ניתוח של Actomyosin בסולמות הסלולר והרקמה המקומית באמצעות הזמן- סרטים פקיעה של מתורבת ביצת ביצה צ'יימברס

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה ידידותית למשתמש המבוססת על פיג'י, יחד עם הוראות ברורות המסבירות כיצד לנתח באופן אמין את התנהגות actomyosin בתאים בודדים ורקמות אפיתל מעוקל. כישורי תיכנות אינם נדרשים לבצע את הלימוד; כל השלבים מתבצעים באופן חצי אינטראקטיבי באמצעות ממשק המשתמש הגרפי של פיג'י ותוספים משויכים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Viktorinová, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers. J. Vis. Exp. (148), e58587, doi:10.3791/58587 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

דרוזופילה ביצים לא בוגרות נקראות תאי ביצה, והמבנה שלהם דומה לאברים פרימיטיביים העוברים שינויים מורפולוגיים מסיבוב לצורת אליפסואיד במהלך הפיתוח. תהליך התפתחותי זה נקרא oogenesis והוא חיוני כדי לייצר ביצים בוגרות תפקודית כדי לאבטח את דור הזבוב הבא. מסיבות אלו שימשו תאי ביצה כמודל אידיאלי ורלבנטי להבנת התפתחות אברי החיות.

כמה מהפרוטוקולים בפרוטוקולים מחוץ למבחנה פותחו, אך קיימים מספר חסרונות לפרוטוקולים אלה. אחד כולל את היישום של כיסויים שונים, כי להפעיל לחץ מלאכותי על תאי ביצה התמונה כדי לשתק אותם ולהגדיל את מטוס רכישת התמונה של המשטח ההיקפי של תאי ביצה מנותח. גישה כזו עלולה להשפיע לרעה על ההתנהגות של מכונות actomyosin דק היוצר את הכוח לסובב תאי ביצה סביב הציר הארוך שלהם.

לפיכך, כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו התרבות דרוזולה תאי ביצה באופן חופשי בתקשורת כדי לנתח בצורה אמינה מכונות actomyosin לאורך ההיקף של תאי ביצה. בחלק הראשון של הפרוטוקול, אנו מספקים מדריך המפרט כיצד לנתח את מכונות actomyosin במישור רכישה מוגבלת בקנה מידה הסלולר המקומי (עד 15 תאים). בחלק השני של הפרוטוקול, אנו מספקים למשתמשים תוסף חדש מבוסס פיג'י המאפשר החילוץ הפשוט של שכבה דקה מוגדרת של משטח הביצה ' היקפי. לאחר מכן, הפרוטוקול הבא מתאר כיצד לנתח אותות actomyosin בסולם הרקמה (> 50 תאים). לבסוף, אנו מאתרים את המגבלות של גישות אלה הן בסולמות הסלולר והן הרקמה המקומית ודנים בפיתוח עתידי הפוטנציאלי וביישומים אפשריים.

Introduction

פיתוח מתמשך של הדמיה הרומן וטכנולוגיות תוכנה עם יישומים במדעי החיים סיפקה השפעה עצומה על הבנת עקרונות היסוד של החיים. אחד האתגרים העיקריים הוא ההדמיה המהימנה של תהליכים התפתחותיים בשילוב עם הדמיה חיה ברקמות שונות. רקמות הן חלקים של איברים וגופים, וככאלה, הרוב אינו נגיש בקלות להדמיה. לכן, הפרוטוקולים המאפשרים את הניתוח שלהם ובדיקת החוץ הגופית פותחו על מנת להמחיש אירועים ביולוגיים המשקפים בצורה מספקת את המצב הvivo בתוך גוף חי.

במהלך העשורים האחרונים, ההדמיה החיה של מתקני ביצים של דרוזוהילה , מבנים דמוי-שכבתית הדומים לאברים פרימיטיביים, תרמה רבות להבנת העקרונות הבסיסיים של פיתוח איברים פרימיטיביים1 , מיכל השני , 3. כיום, יש כמה פרוטוקולים culturing זמין, השימוש שלהם תלוי בזמן הרכישה, סוג התא כדי להיות בתמונה, ואת הנגישות שלהם (למשל, הפנימי germline מול קו הסומאטיק החיצוני)4.

תכונה נפוצה בכל הפרוטוקולים הללו culturing הוא הצורך השתק של תאי ביצה מנותח המציגים פעילות הקונקטילה גבוהה במדיה נוזלית. הפעילות הקונאקטעית של תאי ביצה נגרמת בעיקר על ידי גיליון השריר המכסה מחרוזת ארוכה של תאי ביצה מחוברים5,6,7. לכן, כדי להשיג השתק מתאים של תאי ביצים צעירים, התפתחו גישות שונות, מעורבים כיסוי תאי ביצה עם מכסים6,8,9 או שמיכות גמיש4, 10 או להטביע אותם בנקודת התכה נמוכה-ההיתוך3,11. גישות אלה הן פופולריות כפי שהם גם מאפשרים הדמיה של מטוס חזותי גדול יותר בשל שיטוח עדין של המשטח ההיקפי של תאי הביצה.

עם זאת, לאחרונה, זה הוכח כי חדרי ביצה צעירים (שלב 1-8) לסובב סביב הציר האחורי שלהם6 וכי תנועה זו רקמה מופעל על ידי רשת actomyosin קנס קרוב למשטח ההיקפי של אלה ביצה צעירים 12. לכן, שינוי מלאכותי של משטח הסלולר הנגרם על ידי שיטוח עדין של רקמה זו עשויה להיות השפעה שלילית על התנהגות של מכונות הפקת כוח actomyosin. קונטרפונקט הוא כי אם הרקמה הקאמרית ביצה אינו משוטח, הדמיה מיקרוסקופית של חלבונים על פני השטח הcircumשל תאי ביצה הופך להיות מוגבל עוד יותר על ידי גודל ירידה של מטוס הרכישה.

לכן, יש לנו פרוטוקולים משולבים מ פראסאד ואח '9 ואת המעבדה של סלסט ברג4,10 ועוד שונה אותם כך לא coverslip/שמיכה גמישה/agarose משמש בשיטה מפותחת. מרבית תאי הביצה מתורבתים באופן חופשי בתקשורת והפרוטוקול המוצג כאן חל רק מיקרוסקופ הפוך. . יש שני חלקים לפרוטוקול החלק הראשון מתמקד בניתוח של אותות actomyosin בקנה מידה הסלולר המקומי (עד 15 תאים) בתוך תאי ביצה. בחלק השני אנו מתמקדים בהתגברות על המגבלות הקשורות למישור הרכישה הקטן שנגרם כתוצאה מהתפירה החופשית של תאי הביצה. בהקשר זה, פיתחנו הרומן מבוססי פיג'י שיטה חישובית עם ממשק משתמש גרפי למחצה אינטראקטיבי באופן סלקטיבי ומתגלה שכבות מוגדרות של משטח רקמות. הדבר מלווה בפרוטוקול המתאר כיצד לנתח actomyosin בסולם הרקמה (כלומר, > 50 תאים). כמו החילוץ סלקטיבי של שכבה דקה מוגדרת של רקמות אפיתל מעוקל לא ניתן בקלות באמצעות הקרנת z-מחסנית קלאסית (איור 1), זו שיטה קלה לשימוש משמש כתנאי מוקדם חשוב להבין באופן מקיף את ה אופן הפעולה של רשת actomyosin דקה (< 1 μm) בסולם הרקמה בתאי ביצת דרוסופילה .

בנוסף, כדי להקל על הפרוטוקול, אנו מספקים למשל סרטים לפקיעה זמן (TLMs) וקבצים לדוגמה של מתויג בלתי שרירים רירן II התנהגות קונבנציונאלי (ראה קובץ משלים 3). רירן II הוא חלבון מוטורי ומייצג את החלק האקטיבי של המכונות actomyosin. כדי לדמות רירן II, אנו משתמשים הקווים הטרנסגניים הכוללים שרשרת אור שונה הרגולציה של רירן II בשם mrlc:: gfp (ראה טבלת חומרים לפרטים)12,13. כדי להמחיש את קרום התאים, הפרוטוקול מבוסס על צבעים מסחריים (ראה טבלת חומרים). פרוטוקול זה מתאים לא רק לניתוח של mrlc קטן מסוג subcellular:: אותות gfp12 אבל גם עבור כל החלקיקים בגודל זהה subcellular סביב ± 300 μm, כגון אלה שנצפו עם חיים-Act:: gfp12,14.

למרות ששני הפרוטוקולים הללו מוצגים באמצעות מבחנה בתאי ביצה מחוץ לגופית, רכישת אותות actomyosin יכול גם להתבצע באמצעות רקמות אחרות על אופטימיזציה של מדיה culturing ובהתאם לזמינות של או פלואור מתויג חלבונים עם צבעים מסחריים מתאימים או, למשל, מיקרוזריקות mRNA כדי להשיג פרופילים של ביטוי גנים ארעי. באופן דומה, הפרוטוקול המבוסס על פיג'י להפקת שכבה דקה ממשטח משטח, ניתן ליישם באופן כללי יותר אליפסואיד ורקמות כמו איברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: הפרוטוקול הבא מספק הוראות כיצד לנתח actomyosin ב הסלולר המקומי ובקנה מידה הרקמה בבית הביצה Drosophila ילה . הגישה בקנה מידה מקומי מאפשרת למשתמשים לנתח התנהגות actomyosin מפורטת של עד 15 תאים לכל תא ביצה ודורש רכישה של tlms לתקופה קצרה של זמן (5-10 דקות) באמצעות דימות במהירות גבוהה ומיקרוסקופ קונפוקלית הפוכה. לעומת זאת, קנה המידה של רקמת מספק למשתמשים עם מידע actomyosin ב 50-100 תאים ודורש רכישת TLMs לתקופה ארוכה של זמן (≥ 30 דקות) באמצעות דימות במהירות נמוכה מיקרוסקופ דיסק מסתובב הפוך (ראה איור 2 ו פרמטרים מומלצים בכל קנה מידה בטבלה 1). ההחלטה באיזו מידה לנתח אותות actomyosin תלוי לחלוטין בשאלה המדעית של המשתמש. בדיקה מלווה לקבלת החלטות אלה אמורות לסייע לבצע החלטה זו.

1. סולם הסלולר המקומי (LCS)

הערה: לנתח ולצלם בחדרי ביצה בעלי מבחנה תרבותית, עקבו אחר הפרוטוקול המתואר בקובץ המשלים 1. כדי לנתח TLMs שנרכשו, המשך בפרוטוקול הבא. קישורים לקבצי בדיקה מלווים של TLMs מסופקים בקובץ המשלים 3.

