셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

Biochemistry

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Summary

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

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Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. J. Vis. Exp. (142), e58582, doi:10.3791/58582 (2018).

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Abstract

생물 학적 과정의 다양 한 일반적으로 인접 셀 간의 인터페이스에 상호 작용 하는 단백질에 의해 중재-세포 상호 작용을 포함 한다. 관심,만 몇 가지 분석의 특히 살아있는 세포에 직접 그런 상호 작용 할 수 있다. 여기, 선물이 표현-셀 연락처에 이웃 세포의 표면에 단백질의 바인딩을 측정 하는 시험. 이 분석 결과 두 단계로 구성 됩니다: confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 셀 연락처에서 형광 변동 분광학 측정 뒤에 다른 형광 단백질을 융합 하는 관심사의 단백질을 표현 하는 셀의 혼합. 우리 셀 접속점에 걸쳐 녹말 체 선구자 같은 단백질 1 (APLP1)의 상호 작용을 측정 하 여 생물학으로 관련 된 맥락에서이 분석 결과의 타당성을 보여줍니다. 우리는 형광 기반 기술 (형광 교차 상관 분광학, 교차 상관 번호와 밝기 분석 검사)를 사용 하 여 필요한 악기 교정 데이터 수집에 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 또한, 우리는 데이터 분석 및 식별 하 고 외부, 스 퓨 리 어스 신호 변이 때문에 photobleaching 또는 셀 운동 등을 수정 하는 방법에 중요 한 단계를 논의.

일반적으로 제시 분석 결과 호모-또는 같은 또는 다른 종류의 셀 사이의 셀 연락처에서 heterotypic 단백질-단백질 상호 작용에 적용 하 고 상업 confocal 레이저 스캐닝 현미경에 구현 될 수 있습니다. 중요 한 요구 사항은 몇 분 동안 관심사의 단백질의 방산 역학 조사 하기에 충분 해야 하는 시스템의 안정성 이다.

Introduction

많은 생물학 과정 세포 세포 상호 작용, 예를 들어, 셀 접착1,2,3, 셀 셀 퓨전4 및 세포 인식5사이트에서 발생합니다. 이러한 이벤트는 특히 중요 한 다세포 생물의 세포-세포 커뮤니케이션, 예를 들어, 면역 반응 동안에 대 한 개발 중입니다. 이 프로세스는 일반적으로 즉, 이웃 세포의 원형질 막 (오후)에 표면에 지역화 되 고 규제에서 공간과 시간을 정확 하 게 세포 세포 접촉에서 특정 상호 작용을 받을 단백질에 의해 중재 됩니다. 대부분의 경우에서 이러한 상호 작용 직접 호모-또는 heterotypic 단백질-단백질 트랜스 상호 작용, 하지만 또한 이온 또는 extracellular 링커1로 작동 하는 ligands를 포함 될 수 있습니다. 비록 기본적인 중요성의, 살아있는 세포의 기본 환경에서 직접 이러한 특정 단백질-단백질 상호 작용을 조사 하는 분석 실험의 부족이 이다. 많은 방법 중 필요 셀 중단 (예, 생 화 확 적인 분석 실험 공동 immunoprecipitation6등), 고정 (예를 들어, 일부 최고 해결책 광학 현미경 검사 법 기술과 세포-세포의 전자 현미경의 7연락처), 또는 일반적인, 예를 들어, 집계 / 접착 분석 실험8,9. 이 문제를 해결 하려면 형광 기법 형광 공명 에너지 전달 (무서 워)10 또는 형광 보완성11기반으로 구현 되었습니다. 그러나, fluorophores 사이 충분히 작은 거리를 위해 이러한 메서드는 단백질10, 트랜스 상호 작용을 잠재적으로 방해의 extracellular 측에 형광 라벨 필요 합니다.

여기, 우리 셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용에 대 한 대체 형광 기반 분석 결과 제시. 이 방법은 결합 형광 크로스-상관 관계 접근 (검색 형광 교차 상관 분광학 (sFCCS), 교차 상관 번호와 밝기 (ccN & B))의 단백질의 융합 개념을 표현 하는 셀의 혼합 관심, 예를 들어, 접착 수용 체. 두 개의 상호 작용 세포에 조사 수용 체는 세포내에서 2 개의 괴기 하 게 분리 된 형광 성 단백질 (FPs), 표시 됩니다 ( 그림 1A참조) 사이드.

고용된 방법 confocal 레이저 스캐닝 현미경의 초점 볼륨을 통해 형광 성 융해 단백질의 방산 움직임에 의해 유도 된 형광 변동에 대 한 통계 분석을 기반으로 합니다. 더 자세히 분석 결과 프로브 셀 연락처에서 두 이웃 PMs에 관심사의 단백질의 공동 보급 합니다. 단백질 트랜스 상호 작용을 받을 경우이 트랜스 단지 두 스펙트럼 채널에 방출, 두에 미터의 상관된 형광 변화를 일으키는 형광 단백질을 수행 한다. 다른 한편으로, 아무 바인딩 경우 PMs를 직면 하 고 있는 단백질의 번호 변동 독립, 아무 상관된 변동 원인이 될 것입니다. 인수는 두 가지 방법으로 수행할 수 있습니다: 1) sFCCS-셀 접촉에서 선 모양의 검사에 근거 하 고 효과적으로 접촉 지역에 위치한 자리에 상호 작용을 조사. 형광 변화의 시간적 분석을 통해 sFCCS 또한 역학 정보를 제공 한다 즉, 단백질 복합물;의 확산 계수를 2) ccN & B 세포 세포 접촉 지역에서 취득 하는 이미지의 시퀀스에 대 한 pixel-wise 분석 기반으로 합니다. 프로브 하는 기능이 고 전체 따라 지도 상호 작용 영역 (하나의 초점 비행기), 문의 하지만 역학에 정보를 제공 하지 않습니다. 두 가지 방법, 즉, 평균 형광 신호 시간 단위에 단일 확산 단백질 복합물에 의해 방출 하 고, 따라서,에서 단백질 복합물의 산출할의 견적을 제공 분자 밝기의 분석 결합 될 수 있다 셀 연락처입니다.

이 문서에서 우리는 상업 confocal 레이저 스캐닝 현미경에 제시 분석 결과 수행 하기 위해 샘플 준비, 계측기 교정, 데이터 수집 및 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 모든 악기와 광자 계산 또는 아날로그 탐지기 높은 숫자 조리개와 목표에 실험을 수행할 수 있습니다. 우리 또한 프로토콜의 중요 한 단계를 토론 하 고 artefactual 신호 변동, 예를 들면, 감지기 소음, photobleaching 또는 셀 운동 발생 하는 여러 프로세스에 대 한 수정 계획을 제공 합니다. 원래 부착 세포 간의 상호 작용을 개발, 분석 결과 현 탁 액 셀을 수정할 수 있습니다 또는 적응 모델 멤브레인 시스템, 예를 들면, 거 대 한 unilamellar 소포 (GUVs) 또는 거 대 한 플라즈마 막 소포 (GPMVs), 수는 상호 작용 다른 지질 환경에서 또는 조직된 골격12,13의 부재에서 부 량이 고

형광 교차 상관 분광학 검색 형광 교차 상관 분광학14 의 수정된 된 버전 이며, 지질 막15의 느린 방산 역학 조사 하도록 특별히 설계 되었습니다. 그것은 관심의 형광 단백질을 포함 하는 오후에 수직 라인 스캔 수집을 기반으로 합니다. 2 개의 다르게 분류 단백질의 상호 작용을, 인수 spectrally 분리 fluorophores에 대 한 두 개의 레이저 라인 및 2 개의 검색 창을 사용 하 여의 스펙트럼 채널 두 개에서 수행 됩니다. 때문에 오후에 있는 단백질의 느린 유포 역학 (D≤ ~ 1 µ m2/s), 크로스 토크 무료 측정15라인을 라인에서 흥분 체계를 대체 하 여 수행할 수 있습니다. 로 시작 하는 분석: block-wise ~ 1000 라인, 2) 위치와 함께 최대 형광 신호즉, 오후, 각 블록에 위치 결정의 평균 3) 변화에 따라 측면 셀 운동 1) 정렬 알고리즘 수정 일반적인 기원12,15, 각 채널에 별도로 모든 블록의 다음, 오후에 해당 하는 픽셀의 자동 선택 모든 정렬된 라인 (즉, 센터 ± 2.5σ)의 합계의 가우스 적합에서 중앙 영역을 선택 하 여 수행 됩니다. 각 줄에 신호의 통합 수익률 막 형광 시계열 f (t) 각 채널에 (g = 녹색 채널, r = 빨강 채널). 픽셀 크기가 작은 만큼, 예를 들어, 수는 < 200 nm, 포인트의 형태를 재구성 하 기능을 확산 하 고에 해당 하는 오후의 위치는 센터. 상당한 photobleaching 존재 각 채널에서 형광 시계열 수 두 배 지 수 함수 모델링 있으며 다음 다음 수식을 사용 하 여 수정:16

Equation 1.    (1)

이 수식은 효과적으로 진폭 및 확산 시간 f (t)c, f (t)교정된 얻어질 것 이다 매개 변수 추정에 비해의 상관 관계 분석에서 얻은 수정 주의에 중요 하다. 다음, 자동 및 교차 상관 기능 (ACFs / CCFs) 형광의 신호 계산 됩니다:

Equation 2(2)

Equation 3(3)

여기서 δF Fi(t)-= Image 1 Fi(t)Image 2 g, r=.

