20 éléments DFT comme décrit précédemment, 19 cartes apparaîtra ici. Lorsque vous utilisez le dataset de l’exemple fourni, les plans de poids de 5 ou 6 premiers sera différents, mais le reste d'entre eux sera assez identique. Dans ce cas, on peut conclure qu’il suffirait d’utiliser environ 7 composants DFT.

Representative Results

Nous avons appliqué un DFT pour calculer les principales composantes de la forme correspondant à des projections de la cellule. Les descripteurs de Fourier ont été obtenues en appliquant l’algorithme DFT sur les paires de coordonnées xy de la périphérie équipée des projections cellulaire, obtenue comme la sortie de la partie AbSnake de notre flux de travail. Ces paires de xycoordinate peuvent être gérés comme un vecteur 2D complexes « g » :
Equation 1

Du vecteur « g », les DFT nous permet de calculer le spectre de Fourier complexes :
Equation 2
Selon des formules bien connus le spectre de Fourier discrète, et en utilisant le nombre complexe étiquetage des « g » comme :
Equation 3
Nous obtenons :
Equation 4(1)
Nous pouvons calculer le réel (« A ») et imaginaires composants (« B ») de Equation 5 :
Equation 6(2)
Equation 7(3)
Ici, le premier DFT composante G0 correspond à m = 0, ce qui donne :
Equation 8(4)
Equation 9(5)
Par conséquent, ce composant décrit le centre géométrique de l’objet original.
Le deuxième élément du spectre avant DFT, G1, correspond à m = 1 :
Equation 10
Equation 11(6)

Nous concluons que ces points forment un cercle d’un rayon de Eq.6 Equation 12 et angle de départ Equation 13 , où le cercle décrit un tour complet, tandis que la forme est retracée en une fois. Le centre du cercle se trouve à l’origine (0, 0), le rayon est | G1| et le point de départ est :

Equation 14Equation 15(7)

En général, pour un seul coefficient de Fourier Equation 16 , les coordonnées sont décrites comme :

Equation 17
Equation 18(8)

De même à Eq.6, Eq.8 a aussi décrit un cercle, mais avec un rayon de Rm= | Gm|, un angle de départ Equation 19 et un point de départ à Equation 20 , où le contour est tracé une fois tandis que le cercle passe par « m » orbites complet16,17.

Paramètres de forme comme entrée SOM
Le flux de travail, tel que décrit dans la Figure 1, a été appliqué un deconvolved (en utilisant une fonction de propagation Point mesuré) la microscopie intravitale multiphotonique dataset des microglies pour caractériser leurs changements morphologiques dans saines ou cancéreuses corticales 18de tissu. Composants DFT vingt ont été calculés pour chaque projection 2D des surfaces 3D reconstituées et les résultats ont été utilisés comme entrée pour la formation de SOM. Dans des conditions physiologiques, les cellules microgliales présente une forme assez complexe avec de multiples, fortement ramifié processus (Figure 2 a). Lorsqu’il est placé dans un environnement cancéreux (tumeur corticale modèle), les cellules microgliales changé sous une forme plus simple, plus semblable à broche (Figure 2 b).

Le SOM formé a été testé afin d’évaluer sa capacité à distinguer des cellules saines et cancéreuses. La population de cellules saines était projetée sur un unique à la surface de la SOM (Figure 2c). Le SOM a répondu au dataset microglie cancéreux avec une région active en forme d’haltère (Figure 2d). Un ensemble de données d’entrée aveuglément mixte qui se composait de DFT forme éléments de bien-portants et le groupe cancéreux a été projeté par le SOM en deux groupes distincts, tout en gardant la forme de leurs contours individuels semblables à ceux des groupes séparés ( Figure 2e; comparer avec 2C et 2d). On peut donc conclure que le groupe de données mixte a été avec succès groupé par SOM.