  1. עיבוד נתונים של TLMs בסולם הסלולר המקומי (LCS)
    1. תיקון אקונומיקה של TLMs כדי לפצות על התנוונות העוצמה של תוויות פלורסנט
      1. ודא שהיישום העדכני של פיג'י מותקן במחשב שבו נעשה שימוש על-ידי ביצוע ההוראות הבאות: פיג'י לפתוח את החור (למשל, TestMovie1. Tif מתוך הקובץ המשלים 3).
      2. פצל את ערוצי הצבעים על -ידי לחיצה על > צבע > לפצל ערוצים.
      3. בצע תיקון אקונומיקה בשני הערוצים באמצעות התמונה > התאים תיקון אקונומיקה > יחס פשוט > רקע עוצמה 0.0.
        הערה: אם מתקבלים תוצאות לא משביעות רצון, חקור אילו שיטות תיקון בתוסף זה מתאימה ביותר (לדוגמה, השתמש בהתאמת היסטוגרמה במקום ביחס פשוט).
    2. פילוח של תא כדי ליצור מסיכת תא עבור TLMs
      1. אם פיג'י כבר לא פתוח, פתח אותו מחדש (וודא שהוא עדכני) לאחר העזרה > עדכון > החיל שינויים > אישור.
      2. אם זה עדיין לא נעשה, להוריד את המאקרו Tissuecellmentמסרט. ijm (מ http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm). גרור ושחרר סקריפט זה לתוך פיג'י.
      3. פתח את קובץ ה-. tiff המתוקן של האקונומיקה (ראה סעיף 1.1.1). פצל את הערוצים של הקובץ שתוקן על-ידי אקונומיקה באמצעות תמונה > צבע > ערוצים מפוצלים.
      4. הפעל את קובץ ה-script שהועלה על ערוץ הממברנה של התא הפעיל של ה-, על-ידי לחיצה על הסמל הפעל בקובץ ה-script הפתוח. הגדר את הטשטוש של גאוס ל- 2.500 ורגישות זיהוי התא ל -1 ולחץ על אישור. על מנת לקבל מסיכת תא נחמדה, אל תשנה פרמטרים אלה לעיל. הגדר את עמידות הרעש המשוערת בין 10 ל-20 עבור הרכישה באמצעות המטרה 63 x ולחץ על אישור.
        הערה: למטרות אחרות, ייתכן שיידרשו פרמטרים שונים. מנקה הרקע בתוך מערכת החומר , העמידות הנמוכה ביותר ברעש.
      5. מסיכת תא שנוצרה מופיעה ב-"מחסנית מנותח" וגם בחלון חדש הנקרא ' שלמחסנית ' (G), ובנוסף, חלון קטן בשם ' הפעולה הדרושה ' מופיע. ממסכת התא ב-, התמקד רק בתאים במרכז ה-, ובחר באלה שיכולים לספק קווי מתאר מלאים ומוגדרים היטב ברחבי ה-.
      6. אם התאים הנבחרים מכילים קווי מתאר של תאים מלאכותיים/מיותרים, השתמש בחלון כלי המיזוג הנקרא פעולה הדרושה ב-, הדבר הנדרש. במקרה האחרון, עקבו אחר ההוראות שבחלון.
        הערה: ודא שקווי המתאר של התא מוגדרים היטב ומתאימים לקרומים התאים האמיתיים בתוך מכשיר שאינו מדויק ככל שניתן להשפיע על הניתוחים הבאים. מנופך ושינויים נוספים, כגון הסרת תאים לא רצויים, ניתן לבצע מאוחר יותר באמצעות הכלי מנהל פני השטח (המתואר בסעיף 1.1.3).
      7. כאשר התאים הנבחרים במרכז מתאימים בצורה יפה לקרומים האמיתיים של התא, שמור את המחסנית כקובץ. tiff לאחר הקובץ ≫ שמירה כ -> tiff.
    3. טעינת מסיכת התא שנוצרה למנהל פני השטח
      1. התקנת מנהל פני השטח תוסף15 לתוך ההתקנה בשימוש פיג'י. בצע את ההוראות של וויקטורנובה ואח '16.
      2. מנהל פני שטח פתוח באמצעות תוספים > פילוח > מנהל פני השטח (3d).
        הערה: חלון מנהל פני השטח מציג מספר לחצני פעולה בצד ימין וחלון ריק משמאל. כדי לראות את כל לחצני הפעולה, ייתכן שתידרש למתוח את החלון בגובהו/רוחבו. שים לב שמסגרות זמן יופיעו כפרוסות z.
      3. פתח את הקובץ המתאים של מחסנית. tiff למנהל פני השטח על-ידי לחיצה על קובץ > פתוח ובחר את התמונה לפתיחה (לדוגמה, ParticlesStack1. tif).
      4. במנהל פני השטח, לחץ על לחצן ' קרא תמונת חלוקה לרמות ' והגדר את האינדקס של ג'אקארד ל-60%.
        הערה: טעינת הקובץ ParticlesStack1. tif עשויה להימשך עד מספר דקות, בהתאם לעוצמת העיבוד של המחשב.
      5. לאחר הטעינה, כל תא יוקצה עם מספר S ויופיע בחלק השמאלי של חלון מנהל פני השטח.
        הערה: כדי להציג קווי מתאר ושמות תאים עבור כל התאים, סמן את תיבות הסימון הצג הכל והראה תוויות בתחתית החלון של מנהל פני השטח. מומלץ להשתמש בפונקציה זו לאחר שמספרי התאים נבדקו על נכונותם.
      6. לחץ על מספר ה-S הראשון; קו המתאר של התא המיובא מ-ParticlesStack1. tif מופיע ב-. בדוק כל מספר S מיובא עבור איכות החלוקה לרמות של התא ברחבי ה-, והסר תאים לא רצויים המציגים קווי מתאר של תאים שגויים. לשם כך, סמן את קו המתאר של התא ולחץ על הלחצן Delete.
        הערה: ניתן גם לתקן קווי מתאר של תאים מדויקים ולהוסיף קווי מתאר חדשים לתאים. הדבר מתואר בסעיף הדיונים.
      7. שמור את כל התאים המתוקן כקובץ RoiSet. zip על-ידי לחיצה על לחצן שמור לדיסק .
        הערה: אם ההפעלה צריכה להיות מופרעת, ניתן לטעון את הקובץ RoiSet לתוך מנהל פני השטח מאוחר יותר: לפתוח קטע בפיג (קובץ > פתוח) ובחר בחור. מנהל פני שטח פתוח באמצעות תוספים > פילוח > מנהל פני השטח (3d). טען את הקובץ RoiSet. zip המתאים על-ידי לחיצה על לחצן הטעינה מהדיסק ובחירת קובץ ה-RoiSet. zip המתאים. בדקו פעמיים שמסיכות התא הטעונות מתאימות ל-"טים" הטעון.
    4. תיקון עבור הסחף רקמות ב-TLMs
      הערה: במהלך זמן הרכישה של TLMs, השפעות הסחף עשויות להיות נצפו עקב סיבוב האפיתל או תנועה בלתי רצויה. בשני המקרים, אנו ממליצים לתקן את כל הסחף כדי לפשט את הניתוח הידני של actomyosin מאוחר יותר. תיקון הסחף נדרש רק עבור ניתוח actomyosin ידני. ערכת לימוד זו מחייבת תוכנה מעודכנת של פיג'י עם התוסף MultiStackReg (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) מותקן.
      1. פתחו את מתקן האקונומיקה בפיג באמצעות הקובץ > פתח ובחר את הקובץ המתוקן באקונומיקה שנוצר באמצעות ערכת הלימוד שהוזכרה לעיל.
      2. פצל את הערוצים ובחר באפשרות המזהה את קרום התא באמצעות תמונה > צבע > ערוצים מפוצלים.
      3. השתמש בפרוטוקול הבא כאשר קווי המתאר של התא אינם חלקים בעליל: תהליך ≫ מסננים > טשטוש לפי עקומת גאוס. הגדר אותו ~ 1 – 2 עבור מטרה 63 x ולחץ על אישור ואז כן. לחץ על תהליך ≫ בינארי > המר למסיכה באמצעות הגדרות ברירת המחדל; לאחר מכן, לחץ על אישור.
      4. טען את התוסף MultiStackReg לאחר התוספים > רישום > multistackreg.