2 차원 확산 모델은 다음 모든 상관 관계 기능 (CFs)에 장착 되어:

Equation 4.   (4)

여기, N 각 채널에 대 한 확산 시간 관찰 볼륨과 τd 에 형광 단백질의 수를 나타냅니다. 이 모델 고려는 설명된 실험 설정에서 x-z 평면에서 발생 하는 오후에 있는 단백질의 유포 형광 상관 관계의 일반적으로 사용 되는 구성 달리 분광학 (FCS) 실험 조사 하는 세포 막에 confocal 볼륨17의 x y 평면에서 보급. 허리 w0 와 구조 인자 S, 설명 하는 신장 z, S에에서 초점 볼륨의 wz = wz/w0, 괴기 하 게 비슷한 염료와 같은 광학 설정 포인트 FCS 교정 측정에서 얻을 수 있습니다 이미 사용 가능한 값을 사용 하 여 확산 계수에 대 한 D염료:

Equation 5(5)

τd, 염료는 피팅 데이터를 3 차원 확산에 대 한 모델에서 얻은 염료 분자의 측정 된 평균 보급 시간에 분수 모든 N 분자의 T 의 계정 전환으로 복용 한 시간 상수와 triplet 상태 ττ:

Equation 6.   (6)

마지막으로, 확산 계수 (D), 분자 명도 값 (ε) 및 sFCCS 데이터 (rel.cc.)의 상대 교차 상관은 다음과 같이 계산 됩니다.

Equation 7(7)

Equation 8(8)

Equation 9(9)

어디 간 상관 함수의 진폭은 G크로스(0)와 Equation 14 i-번째 채널의 자기 상관 함수의 진폭은 이다.

이 정의 상대 교차 상관, 최대 수식 9에 의미 를 대신 사용 하 여 고려는 단지 두 개의 단백질 종의 다양 한 농도의 최대 수에 의해 제한 됩니다는 낮은 번호에 종입니다.

교차 상관 수와 밝기 기반 샘플에서 고정된 위치에서 시간이 지남에 인수는 이미지 스택의 각 픽셀에 대 한 형광 강도의 순간 분석 일반적으로 100 ~ 200의 구성 된 프레임, 2 개의 스펙트럼 채널 ( g = 그린 채널, r = 빨강 채널). 시간적 의미에서 Image 1Image 2 및 분산 Equation 16 , 분자 밝기 εi 및 숫자 n 각 픽셀에 스펙트럼 채널 계산 됩니다 ( = g, r)18:

Equation 10(10)

Equation 11. (11)

그것은 진정한 광자 계수 검출기의 이상적인 경우에는 주어진된 방정식 적용 해야 합니다. 아날로그 탐지 시스템에 대 한 다음 방정식19,20적용:

Equation 12(12)

Equation 13.   (13)

여기, S는 감지 된 광자와 기록된 디지털 카운트 사이의 변환 계수 Equation 24 판독 소음 및 오프셋 검출기 강도 오프셋을 나타냅니다. 일반적으로, 이러한 수량 해야 될 보정, 꾸준한 조명19, 예를 들어, 반사 금속 표면 또는 말린된 염료 솔루션에 대 한 강도의 기능으로 측정 하는 검출기 편차에 따라 모든 검출기 종류에 대 한. 오프셋 은 여기 빛 없이 샘플 카운트 속도 측정 하 여 확인할 수 있습니다. 검출기 관련 분산의 선형 회귀를 수행 하 여 Equation 25 () 강도 플롯, S 대와 Equation 24 결정된19일 수 있다:

Equation 14.   (14)

마지막으로, 교차 상관 밝기 각 픽셀에 계산 되 고21 으로 일반적 정의

Equation 15(15)

어디 Equation 29 크로스-분산은 Equation 30 .

수명이 긴 동요를 필터링 하기 위해 모든 ccN & B 계산 수행 됩니다 다음 필터링 하지, 독립적으로 각 픽셀22기차. 간단히, ni, ε ( = g, r)와 Bcc 슬라이딩의 예를 들어, 세그먼트 8-15 프레임에서 계산 됩니다. 이렇게 얻어진 값은 다음 값을 가져올 최종 픽셀 수와 밝기 평균 수 있습니다.

산출할 분석
셀 연락처에서 단백질 복합물의 산출할을 추정 하기 위해서는 분자 밝기는 sFCCS 또는 ccN & B 데이터에 대 한 각 스펙트럼 채널에 별도로 분석할 수 있습니다. SFCCS에서 한 명도 값 측정 각 채널에서 당 얻은 것입니다. CcN & B, 셀 연락처에 해당 하는 모든 픽셀의 밝기 히스토그램 취득 하 고 평균 (또는 평균) 값 측정을 위한 대표적인 밝기로 사용할 수 있습니다. 단위체 참조에 동일한 분석을 수행 하 여 모든 명도 값 감지 단백질 복합물의 평균 oligomeric 상태를 직접 정규화 될 수 있습니다. 이 시점에서, 그것은 oligomeric 상태의 과소에 발생할 수 있는 비 형광 FPs의 존재에 대 한 수정 하는 것이 중요. 이는 호모 dimeric 참조 단백질23,24 한 색상 sFCS 또는 번호를 사용 하 여 밝기와 밝기 (N & B)를 측정 하 여 일반적으로 수행 됩니다.

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Protocol

1. 시료 준비:-셀 혼합 분석 결과

참고: 다음 프로토콜 부착 셀 혼합 절차를 설명합니다. 그것은에 경작 하는 셀에 대 한 수정할 수 있습니다.

  1. 6 잘 플레이트, 예를 들어, 800000 HEK 293T 세포 (Neubauer 챔버 계산으로 계산), transfection 전에 하루에 셀의를 적절 한 수 씨 수 시드 및 transfection 사이의 시간에 따라 수정 하 고 다른 셀 형식에 대 한 조정 수 있습니다. 기본적인 실험 (즉, 관심과 부정적인 컨트롤의 단백질)을 수행 하려면 적어도 4 우물을 준비 합니다. 37 ° c, 5% CO2 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 매체에 문화 세포 보충 소 태아 혈 청 (10%)와 L-글루타민 (1%).
  2. 제조업체의 지침에 따라 셀 transfect ( 재료의 표참조).
    1. 기본 실험을 수행 하려면 transfect, 플라스 미드는 '그린' (예를 들면, 단위체 향상 된 녹색 형광 단백질 (mEGFP), 또는 노란 형광 성 단백질 (mEYFP))에 '레드' (예를 들어, mCherry, 융합 하는 관심사의 단백질에 대 한 별도 스 또는 mCardinal) 형광 단백질.
      참고:이 프로토콜에서 우리 APLP1 mEYFP 및 APLP1 mCardinal12, 그리고 해당 부정적인 제어, 예를 들어, myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-팜-mEYFP)-mCardinal (myr-팜-mCardinal)12에 집중 한다. 일반적으로, 200 ng-플라스 미드 DNA의 1 µ g 충분 하다. 높은 transfection 효율 증가 접촉에서 '빨간색'과 '녹색' 셀을 찾을 수 있는 기회. Transfection 효율을 최적화 하기 위해 플라스 미드 및 transfection 시 약의 양을 수정 합니다. 중요 한: 셀 confluency 이어야 한다 약 70%는 셀 transfecting 때. 셀-합칠 경우 transfection 효율 감소 합니다. 셀 confluent 충분히 있다면, transfection 혼합 수 있습니다 스트레스를 유발 하 고 혼합 후 적절 한 첨부 파일에서 많은 세포를 방지.
  3. 세포 transfection 후 ~4 ± 2 h 혼합을 수행 합니다.
    1. 성장 매체를 제거 하 고 각각 1 mL PBS Mg2 + 그리고 캘리포니아2 +보충 부드럽게 잘 씻어. 그런 다음, PBS를 제거 합니다. (중요) 세척 하는 동안 세포의 분리를 방지 하기 위해 잘 가장자리에 PBS를 드롭.
    2. Drop-wise 셀의 분리를 촉진 하기 위하여 각 잘 ~ 50 µ L 트립 신 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션 추가. 나중에 2 분 동안 37 ° C에서 품 어, 6 잘 플레이트 세포를 분리 하는 것을 옆으로 천천히 흔들.
      참고: 확장 된 보육 시간 셀 형식에 대 한 필요할 수 있습니다.
    3. 각 우물에 성장 매체의 950 µ L을 추가 하 고 몇 번 왔다 갔다, 잘 아래에서 모든 셀을 분리 함으로써 pipetting으로 셀을 resuspend. (중요) 셀은 제대로 resuspended 하 고 물의 resuspension 후 큰 셀 집계의 부재에 대 한 시각적으로 확인 하 여 서로에서 분리 확인 하십시오. 그렇지 않으면 혼합 후 많은 '빨간색'-'빨간색' 또는 '녹색'-'녹색' 연락처를 얻을 것 이다.
    4. 해당 음, 즉, '레드' (예를 들어, APLP1-mCardinal 페) 하는 '그린' (예를 들어, APLP1-mEYFP 페) 한 음 (관심이 나 부정적인 컨트롤의 단백질)의 셀 솔루션 전송 셀. 부드럽게 위아래로 몇 번 pipetting으로 혼합. 다음, 씨앗이 35 m m 유리 하단 요리 접시, 당 혼합된 셀 솔루션 (1 mL) 플러스 성장 매체의 1 mL와 문화 혼합된 셀 37 ° C, 5% CO2에서 또 다른 하루에 대 한 셀 시드.