Nous avons testé les performances de la SOM en comparant ses projections à l’analyse manuelle des mêmes données par un expert médical, qui a classé le groupe de données basé sur leur comportement spatio-temporel. L’expert a identifié quatre groupes distincts de cellules (cellules au repos, phagocytants cellules, cellules qui interagissent et cellules mobiles18), ont été reconstruits et utilisés pour former un 12 x 12 som Le réseau formé (Figure 3 a) affiche les groupes de hautes valeur hit de neurones artificiels, en particulier dans le coin inférieur gauche et les zones de milieu du SOM. La réponse du réseau formé a également été testée avec quatre sous-ensembles choisis au hasard (qui ne faisaient pas partie de l’objet dataset formation) des images provenant des quatre groupes différents identifiés par les experts18. Ces sous-ensembles image a entraîné quatre réponses bien définies par le modèle SOM, comme illustré à la Figure 3 b. Les cellules au repos présentent la forme plus complexe et a montré le plus haut niveau de séparation au sein du réseau neuronal (Figure 3 b « au repos » panneau). Les trois autres types de cellules identifiées partagent un espace commun de la SOM dans le coin inférieur gauche, mais étaient autrement séparés par SOM. Le coin inférieur gauche zone SOM correspond donc à des valeurs DFT indice inférieur.

La robustesse de l’approche SOM a été testée en utilisant le modèle SOM formé avec trois sous-ensembles aléatoires de la même chose - se reposer - type (qui ne fait pas partie de l’ensemble de données de formation) de cellule. La réponse de la SOM à cette entrée présente une réponse très similaire (Figure 3C, sous-ensembles 1-3), ce qui démontre la solidité de notre approche.

Les changements de forme cellulaire dépendant du temps se caractérisent précisément par DFT
Afin d’examiner l’effet des changements temporels de la forme des cellules sur les composantes de la DFT, cellules d’une à trois par sous-groupe (voir la Figure 3 b) ont été suivis pendant 13 à 28 points dans le temps. La figure 4 montre la DFT dix premiers composants d’une cellule mobile (Figure 4 a) et une interaction cellulaire (Figure 4 b), qui ont été tracées en fonction du temps. La cellule mobile a une forme en permanence modifiée (voir vidéo supplémentaire 4 à 8), qui se traduite par une surface plus rugueuse de la DFT. Les éclats de l’amplitude DFT dans le premier tiers de l’évolution temporelle de l’interaction cellule coïncident avec les changements de forme cellulaire rapide et vaste comme sur la vidéo supplémentaire 5 à 8.

L’évolution temporelle de tous les composants DFT 19 a aussi été caractérisée pour ces deux cellules à trois moments distincts durant le suivi d’une cellule mobile (Figure 5 a) et d’une interaction cellule (Figure 5 b). Les axes perpendiculaires sont par les présentes les angles de six rotation et indiquent que toutes les projections sont tout aussi importantes pour la caractérisation de la forme pour les deux types de cellules.