      5. ודא שמחסנית 1 מוגדרת לערוץ קרום התא, פעולה 1 מוגדרת כיישור ושינוי צורה מוגדר כתרגום. בדוק את תיבת הסימון שמור קובץ המרה ולאחר מכן לחץ על אישור.
      6. פתח מחדש את ה-, MultiStackReg Plug-in, וקובץ ההמרה השמור באמצעות הקובץ > פתוח ובחר באפשרות. פצל את ערוצי הצבע באמצעות > צבע תמונה > לפצל ערוצים.
      7. טען את התוסף MultiStackReg על ידי לחיצה על תוספים > רישום > multistackreg. בחרו ' טען קובץ המרה כפעולה 1 '.
      8. השאר שינוי כגוף קשיח ולחץ על אישור. בחרו בקובץ ההמרה שנשמר בעבר ולחצו על ' אשר ' שוב.
      9. מזג את ערוצי התמונות ושמור את ה-"מיזוג" הרשום כקובץ. tiff לאחר התמונה > צבע > למזג ערוצים. שמור את הקובץ על-ידי לחיצה על קובץ שמירה בשם > Tiff.
        הערה: ישנן דרכים חלופיות כדי לתקן את הסחף רקמות בפיג, כלומר באמצעות תוספים > רישום Stackreg/תיקון 3d הסחף.
  2. ניתוח הפולסים של actomyosin במנהל פני השטח at LCS
    הערה: שלב זה של פרוטוקול מאפשר למדענים לזהות אם פולסים actomyosin נמצאים ברקמה מנותח ולהבין את ההתנהגות המפורטת, כמו גם את הכיווניות של אותות actomyosin.
    1. פתחו את פיג'י וודאו שמסכת התאים המתאימה פתוחה במנהל פני השטח.
      הערה: ודא שפיג'י מותקן ומעודכן ותוסף מנהל פני השטח מותקן (שלב 1.1.3.1).
    2. פתח קשר עם קובץ > פתוח ובחר באפשרות לפתיחה (לדוגמה, TestMovie1_bleach. tif). טען את מנהל פני השטח Plugin באמצעות תוספים > פילוח > מנהל פני השטח (3d). טען את מסיכת התא השמורה שנוצרה בערכת הלימוד כאן (לדוגמה, ParticlesStack1 . tif) באמצעות הקובץ > פתיחה ובחירה של מסיכת תא (לדוגמה, ParticlesStack1. tif). טען את אזור הריבית המתאים (ROI, לדוגמה, TestMovie1_RoiSet. zip). ראה איור 3A.
    3. מעבר לערוץ העניין של היחידה הנבחרת.
      הערה: כדי להבדיל בין הערוצים, פעל לפי קוד הצבע המצוין סביב האזור.
    4. במנהל פני השטח, לחץ על לחצן הסטטיסטיקה כדי לקבל את החלון הנקרא ערך אפור ממוצע פרוסה לפי פרוסה (איור 3 ב'). שים לב כי ערכי האינטנסיביות הממוצע/חציון של מאותת actomyosin בערוץ מנותח נתון בתוך קווי המתאר של התא המוגדרים לאורך זמן יוצגו, כמו גם פרמטרים אחרים הקשורים לאזור התא וצורת התא.
      הערה: ערכי האינטנסיביות נמצאים בתוך יחידות בוררויות (A.U.); אזור התא הוא בפיקסלים ויש צורך להמיר לתוך מיקרומטר מרובע.
    5. שמור את הערכים שהושגו כקובץ גיליון אלקטרוני. לחץ על החלון סטטיסטיקה, הקובץ שמירה בשם.
      הערה: לאחר מכן ניתן לוודא שהושגו ערכים סטטיסטיים מאוחר יותר: פתחו את היחידה לתיקון אקונומיקה בפיג ומנהלת פני השטח הפתוחה. טען את ה-RoiSet. zip המתאים ל-מיקוד על-ידי לחיצה על לחצן הטעינה מהדיסק ופתיחת הקובץ. המסיכה שנשמרה עם קווי מתאר של תאים יועלו ושמות התאים יופיעו בחלון מנהל המשטח השמאלי. לחץ על לחצן סטטיסטיקה עבור ערכים סטטיסטיים.
  3. ניתוח ידני של אותות בעלי הסלולר היחידניים ב-LCS
    הערה: פרוטוקול זה מחייב את רוב הריכוז והוא מגזול זמן רב. באופן כללי, ניתן לנתח את האדם בתוך יום אחד. זה לא כולל את הזמן להכנה לטוס לפני הניתוח שלהם, הניתוח עצמו, ורכישת תמונה.
    1. פתח את הטופס הנבחר, המתוקן והרשום (מתוקן להיסחף) ביישום פיג'י עדכני. השתמש בתיקון מלבין ומתוקן להיסחף (לדוגמה, TestMovie1_bleach_reg. tif) כדוגמה לבדיקה.
    2. כוונן את הבהירות והניגודיות כדי לראות את אותות actomyosin בודדים באמצעות התמונה > התאים ≫ בהירות /ניגודיות.
    3. יישר את TLMs באותו כיוון יחסית לציר הרקמה/הגוף. במקרה של תאי ביצה, ליישר את הצד הקדמי של תאי הביצה תמיד לשמאל התמונה/submovie/לפני הניתוח.
    4. חלק את הסרט הנבחר לסרטי משנה קצרים של 30 ולפרוייקט זמן כל אחד מהם. שמור סרטים משניים שאינם מוזמנים ומוקרן בזמן עם שמות מקבילים. . שמור את המקור המקורי
      הערה: ניתן ליצור סרטים משניים מתוך TLMs מקוריים על-ידי מחיקה ראשונה של מסגרות לא רצויות באמצעות תמונה > ערימות > מסיר פרוסה. הגדירו את הפרוסות שיוסרו וקבעו תוספת קבועה. המרה ל-RGB לפני השימוש במסיר הפרוסה כאשר תוספת = 1. כדי להקרין זמן בפרוייקט משנה של 30 s, לחץ על תמונה > ערימות > Z-project > Max עבור המסגרות המוגדרות (פרוסות) ולאחר מכן לחץ על אישור. לדלג על כל שנייה 30 של הסרט submovie כדי למנוע ספירה של אותות actomyosin 2x בשני שלאחר מכן 30 הסרטים המשניים.
    5. מניחים תמונה מוקרן בזמן ליד המקבילה של 30 הסרט המשנה (איור 4A, B). זהה את קו האות בסרט המשנה שמתוכנן בזמן. זיהוי הכיוון של תנועת האות actomyosin (0 ° – 360 °) לאורך קו זה בסרט המשנה המקורי על ידי השמעת ידנית הסרט submovie. השתמש בכלי זווית (בשורת פיג'י) כדי למדוד באופן ידני את כיוון תנועת האות ביחס לציר הרקמה המוגדר או לכלי הזמין דומה.
      הערה: פיג'י פועל רק בקנה מידה של 0 ° – 180 ° (איור 4C), והחישוב מראש של הערכים שהתקבלו על קנה מידה של 0 ° – 360 °. קו איתות תואם למסלול. של תנועת אות אחת לאורך זמן
    6. כדי למנוע כפילות בניתוח של אותות actomyosin, לסמן את קווי האות מנותח בתוך תאים בזמן מוקרן submovie (איור 4B, D).
    7. נתח את כל התאים שנבחרו בסרט המשנה של 30 ושמור את הזוויות שהתקבלו.
      הערה: לנתח רק התאים המשניים cytoplasmic actomyosin בתאי עם קווי מיתאר מוגדרים היטב ברחבי הדרך. לא לכלול תאים בודדים עם פחות מ 15-20 זיהה אותות ב-השלם. התעלם מאותות actomyosin העוברים בין תאים עקב מקורם הלא ידוע. דוגמה לספירת אותות עבור תא אחד שנותח בסרט המשנה של 30 מוצגת באיור 4D.
    8. המשך עד ל-30 הסרטים המשניים הארוכים של היחידה המנותח, ושמור את כל הזוויות הנמדדות של אותות actomyosin של אחד בקובץ הגיליון האלקטרוני.
    9. סיכום כל הזוויות שנמדדו במספר הרלוונטי של TLMs (התלויות בניסוי). התווה את אחוז הכיוון של אותות actomyosin שנותחו, לדוגמה, כדיאגרמת ורד עם טווח של 0 ° עד 360 ° עם תוכנה מועדפת.
      הערה: כדי לקבל תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית, מומלץ לנתח חמישה עד עשרה תאי ביצה עצמאיים של כל משלב של תא ביצה.