Figure 1
그림 1 . 실험 워크플로우 및 형광 교차 상관 분광학 및 교차 상관 수와 밝기 분석 셀 연락처에서 검색의 도식 대표. 샘플 준비의 (A) 구조: 2 개의 괴기 하 게 고유한 형광 단백질 (예를 들어, mEYFP 및 mCardinal) 융합 (예를 들어, APLP1)의 단백질으로 페 두 셀 인구 transfection 후 혼합. 연락처 다르게 transfected 세포의 현미경 실험에서 선택 됩니다. Extracellular 바인딩 도메인 간섭을 유발 하지 않도록, 관심사의 단백질의 세포내 종착역에 형광 단백질을 융합 한다. (B) 스캔 FCCS (sFCCS) 측정 셀 연락처 두 스펙트럼 채널 (채널 1, 녹색 및 채널 2, 빨간색)에 수직으로 수행된 됩니다. 스캔 라인 (kymographs로 표시)는 정렬 하 고 표현 하는 막 픽셀. 그런 다음 ACFs 및 CCFs 강도 흔적 Fi(t)에서 계산 됩니다. ACFs는 빨간색과 녹색으로 표시 됩니다. CCF는 파란색으로 표시 됩니다. (C) 교차 상관 N & B (ccN & B) 인수는 3 차원 (x-y-시간) 이미지 스택 발생합니다. 한 투자 수익-셀 연락처 주위 선택 됩니다. 그때 채널 및 교차 상관 밝기 (ε1, ε2및 B참조) 값은 각 셀 연락처 픽셀에 계산 됩니다. 결과 다음 히스토그램, 모든 선택 된 픽셀을 풀링으로 시각화 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

2. 시료 준비: 간 상관 관계 실험 및 밝기 분석에 대 한 호모-이합체 구조에 대 한 긍정적인 통제

  1. 챔버, 35 m m 유리 하단 요리 한 전날 transfection에 계산 셀과 계산 600000 HEK 293T 세포 씨앗 37 ° C, 5% CO2 완전 한 DMEM 매체에서 셀 문화 (단계 1.1 참조) 또 다른 하루.
  2. ~ 250 셀 transfect ng의 플라스 미드 DNA 제조업체 지침에 따라. 긍정적인 교차 상관 제어 플라스 미드 형광 단백질 막 정박 hetero-이합체, 예를 들어, myr-팜-mCherry-mEGFP 또는 myr-팜-mCardinal-mEYFP12 관심사의 단백질의 FPs에 해당 인코딩을 사용 하 여. 밝기 보정를 사용 하 여 인코딩 모두 막 정박 FP 단위체와 호모-이합체 관심, 예를 들어, myr 팜 mEYFP myr-팜-mEYFP-mEYFP의 단백질을 융합 하는 FPs에 해당 하는 플라스 미드의 밝기 분석 보정 APLP1-mEYFP12.
  3. 37 ° C, 5% CO2 완전 한 DMEM 매체에서 셀 문화 (단계 1.1 참조) 또 다른 하루.

3. confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법: 설치 및 초점 볼륨 교정

참고: 다음 프로토콜은 실험 mEGFP/mEYFP와 mCherry/mCardinal 레이저 confocal 현미경이이 연구에 사용 된 검색에 작성 된. 광학 설치, 소프트웨어 설정 (레이저 라인, dichroic 거울, 필터) 보정 염료의 선택은 다른 FPs와 현미경 설정 수정할 수 있습니다.

  1. 설정 현미경과 레이저 적어도 레이저 안정성과 평형 온도 확인 하는 실험 하기 전에 시간.
  2. 100-200 µ L 물 또는 10-50 nM 범위에서 농도와 초점 볼륨 보정 하는 PBS에 적절 한 수용 성 형광 염료 솔루션 (예를 들어 테이블의 자료 참조)를 준비 합니다.
  3. 깨끗 한 35 m m 유리 하단 접시 #1.5, 즉, 0.16 0.19의 두께 갖는 염료 솔루션 배치 m m.
    참고: 이상적으로, 낮은 두께 허용 오차, 예를 들어, 0.170 ± 0.005 m m, 최적의 칼라 링 수정 (단계 3.6)를 허용 하는 데 고성능 커버 유리 접시를 사용 합니다. 그것은 나중에 다음 실험에 사용 된 접시의 동일한 종류를 사용 하는 것이 중요입니다.
  4. 솔루션에 집중 되도록 목표 (선호, 물 침수, 나 1.2)에 직접 염료 솔루션을 포함 하는 접시를 놓습니다. 또는 샘플 (접시의 바닥 위에예를 들어, 10-20 µ m)으로 샘플 홀더 및 초점에 접시를 놓습니다.
    참고: 우리가 권장 하지 않습니다 때 수성 샘플으로 깊은 초점 가난한 신호 인 오일 목표를 사용 하 여.
  5. 1 공기 단위 (AU)의 작은 구멍 크기, 검색 창 499-552 nm, 488/561 nm dichroic 거울, 488 nm 레이저 선택 예를 들어, 여기 및 방출 경로 설정 합니다. 작은 구멍 크기는 간 상관 관계 측정에 사용 될 것과 동일 다는 것을 확인 하십시오.
  6. 핀 홀 위치 (pinhole 조정)와 계산 속도 극대화 하기 위해 객관적인 칼라 링을 조정 합니다. 이 목표를 최대 카운트 속도 감지 때까지 칼라 링을 켜십시오.
    참고: 칼라 링 보정 사용 덮개 유리의 특정 두께 대 한 계정. 수 속도, 극대화., 가능한 분자 당 많은 광자를 수집, 측정의 신호 대 잡음 비율 (SNR)를 극대화 하는 중요 한.
  7. 간 상관 관계에 사용 되는 것으로 서 동일한 레이저 전력에서 포인트 FCS 측정 (예를 들어, 6 시간의 10 s, 즉, 2.5 분 총 1 µs의 유지 시간 이하로 샘플링 15 반복의 구성 된 각 다른 위치에서 측정)의 일련을 수행 측량 (일반적으로 ~ 1%, 즉, 1 ~ 2 µW).
  8. Triplet 기여 (식 6) 데이터를 포함 하 여 3 차원 확산 모델에 맞게.
    참고: 일반적으로, 취득된 확산 시간 약 30 µs 이며 구조 요소 주위 4-8.
  9. 허리를 계산 w0 측정 된 평균 확산 시간과 방정식 5에 따라 실내 온도25 에 사용 된 염료의 확산 계수에 대 한 게시 된 값에서. 일반적인 값은 200-250 nm.
  10. 필요한 경우 두 번째 검색 채널에 대 한 다른 형광 성 염료와 보정 루틴 (단계 3.4-3.9) 반복 (예: 561 nm 여기 및 570 사이 탐지 및 695 nm). 첫 번째 검색 채널에 대 한 설정 했다 작은 구멍 위치와 크기를 유지.
  11. 교정 측정에서 분자 밝기 (식 8)를 계산 하 고 얻은 값을 저장.
    참고: 사용된 설정에 대 한 일반적인 값은 ~8-10 kHz/1.8 µW 488 nm 전원 위한 분자 (MOL). 낮은 보다 보통 가치 목표, 설치 또는 감소 레이저 출력의 부정합에 흙을 나타낼 수 있습니다. 확인 하 고 정기적으로 전력 측정기를 사용 하 여 목표에 레이저 출력 파워를 저장. 다른 설정의 비교, 여기 레이저 파워에 의해 정규화 분자 밝기 현미경 성능을 평가 하는 가장 의미 있는 매개 변수입니다.

4. 스캔 형광 교차 상관 분광학: 수집

참고: 다음 프로토콜은 작성 된 mEGFP/mEYFP (이 하 ' 그린')를 사용 하 여 수행 하는 실험 및 mCherry/mCardinal ('빨간색')에 레이저 스캐닝 confocal 현미경이이 연구에 사용 된. 광 설치 및 소프트웨어 설정 (레이저 라인, dichroic 거울, 필터) 다른 FPs 또는 현미경 설정에 대 한 달라질 수 있습니다.

  1. 광학 경로, 예를 들어, 488 nm 및 561 nm 여기 및 488/561 nm dichroic 거울, 작은 구멍 1 설정 488 nm 여기 AU. 스펙트럼 크로스 토크를 방지 하려면 두 별도 트랙을 자극 하 고 mEGFP/mEYFP (488 nm 여기, 녹색 채널) 및 mCherry를 감지 선택 / mCardinal (561 nm 여기, 빨강 채널) 순차적으로 선택한 모든 줄을 추적 하는 스위치. 검색, 두 채널, 녹색 채널에 예를 들어, 499-552 nm와 570-695 nm 빨강 채널에 대 한 적절 한 필터를 사용 합니다.
  2. 번갈아 구동 불가능, 스펙트럼 크로스 토크를 최소화 하기 위해 빨강 채널에 대 한 적절 한 필터 설정을 사용 하 여 ( 600 아래의 mCherry/mCardinal 형광 검출 nm). 이 빨강 채널에서 검색 된 광자의 양을 감소 하 고 따라서 SNR을 줄일 수 있습니다.
  3. 샘플 홀더에 혼합된 셀을 포함 하는 접시를 놓습니다. 온도 평형 고 초점 드리프트를 줄이기 위해 적어도 10 분 기다립니다.
  4. 전송 찾기 메뉴에 빛을 사용 하 여 셀에 초점.
  5. 한 쌍의 '레드'와 서로 접촉 '녹색' 셀에 대 한 검색. 긍정적인 교차 상관 또는 호모-이합체 밝기 제어 (섹션 2 참조), 오후에 채널 또는 각각 호모-이합체 신호에 형광 발광 격리 된 셀에 대 한 검색.
    참고: (중요) 최소화 샘플 노출 표백 미리 방지 하려면 셀에 대 한 검색 하는 동안이 교차 상관26을 줄일 수 있습니다. 따라서, 가장 빠른 스캔 속도 낮은 레이저 힘에서 스캔. 강력 하 게 표현 하는 세포 이미징 동안 검출기 채도 방지 하려면 통합 모드에서 검색. 그러나, 노출을 최소화 하기 위해 낮은 레이저 파워 스캔 광자 계산 모드에서 가능 하다.
  6. 검색 경로 수직 셀 접촉 (또는 긍정적인 교차 상관 또는 호모-이합체 밝기 제어에 대 한 단일 셀의 오후)을 선택 그림 1B2A에 묘사 된 대로 자르기 단추를 사용 하 여.
    참고: 일부 이전 현미경 임의 스캔 방향 허용 하지 않습니다. 이 경우에, 스캔 방향에 수직인 방향이 셀 연락처를 찾을 수 있다.
  7. 50-200 nm 및 선택 라인 스캔 모드에서 픽셀 크기를 달성 하기 위해 확대/축소 합니다. 128 × 1 픽셀 프레임 크기 를 설정 합니다.
    참고: 일반적인 픽셀 크기는 160 nm, 약 20 μ m의 스캔 길이에 해당.
  8. 설정 스캔 속도 최대 허용 된 값, 예를 들어, 472.73 µs 줄.
    참고:는 대체 구동 방식에 대 한이 954.45 µs 검색 시간, 사용 하는 설치에 검사/s 즉, ~ 1000에 해당 합니다. 스캔 속도 관심사의 단백질의 확산 계수에 따라 조정할 수 있다. 주위는 막 정박 단백질, 전형적인 확산 시간 10-20 양 검색 시간 보급 시간 보다 적어도 10 배 작은 되어야 합니다. 낮은 스캔 속도 강한 photobleaching를 유도 하 고 낮은 조명 능력 필요 수 있습니다. 또는 하나의 시계열 하위 메뉴에서 간격 을 사용 하 여 매우 느리게 확산 단지에 대 한 각 검색 사이 5 ms, 일시 중지, 예를 들어, 부과할 수 있다.
  9. 선택 적절 한 레이저 힘, 488에 대 한 예를 들어, ~ 1-2 µW nm와 ~ 5-10 nm 여기 561 µW.
    참고: 높은 레이저 능력 SNR을 개선 하지만 photobleaching를 증가. 따라서, photobleaching는 초기 카운트 속도의 50% 미만 레이저 힘 선택 되어야 한다.
  10. 100000-500, 000 주기 를 설정 합니다.
    그러나 참고: 수의 검사, 측정의 기간 즉, 다를 수 있습니다: 긴 측정 시간 SNR을 향상 시킬 것입니다 그리고 더 천천히 분자 확산에 대 한 적절 한 있을 수 있습니다, 셀과 photobleaching의 최대 측정을 제한 하는, 시간입니다. 여기에 제시 된 데이터는 ~ 3-6에 대 한 정기적으로 인수 했다 분, 즉, 200000-400000 선 검사.
  11. 탐지기 광자 계산 모드를 설정 합니다. 실험 시작 인수를 시작을 누릅니다. 단계 4.5-4.11 다른 셀 측정을 반복 합니다.
    참고: 그것은 다른 식 수준에서 샘플 당 10-15 셀을 측정 하 고 좋습니다. (중요) 검출기 채도를 높은 식 수준에서 하지 마십시오. 최대 카운트 속도 ~ 1 MHz를 넘지 말아야 한다.
  12. 밝기 분석 oligomeric 상태를 결정 하기 위해 실시 하는 경우 수정된 단계 4.1-4.11에 따라 호모-이합체 밝기 보정 측정을 수행: 각 형광 단백질 호모-이합체 별도로 (고립 된 세포에서 준비를 사용 하 여 측정 프로토콜 섹션 2) 고 한 스펙트럼 채널에만 측정을 수행.