Figure 1
Figure 1. Étape par étape, flux de travail de l’informatique pour identifier la cellule clustering basé sur la forme des cellules. Surfaces reconstituées en 3D ont été utilisées comme entrées dans Blender pour les projections 3D-à-2D automatisées. La périphérie de chaque projection a été localisée et les composants DFT ont été calculés. Les composants servi comme entrée à un SOM formé dans Matlab, ou de former un nouveau som S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. L’aspect typique des cellules de la microglie corticale souris dans des conditions de contrôle (a) et dans les tissus cancéreux (b) captures d’écran des surfaces des microglies reconstituées. Les projections de SOM furent créées à partir de trois groupes d’échantillons de cellules microgliales du cortex de souris : contrôler les cellules (non tumorales) (c) (d) des cellules tumorales et une population mixte de cellules (e). Ce chiffre a été modifié avec la permission de8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. (a, gauche) Auto-organisation de carte d’un dataset de microglie souris constituée des 768 fonction saisie des vecteurs. Le groupe de données a été utilisé pour former un réseau de neurones artificiel 12 x 12, à l’aide de la géométrie de quartier hexagonal, initialisation aléatoire et époques de 2000. (un, droit) Le SOM correspondant d’entrée avions des 10 premiers composants DFT (b) les réponses de la SOM représenté à l’alinéa a, à un VRML fichier sous-ensemble aléatoire chacun des types de quatre cellule « mobile », « interaction », « au repos » et « phagocytaires » comme décrit dans première Figure 5 de Bayerl et al. 18. réponse (c) le de la SOM même comme dans (a, gauche) à trois sous-ensembles aléatoires du jeu de données entier (qui ne faisaient donc pas partie du dataset formation) des cellules « au repos »-tapez les surfaces 3D. La similitude entre les trois réponses est remarquable. Ce chiffre a été modifié avec la permission de8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. (a) dépendance du temps des 10 premiers composants DFT pendant une expérience d’imagerie intravitale des microglies souris. Ce panneau montre les données pour une cellule de type « Mobile des cellules ». L’axe des abscisses correspondant à points dans le temps de l’expérience à 60 s temps de résolution, l’axe des y indique l’amplitude des composantes DFT en unités arbitraires (UA), alors que l’axe z correspondant à la composante DFT de 1 à 10. (b) comme dans (un) mais pour une cellule des « Cellules interagissent » tapez. Ce chiffre a été modifié avec la permission de8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5. (a) le comportement de tous les composants DFT 19 d’une cellule de type « Mobile des cellules » au début, au milieu et à la fin de l’expérience. Les nombres sur l’axe des abscisses correspondent à l’ID du composant DFT de 1 à 19. L’axe des y indique l’amplitude de composante DFT en unités arbitraires (UA), tandis que le z-axe marque les six angles de rotation aléatoire. (b) identique à (un) mais pour une cellule des « Cellules interagissent » tapez. Ce chiffre a été modifié avec la permission de8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

L’identification des conditions potentiellement pathologiques à l’aide d’échantillons de tissus intacts, petit est très important. Ces techniques vont assure une réponse rapide à des maladies infectieuses et agressifs types de cancer. Les réactions cinétiques et morphologiques de diverses cellules immunitaires, par exemple, la microglie et macrophages, sont caractéristiques de la réponse immunitaire du corps. Bien que dans la plupart des cas, il n’est pas pratique ni même possible de surveiller le comportement cinétique de ces cellules, il est relativement simple d’acquérir des images 3-d pour récupérer leur forme. En règle générale, les cellules immunitaires assument une forme complexe dans les tissus sains et une forme beaucoup plus simple sous conditions enflammée ou cancéreuses18. Alors que les caractéristiques dépendant du temps d’un tel changement de forme ajouterait à notre compréhension du développement de la réponse immunitaire, en utilisant uniquement la forme 3D d’un groupe représentatif de cellules peut également être suffisante pour déterminer le caractère sain ou pathologique du tissu.

Caractériser la surface 3-dimensions de la cellule n’est pas une tâche simple. L’application d’harmoniques sphériques est une façon de représenter une surface 3D avec un nombre relativement important (50-70) de composants11,12. En outre, déterminer les harmoniques sphériques est coûteuse ; la projection de formes très complexes sur la sphère unité est impossible ou très difficile en raison de la nécessité d’appliquer plusieurs grilles de finesse divers sur la sphère unité ; Enfin, la véritable interprétation des spectres des composantes harmoniques sphériques est loin d’être négligeable.

Dans notre travail présenté ici, nous remplaçons la difficile tâche d’analyse de surface 3D directe avec l’approche plus simple d’utiliser les projections 2D de la surface originale d’obtenir suffisamment d’information morphologique pour identifier les conditions pathologiques. Nous avons démontré tout au long de ce flux de travail en utilisant des données de la microscopie 3D de cellules myéloïdes, tout en soulignant clairement que toutes les mesures étaient simples à remplir, et les cartes 2 dimensions résultantes étaient faciles à interpréter.