2. רקמת מאזניים

הערה: לנתח ולצלם בחדרי ביצה בעלי מבחנה תרבותית, עקבו אחר הפרוטוקול בקובץ המשלים 2. כדי לנתח TLMs שנרכשו, המשך בפרוטוקול הבא שלהלן. קבצי מבחנים מלווים של TLMs ממוקמים בקובץ המשלים 3.

  1. הוצאת פני שטח סלקטיבית של רקמות אפיתל מעוקל
    הערהפרוטוקול זה מאפשר למשתמשים לחלץ באופן סלקטיבי שכבה דקה של actomyosin ברקמת אפיתל מעוקל לאורך זמן. שלב פרוטוקול זה הוא ידידותי למשתמש ומבוסס על ממשק גרפי אינטואיטיבי. ניתן לנתח בנוחות (לחלץ משטח) מספר tlms. השתמש ב-TestMovie2. czi (מתוך הקובץ משלים 3) כדוגמה של מבחן.
    1. פתח יישום פיג'י עדכני (פיג'י > עזור עדכון > החיל שינויים > אישור).
    2. ודא כי הקרנת פני השטח של אליפסואיד תוסף15 מותקנת. עקבו אחרי וויקטנובה ואח'. . שישה עשרה
    3. פתח HDF5 ולייצא אותו כקובץ XML/על-ידי לחיצה על תוספים bigdataviewer > ייצוא תמונה נוכחית כקובץ XML/HDF5.
      הערה: הוא נדרש להגדרת נתיב ייצוא. החיסכון עצמו יכול להימשך מספר דקות ותלוי באורך של היחידה.
    4. פתח את הקובץ המיוצא בהקרנת פני השטח של אליפסואיד על-ידי לחיצה על תוספים במציג bigdataviewer ≫ הקרנת משטח אליפסוID > בחר קובץ XML.
      הערה: חלון חדש עם תצוגות משונן של חדר הביצה ודיאלוג כדי להנחות את המשתמש דרך העיבוד יופיע. פרטים על אופן הניווט בתצוגת הפרוסה ניתן למצוא ב-https://imagej.net/BigDataViewer.
    5. לחלון הדו שנקרא הקרנת שחלות יש כמה כרטיסיות. בכרטיסיית הדו הראשונה הנקראת תיבה תוחמת, הגדירו את גבולות ה-x ו-y של תא ביצה ביחד עם רוחב z של התיבה התוחמת (כלומר, העומק של מחסנית z/תא ביצה) והקישו set (איור 5a).
    6. כדי להגדיר גבולות, לחצני גרירה לצד x, y ו-z או להגדיר את קואורדינטות המספר בתיבות x, y ו-z. ודא כי הגבולות הם נדיבים מספיק כדי לקבל את החלק של חדר הביצה של עניין לתוך החילוץ פני השטח. החלקים הנבחרים של תא הביצה מודגשים בוורוד.
    7. עבור לכרטיסיה הנקראת בועות חיפוש בחלון הקרנת השחלות. הגדירו את הסיגמא ואת ערך השיא המינימלי; לאחר מכן, הקש מחשב כדי לזהות את אותות actomyosin (איור 5B), אשר יופיע כתמים ירוקים. נסה שוב לבצע שלב זה עם פרמטרים שונים עד שיימצאו מספיק נקודות (סביב 100).
      הערה: סיגמא 1 \ u20123 עם ערך שיא מינימלי 20 \ u2012100 עובד הטוב ביותר כדי לזהות אותות actomyosin של שלב 6 ל-8 תאי ביצה. זיהוי אותות actomyosin הוא צעד מכריע תלוי באיכות האות וגודלה. חשוב לאשר את הגודל הנכון של הכתמים הקיימים. אין כתמים/כתמים ירוקים גלויים בתמונה פירושו שהשלב הבא לא יפעל. דפדף בין מטוסי z שנבחרו כדי לראות כתמים.
    8. כדי לעצב את האליפסואיד, המשך בכרטיסיה הנקראת ' התאם אליפסואיד'. הגדר דגימות אקראיות ל-10,000, מרחק מחוץ לטווח החיתוך אל 1 \ u201210 ולאחר מכן לחץ על חשב (איור 5c).
      הערה: ככל שהמרחק החתוך נמוך יותר, כך האליפסואיד הרצוי יהיה מדויק יותר. לאחר מכן, הכרטיסייה שנקראת הקרנה תיפתח באופן אוטומטי ותאפשר את ההגדרה של הוצאת פני השטח. יש למטב את ההגדרות.
    9. המשך להתקדם עם הכרטיסייה הנקראת הטלה (איור 5d). הגדר מרחק הקרנה מינימלי ומקסימלי (כלומר, הרוחב של האליפסואיד הרצוי). היא מחויבת לקבוע מרחק הקרנה מינימלי ומקסימלי, כך שאזור אליפסואיד הוורוד המוגדר כולל את כל השכבה החיצונית של תא הביצה. הגדירו את מרחק הפרוסה (1 מומלץ).
      הערה: דוגמאות להתאמת אליפסואיד שגויה ומיטבית, וכתוצאה מכך פרמטרי הקרנה שגויים ואופטימליים מוצגים באיור 6A, C. ניתן להגדיר מאוחר יותר את השכבה הבפררית הדקה של הריבית. ודא שהאזור הוורוד של האליפסואיד עם הרוחב המוגדר על תא הביצה גלוי לפני ההקשה על חישוב. חשוב כי האליפסואיד הרצוי (קו יחיד ורוד) מתאים בצורה יפה למשטח האליפסואיד של תא ביצה על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר. אם התאמת האליפסואיד אינה טובה, סדר הגדרות שונות עד להשגת הוצאת המשטח הרצויה.
      1. הגדר רוחב פלט (≥ 800) וגובה (≥ 400) של האליפסואיד. הגדר מתוך איזו נקודת זמן שאליה יש ליצור את החילוץ פני השטח (כלומר, להגדיר את אורך מיצוי המים). בחרו הקרנה כדורית או גליל. היפוך Z וישר Y במידת הצורך.
      2. לחץ לחשב כדי לקבל מיצוי פני שטח עבור שני הערוצים בחלונות חדשים בשם תמונה. כוונן את הבהירות והניגודיות של חלונות התמונה שהושגו כדי לראות את האותות המוקרנת של actomyosin, על-ידי לחיצה על תמונה ≫ התאם ≫ בהירות /ניגודיות.
        הערה: דוגמה להשוואה בין הקרנה שנובעת מהתאמת אליפסואיד שגויה ואופטימלית מופיעה באיור 6B, D.
    10. אם הוצאת פני השטח נראית טוב, שמור את התמונות (שני הערוצים בנפרד) כ-tiff. בנוסף, שמור את קובץ החלון Log לעיון עתידי לגבי אופן החילוץ של פני השטח של תא ביצה מסוים זה.
      הערה: זה מידע חשוב במיוחד אם יש להחזיר את השכבה הדקה המחולץ לצורתו המקורית (למפתחים בלבד).
    11. מזג את הערוצים באמצעות קוד צבע מועדף בפיג.
      הערה: במקרה הצורך, הפרוייקט מחסנית z שנבחרה עם אותות actomyosin. הקרנת השכבות של מחסנית z הנבחרת נדרשת כאשר מוקד הרכישה משתנה מעט לאורך זמן ב-ביצוע. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הפרוייקט ברוב אחד עד שתי שכבות z-מחסנית.
    12. שמור את התוצאות כקבצי tiff.
      הערה: דוגמאות הנציג של שכבות דקות (בסיס סלקטיבי משטח הקודקוד) המייצגים את רירן II (MRLC:: GFP) האות מן האפיתל הזקיק של השליטה ו fat2 ביצה מוטציה ניתן למצוא באיור 8.
  2. עיבוד נתונים של משטח רקמה מחולץ סלקטיבי
    1. אקונומיקה-תקן את ה-TLMs כדי לפצות על הדעיכה האינטנסיביות של תוויות הפלורסנט.
      1. . פתח את פיג'י פתח את הקובץ (למשל, TestMovie2_extraction. tif מהקובץ המשלים 3) תוך שימוש בקובץ > פתוח. בחר בתמונה כדי לפתוח אותה.
      2. פצל את ערוצי הצבע והמר אותם לתמונות של 16 סיביות, במידת הצורך, על-ידי לחיצה על תמונה > צבע > פצל ערוצים. המר את הערוצים לתמונות של 16 סיביות (מתמונות 32 סיביות) באמצעות תמונה > סוג > 16 סיביות.
      3. בצע תיקון אקונומיקה בשני הערוצים באמצעות התמונה > התאים תיקון אקונומיקה > יחס פשוט > רקע עוצמה 0.0.
        הערה: אם מתקבלים תוצאות לא משביעות רצון, נדרש לחקור אילו שיטות תיקון בתוסף זה מתאימות ביותר (לדוגמה, השתמש בהתאמת היסטוגרמה במקום ביחס פשוט).
      4. מזג את הערוצים משתי התמונות שתוקנו על- ידי האקונומיקה על-ידי לחיצה > צבע > מיזוג ערוצים. שמור את התמונה הממוזגת כקובץ. tiff על-ידי לחיצה על קובץ שמירה בשם > tiff.
        הערה: כוונן את הניגודיות והבהירות עבור הערוצים במידת הצורך.
    2. פילוח של תא כדי ליצור מסיכת תא עבור TLMs
      1. אם פיג'י כבר לא פתוח, פתח אותו מחדש (וודא שהוא עדכני על-ידי לחיצה על עזרה > עדכון > החיל שינויים > אישור).
      2. אם זה עדיין לא נעשה כך, הורד את המאקרו מאקרו. ijm (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