5. 스캐닝 형광 교차 상관 분광학: 데이터 분석

참고: 다음 프로토콜 이전 기사12,15에서 자세히 설명 하는 분석 절차의 구현을 다음과 같습니다. 소프트웨어 코드는 저자에 요청에 따라.

  1. 원시 데이터 형식에는 RGB TIFF 이미지를 원시 데이터 (예: CZI) 파일을 내보냅니다. 이 파일 녹색 kymograph를 포함 하 고 빨강 채널 데이터 채널에서 나 G와 R은 이미지의 각각.
  2. 적절 한 분석 소프트웨어 TIFF 파일 고 분석을 수행 하.
    참고 다음 단계 (단계 5.3 5.7) 각 채널에 개별적으로 적용 됩니다.:
  3. 부문별 또는 이동 시간 평균 500-1000 라인의 블록을 수행 하 여 줄을 맞춥니다. 막 위치, 즉, 각 블록에 최대 카운트 속도와 픽셀 위치를 결정 합니다. 동일한 측면 위치를 모든 블록을 이동 합니다. 이 절차는 세포-세포 접촉, 예를 들어, 셀 운동 때문의 수평 변위에 대 한 해결합니다.
  4. 시간 축 따라 정렬 된 모든 라인을 합계를 구합니다 고 가우스 함수를 사용 하 여 평균 강도 프로 파일에 맞지. 중요 한 세포내 배경, 존재는 가우스 플러스 시그모이드 함수를 사용 합니다. 에 해당 하는 막 막 위치와 이러한 픽셀 (즉, 각 라인 스캔에 대 한) 각 시간 지점에 대 한 단일 형광 신호 값을 가져오는 각 줄의 강도를 합계의 ±2.5σ 내 모든 픽셀 픽셀을 정의 합니다.
  5. 필요한 경우 (예를 들어, 배경 > 막 신호의 10%), 1000 라인 단위로 막 형광에서 2.5σ (픽셀 단위)에 의해 세포질의 평균 픽셀 강도 빼서 배경 보정을 적용. 배경 픽셀을 선택할 때 밝은 세포내 소포를 하지 마십시오.
  6. Photobleaching 관찰 표백 보정을 적용 합니다. 따라서, 두 배 지 수 함수 형광 막 시계열을 적합 하 고 적절 한 수정 수식, 공식 116를 적용 합니다.
    참고: 또는, 푸리에 스펙트럼 기반 교정 계획 수 있습니다 적용된27. (중요) 있으면 photobleaching 하지에 대 한 수정 하지만 CFs는 심각 하 게 왜곡 될 수 있습니다 및 매개 변수 견적을 강하게 편견 수 있습니다 (예를 들어, 그림 5E참조).
  7. ACFs 및 수식 2와 3을 사용 하 여, 예를 들어, 다중-타우 알고리즘28CCFs 계산 합니다. 분석의 신뢰성 향상 및 유물을 피하기 위해, 전체 측정의 10-20 같은 세그먼트에 대 한 계산을 수행 합니다. 각 세그먼트에 형광 시계열 및 CFs를 검사 하 고 명확 하 게 왜곡 된 세그먼트 ( 그림 4A-4 D에서에서 예를 참조)를 제거 합니다. 모든 비 왜곡 세그먼트를 평균.
    참고:이 절차는 데이터29주관적인 편견을 피하기 위해 자동화할 수 있습니다. 매우 불안정 한 측정에 대 한 많은 짧은 세그먼트를 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 세그먼트의 길이 아직도 해야 보급 시간을 피하기 위해 위 세 배나 오류29,,3017언더샘플링 통계.
  8. 2 차원 확산 모델, 방정식 4, 획득된 CFs에 적합. 따라서, 구조 요소 교정 측정 (프로토콜 섹션 3)에서 얻은 값을 수정 합니다. 가 중된 맞는 여러 타우 알고리즘에서 얻은 각 데이터 포인트의 통계적 무게를 사용 하 여 수행 하 여 적합의 정확도 개선할 수 있습니다.
  9. 공식 7에 따라 보정된 허리를 사용 하 여 확산 계수를 계산 합니다.
  10. 입자, 식 8의 해당 수로 각 채널에서 평균 형광 강도 나누어 분자 밝기를 계산 합니다. 계정 비 형광 FPs23으로 oligomeric 상태를 얻기 위해 해당 단위체 참조의 평균 밝기에 의해 각 채널에 결정된 밝기 값을 정상화. 이 목표에 한 색상 분석 비 형광 FPs23분수 계산을에서 평균 호모-이합체 밝기 값을 결정 합니다.
  11. 수식 9에 따라 상대 간 상관 관계를 계산 합니다.

6. 교차 상관 수와 밝기: 검출기 교정

참고: 다음 프로토콜 탐지 시스템을 보정 하는 방법에 관한 일반적인 지침을 제공 합니다. 이 절차는 아날로그 탐지 시스템에 대 한 필수 하지만 진정한 광자 계수 검출기를 사용 하는 경우에 필요 하지 않습니다 엄격 하 게.

  1. 건조 35 m m 유리 하단 접시에 적절 한 수용 성 염료 솔루션 (예제 테이블의 자료 를 참조). 광학 경로 따라, 설정 즉, 488 또는 561 nm 여기 및 탐지 499-552 nm 또는 570-695 nm, 각각.
    참고: 또는, 반사 금속 표면을 사용할 수 있습니다 말린된 염료 솔루션 대신 직접 목표 위에 금속 조각을 배치 하 여.
  2. 다른 염료 농도 또는 다른 레이저 힘에 지역에서 한 색상 N & B 측정을 수행 합니다. 따라서,를 사용 하 여 확대/축소 300의 픽셀 크기를 달성 nm, 스캔 속도 설정 적절 한 픽셀 유지 시간, 예를 들어, 25 µ s와 100-200 프레임을 주기 를 설정 하는.
  3. 광자 계산 (또는 아날로그 모드 아날로그 감지 측정을 수행) 탐지기를 설정 하 고 실험 시작 인수를 시작을 누릅니다. 강도 오프셋을 결정 하기 위해 전원 0에서 측정을 수행 합니다.
  4. 모든 측정 픽셀 픽셀 농도의 기능으로 픽셀 분산을 플롯 하 고 이러한 데이터의 선형 적합을 수행 합니다. 결정 선형 적합의 기울기로 S. S 방정식 14 따라 결정된 강도 오프셋을 사용 하 여 y 절편에서 판독 불가 소음을 계산 합니다.