Naturellement, une projection 3D-à-2D entraînera la perte d’informations sur la structure de la surface. Dans notre exemple dataset des microglies dans un modèle de tumeur corticale de la souris, il suffisait d’utiliser six angles lors de la création des projections en 2D. Toutefois, les changements morphologiques moins importants ou des formes plus complexes peuvent nécessiter qu’un plus grand nombre de projections est créé afin de pouvoir identifier de façon fiable sous-groupes de cellules avec SOM. Pour cette raison, notre approche est conçue pour pouvoir générer et analyser n’importe quel nombre de projections. Tout simplement en choisissant un plus grand nombre de projections pour des formes plus complexes, il est possible à l’échelle de la perte d’informations à un minimum acceptable. À titre d’exemple, le type de cellule qui interagissent dans la Figure 4 a et 4 b exigerait un plus grand nombre de projections afin de représenter la surface complexe correctement.

Comme toute méthode approximative, le flux de travail proposé par les présentes devait être évalués par comparaison des résultats d’un processus manuel de classification des microglies18. Les résultats présentés plus tôt confirment la fiabilité du flux de travail automatisé. En outre, le flux de travail est plus efficace de temps par rapport à l’analyse conventionnelle. L’expert médical qui a classé les cellules de la microglie manuellement nécessaire environ 4 semaines pour son analyse de l’ensemble de données, tandis que notre flux de travail nécessaires seulement environ 1 jour. La robustesse de notre approche a été clairement prouvée par la reproductibilité de la SOM formé à un sous-ensemble des données qui appartiennent au même type de cellule, mais ne servait pas à former le SOM, comme le montre la Figure3C.

Bien que notre approche n’a pas examiné les informations cinétiques, nous avons examiné l’effet de "timing" sur l’analyse de la forme de base DFT. L’exemple le plus typique pour un comportement dépendant du temps a été trouvé parmi la population de cellules mobiles, où la contribution des composants DFT indexées plus élevés a été clairement observable, comme dans la Figure 4 a. Cela attire l’attention sur l’importance d’utiliser un nombre assez élevé de composants DFT lorsqu’il s’agit des types de cellules qui sont susceptibles de se comporter d’une manière très dépendantes du temps. En raison de la nature automatisée et la vitesse d’exécution élevée de nos outils logiciels, l’augmentation du nombre de composantes DFT et projections augmentera la précision et la fiabilité des résultats, alors qu’ils n’entravera pas sensiblement les performances de calcul.

Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Benjamin Krause pour le débat fructueux et son soutien. Les auteurs de plus remercient Robert Günther pour son aide avec la microscopie des cellules vivantes.

Le travaux ont été subventionnés par le soutien financier de DFG NI1167/3-1 (JIMI) à R.N. et Z.C., DFG financier soutien CRC 1278 PolyTarget projet Z01 Z.C., C01 dans TRR130 R.N. et SFB633, TRR130, Exc257 à A.E.H. et J.B.S. Le BfR a soutenu intra-muros SFP1322-642 F.L.K et A.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Imaris 9.1.2, software Bitplane, Zürich, Switzerland v.9.1.2 3D image reconstruction and surface generation; this was used by us!
Blender 2.75a, software https://www.blender.org/ v.2.75a 3D and 4D open source animation software; 2.75a is the required version for this Python
Fiji /ImageJ, software https://fiji.sc/ ImageJ v.1.52b Open source multi-D image analysis toolkit
MATLAB MathWorks, www.mathworks.com R2017b General computational mathematical software
MATLAB Machine Learning kit MathWorks, www.mathworks.com R2017b Can only be used together with MATLAB
Fiji plugins: SHADE https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis v.1.0
Fiji plugins: ActiveContour http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?
id=plugin:segmentation:active_contour:start
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References

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