      3. גרור ושחרר סקריפט זה לתוך פיג'י. פתח את הקובץ המתוקן באקונומיקה (לדוגמה, TestMovie2_bleach. tif מתוך הקובץ המשלים 3, ראה גם 2.2.1).
      4. פצל את הערוצים של הקובץ המתוקן באקונומיקה על-ידי לחיצה על תמונה > צבע > ערוצים מפוצלים. כוונן את ערוץ הממברנה כדי להבטיח קווי מתאר של תאים ברורים על-ידי לחיצה על תמונה ≫ התאם ≫ בהירות /ניגודיות.
      5. הפעל את קובץ ה-script שהועלה על ערוץ הממברנה של התא הפעיל של ה-, על-ידי לחיצה על הסמל הפעל בקובץ ה-script הפתוח. הגדר טשטוש גאוסיאני ל- 1.500. הגדר רגישות לזיהוי תאים 1 ולחץ על אישור. הגדר עמידות לרעשים מוערכים ל-~ 8 עבור הרכישה של tlms עם המטרה 40x ולחץ על אישור.
        הערה: על מנת לקבל מסיכת תא נחמדה, אל תשנה פרמטרים אלה לעיל. למטרות אחרות, ייתכן שיידרשו פרמטרים שונים. מנקה הרקע בתוך מערכת החומר , העמידות הנמוכה יותר ברעש.
      6. מסיכת תא שנוצרה מופיעה ב-"טים" המנותח וגם בחלון חדש הנקרא ' מחסנית ' (G). בנוסף, מופיע חלון קטן שנקרא ' פעולה '. ממסכת התא ב-, התמקד רק בתאים במרכז ה-, ובחר באלה שיכולים לספק קווי מתאר מלאים ומוגדרים היטב ברחבי ה-.
      7. אם התאים הנבחרים מכילים קווי מתאר של תאים מלאכותיים/מיותרים, השתמש בחלון כלי המיזוג הנקרא פעולה הדרושה ב-, הדבר הדרוש. במקרה האחרון, עקבו אחר ההוראות שבחלון.
        הערה: ודא שקווי המתאר של התא מוגדרים היטב ומתאימים לקרומים התאים האמיתיים בתוך מכשיר שאינו מדויק ככל שניתן להשפיע על הניתוחים הבאים. מנופך ושינויים נוספים, כגון הסרת תאים לא רצויים, ניתן לבצע במועד מאוחר יותר באמצעות הכלי מנהל פני השטח (המתואר במדריך להלן).
      8. כאשר התאים הנבחרים במרכז מתאימים יפה לקרומים האמיתיים של התא, שמור את המחסנית כקובץ . tiff לאחר הקובץ ≫ שמירה כ -> tiff. המשך לבצע את טעינת מסיכת התא שנוצר ואת ניתוח actomyosin מנהל פני השטח כפי שבוצעה בעבר סעיפים 1.1.3 ו 1.2 (המתואר גם בפירוט סעיפים 2.2.3 ו 2.3).
    3. טעינת מסיכת התא שנוצרה למנהל פני השטח
      1. אם מנהל פני השטח תוסף כבר מותקן בכיוונון פיג'י בשימוש, המשך לשלב 2. אם לא, עקבו אחר וויקטורנובה ואח '16. עבור מפתחים, רק קוד המקור זמין גם כן15.
      2. מנהל פני שטח פתוח על-ידי לחיצה על תוספים > פילוח > מנהל פני השטח (3d).
        הערה: חלון מנהל פני השטח מציג מספר לחצני פעולה בצד ימין וחלון ריק משמאל. כדי לראות את כל לחצני הפעולה, ייתכן שתידרש למתוח את החלון בגובהו/רוחבו. שים לב שמסגרות זמן יופיעו כפרוסות z.
      3. פתח את הקובץ המתאים למחסנית. tif לתוך מנהל פני השטח באמצעות הקובץ > פתח ובחר את התמונה לפתיחה (למשל, ParticleStack2. Tif מהקובץ המשלים 3).
      4. במנהל פני השטח, לחץ על לחצן ' קרא תמונת חלוקה לרמות ' והגדר את האינדקס של ג'אקארד ל-60%.
        הערה: טעינת קובץ מחסנית. tif יכול להימשך עד מספר דקות, בהתאם לעוצמת המחשב.
      5. לאחר הטעינה, כל תא יוקצה עם מספר S ויופיע בחלק השמאלי של חלון מנהל פני השטח (איור 7A).
        הערה: כדי להציג קווי מתאר ושמות תאים עבור כל התאים, סמן את תיבות הסימון הצג הכל והראה תוויות בתחתית החלון של מנהל פני השטח. מומלץ להשתמש בפונקציה זו לאחר שמספרי התאים נבדקו על נכונותם.
      6. לחץ על מספר ה-S הראשון; קו המתאר של התא המיובא מתוך מחסנית. tif מופיע ב-. בדוק כל מספר S מיובא עבור איכות החלוקה לרמות של התא ברחבי ה-, והסר תאים לא רצויים המציגים קווי מתאר של תאים שגויים. לשם כך, סמן את קו המתאר של התא ולחץ על הלחצן Delete.
        הערה: ניתן גם לתקן קווי מתאר של תאים מדויקים ולהוסיף קווי מתאר חדשים לתאים. הדבר מתואר בסעיף הדיונים.
      7. שמור את כל התאים המתוקן כקובץ RoiSet. zip על-ידי לחיצה על לחצן שמור לדיסק .
        הערה: אם ההפעלה צריכה להיות מופסקת, ניתן לטעון את הקובץ RoiSet. zip למנהל פני השטח מאוחר יותר: לפתוח את הקטע בפיג באמצעות הקובץ > פתוח ובחר בחור. מנהל פני שטח פתוח כדלקמן: תוספים > פילוח > מנהל פני השטח (3d). טען את RoiSet. zip המתאים על-ידי לחיצה על לחצן הטעינה מהדיסק ובחירת קובץ ה-RoiSet. zip המתאים (לדוגמה, TestMovie2_RoiSet. zip). בדקו פעמיים שמסיכות התא הטעונות מתאימות ל-"טים" הטעון.
  3. ניתוח פולסים במנהל פני השטח
    הערה: פתחו את פיג'י וודאו שמסכת התאים המתאימה פתוחה במנהל פני השטח. ודא שפיג'י מותקן ומעודכן ומנהל המשטח (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) מותקן.
    1. פתח קשר עם קובץ > פתוח ובחר באפשרות לפתיחה (לדוגמה, TestMovie2_bleach. tif). טען את תוסף מנהל פני השטח באמצעות תוספים > פילוח > מנהל פני השטח (3d). טען את מסיכת התא השמורה שנוצרה בערכת הלימוד כאן (לדוגמה, ParticlesStack2 . tif) באמצעות הקובץ > פתיחה ובחירה של מסיכת תא (לדוגמה, ParticlesStack2. tif). טען את התשואה המתאימה (לדוגמה, TestMovie2_RoiSet. zip).
    2. מעבר לערוץ העניין של היחידה הנבחרת.
      הערה: כדי להבחין בין הערוצים, פעל לפי קוד הצבע המצוין סביב האזור.
    3. במנהל פני השטח, לחץ על לחצן הסטטיסטיקה כדי לקבל את החלון הנקרא ערך אפור ממוצע פרוסה לפי פרוסה (איור 7b). שים לב כי ערכי האינטנסיביות הממוצע/חציון של מאותת actomyosin בערוץ מנותח נתון בתוך קווי המתאר של התא המוגדרים לאורך זמן יוצגו, כמו גם פרמטרים אחרים הקשורים לאזור התא וצורת התא.
      הערה: ערכי העוצמה הם ב-A.U.; אזור התא הוא בפיקסלים ויש צורך להמיר לתוך מיקרומטר מרובע.
    4. שמור את הערכים שהושגו כקובץ גיליון אלקטרוני: לחץ על החלון סטטיסטיקה, הקובץ שמירה בשם.
      הערה: ניתן לאמת את הערכים הסטטיסטיים שהושגו מאוחר יותר, כדלקמן. פתח את מתקן האקונומיקה בפיג. מנהל פני שטח פתוח. טען את ה-RoiSet. zip המתאים ל-מיקוד על-ידי לחיצה על לחצן הטעינה מהדיסק ופתיחת הקובץ. המסיכה שנשמרה עם קווי מתאר של תאים יועלו ושמות התאים יופיעו בחלון מנהל המשטח השמאלי. לחץ על לחצן סטטיסטיקה עבור ערכים סטטיסטיים.
      הערה: לגבי ניתוח ידני של אותות הסלולר actomyosin בודדים, לא ניתן לבצע ניתוח ידני של אותות actomyosin בקנה מידה של הרקמה. מיטוב נדרש לניתוח של אותות actomyosin בודדים בסולם למחצה רקמה, כפי שמסומן בסעיף הדיון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מאפשר למדענים לחקור את ההתנהגות של רשתות actomyosin ברקמות אפיתל. זה אפשרי רק כאשר ניתוח מפורט של התנהגות actomyosin בקנה מידה הסלולר המקומי (כמה תאים) משולב עם ניתוח דומה בסולם הרקמה (תאים רבים). עם זאת, רקמות אפיתל הן לעתים קרובות מעוקל והפקת שכבה דקה של רקמות אלה בעבר לא ניתן בקלות, כפי שמוצג בתאי ביצה Drosophila ילה (איור 1). הפרוטוקול המוצג כאן מספק למשתמשים הוראות פשוטות המתארות כיצד לנתח התנהגות actomyosin בשני סולמות אלה (איור 2).