7. 교차 상관 수와 밝기: 수집

  1. 4.1-4.4 sFCCS 수집 프로토콜의 단계를 따릅니다.
  2. 작물 을 사용 하 여 셀 접촉 (또는 호모-이합체 밝기 제어에 대 한 격리 된 오후) 512 × 128 픽셀의 프레임을 선택 하 고 50-100 nm의 픽셀 크기를 달성 하기 위해 확대/축소 .
  3. 설정할 적절 한 픽셀 유지 시간, 예를 들어, 6.3 µs 스캔 속도 사용 합니다.
    참고: N & B, 픽셀의 유지 시간 되어야 합니다 관심사의 단백질의 확산 시간 보다 훨씬 작습니다. 대체 여기 구성표를 선택 하면 모든 라인을 추적 예를 들어, 스위칭, 두 트랙 사이의 시간 관심사의 단백질의 확산 시간 보다 작아야 합니다. 그렇지 않으면 감지 교차 상관은 감소 된다.
  4. 100-200 프레임을 주기 를 설정 합니다.
    그러나 참고: 프레임 번호가 높은 SNR 향상 시킬 것입니다, 그리고, 세포 운동 총 측정 시간을 제한할 수 있습니다. 프레임 당 검색 시간 관심사의 단백질의 확산 시간 보다 훨씬 높아야 한다. 그렇지 않으면 명백한 밝기 감소, 즉, 입자 이동할 것 같습니다. 매우 느리게 확산 단지에 대 한 부과 일시 중지, 예를 들어, 2 s 사이 간격 을 사용 하 여 시계열 하위 메뉴에서 프레임.
  5. 레이저 파워 적절 한 값으로 설정 (일반적인 값은 1 ~ 2 488에 대 한 µW 및 ~ 5-10 µW 561 nm 여기).
    참고: 높은 레이저 전원 리드 더 높은 밝기와 향상 된 SNR, 뿐만 아니라 향상 된 photobleaching. 레이저 파워 이상 ~ 1 kHz의 감지 된 광도 달성 하기 위해 충분히 높은 해야/MOL 하지만 10-20 %photobleaching 보다는 더 많은 피하기 위해 충분히 낮게 유지. 10% 미만 mEGFP/mEYFP 또는 mCherry/mCardinal, photobleaching에 대 한 일반적으로 얻을 수 있습니다.
  6. 탐지기 광자 계산 (또는 아날로그 모드 아날로그 감지 측정을 수행)을 설정 합니다. 실험 시작 인수를 시작을 누릅니다.
  7. 광자 수 속도 평가 합니다. 셀 연락처 픽셀에서 카운트 요금 1 MHz를 초과 하는 경우 레이저 힘 또는 더 낮은 식 수준의 선택 셀을 줄일 수 있습니다. 7.2 7.7 단계를 반복 합니다. 에 셀의 다음 쌍을 측정 합니다. 다른 식 수준에서 실험 당 10-15 셀을 측정 하는 것이 좋습니다.
  8. Oligomerization 계량 밝기 분석을 수행 하는 경우 수정된 단계 7.1-7.7에 따라 호모-이합체 밝기 보정 측정을 수행: 각 형광 단백질 호모-이합체 별도로 (고립 된 세포에서 준비를 사용 하 여 측정 프로토콜 섹션 2) 고 한 스펙트럼 채널에만 측정을 수행.

8. 교차 상관 수와 밝기: 데이터 분석

참고: 다음 프로토콜에는 앞에서 설명한 분석 절차12,31다음과 같습니다. 소프트웨어 코드는 요청 시 저자에서 있습니다.

  1. 원시 데이터를 가져오기 (예를 들어, CZI 파일은 Bioformats32 패키지도 가져올 수 있습니다). 모든 프레임 평균 고 세포 세포 접촉 주위 관심 (ROI) 영역을 선택 합니다.
  2. 이미지 정렬 알고리즘33, 예를 들어, 임의의 측면 번역, 두 채널 동안 평균 프레임에 ROIs 공간 상관관계를 극대화 하 여 수행 합니다. 이 절차는 세포의 측면 움직임에 대 한 수정 됩니다.
  3. 외부 장 변동에서 예를 들어, 잔여 세포 운동 또는 배경 표백 발생을 줄이기 위해 기차 필터22 를 적용 합니다. 또는, photobleaching34에 대 한 해결 하기 위해 detrending 메서드를 적용할 수 있습니다.
    참고: 경우 아무 부문별 분석 또는 적용 트렌딩, 명백한 밝기는 크게과 대 평가 될 수 있습니다.
    1. 예를 들어, 8 ~ 15 프레임 (예를 들어, 프레임 1 ~ 8, 9 2 등등)의 슬라이딩 세그먼트를 정의 하 고 방정식 10, 11 및 15 pixel-wise 각 세그먼트에 따라 채널 및 크로스 밝기 값을 계산. 탐지기 진정한 광자 검출기를 계산 하지 않으면, 고려해 보정된 검출기 매개 변수 대신 밝기, 즉, 사용 방정식 12 및 13를 계산할 때.
      참고: 8 ~ 15 프레임의 세그먼트의 밝기 값 계산 절대 밝기의 10-20% 싼와 입자 수의 10-20% 과대평가 이끌어 낸다. 그럼에도 불구 하 고, 밝기 비율 (예를 들어, 이합체 단위체 밝기)는 영향을 받지, 세그먼트 길이 분석 (데이터 표시 되지 않음)에 걸쳐 일정 하 게 유지로. 주어진된 세그먼트 길이 대 한 통계 오류 시뮬레이션을 통해 결정 하 고 따라서에 대 한 수정 수 있습니다.
    2. Pixel-wise 모든 세그먼트를 통해 얻은 밝기 값을 평균입니다. 이 단계에서 하나 세그먼트 밝기 값의 최고 및 최저 5%는 평균에서 제거 하거나 세그먼트는 세포내 소포 또는 집계에 뚜렷이 존재 때문에, 예를 들면, 강도에 분명 왜곡 표시를 제외합니다 픽셀입니다.
  4. 픽셀 농도의 기능으로 픽셀 밝기 값을 플롯 하 고 셀 연락처에 해당 하는 픽셀의 인구를 선택 합니다. 배경 픽셀 매우 낮은 강도 값을 갖습니다. 이 시점에서 다시 최대 카운트 속도 평가 합니다. 1mhz 산더미 효과 방지 하기 위해 위의 수 속도와 픽셀을 제외 합니다.
  5. 선택한 셀의 채널 및 크로스 밝기 히스토그램 연락처 픽셀 만들고 투자 수익 평균 밝기 값을 구하십시오. 계정 비 형광 FPs23으로 oligomeric 상태를 얻기 위해 해당 단위체 참조의 평균 밝기에 의해 평균 채널 밝기 값을 정상화. 따라서, 한 색상 분석 비 형광 FPs23분수 계산을에서 평균 호모-이합체 밝기 값을 결정 합니다.
  6. 이해를 돕기 위해 채널 및 크로스 밝기 지도 플롯 합니다.

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Representative Results

첫 번째 테스트 단백질 단백질 상호 작용 분석 결과 대 한 즉, sFCCS/ccN & B 측정 (그림 1), 괴기 하 게 고유한 형광 단백질을 표현 하는 셀의 혼합 수행 해야 되지 것으로 예상 되는 단백질에 세포 세포 접촉을 (즉, 부정적인 컨트롤)에서 상호 작용 합니다. 따라서, HEK 293T 세포 myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-팜-mEYFP) 또는-mCardinal 표현 했다 혼합 하 고 sFCCS-셀 접촉 (그림 2A)에 걸쳐 수행 되었다. 이상적인 경우, 각 채널에 형광 신호는 오후에 있는 단백질의 방산 모션 때문에 안정적인 평균 주위 변동 되어 초점 볼륨에 있는 단백질의 수의 통계 유사. 상호 작용 하지 않는 단백질에 대 한 변동 두 채널에 서로 독립적 이며, 따라서, 스펙트럼 간 상관 관계 0 주위 변동 될 것으로 예상 된다. 사실, 제로 가까운 상대 간 상관 관계는 일반적인 측정 (그림 2C)에서 관찰 되었다. ACFs 쇼 ~ 10-20의 독특한 붕괴 시간 ms (Dmyr 팜 , 평균, 해당 1.3 ± 0.3 µ m2/s = (± SD, 의미 n = 20 셀)), 확산 myr-팜-mEYFP 고-mCardinal의 오후, 예를 들어, D에서에서에 대 한 예상 대로 myr 팜 = 0.88 ± 0.11 µ m2/s (평균 ± SEM) photobleaching (FRAP)35실험 후 형광 복구에 따라. 오히려 느린 역동성 번갈아 흥분 체계, 즉, 녹색 및 빨간색 구동 및 검출 ~0.5 ms 간격 두 채널에 신호를 발생 하지만 억제 모든 라인을 전환의 사용을 허용 하는 특히, 스펙트럼 크로스-이야기입니다. 에 평균 0.08 ± 0.10의 매우 낮은 평균 교차 상관 (± SD, 의미 n = 17 셀) 예상 대로 부정적인 컨트롤 (그림 3E)에 대 한 취득 했다.

다음으로, 긍정적인 교차 상관 제어 최대 가능한 교차 광학 설치에 상관을 보정 하기 위해 사용 되었다. 따라서,는 막 정박 hetero-이합체 myr-팜-mCardinal-mEYFP HEK 293T 세포에 표현 했다 고 sFCCS 측정 단일 셀 (그림 2B)에 대해 수행 합니다. 얻은 CCFs 긍정적인 진폭 졌고 ACFs, 다시 10 ~ 20으로 비슷한 붕괴 시간을 보였다 (그림 2D). 에 평균, 0.96 ± 0.18의 상대 교차 상관 (± SD, 의미 n = 14 셀) 긍정적인 컨트롤 (그림 3E) 측정 되었다.

Figure 2
그림 2 . 형광 교차 상관 분광학 제어 측정 스캐닝. (A) 혼합된 HEK 293T의 대표 이미지 트랜스 상호 작용에 대 한 부정적인 컨트롤로 표현 myr-팜-mEYFP /-mCardinal 세포. 노란색 화살표는 sFCCS 검색 경로 나타냅니다. 스케일 바는 5 µ m. (B) 대표 이미지 표현 myr-팜-mCardinal-mEYFP 이종-이합체 HEK 293T 세포 (왼쪽: 녹색 채널, 오른쪽: 빨강 채널) 긍정적인 교차 상관 제어로. 노란색 화살표는 sFCCS 검색 경로 나타냅니다. 눈금 막대는 5 µ m. (C) 대표 CFs (녹색: 녹색 채널 (mEYFP), 레드 피 오: 빨강 채널 (mCardinal), 파란 피 오: CCF) 부정적인 제어를 위한 sFCCS 측정에서 얻은. 실선 CFs. (D) 대표 CFs 2 차원 확산 모델의 표시 (녹색: 녹색 채널 (mEYFP), 레드 피 오: 빨강 채널 (mCardinal), 파란 피 오: CCF) 긍정적인 컨트롤의 sFCCS 측정에서 얻은. 실선 표시 2 차원 확산 모델의 CFs. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

이 분석 결과의 적합성 다음 녹말 체 선구자 같은 단백질 1 (APLP1), 일종의 트랜스 상호 작용을 조사 하 여 생물학으로 관련 된 맥락에서 조사 나 막 횡단 단백질 신경 접착 역할을 제안 하고있다 수용 체입니다. 이 목표를 mEYFP를 융합 하는 APLP1 또는 mCardinal HEK 293T 세포에 표현 했다. 방해가 extracellular 바인딩 도메인을 제외 하려면 FPs는 APLP1, 즉, 세포내 도메인에의 C-말단에 융합 했다 ( 그림 1참조). SFCCS 측정 APLP1-mEYFP APLP1-mCardinal 셀 (그림 3A) 표현, ACFs 고 CCFs (그림 3C) APLP1 확산에 대 한 정보를 제공 하는 사이-셀 연락처에 수행한 다음, 그리고 상호 작용입니다. 0.45 ± 0.21의 긍정적인 상대 교차 상관 (± SD, 의미 n = 17 셀) 즉, 부정적인 컨트롤 (그림 3E) 보다 훨씬 큰 값 관찰 되었다. 흥미롭게도, 평균 상대 교차 상관만 부분 트랜스 바인딩을 나타내는 긍정적인 컨트롤 (그림 3E)의 저것 보다는 더 했다.

마지막으로, 분석 결과 아연 이온은 향상 된 APLP1 트랜스 12,31바인딩을 용이 하 게 보여 사용 되었다. SFCCS-셀 연락처 (APLP1-mEYFP APLP1-mCardinal 고 아연 이온, 그림 3B존재 빠르게 형성의 강한 공동 지역화 특징)에서 APLP1 클러스터에 걸쳐 측정에서 얻은 CFs 강하게 보였다 감소 된 역학, 큰 부패 시간과 큰 지연 시간 (그림 3D)에서 진동에서 분명. 그럼에도 불구 하 고, 짧은 지연 시간에 진폭의 분석 계시 0.8 ± 0.3 상대 간 상관 관계의 상당한 증가 (± SD, 의미 n = 17 셀), 보정 최대 (그림 3E) 즉, ~ 80%. 이러한 느린 역학 상관 관계 곡선 ( 그림 3D참조) 인해 방산 이벤트 유도 하는 소위 입자 유한 측정 시간 동안 검출 될 수 있는 제한 된 수의 심각한 왜곡을 유발 하는 것을 예상 될 것입니다. 소음30. 정확한 정량화에 대 한 최대 지연 시간은 3 배나 위의 (참조 이전 리뷰30,17 더 세부 사항을 위해) 보급 시간 이어야 합니다.

SFCCS APLP1 데이터에서에서 분자 밝기는 더 분석, 각 채널에 단위체 기준으로 myr 팜 부정적인 컨트롤을 사용 하 고 비 형광 단백질23금액 수정. 아연 이온 또한, 시 분자 밝기는 상당히 작은 올리고에서 증가 (~ 이합체) ~ 10-50의 구성 된 더 큰 multimers를 각 셀 (그림 3F)에서 단위체. 따라서, 평균, 100 ~ APLP1까지 단위체 단백질 전체 클러스터에 걸쳐 있습니다-셀 교차점.

Figure 3
그림 3 . APLP1-셀 연락처에서 상호 작용의 형광 교차 상관 분광학 측정 검사. (A, B) APLP1-mEYFP (녹색)을 표현 하는 HEK 293T 세포의 대표 이미지 / APLP1-mCardinal (레드) (A) 전에 하 고 30 분 후 아연 이온 치료 (B, 다른 세포). 노란색 화살표는 sFCCS 경로 스캔을 나타냅니다. 스케일 바는 5 µ m. (C, D) 대표 CFs (녹색: ACFs 녹색 채널 (mEYFP), 빨간색: 빨간색 채널 (mCardinal), 블루 ACFs: CCFs) 후 아연 이온 치료 (C) APLP1 및 (D)에 대 한 sFCCS 측정에서 얻은 아연 이온 치료입니다. 아연 이온과 긍정의 존재와 부재에 APLP1 부정적인 컨트롤 ("네거티브")의 sFCCS 분석에서 얻은 상대 교차 상관의 CFs. (E) 상자 플롯 2 차원 확산 모델의 실선 표시 교차 상관 컨트롤 ("긍정적인"). 플롯 표시 중간 값과 최대 값 최소에서까지 수염. (F) 상자 부재와 아연 이온의 존재에 셀 연락처에서 APLP1의 sFCCS 분석에서 얻은 녹색 채널 (mEYFP)에서 정규화 된 분자 밝기의 플롯 합니다. 밝기 값 비 형광 mEYFP myr-팜-mEYFP-mEYFP 호모-이합체 HEK 293T 세포에 표현 된 동일한 조건23에서 측정의 sFCS 측정에 기반에 대 한 수정 했다. 플롯 표시 중간 값과 최대 값 최소에서까지 수염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

지금까지 보이는 모든 측량은 발생 하는 추가, 스 퓨 리 어스 변동에 대 한 수정 했다, 계정에 촬영 되지 않은 경우 만들 것입니다 sFCCS 분석 도전 셀에. 부정적인 컨트롤에 대 한 예를 들어이 발생할 수 있습니다 거짓 양성 교차 상관, 아무 보정 제도 적용 되는 경우. CFs를 왜곡 심각 수 있는 두 가지 주요 프로세스는: 1) 기록 된 형광에서 불안정성 때문에 세포내 소포 정도 입력 초점 볼륨 또는 슬로우 막 역학, z-방향으로, 예를 들어, 드리프트와 2 신호) photobleaching입니다. 일시적인 불안을 식별 하기 위해 10-20 동일 하 게 크기의 세그먼트에서 전체 측정을 분할 하 고 각 세그먼트에 강도 시계열 및 CFs를 시각적으로 검사 것이 좋습니다. 이 절차는 그림 4, 부정적인 컨트롤 측정의 분석에서 얻은 명확 하 게 왜곡 된 세그먼트의 예를 제공에 그림입니다. 일시적인 불안정성 (그림 4A, 강도 트레이스 세그먼트 1과 2의) 음수 값 (그림 4B, 세그먼트 1) CCF에 발생할 수 있습니다 또는 높은 긍정 크로스-상관 관계 (그림 4B, 세그먼트 2)입니다. 일반적으로, 이러한 불안정성 느린 신호 변화(그림 4)로 강도 시리즈에서 볼 수 있습니다. 해당 CFs 일반적으로에, 예를 들어, 높은 진폭 및 훨씬 느린 감퇴 시간 표시 하는 세그먼트의 대부분의 CFs에서 강하게 일탈은 ~ 규모 두 번째 ( 그림 4B-4 D참조). 분석에서 이러한 세그먼트를 제거 하는 것이 좋습니다 하 고 모든 비 왜곡 세그먼트, 즉, 세그먼트를 평균 하 여 최종 CFs 특징 CFs 하지 CFs의 대부분에서 일탈 하는 일반적으로,이 계산 하는 그래픽에 이루어집니다. 평균 및 3 세그먼트를 왜곡 명확 하 게 1) 반복적으로 세그먼트, 2를 검사 하 여 인터페이스) 제거) 제거 되지 않은 세그먼트의 업데이트 평균 CFs에 관하여 세그먼트 남은 CFs를 검사. 이 절차, 부분적으로 왜곡 된 긴 측정그림 5(A), 적용 하 여 보여주는 천천히 부패 (손상 된) CFs (그림 5B) 성공적으로 수정 했다 고 의미 있는 상관 관계 곡선 (그림 5C)를 복구. 일반적으로,이 교정 절차 automatized29, 주관적인 편견에 경향이 있을 수 있습니다 사용자가 육안 검사를 피할 수 있습니다. 강도 비해 기반 필터링 방법을36, 작은 쓰레기통 측정의 평가 전체 측정의 평균 강도를 비교 하 고는 설명된 임계값 매개 변수를 초과 하는 경우 제거 그들의 강도에 따라 프로시저 매개 변수를 외부에 의존 하지 않는 고 사소한 불안에도 민감합니다.

Photobleaching에 대 한 보상을 위해 설명된 수학 교정, 공식 1, 적용 했다. 일반적으로, photobleaching로 식별할 수 있습니다 CFs, 지배 하는 형광 신호 (그림 5D), 부패 지 수는 다음 거짓 양성 간 상관 관계를 표시 하 고 시간에 부패는 ~ 분 규모 (일반 곡선 모양을 보고 그림 5E). 교정 절차 복구 비 왜곡 CFs (그림 5F). 이미 언급 한, 유사한 강도로 단일 측정 내 유사 오후 운동, 예를 들어, z-드리프트, 또는 대형 천천히 이동 구조에 의해 또한 발생할 수 있습니다. 그러나, 유사한 지 수 부패 한다 모든 측정에 표시, photobleaching 가장 가능성이 소스 될 것입니다. 일반적으로, 교정 제도 결합 될 수 있다, 예를 들어, 강도 필터링, CF 기반으로 필터링 및 추가 방법 푸리에 변환와 같은 기반으로 느린 신호 변화 주파수 공간27의 필터링.