החלק הראשון של פרוטוקול זה מתמקד בהוראות לגבי הניתוח של פולסים actomyosin באמצעות תוסף מנהל פני השטח (איור 3). הוא גם מתאר כיצד לנתח באופן ידני התנהגות actomyosin בודדים בקנה מידה הסלולר המקומי (איור 4). החלק השני של פרוטוקול זה מסביר כיצד לחלץ שכבה דקה של רקמת אפיתל באמצעות הקרנת פני השטח אליפסואיד (איור 5 ואיור 6). רק אז אפשר לנתח פולסים actomyosin בסולם הרקמה באמצעות תוסף מנהל פני השטח (איור 7). תוצאות הנציג והשוואה של התנהגות actomyosin בשליטה מסתובבת וסטטי fat2 מוטציה דרוזופילה ביצה בקנה מידה מקומי ורקמות התאים מוצג באיור 8 ובסרט המקביל 1, סרט 2, סרט 3, סרט 4, סרט 5, וסרט 6 (לפרטים, ראה איור 8).

Figure 1
איור 1: חילוץ סלקטיבי של שכבה דקה של משטח רקמה עקום. (א) על מנת להשיג מידע מספיק לגבי רשתות actomyosin בתוך מעוקל epithelia, יש צורך לרכוש מחסנית z עמוק (ורוד) מעל רוב רקמת נראה כפי שמוצג עבור האפיתל זקיק מעוקל (אפור) של משפחת דרוזוהילה . (א) עם זאת, הקרנה פשוטה של כזה z-מחסנית מוביל ערבוב של רשתות actomyosin שלם בתאי זקיק. רירן השני דמיינו עם mrlc:: gfp (ירוק) מראה את הביטוי הפנימי ביותר (apical) האזור של תאים זקיק בכזה z-הקרנה וכמעט אין מידע מן הבסיס (החיצוני) בצד, שבו רירן II מציג תא מישורי חזק הקוטביות פנוטיפ, אבל ה עוצמת האות נמוכה12. כדי למנוע ערבוב כזה כפי שמוצג בלוח A ', פיתחנו ידידותי למשתמש, התוסף מבוסס פיג'י בשם אליפסואיד הקרנה משטח ב bigdataviewer18 המאפשר (ב) החילוץ סלקטיבי של שכבה מוגדרת, דקה (ורוד ) של actomyosin מתוך אפיתל מעוקל (ב ') כפי שמוצג עבור רירן II (ירוק) בחילוץ נבחר של הבסיס (החיצוני) בצד של האפיתל זקיק. להשוות את ההבדל באות של רירן II (MRLC:: GFP) בלוחות A ' ו- B '. שים לב לתבנית מקוטב מישורי של רירן II בלוח B '. . קווי המתאר של התאים באדום . הצד הקדמי בצד שמאל סרגל קנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הרשת המקומית בגווני הסלולר והרקמה המקומיים. הדמיה של actomyosin בסולמות שונים מאפשר ניתוח של מספרים שונים של תאים אפיתל, כלומר (א) עד 15 תאים בקנה מידה הסלולר המקומי ו (ב) 50-100 תאים בסולם הרקמה של האפיתל הזקיק של תרבותי . בתאי ביצה דרוזופילה Nonmuscle II שרירים הוא דמיינו עם MRLC:: GFP (ירוק) ו-גנוטיפ של קו טרנסגניים משומשים מצוין בטבלה של חומרים. קווי המתאר של התא. נמצאים בתוך מגנטה . הצד הקדמי בצד שמאל סרגל ברים = 5 יקרומטר (A); 50 יקרומטר (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: דוגמה לניתוח פולסים רירן II במנהל פני השטח בקנה מידה הסלולר המקומי. (א) ערימת חלקיקים נטענת למנהל פני השטח. שים לב שכל התאים המזוהים ב-, מופיעים בחלון מנהל פני השטח. חשוב למחוק את כל התאים לא רצויים או לא מלאים לאורך הדרך. (ב) סטטיסטיקות שהתקבלו ב-רירן II (mrlc:: gfp) עבור תאים נבחרים מוצגים בחלון שנקרא ערך אפור ממוצע פרוסה לפי פרוסה במנהל פני השטח. MRLC:: GFP מוצג ירוק בעוד הקרומים הסלולריים הם באדום. . הצד הקדמי בצד שמאל אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: דוגמה לניתוח ידני של אותות רירן II בודדים בקנה מידה הסלולר המקומי. (א) הקרנת הזמן של סרט משנה שנבחר ב-30 s ממוקמת ליד (ב). שים לב כי עם הקרנת הזמן, רירן II (MRLC:: GFP) מראה קווי מסלול ארוך יותר (ראה פאנל B) בתוך תאים בודדים מאשר במסגרת זמן בודדים (ראה פאנל A). יש לנתח קווים בודדים בתאים לכיוון הזוויתי ביחס לציר האחורי הקדמי של תאי הביצה. (ג) הערה כי פיג'י אינו מודד 0 ° – 360 °, אלא רק 0 ° – 180 ° עבור אותות המצביעים עד 0 ° – 179 ° עבור אותות המצביעים למטה. שים לב כי 0 ° ממוקם atypically על ימין של תמונה מנותח. (ד) מבוסס על מידע זה, קווים הזזים עם (למעלה בוורוד) או נגד (למטה בצהוב) הכיוון של סיבוב האפיתל בחדר ביצה מסוים צריך להיות מקוטע כדי לזהות אם שבירת סימטריה של אותות מנותח נמצא בתוך תא ולאחר מכן עבור תאים מרובים ברקמה שנותחה. MRLC:: GFP מוצג ירוק בעוד הקרומים הסלולריים הם באדום. . הצד הקדמי בצד שמאל אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: דוגמה ליצירת אליפסואיד משתלבת בקנה המידה של הרקמה. כדי להתאים אליפסואיד אל תא ביצה באמצעות תוסף הקרנת המשטח של אליפסואיד ב-BigDataViewer, נדרש להגדיר תיבהתוחמת הכוללת את רוב הרקמה הסרוקה. לאחר מכן, חשוב (ב) כדי לזהות נקודות אות, שהן תנאי מוקדם ליצירת התאמה מיטבית של אליפסואיד. (ג) כאשר להתאים אליפסואיד אינו אופטימלי ואינו מקיף בצורה יפה את חדר הביצה, התוצאה היא הפקת שכבת רקמה עלובה. לראות את החילוץ ואת תוצאות ההקרנה מאוחר יותר באיור 6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: השוואה בין התאמת אליפסואיד שגויה ואופטימלית לבין התחזיות של פני השטח המתאימות. (א) כאשר האליפסואיד אינו מצויד כראוי, (ב) הקרנת פני השטח הסופית לא תספק נתוני אות מלאים בשכבה הדקה של הרקמה שנותחה. (ג) עם זאת, כאשר מצויד בצורה אופטימלית, היא מבטיחה זיהוי אותות שווה של שכבה דקה ברקמה. (ד) שים לב כי הקרנת המשטח האופטימלי מכילה מספר שכבות דקות כמחסנית zמוקרנת על פני השטח לאורך זמן, שניתן להפריד לאחר מכן כמוצג באיור 8. רירן II אותות (MRLC:: GFP, לבן) ואותות ממברנה (לבן) הם ממוזגים בתחילה לפני ההקרנה (פאנלים A ו- C), אבל על פני השטח עצמו, ערוצים אלה מופרדים (ראה התחזיות של רירן II בפאנלים B ו -D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: דוגמה לניתוח פולסים רירן II במנהל פני השטח בסולם הרקמה. (א) ערימת חלקיקים נטענת למנהל פני השטח. שים לב שכל התאים המזוהים ב-, מופיעים בחלון מנהל פני השטח. חשוב למחוק את כל התאים לא רצויים או לא מלאים לאורך הדרך. (ב) סטטיסטיקות שהתקבלו ב-רירן II (mrlc:: gfp) (ממוצע או חציון) עבור תאים נבחרים לאורך זמן מוצגים בחלון הנקרא פרוסה ממוצע אפור ערך באמצעות פרוסה במנהל פני השטח. שימו לב כי נקודות רירן II חזק עשוי להשפיע על המדד הסופי של אינטנסיביות רירן II הפנימי. תוצאה זו נובעת מהבעיה שנקודות אלה של רירן II עשויות להופיע מעבר לחלוקה לרמות של התא, שם קיימת הגדרת מיתאר תא שגויה במסכת התא שנוצרה. MRLC:: GFP מוצג ירוק בעוד הקרומים הסלולריים הם באדום. . הצד הקדמי נמצא למעלה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: תוצאות מייצגות של רשת רירן II ב האפיתל הדרוזויום זקיק. דוגמאות מייצגות של רירן II דינאמי (mrlc:: gfp) התנהגות (A ו- B) בקנה מידה הסלולר המקומי ו (C-F) בסולם הרקמה לשליטה וfat2 מוטציה דרוזופילה ביצה בתאי. ראה טבלת חומרים למידע מפורט על גנוטיפים משומשים. שים לב כי MRLC:: אותות GFP (ירוק) מעבר בניצב לציר האחורי הקדמי (AP) של תאי ביצה בקרה. הקוטביות הזאת אבודה בתאי ביצים fat2 מוטציה ומובילה ל-רירן הפולסים/תנודות של אניסוטרופי. לאחר ניתוח ידני של MRLC קטן:: אותות GFP (~ 300 μm) ואת הקוונפיקציה של התנועה זוויתי כיוונית כמתואר בפרוטוקול, שבירת סימטריה של MRLC:: אותות GFP ניתן לצפות עם העדפה נגד כיוון האפיתל סיבוב בחדר ביצה מנותח12 (איור 4). סרטים תואמים הם: פאנל A = סרט 1, פאנל B = הסרט 2, פאנל C = הסרט 3, פאנל D = הסרט 4, פאנל E = סרט 5, פאנל F = . הסרט השישי קווי מתאר של תאים מוצגים בארגמן. . הצד הקדמי בצד שמאל סרגל ברים = 5 יקרומטר (A ו- B) ו-50 יקרומטר (C-F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פרמטרים מומלצים להדמיה במהירות גבוהה בקנה מידה מקומי:
אני. רקמת הריבית מונחת באופן חופשי במדיום culturing (כלומר, ללא תעודות מכסות, שמיכות גמישות, וכו ')
השני. 63 x מטרה מים עם מפתח מספרי > = 1.3
השלישי. מיקרוסקופ קונקונוס הפוך
רביעי. מישור יחיד
v. 6-12 s מרווחי זמן
שישי. 5-10 דקות משניות
השביעי. דרישות אחסון נתונים לכל מקום עד 100MB
פרמטרים מומלצים לדימות מהיר וארוך בסולם הרקמה:
אני. רקמת הריבית מונחת באופן חופשי במדיום culturing (כלומר, ללא תעודות מכסות, שמיכות גמישות, וכו ')
השני. 40x מטרות מים מפתח מספרי > = 1.3
השלישי. מיקרוסקופ דיסק מסתובב הפוך
רביעי. z-ערימות לרכוש ca. מחצית של תא ביצה
v. 60 s מרווחי זמן
שישי. לפחות 30 דקות בלבד
השביעי. דרישות אחסון נתונים ca. 1GB

טבלה 1: פרמטרי הדמיה מומלצים.

Movie 1
סרט 1: התנהגות הנציג הדינמי של רירן II (MRLC:: GFP) בקנה מידה הסלולר בתוך שליטה בחדר הביצה דרוזולה . שים לב ש-MRLC:: GFP (ירוק) מעדיף לנוע בניצב לציר AP של תאי הביצה. קווי המתאר של התא. נמצאים בתוך מגנטה . הנוף הבזאלי . הצד הקדמי בצד שמאל סרגל קנה מידה = 5 μm. לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.

Movie 2
סרט 2: התנהגות הנציג הדינמי של רירן II (MRLC:: GFP) בסולם הסלולר בחדר ביצים . של fat2 מוטציה שים לב ש-MRLC:: פולסים מסוג GFP (ירוק) והוא כבר אינו מיושר מישורי בניצב לציר AP של תאי ביצה סטטיים. קווי המתאר של התא. נמצאים בתוך מגנטה . הנוף הבזאלי . הצד הקדמי בצד שמאל סרגל קנה מידה = 5 μm. לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.

Movie 3
סרט 3: התנהגות הנציג הדינמי של רירן II בסיס (MRLC:: GFP) בסולם הרקמה בתוך שליטה. בחדר הביצה שים לב כי רק בסיס דק (חיצוני) MRLC:: שכבת GFP מופק כמעט מחצית האפיתל הזקיק של תא ביצה. MRLC:: GFP הוא ירוק וקווי מתאר של התא נמצאים בתוך מגנטה. שים לב להבדל ברמת הפירוט של MRLC המתקבל:: התנהגות אות GFP כאן (המייצגת את קנה המידה של הרקמה) בהשוואה לסרט 1 (המייצג את הסולם התאי). . הצד הקדמי בצד שמאל סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.

Movie 4
סרט 4: נציג התנהגות דינמית של בסיס רירן II (MRLC:: GFP) בסולם הרקמה בחדר ביצה fat2 מוטציה דרוסופילה . שים לב כי MRLC:: GFP (ירוק) פולסים בחוזקה בצד הבסיס של כמעט חצי של האפיתל הזקיק של תא ביצה fat2 מוטציה ונכשל ליצור את כוח מסונכרן הנדרש כדי לקדם את הסיבוב האפיתל. קווי המתאר של התא. נמצאים בתוך מגנטה . הצד הקדמי בצד שמאל סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.

Movie 5
סרט 5: מייצג התנהגות דינמית של פסגה רירן II (mrlc:: gfp) בסולם הרקמה בתוך שליטה בחדר ביצה דרוזולה . רק mrlc דק:: שכבת gfp מופק מן פסגה (הפנימי) בצד של כמעט חצי של האפיתל הזקיק של תא ביצה. שים לב כי mrlc:: gfp (בירוק) מראה התנהגות דינמית שונה כאן בצד פסגה לעומת הצד הבסיס של האפיתל הזקיק (כפי שמוצג בסרט 3). קווי המתאר של התא. נמצאים בתוך מגנטה . הצד הקדמי בצד שמאל סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.

Movie 6
סרט 6: התנהגות הנציג הדינמי של פסגה רירן II (mrlc:: gfp) בקנה המידה של הרקמה. בחדר ביצת הfat2 מוטציות התנהגות דינמית שונתה של mrlc:: gfp (ירוק) שחולצו מאזור פסגה דק של כמעט חצי של האפיתל הזקיק של תא סטטי fat2 מוטציה ביצה. קווי המתאר של התא. נמצאים בתוך מגנטה . הצד הקדמי בצד שמאל סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלבים קריטיים ופתרון בעיות לחיתוך ולניתוח של תאי ביצה

אם זבובים רבים מדי ממוקמים לתוך בקבוקון קטן, האוכל לעוף יכול להפוך מלוכלך אחרי 2 – 3 ימים בשל כמויות נרחבות של הזחלים האכלה וזבובים מבוגרים לכודים במזון לעוף. במקרה כזה, להפוך את שאר הזבובים האלה לתוך בקבוקון חדש עם מזון טרי להוריד את המספר שלהם. בפרט, אין לכלול נקבות שנתקעו במזון.

יש להכין את תמהיל שניידר (SM) מראש וניתן לאחסנו ב-4 ° c ל-14 ימים. שים לב שתמהיל ישן יותר עשוי להכיל קריסטלים שעלולים להזיק למשטח של תאי ביצה. ערבב תמיד את ה-SM עם אינסולין מוסף טרי ולאפשר לו זמן מספיק כדי להגיע לטמפרטורת החדר. זה מגן על תאי ביצה נגד הלם קר, אשר יכול להיות השפעה שלילית על הצמיחה של microtubules ואת היישור מישורי של שלד התא (כפי שניתן לראות את אגף Drosophila ילה 19).