Figure 4
그림 4 . 네거티브 교차 상관 제어의 형광 교차 상관 분광학 측정 검사의 부문별 분석. (A) (F1) 녹색과 빨강 채널 (F2) 두 개의 다른 시간 세그먼트의 형광 강도 (~ 20 20 세그먼트에서 각 측정 분석 s 각), 부정적인 컨트롤의 sFCCS 측정에서 얻은. (B) CCFs 20 세그먼트의 각각의. 세그먼트 1과 2에 대 한 CCFs 빨간색과 오렌지, 각각 강조 표시 됩니다. (C, D) (C) 녹색과 빨강 (D) 채널에 각 세그먼트의 ACFs. 세그먼트 1과 2에 대 한 ACFs 빨간색과 오렌지, 각각 강조 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 . 셀 연락처, 부정적인 교차 상관 제어 exemplified에서 형광 교차 상관 분광학 측정 검사에 섭. (F1) 녹색과 빨강 채널 (F2)에서 표본 측정 (A) 전체 형광 시간 시리즈. 빨간색 실선 각 채널에서 시계열의 이중 지 수 적합을 나타냅니다. (B, C) CFs (녹색: 녹색 채널, 빨간 ACFs: ACFs 파랑 빨강 채널에서: CCFs) 형광 시간 시리즈의 A, (B) 계산에 표시 된 전체 측정 또는 (C) 연관 별도로 20 세그먼트를 상호 연결 하 고 평균 최소한 왜곡 ~ 80% (녹색 채널)와 세그먼트의 50% (빨강 채널)의 cFs. 실선은 데이터를 2 차원 확산 모델의 적합을 나타냅니다. (D) 완전 형광 시간 시리즈 및 측정 (F1) 녹색과 빨강 채널 (F2)에서 상당한 표백 특징의 이중 지 수 맞추기 (빨간 실선). (E, F) CFs (녹색: 녹색 채널, 빨간 ACFs: ACFs 파랑 빨강 채널에서: CCFs) 형광 시간 시리즈의 D, (E)에 의해 계산에 표시 된 전체 측정 또는 (F) 연관 표백 수정, 공식 1 적용 20 연관 별도로 세그먼트와 세그먼트의 ~ 90% (양쪽 채널)의 이상 왜곡 된 CFs를 평균. 실선은 데이터를 2 차원 확산 모델의 적합을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

SFCCS에 대 한 보완적인 접근로 셀 혼합 후 단백질 단백질 상호 작용을 검출 하 ccN & B (그림 1C)를 사용할 수 있습니다. SFCCS, 달리 ccN & B 단백질 역동성에 정보를 제공 하지만 전체 셀 접촉 한 초점 평면에 따라 트랜스 상호 작용을 측정 하는 수 있습니다. APLP1 샘플 측정 전후에 치료 50 µ M ZnCl2, 뿐만 아니라 부정적인 myr-팜 컨트롤에 수행 했다. 이러한 측정 셀 움직임, 특히 아연 이온 치료 샘플, APLP1 클러스터의 느린 역학을 장기간된 수집 시간 요구에 민감합니다. 따라서, 이미지 정렬 알고리즘은 셀33의 측면 운동에 대 한 해결 하기 위해 구현 되었습니다. 또한, 기차는 필터22 (8 프레임 크기, ~ 5 상자 s) 측정 신호의 낮은 주파수 변동 제거를 적용 했다. 즉, 픽셀 독립적으로 처리 됩니다,이 절차는 매우 지역 평균37 또는 트렌딩18,34, N & B 분석에 사용 되는 다른 필터와 유사 하지만 불변 원래 데이터를 유지 및 평균 또는 신호 빼기 수행 됩니다. 이 절차는 효과적으로 상자 크기22보다 더 긴 시간의 척도에 수명이 긴 변동을 하지 않습니다. 이러한 데이터 분석에 따라 모든 샘플에 대 한 교차 상관 밝기 값 교차 상관 밝기 히스토그램에서 모든 셀 연락처 픽셀을 풀링 하 여 비교 했다. APLP1 아연 이온 (그림 6A6 D)의 부재에 대 한 긍정적인 평균 Bcc 0.068 ± 0.004 (± sem의 의미 n = 18 셀) 관찰 되었다. 아연 이온 또한 (그림 6B 6E), 후 Bcc 값 증가 0.266 ± 0.006 (± sem의 의미 n = 19 셀). 부정적인 컨트롤 (그림 6C 6F)에 대 한 더 낮은 평균 교차 상관 밝기 감지 되었습니다 (Bcc ± sem의 의미 = 0.022 ± 0.002, n 26 셀에 =). 셀 연락처에서 APLP1 복합물의 산출할 추정, APLP1-mEYFP의 밝기는 얻은 myr-팜-mEYFP에 대 한 평균 값을 사용 하 여 정규화 되었는지 (즉,., 부정적인 컨트롤) 비 형광 금액 수정 단백질23. SFCCS 데이터와 밝기 분포는 해당 제안 평균 2:2 산출할 아연 이온의 부재에서 이합체 (그림 6G), 하는 값을 중심으로. 아연 이온 치료 후 정규화 된 밝기 강하게 이동 큰 값, ~ 10 ~ 60 (그림 6H), 에 stoichiometries의 적어도 10시 10분 또는 sFCCS 데이터와 좋은 계약에 다시 더 큰.

Figure 6
그림 6 . APLP1-셀 연락처에서 상호 작용의 교차 상관 수와 밝기 측정. (A-C) 대표 ccN & B 이미지 (A) 없이 APLP1 mEYFP 및 APLP1 mCardinal 표현 HEK 293T 세포 사이 세포 세포 연락처의 프레임 및 아연 이온 (B) 또는 myr-팜-mEYFP 및 myr-팜-mCardinal 표현으로 부정적인 세포 교차 상관 제어 (C). 스케일 바는 5 µ m. (D-F) ccN에서 얻은 모든 시험된 픽셀 및 셀의 교차 상관 밝기 (B참조) 히스토그램 및 APLP1 샘플 (D), 아연-대우 APLP1-셀 연락처 B 분석 (샘플 E)와 myr-팜-mEYFP myr-팜-mCardinal (F)를 포함 하는 샘플. (G, H) APLP1 샘플의 밝기 히스토그램 정규화 (G: 아연 이온, H없이: 아연 이온으로) 동일한 세포 및 ROIs B참조계산에 대 한 사용의 밝기 분석에서 얻은 녹색 채널 (mEYFP)에 대 한. G에서 인세트 10-2의 표준화 된 밝기 범위 확대를 보여줍니다. 밝기 값 비 형광 mEYFP myr-팜-mEYFP-mEYFP 호모-이합체 HEK 293T 세포에 표현 된 동일한 조건23에서 측정의 N & B 측정에 기반에 대 한 수정 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

CcN & B 분석을 수행 하기 위하여 감지기의 주의 교정 수행 되어야 한다. 이 연구에 사용 된 실험 설정에 대 한 이러한 교정에 대 한 필요성이 분명해졌습니다 분자 밝기 고정된 샘플 (즉, 숫자 변동 없을 경우에)에서 분석 했다. 이 경우에, 분자 밝기 분산 해야만 발견자 소음에서 발생 한 이후 공식 10에 따라 0이 될 전망 이다. 그러나 때만 (부동) 배경 픽셀을 포함 하는 투자 수익 분석 (그림 7A7B), ~0.1 cts./(MOL x dwell time)의 긍정적인 밝기 결정 했다. 비슷한 값 얻은 공연 N & B 측정 glycosylphosphatidylinositol-mCherry (GPI-mCherry, 그림 7C) 변화를 표현 하는 HEK 293T 세포의 레이저 파워 및 측정된 분자 밝기를 바탕 제로 레이저 파워입니다. 이 효과 대 한 수정, 우리는 이전에 보고 된 (방정식 12 참조)19,20, 검출기의 체계적인 교정 수행. 우리는 따라서 말린된 형광 염료 해결책의 구성 된 샘플에 검출기 카운트 속도의 기능으로 분산을 측정 하 고 매개 변수 S, 결정 Equation 24 및 어두운 수 속도 오프셋. 후자 제로 레이저 전력에서 강도 측정에서 얻은 고 했다, 우리의 경우, 무시할 수 있습니다. 강도 음모 대 분산의 선형 적합에서 우리는 결정 S의 방정식 14, 경사에 따라 = 1.1, 및 무시할 수 판독 잡음. 결정된 값 (S 1.1 = Equation 24 = 0, 오프셋 = 0) 제대로 분자 밝기와 식 12 및 1319에 따라 번호를 계산 하는 데 사용 했다. Superpoissonian 검출기 잡음, 잡음, 총 Poissonian 보다 큰 노이즈를 ~ 10% 즉, 설명에 긍정적인 분자 밝기의 관측 사실에 근거한 더 경험적 교정 체계를 적용 될 수 있다 또는, 번호 변동 없이 픽셀. 이 가정을 사용 하 여, 같은 픽셀에서 ~0.1 cts./(MOL x dwell time)의 결정된 밝기 여겨질 수 있다 일정 한 밝기 오프셋 하 고 따라서 모든 명도 값 방정식 10 계산에서 공제 해야. 가장 중요 한 것은, 둘 다 동일한 결과에 접근 리드 만큼 밝기 비율을 계산할 때 설명 Equation 24오프셋 무시할 수 있습니다. 그것은 동일의 다른 현미경 중 언급 가치가 각 개별 설치에 주의 검출기 교정에 대 한 필요성을 강조 유형 (공급 업체, 같은 모델, GaAsP 탐지기 광자 카운트 모드에서) 다른 S 값이 관찰 되었다.

더 중요 한 매개 변수 밝기 측정에서 감지기의 성능에 영향을 미치는 검출기 죽은 시간 이다. 이전 보였다, 검출기 죽은 시간 수 실질적으로 줄일 중간 수 속도 에서도 감지 된 분자 밝기 (102-103 위 kHz)38. 이 유물을 방지 하려면 측정 하거나 수행 해야 낮은 수 요금, 또는 죽은 시간 희석 일련의 예를 들어, EGFP 버퍼 솔루션에 N & B 또는 FCS를 수행에 따라 보정 해야 합니다. 다음, 측정된 수 요금 보정된 시간38을 사용 하 여 수정 될 수 있습니다. 이 연구에 사용 된 설치에 대 한 희석된 염료 솔루션 N & B를 사용 하 여 이러한 교정 ~0.5 MHz 수 및 해당 죽은 시간 ~ 6까지 안정적인 분자 밝기 값 공개 ns (그림 7E). 수에 감소는 이전에 게시 수정 수식38~ 8 kHz의 일정 한 밝기 값을 사용 하 여 따라서 수정 하실 수 있습니다/몰.

Figure 7
그림 7 . 번호와 밝기 분석 검출기 교정. (A) N & B HEK 293T 세포 표현 GPI-mCherry의 측정에서 대표 이미지. 투자 수익 (파란색 파선된 사각형) 배경에서 선정 되었다. (B) A에서 투자 수익에 해당 하는 모든 픽셀의 픽셀 명도 히스토그램. 가우스 함수, 픽셀 밝기 히스토그램 피팅에서 얻은 평균 픽셀 밝기는 ~0.1 cts./(MOL x dwell time). 데이터는 25 µs 픽셀 유지 시간에 인수 했다. (C) 분자 밝기 GPI-mCherry HEK 293T 세포에 표현 된의 N & B 분석에서 얻은 3 개의 다른 레이저 힘 (6 셀, 561 nm 여기, 25 µs 픽셀 유지 시간)에서 측정 합니다. 데이터는 ± sd. 뜻으로 표시 됩니다. 선형 회귀 (레드 라인) 0.11 ± 0.02 cts./(MOL x dwell time)의 오프셋된 값을 제공합니다. 형광 염료의 말린된 솔루션의 N & B 측정에서 픽셀 농도의 기능으로 픽셀 분산의 (D) 줄거리 (561에 흥분 nm), 샘플의 다른 지역에서 여러 측정의 모든 픽셀에서 풀링된. 빨간색 실선 표시 검출기 교정의 S 요소를 제공 하는 1.1의 경사에 따른 데이터의 선형 적합 합니다. 탐지기 수 속도의 기능으로 (E) 분자 밝기 희석된 fluorophore 솔루션의 N & B 측정에서 얻은 (488에 흥분 nm). 이전에 게시 교정 계획38 검출기 죽은 시간에 대 한 다른 가능한 값을 사용 하 여 적용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

여기에 설명 된 실험 절차-셀 연락처, 형광 변동 분광학 기술을, 즉 sFCCS 및 ccN & B에서 트랜스 상호 작용 단백질-단백질의 조사를 수 이러한 방법은 두 괴기 하 게 분리 된 FPs 하나 또는 다른 융해 단백질을 표현 하는 각각 두 개의 인접 셀의 연락처에 대 한 관심의 protein(s) 융합에 의해 방출 되는 형광 변동에 대 한 통계 분석을 포함 한다. 트랜스 복합물의 존재는 이웃 PMs에서 단백질의 공동 보급의 정도 조사 하 여 정량은. 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석에 자세한 프로토콜,이 문서 분석 결과의 성공적인 신청의 실험적인 증거를 신경 접착 단백질 APLP1에 제공합니다. 우리는 APLP1 관련, 셀 연락처에서 homotypic 트랜스 상호 작용을 거쳐 보여줍니다. 또한, 아연 이온 트랜스 상호 작용에 대 한 multivalent 플랫폼을 제공 하 고, 따라서, 향상 된 트랜스 바인딩을 유도 하는-셀 연락처에서 APLP1 클러스터의 형성을 촉진 합니다.

파괴적인 생 화 확 적인 방법6에 따라 이러한 상호 작용을 검출 하는 이전 분석 실험, 달리 제시 접근 고정 또는 단백질 복합물의 고립에 대 한 필요와 함께 살아있는 세포에서 직접 수행할 수 있습니다. 또한, 그것은 제공 합니다 분자 특이성 및 정보 이전 질적 분석8,9달리 관심사의 단백질을 융합 유전자 형광 단백질의 탐지에 의해. 다르게 무서 워10 및 형광 보완성11등 다른 형광 기반으로 접근에서 필요는 없습니다 (잠재적으로 방해 하 고 세포 외에 지역화를 형광 라벨에 대 한 단백질 단백질 상호 작용)입니다. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 C 터미널 FPs 세포내 구성 요소, 예를 들어, 어댑터 단백질 골격과 상호 작용을 중재 하는 바인딩 변경 여전히 수 있습니다 주목 해야 합니다. 특히, 분석 결과 호모-및 heterotypic 상호 작용에 적용 됩니다.

몇 가지 요구 사항을 제시 분석 결과의 성공적인 응용 프로그램에 대 한 언급 가치가 있다. 밝은 필요로 하는 임시 측정 및 photostable를 기반으로 하는 수행된 형광 변동 방법 많은 빨간 FPs23에 대 한 주요 제약은 단위체 FPs. 제시 스캐닝 체계는 일반적으로 세포 세포 상호 작용에 관여 하 고, 막 횡단 단백질의 느린 역학 조사를 위해 특히 적합 하더라도 잔여 photobleaching 여전히 발생할 수 있습니다. 따라서, 선물이 수정 계획, 즉, 에 대 한 자세한 설명을 ccN & B, 그런 섭을 최소화에 대 한 sFCCS 및 기차 필터에 대 한 표백 보정. 또한, 우리는 효과적으로 셀의 측면 운동 등 다른 체계적인 물결에 대 한 올바른 숫자 정렬 알고리즘 토론 하 고 일시적인 불안을 제거 하는 지침을 제공. 이러한 불안의 주요 소스는 기공을 전송, 즉, 세포내 소포 관심사의 단백질을 운반 뚜렷이 초점 볼륨을 입력입니다. 다양 한 경우에서 비록이 현상 수 있습니다 일반적으로 심각 하 게 방해 데이터 수집 및 분석. 그러나, 보정 알고리즘의 응용 프로그램 확장된 측정 그 시간 특히 느린 방산 역학 조사 하는 데 필요한 수 있도록 수집의 안정성을 향상 시킵니다. 이와 관련, 그것은 퍼지는 역학의 존재 작업 메서드에 대 한 필수적인 조건 임을 밑줄이 수 있다. 아연 이온의 예 중재 APLP1 클러스터링 쇼 기술은 그것의 한계를 밀어 큰 소음으로 인해 기본 역학의 정확한 정량화를 방지 하는 큰, 매우 느린 단백질 복합물 (D ≈ 0.001 µ m2/s)의 과감 한 예 제한 된 수집 시간30,17에 의해 유도.

이러한 맥락에서 sFCS 및 초고 해상도 접근, 예를 들어, 검색 자극된 방출 소모 FCS (FCS 호텔 위치), 작은 초점 볼륨 및 이렇게 더 작은 효과적인 보급을 제공 하 여 도움이 될 수 있습니다 빗질에 최근의 진보39 회 ,40. 이것 또한 아연의 APLP1에 대 한 관찰로 단백질 클러스터 셀 연락처에서 관심사의 단백질의 휘도가 지역화 하는 경우를 해결 하기 위해 도울 수 있었다. 불행히도, 적용할 수 있는 바로 여기, 호텔 위치-FCS, 즉, 호텔 위치 FCCS 스캔의 교차 상관 구현은 성공적으로 증명 되지 아직 두 색 호텔 위치-FCS에 대 한 호환 염료를 찾아내기의 어려움 때문에. 충분히 빠른 역학 (D ≥ ~0.05 µ m2/s), 경우 sFCCS 분석 계량 단백질-셀 연락처 또는 오후12의 다른 지역에서의 확산을 수 있습니다.

(SFCCS, ccN & B), 모든 데이터에 대 한 밝기 분석을 수행 하는 더, 단백질 복합물 트랜스 의 산출할의 견적을 제공 하. 그것은 트랜스 (즉, 단지 몇 cis 단지 밝기 결정에도 영향을 미칠 수 있는 경우)에 단백질의 양을 산출할 정량화의 정확도 증가 언급 되어야 합니다. 밝기 분석 해결 다른 oligomeric, e.g.,cis 단위체 및 트랜스 tetramers의 혼합물을 허용 하지 않습니다. 더 일반적으로, 그것은 지적 되어야 N & B 균질 샘플에서 배포 다른 oligomeric 종의 혼합물을 해결할 수 없습니다. 여러 종 픽셀 내에서 존재 하는 경우 밝기의 하나의 단일 값 측정 (즉, 각 oligomeric 종족의 밝기의가 중된 평균) 될 것입니다. 관찰 된 명도 값 (예를 들어, 서로 다른 픽셀에서)의 통계 분포 oligomeric 종의 상대적인 양을에 직접 연결 하지. 이러한 혼합물을 해결 하려면 다른 방법을 사용 해야 합니다 (예를 들어, 공간 강도 분포 분석 (SpIDA)41, 광자 히스토그램 (PCH)42세). 마찬가지로, sFCCS에서 스펙트럼 간 상관 관계의 정량화를 간단 하 고, 알려진 stoichiometries에 대해서만 바운드 및 언바운드 단백질의 일부 예를 들어, 1: 1의 정확한 정량화를 제공합니다. 더 복잡 한 산출할에 대 한 추가 가정43을 만들 수 있다. 전반적으로, 밝기 분석 검출기 시스템 및 비 형광 FPs의 분수는 보정된23 프로토콜에 설명 된 대로 경우 강력한 실험 도구를 남아 있습니다.

여기에 제시 된 응용 프로그램은 부착 세포에 있는 단백질 단백질 상호 작용에 초점을 맞추고, 있지만 분석 결과 샘플, 예, 현 탁 액 셀의 넓은 범위에 적용할 수 있습니다. 이러한 시스템에 대 한 보정 측면 셀 운동에 대 한 특히 중요 한 있을 수 있습니다. 또한, 그것은 쉽게 모델 멤브레인 시스템 GUVs 또는 GPMVs, 잘 제어 조건, 예를 들어, 다른 지질 구성 또는 부족 조직 세포 막 분자 상호 작용의 정량화를 허용에 적용할 수 있습니다. 골격입니다. 이러한 vesicles에서 sFCCS를 수행할 때 수직 모션 추가 신호 변동, 하지만 큰 소포에 초점을 맞추고 때 최소화 될 수 있다. 이러한 맥락에서 여러 조합을 약속, 예를 들면, 우두머리-GPMV-셀 혼합12/. 최근 간행물 같이 면역 시 냅 스의 형성 같은 시스템44에 의해 성공적으로 모델링 될 수 있습니다. 따라서, 제시 분석 결과 확실히 큰 다양 한 세포 세포 상호 작용의 수사를 위해 유용한 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

이 작품은 부분적으로 도이치 가운데 (DFG)에 의해 지원 254850309를 부여. 저자는 원고의 중요 한 독서에 대 한 Madlen Luckner 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM growth medium PAN-Biotech P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-35500
Trypsin EDTA PAN-Biotech P10-023100
TurboFect Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific R0531
HEK 293T cells DSMZ ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A20000
Rhodamine B Sigma-Alderich 83689-1G
Plasmid DNA Addgene NA See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate Starlab CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes CellVis D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal Carl Zeiss NA
MATLAB software package MathWorks  2015b 
Neubauer cell counting chamber Marienfeld 640110

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References

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