תאי ביצה ומאונות שנבחרו הם מאוד שבירים, ובגלל גודלם הקטן, עשוי לצוף ב-SMI (SM עם אינסולין). מומלץ לתת להם לשקוע באופן ספונטני ב-SMI. הם גם לעתים קרובות להיצמד הכלי מלקחיים/קקטוס. במקרה כזה, תן להם לשחרר את עצמם ממכשירים לחיתוך על ידי הזזת אותם בעדינות ב-SMI. הימנע לסחוט ולגעת בהם ישירות בכל עת. אם יש צורך, אין לכלול את תאי הביצה/האושתנים מהפרוטוקול נוסף.

כמו הניתוח סטריאוסקופ אינו אמין לזיהוי של תאי ביצה פגומים/ovarioles, תאי ביצה/ovarioles יש לבדוק באמצעות CellMask או FM 4-64 לצבוע תחת מיקרוסקופ/מסתובב הדיסק הקשיח. תאי ביצה פגומים להראות צביעה קיצונית לעומת רקע רקמת ביצה ניזוק. לעולם אל תרכוש את האקדח. עם תיקוני צבע חזקים

שלבים קריטיים ופתרון בעיות עבור הדמיה של מבחנה חיה בתאי ביצה

אם מניחים בחופשיות תאי ביצה ב smi עדיין לזוז, לבדוק שוב תחת המיקרוסקופ קונפוקלית וקד כדי לראות אם יש עדיין כל שאריות התעלמו של גיליון שריר ופסולת צף smi. הסר אותם ונסה שוב. של תאי הביצה, 90% צריך להיות יציב ומשותק במהלך הדמיה הבאים.

כדי לוודא שחדר הביצה/ovariole שנבחר יציב, השתמש בהדמיה במהירות גבוהה (6 מרווחי זמן) עבור 1 דקות. תאי ביצה לא יציבים. יזוזו בנקודה הזאת עם זאת, מומלץ לצפות בכל הקלטה של הזמן כדי להיות מסוגל לתקן בעדינות את התנועה הפוטנציאלית בלתי צפויה של תא ביצת התמונה. ניתן לעשות זאת על-ידי הזזת השלב/השולחן המיקרוסקופי, המחזיק בצלחת פטרי עם תאי ביצה מתורבתים/אושתנים, לתנוחה המקורית כך שחדר הביצה של העניין הוא שוב בחלון התמונה הממוקד.

הפסיקו לדמיין אם מופיעה תנועה פתאומית ובלתי צפויה של תא ביצת התמונה. בדוק את הריפוד של הטבלה המיקרוסקופ, ולהימנע הליכה ליד המיקרוסקופ בזמן הרכישה כמו זה עשוי לגרום לשיבוש רכישת התמונה בשל התנודות גרם.

אם צבע קרום התא אינו נראה לאחר 30 דקות, קו הלייזר המשמש נכון, להוסיף יותר את הצבע ולהגדיל את הריכוז שלו עבור הרכישה הבאה.

אם אותות actomyosin נראה מטושטש, לבדוק את NA של המטרה בשימוש. מבנה NA נמוך מ-1.3 יקטין את איכות ההדמיה. בנוסף, ודא כי שמן טבילה בשימוש הוחל כראוי על המים 63 x המטרה. הוסף או החלף אותו במידת הצורך.

אם תאי הביצית מתכווצים וממברנות התא שנצפו, בדקו אם המכסה סגור כראוי. אם המכסה חסר או לא סגור כראוי, תאי הביצה יכולים להתייבש בשל אידוי SMI על זמן הרכישה.

אם הסיבוב של תאי הביצה מאט או עוצר, להקטין את כוח הלייזר. אם חור מופיע בתא הביצה, הוא נשרף על ידי הלייזר. . הנמך את כוח הלייזר

אם actomyosin מאותת מלבין לאחר 2 דקות במהלך רכישת לייזר, להקטין את כוח הלייזר ולהגדיל את הגברה האות בתוכנת המיקרוסקופ.

פעם אחת, מומלץ להימנע מהדמיה שוב באותו אזור של תא ביצה, ולמנוע את הדימות של האפיתל הזקיק של תא ביצה אחד. עם זאת, כאשר תאי ביצה מסתובבים סביב ציר AP שלהם, אפשר לחזור על רכישת מנוע באמצעות חדר הביצה הניזוק הזה לאחר בסביבות 30 דקות. בעוד הדמיה האפיתל זקיק בחדר ביצה אחד, תאי ביצה אחרים לא יהיה מולבן/ניזוק גם אם הם ממוקמים באותו ovariole או ב ovariole אחר ב SMI.

אם כל הדרישות הללו מולאו, האחוז של תאי ביצה בעלי התמונה צריך להיות בסביבות 90%-100% עבור שלבים 6 – 8, בערך 50%-60% עבור שלבים 3 – 5, ובסביבות 20% – 30% עבור שלבים 1 – 2. כישלון הוא בעיקר בשל התנועה של תאי ביצה או נזק להם במהלך הניתוח/מניפולציה שלהם.

שלבים קריטיים ופתרון בעיות לעיבוד נתונים

במהלך יצירת מסכות באמצעות הסקריפט המסופק בפיג, זה יכול לקרות שיש הרבה קווי מתאר של תאים שנוצרו שאינם משקפים את הקרומים בפועל של התאים. זה נגרם לעתים קרובות על ידי רעש ברקע גבוה, במיוחד כאשר הצבעים לתאי הכתמים הכתם משמשים. במקרה כזה, כדי למנוע תיקון מייגע של קווי מתאר של תאים בלתי רצויים במסכה שנוצר, להפעיל את פילוח שוב ולהגדיר את הפרמטרים להתאמה הטובה ביותר. ניתן לבצע זאת על-ידי התאמת הפרמטר המשוער לרגישות לרעש.

בעת טעינת אחד מהקבצים המערם. tif המכילים קווי מיתאר של תאים למנהל פני השטח, זמן הטעינה מקנה מידה ליניארי עם מספר קווי המתאר של התא ויכול להימשך מספר דקות. אם הטעינה משובשת או שגויה, חזור על הפעולה. ודא שחלון ההעלאה נמצא בפוקוס ולא נעשה שימוש בתוכנית אחרת.

לעתים יש לתקן קו מיתאר של תא במסגרות מסוימות; במקרה כזה, השתמשו בלחצן ' מברשת '. צייר את קו המתאר התא הנכון במסגרת אחת מסוימת על-ידי גרירת העכבר סביב קרום התא. עבור למסגרת אחרת של ה-, ולאחר מכן, חזור למסגרת הזמן עם התיקון: החלוקה לרמות שגויה של התא אמורה להיות מוחלפת כעת. לאחר מכן, עבור שוב אל המסגרת הבאה כדי לתקן אותה. הכלי מברשת עובר כעת למצב מחיקה. במקרה הצורך, תקנו את קווי המתאר במסגרות הזמן הבאות על-ידי דחיפת החלוקה לרמות הקיימת של התא ולאחר מכן הקשה על הלחצן + Add כדי ליצור חלוקה לרמות חדשה של תא. מחק את מספר ה-S הישן מחלון מנהל פני השטח ושנה את שם החלוקה לרמות החדשה על-ידי לחיצה על לחצן שנה שם במידת הצורך.

אם תא חשוב שלם חסר במהלך הפעולה, צור חלוקה לרמות חדשה של מסיכה על-ידי לחיצה על ביטול ה> מצולע. צור מיתאר תא חדש במסגרת הראשונה של ה-"טים" על-ידי לחיצה לאורך קרום התא. לאחר מכן, עבור אל המסגרת האחרונה של ה-, ועשה אותו דבר עבור התא הנבחר. על-ידי הפעלת הסרט בזמן, מיתאר התאים יאינטרפולציה. במידת הצורך, תקן את הכלי מברשת . לאחר סיום, הקש על הלחצן + הוסף ושנה את שם המיתאר של התא על-ידי לחיצה על לחצן שינוי שם . הנקודות/לחיצות יותר ליצירת חלוקה לרמות חדשה של תא, האינטרפולציה מתאימה יותר.

מלבד סיבוב האפיתל, TLMs מושפעים לעיתים על ידי תנועה לא רצויה. לכן, מומלץ לתקן את הסחיפה של רקמות אלה ב-Tms אלה. על-ידי כך, TLMs מתוקנות גם עבור סיבוב אפיתל של תאי ביצה, וממברנות התא להיות נוקשה. פעולה זו הופכת את הניתוח הידני של אותות actomyosin לקל יותר. עם זאת, גישה כזו אינה מאפשרת למדענים להבחין אם אותות actomyosin שנצפו להעביר או הם סטטיים יחסית קרום התא. אם הבחנה בין תנועות סטטי ופעיל של אותות actomyosin היא המטרה של ניתוח כזה, אין להחיל תיקון להיסחף רקמות. מצאנו כי רוב האותות actomyosin לנוע באופן פעיל ביחס קרום התא ורק חלק קטן מהם מופיעים סטטי.

שלבים קריטיים ופתרון בעיות לניתוח אותות actomyosin subcellular

אם הסטטיסטיקה שנוצרה מכילה החוצה, ודא שכל הערכים הנמוכים או הגבוהים ביותר ביחס לערכת הנתונים כולה משקפים באמת את אופן הפעולה בתא ואינם חפצים. ניתן לעשות זאת על-ידי זיהוי התא המכיל את המודדות ובדיקת איכות החלוקה לרמות של התא בזמן שבו הערך הנמוך/גבוה נמדד. לעתים קרובות, ערכים קיצוניים כאלה נובעים מקווי מתאר של תאים פגומים שמודדים באופן שגוי חלק מתא אחר. הדבר עשוי להיות ברור במיוחד כאשר כתמים גדולים מפריעים למתאר התא של תא שכן. במקרה כזה, חשוב לתקן את קווי המתאר של התא ולחזור על המדידה.

כדי להקל על הכמת, נתח את האותות במשטח תא אחד והמשך אחד אחרי השני עד שכל התאים נותחו בסרט משנה. התוצאות של ניתוח ידני של האותות actomyosin הsubcellular לא יכול להראות שבירת סימטריה בתא אחד וחדר ביצה מסוים אחד. חווינו כי actomyosin לא ברור לשבור סימטריה יחסית לתנועת רקמות ב< 10% של תאי ביצה מסתובבת (שלבים 6 – 8). אחוז זה מוגבר סביב שלב 412. מצאנו גם כי אין הבדל אם 5 דקות או 10 דקות מנותח בזיהוי של הכיוון המועדף של תנועת האות actomyosin בתא ביצה12.

שלבים קריטיים ופתרון בעיות לחילוץ סלקטיבי של אותות actomyosin מרקמות מעוקל

בגודל הלא נכון של כתמים (אותות מזוהים) יגרום ללא כתמים התוכנית יקפא בשלב הבא. במקרה זה, כפיית הפסקת פיג'י והפעל מחדש את הקרנת המשטח של התוסף אליפסואיד. בצע אותו דבר כאשר התוכנית אינה מגיבה לאחר הקשה על חישוב. לעתים קרובות, זהו סימן לכך שנבחרו פרמטרים לא מתאימים.

אם יש יותר מדי כתמים ו/אם הם מרוכזים לכיוון צד אחד של תא ביצה שנותחו, זה עשוי להשפיע על אליפסואיד מעוצב ולא לספק את ההתאמה הנכונה לחדר הביצה. חזור לזיהוי הכתמים ונסה לסדר את גודלם בשילוב עם הבחירה בציר x, y ו-z של תא הביצה. כישלון ביצירת התאמה אליפסואיד טובה מתרחש לעתים קרובות גם כאשר נעשה שימוש בהגדרות מרחק בלתי מתאימות.

התחזיות שהתקבלו עשוי לפעמים להיראות ממוקד, או אולי מטוס z שהושג למעשה נע בין שכבות התא ליד פני השטח של תא ביצה. זהו בדרך כלל סימן לאליפסואיד מתאים למדי, שאזור אחד של האליפסואיד מוגדר רחוק מדי מחדר הביצה. נסו להתאים את האליפסואיד כך שהיא תחזק את המרחק מההיקף של תא הביצה.

מגבלות השיטה וגישות הרומן

משמיט את השיטוח העדין. של המשטח של תא ביצה למטרה זו, לשיטה זו יש יתרונות וחסרונות. בעת שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית, הוא מספק למשתמשים ברזולוציה גבוהה והדמיה במהירות גבוהה כי מהימן חושף actomyosin התנהגות בתאים בהיקף של תאי ביצה לתקופה קצרה של זמן (5 – 10 דקות). עם זאת, על-ידי כך, הוא מגביל את הגודל של מישור יחיד שניתן לבצע בו יצירת תמונה עם מיקרוסקופ באמצעות מיקוד לאורך זמן. באופן כללי, ניתן לדמות עד ~ 15 תאים לכל חדר ביצה בשלבים 6-8 אבל רק על שני תאים בתאי ביצה בשלבים 1 – 5. לכן, הגדרתם כאן שיטה זו כמתאימה רק לקנה המידה התאי המקומי.

כדי להתגבר על מגבלות גודל אלה הנגרמות על ידי הגודל המוגבל של מישור קונפוקלית וקד אחד, פיתחנו גישה חלופית מבוססת פיג'י הנקראת הקרנת משטח אליפסואיד, לשימוש בסולם הרקמה. זה משלב מיקרוסקופ דיסק מסתובב עם משטח למחצה אינטראקטיבית של תאי ביצה בסולם הרקמה. בדרך זו, אותות actomyosin ניתן לקבל באותו זמן עבור יותר מ 50--100 תאים מחדר ביצה אחד ניתח. חשוב לציין כי גישה זו מפיקה קבוצות נתונים גדולים מאוד של הנתונים הנרכשים (~ giga בתים), יש רזולוציה נמוכה יותר (היא משתמשת 40x לעומת מטרה 63 x), וכן מספק מהירות הדמיה איטית יותר (זה לוקח ~ 60 s כדי לסרוק דרך מחצית הרקמה של ביצה צ'אם בר [שלבים 6 – 8] וככזה, הוא איטי ב-10x מאשר השיטה המוגבלת של המישור הקונמטאני.

לעומת תוכנה קיימת אחרת לחילוץ התחזיות שכבתית ממשטחים parametrized, התוסף שפותח עבור פרוטוקול זה מתמקד קלות שימוש ומשוב חזותי אינטראקטיבי בכל שלב של התהליך. כלים נוספים, כגון MATLAB המבוססות על שפוי,20, מתמקדים בטיפולבמגוון רחב של דגמי שטח parametrized וnonparametrized ובשיטות הקרנה שונות. לדוגמה, ImSaNE דורשת שהנתונים יעובדו מראש ויהיו מיושרים באופן מסוים ומחייבים באופן חלקי כלים חיצוניים בשלבי ביניים. לעומת זאת, התוסף המוצג כאן מטפל בכל התמונה 3D/4D/5D (רצף) שניתן לפתוח בפיג ללא עיבוד מקדים חיצוני. בעוד ImSaNE הוא מאוד להגדרה (ניתן לתיכנות) על ידי עריכת קבצי script MATLAB, אנו מספקים קבוצה מינימלית של אפשרויות בזרימת עבודה אחת המותאמת לבעיה הספציפית שנדונה כאן. כל שלב של זרימת העבודה האינטראקטיבית מספק תוצאות שניתן לבדוק ולכוונן באופן מיידי במידת הצורך.

ההחלטה לגבי הגישות האלה של הדמיה, מרחב הסלולר או הרקמה המקומית, היא הטובה ביותר לניסוי מסוים, תלויה גרידא בשאלה המדעית להיענות (כלומר, גבוה יותר לעומת רזולוציה נמוכה יותר) קצר לעומת זמן הרכישה הארוך). פשרה טובה בין שני סולמות אלה יכול להיות לשלב את שתי הגישות, ובכך להשיג את הדמיה של אותות actomyosin בסולם למחצה רקמה (כלומר, 20 – 30 תאים). זה דורש מיקרוסקופ דיסק מסתובב, עדשת המים 63 x עם NA ≥ 1.3, והקימו z-מחסנית הגדרות עבור 20 – 30 תאים של תא ביצה. זה הרבה רדודים z-מחסנית (בניגוד z-מחסנית נדרש לרכישת חצי אחד של תא ביצה) מאפשר סריקה מהירה יותר של מתחת 60 s. הזמן הנרכש כאן יכול לשמש עבור הרכישה חוזרת-מחסנית z כדי להאיץ את ההדמיה או לשחזור לדוגמה (הזמן הפנימי) בין היחידה z-ערימות. עם האחרון, זמן רכישה ארוך יותר (> 30 דקות) של TLMs של תאי ביצה מסתובבת ניתן להשיג. זו גישה למחצה רקמה מבטיח החלטה מספקת עבור אותות actomyosin והדמיה של תאים נוספים באותו זמן על תקופות זמן ארוכות יותר.

חזון ואפליקציות עתידיות

שתי השיטות המתוארות (בסולם הסלולר והרקמה המקומיות) מספקות גישה פשוטה ובעלות נמוכה (למעט מכשירי מיקרוסקופ) עם תופעות לוואי מוגבלות ברשת actomyosin וניתן ליישם אותה ולאמץ אותה בקלות לרקמות אחרות בעלי בעלי חיים. תנאי הדרישה היחיד כאן הוא פרוטוקול culturing קיים בצלחת פטרי עבור רקמה מעוקל של ריבית, טרנסגנים זמינים, סמנים או שיטות תיוג.

בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית מנייר אור22, זה גם אפשרי התמונה actomyosin מכונות בטוטו (כלומר, התמונה משטח הקרקע המלא החיצוני של ביצה Drosophila ילה במקביל ולאחר מכן לאחר מכן להתפתח באמצעות תוסף אליפסואיד להפקת משטח). עם זאת, יש מספר מגבלות שצריך להיפתר במונחים של התאמה להדמיה במהירות גבוהה של אותות actomyosin, כלומר 1) הטבעה של תאי ביצה בנקודה נמוכה ההיתוך היתוך או הדבקים שלהם נימי במהלך הדמיה; ii) מפתח מספרי נמוך של עדשות מים משומשים, כי אינם מספקים מספיק רזולוציה actomyosin האות; iii) הזמן הנוסף הדרוש לרכישת מספר זוויות של תאי ביצה, המונע הדמיה במהירות גבוהה.

לשם כך, זה נראה כי, עם עידון של פרמטרים מיקרוסקופ כגון מהירות לסרוק דרך רקמת אפיתל ושיפור של עדשות מיקרוסקופיים משומשים, ניתוח מפורט של מכונות actomyosin יהיה, בעתיד, לאפשר מבטיח תוצאות ברזולוציה גבוהה להיות מושגת על הרקמה בסולם הטוטו לאורך תקופות זמן רב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מודים מאוד למרים אוסטררפילד על שיתוף עצתה ביצירת הדמיה של תאי ביצה באמצעות גישה שאומצה מהמעבדה של סלסט ברג4. אנחנו גם מודים לסבסטיאן טוסי על התסריט של פיג'י המאפשר פילוח של תאים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Schneider Medium Gibco 21720-024 [+]-Glutamine
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122  [+] 10.000 Units/mL Penicillin [+] 10.000 µg/mL Streptomycin
Fetal Bovine Serum Sigma  F135 Heat inactivated
Insulin Solution Human Sigma  I9278
50 mL Falcon tubes Eppendorf sterile
Millex-GV filter Millipore SLGV033NS 33 mm
Glass Bottom Microwell Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-14-C 35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass
Forceps A. Dumont & Fils  #55
CellMask Deep Red (cell membrane dye) Invitrogen C10046
FM4-64 (cell membrane dye) ThermoFisher/Invitrogen T13320
Depression dissection slide Fisher Scientific 12-560B
Microscopic equipment
Steromicroscope e.g. Zeiss Stemi SV 6
Inverted confocal microscope e.g. Zeiss/Olympus
Spinning disc microscope e.g. Zeiss/Andor
Microscopic glass/cover glass e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit needle holder Hammacher 9160020
Cactus spine Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila stocks used in the manuscript
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
  2. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
  3. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries. Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
  4. Peters, N. C., Berg, C. A. In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method. Methods of Molecular Biology. 35-68 (2016).
  5. Spradling, A. C. Developmental Genetics of Oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. Bate, M., Arias, A. M. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
  6. Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
  7. Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development. 143, 1375-1387 (2016).
  8. Pokrywka, N. J. Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).
  9. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
  10. Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).
  11. Cetera, M., et al. Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation. Nature Communications. 5, 5511 (2014).
  12. Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).
  13. Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
  14. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).
  15. Haase, R. Surface manager. Available from: https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager (2018).
  16. Viktorinova, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies. Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018).
  17. Pietzsch, T. BigDataViewer. Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017).
  18. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
  19. Turner, C. M., Adler, P. N. Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila. Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).
  20. Heemskerk, I., Streichan, S. J. Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction. Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).
  21. Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
  22. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics