Pulmão microRNA Profiling através do ciclo estral em camundongos expostos de ozônio

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Aqui nós descrevemos um método para avaliar a expressão de pulmão de miRNAs que são previstos para regular os genes inflamatórios usar ratos expostos ao ozônio ou ar filtrado em diferentes fases do ciclo estral.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fuentes, N., Silveyra, P. Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice. J. Vis. Exp. (143), e58664, doi:10.3791/58664 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Criação de perfil de MicroRNA (miRNA) tornou-se de interesse para os investigadores que trabalham em diversas áreas de pesquisa da biologia e da medicina. Atuais estudos mostram um promissor futuro de usar miRNAs no diagnóstico e cuidados de doenças pulmonares. Aqui, definimos um protocolo para miRNA perfis para medir a abundância relativa de um grupo de miRNAs previstos para regular os genes inflamatórios no tecido do pulmão de um modelo de mouse de inflamação das vias aéreas induzida por ozônio. Porque tem sido demonstrado que os níveis de hormônio sexual circulante podem afetar a regulação da imunidade inata de pulmão em mulheres, a finalidade desse método é descrever um inflamatório miRNA perfilação protocolo em ratos fêmeas, levando em consideração o ciclo estral estágio de cada animal no momento da exposição do ozônio. Abordamos também abordagens aplicáveis bioinformática com miRNA uma métodos de identificação de descoberta e de destino usando- se, um software R/Bioconductor, e software de análise funcional de entender o contexto biológico e caminhos associados expressão diferencial de miRNA.

Introduction

microRNAs (miRNAs) são curtos (19-25 nucleotides), ocorrem naturalmente, não-codificantes moléculas de RNA. Sequências de miRNAs são evolutivas conservada entre espécies, sugerindo a importância de miRNAs na regulação de funções fisiológicas1. microRNA expression profiling tem provado para ser útil para identificar os miRNAs que são importantes na regulação de uma variedade de processos, incluindo a resposta imune, diferenciação celular, processos de desenvolvimento e apoptose2. Mais recentemente, os miRNAs foram reconhecidos por seu potencial uso no diagnóstico da doença e terapêutica. Para pesquisadores estudando os mecanismos de regulação gênica, medir miRNA expressão pode iluminar sistemas-nível modelos de processos regulatórios, especialmente quando informações miRNA são mescladas com mRNA profiling e outros dados de genoma-escala3. Por outro lado, os miRNAs também foram mostrados para ser mais estável que os mRNAs em uma variedade de tipos de amostra e também são mensuráveis com maior sensibilidade do que proteínas4. Isto levou a interesse considerável no desenvolvimento de miRNAs como biomarcadores para diversas aplicações de diagnósticos moleculares, incluindo doenças pulmonares.

No pulmão, miRNAs desempenham um papel importante nos processos de desenvolvimento e a manutenção da homeostase. Além disso, sua expressão anormal tem sido associada com o desenvolvimento e a progressão de várias doenças pulmonares5. Doença pulmonar inflamatória induzida pela poluição do ar tem demonstrado maior gravidade e pior prognóstico nas fêmeas, indicando que os hormônios e o ciclo estral podem regular pulmão inata imunidade e miRNA expressão em resposta aos desafios ambientais 6. no presente protocolo, usamos a exposição de ozônio, que é um componente importante da poluição do ar, para induzir uma forma de inflamação pulmonar em ratos fêmeas que ocorre na ausência de imunidade adaptativa. Usando ozônio, nós estão induzindo o desenvolvimento das vias aéreas hyperresponsiveness que está associada a danos nas células epiteliais das vias respiratórias e um aumento de neutrófilos e mediadores inflamatórios em vias aéreas proximais7. Atualmente, não existem protocolos bem descritos para caracterizar e analisar os miRNAs em todo o ciclo estral em camundongos expostos de ozônio.

Abaixo, descrevemos um método simples para identificar os estágios do ciclo estral e miRNA expressão no tecido pulmonar de ratos fêmeas exposto ao ozônio. Também abordamos a bioinformática eficazes abordagens para identificação miRNA descoberta e alvo, com ênfase na biologia computacional. Analisamos os dados de microarray usando- se, um software de R/Bioconductor que fornece uma solução integrada para a análise de dados a partir de experimentos de expressão de gene8. Análise de dados de matriz PCR de se tem uma vantagem em termos de poder sobre os procedimentos de teste-t com base quando usando o pequeno número de amostras/matrizes para comparar a expressão. Para compreender o contexto biológico miRNA dos resultados da expressão, usamos o software de análise funcional. Para entender os mecanismos de regulação transcricionais mudanças e prever os prováveis resultados, o software combina miRNA-expressão datasets e conhecimento a partir da literatura9. Esta é uma vantagem quando comparado com o software que só olham para o enriquecimento estatístico em sobreposição a conjuntos de miRNAs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Penn State University.

1. avaliação do estágio do ciclo estral

  1. Corretamente, conter uma fêmea C57BL/6 mouse (8 – 9 semanas de idade) usando a técnica de contenção de rato com uma mão descrita em Machholz et al10.
  2. Encha a pipeta plástica estéril com 10 μL de água ultra pura.
  3. Introduza a ponta da pipeta plástica na vagina.
  4. Lave suavemente o líquido 4 a 5 vezes para coletar a amostra.
  5. Coloque o resplendor final contendo fluido vaginal em uma lâmina de vidro.
  6. Observe o resplendor imaculado vaginal sob um microscópio de luz com um objectivo de 20x.
    Nota: Animais que não apresentem ciclos regulares devido a pseudopregnancy ou outras causas que devam ser excluídos do experimento. É recomendável executar as secreções vaginais diárias pelo menos três ciclos consecutivos confirmar o simbolo.

2. a exposição ao ozônio

  1. Coloque um máximo de 4 ratos em dois recipientes de vidro 1,2 L com tampas de malha de arame e água ad libitum.
  2. Coloque um recipiente de vidro em câmara de ozônio e o outro em câmara de exposição de ar filtrado.
  3. Ajuste a concentração de ozônio aos níveis de ozono 2 ppm e monitor regularmente.
    Nota: O aparelho de ozônio proporciona um fluxo de ar regulamentado (> 30 ar alterações/h) com controle de temperatura (25 ° C) e umidade relativa (50%). O sistema gera o ozônio por um ozonizador de descarga elétrica, que é monitorado e controlado por um analisador de ozônio ultravioleta e controladores de fluxo de massa, conforme descrito anteriormente,11.
  4. Remova os recipientes de vidro após 3 h de exposição de ar de ozônio/filtrada. Retorno de animais de gaiola com roupa de cama, comida e água ad libitum.

3. pulmão coleção

  1. 4h após a exposição, anestesiar animais com uma injeção intraperitoneal de uma cetamina/xilazina cocktail (90 mg/kg de cetamina, xilazina 10 mg/kg).
    Nota: Para confirmar um nível adequado de anestesia, verifique o mouse para um pedal reflex (pitada de dedo firme) e ajuste o anestésico conforme necessário.
  2. Umedecer a pele de rato com etanol a 70%.
  3. Fazer uma incisão de 2 cm, usando uma operação tesoura e pinça cirúrgica para expor a veia cava.
  4. Sacrificar os ratos por transecção da veia cava e aorta. Se necessário, introduza uma agulha de calibre 21G a veia cava acima das veias renais para coletar o sangue antes da sangria. Alternativamente, colete sangue através de punção do coração seguindo protocolos padrão.
  5. Use uma tesoura cirúrgica para abrir a cavidade abdominal e remover a pele/superior músculo, se movendo para cima na direção das costelas.
  6. Use uma tesoura cirúrgica para perfurar o diafragma.
    Nota: Os pulmões entrará em colapso longe do diafragma.
  7. Corte da caixa torácica usando uma tesoura cirúrgica para expor o coração e os pulmões.
  8. Usando fórceps, tomar um 1,5 mL RNase-livre microcentrifuga tubo e mergulhe-o em nitrogênio líquido para encher o tubo.
    Nota: Use óculos e luvas protetoras para lidar com nitrogênio líquido.
  9. Remover os pulmões, coloque-os nos tubos RNase-livre microcentrifuga 1,5 mL preenchidos com nitrogênio líquido para snap-congelar o tecido e aguarde alguns segundos até que o líquido evapora.
  10. Feche a tampa do tubo e armazenar o tecido a-80 ° C até o uso.

4. RNA preparação

  1. Pulverize todo pulmões usando um pulverizador de aço inoxidável de tecido.
    Nota: O pulverizador de tecido deve ser colocada em nitrogênio líquido antes de usar. Limpe o pulverizador após cada utilização com solução de RNAse.
  2. Dividir os pulmões pulverizados e colocar em dois tubos de 1,5 mL (metade do pulmão cada).
  3. Adicione 500 µ l de tiocianato de guanidínio por tubo de amostra e misture.  Homogeneizar a amostra usando 18g, 21g e agulhas de 23 G, respectivamente.
    Nota: As amostras podem ser cravadas com 5,6 x 108 cópias de um pequeno RNA pico-no controle (a partir de uma espécie diferente) antes de prosseguir com a extração.
  4. Adicionar 500 µ l de etanol para cada amostra e vórtice por 15 s.
  5. Carga a mistura em uma coluna de rotação em um tubo de coleta e centrifugar a 12.000 x g por 1 min. descartar o escoamento.
  6. Para DNase eu tratamento (em colunas);
    1. Adicione 400 µ l de RNA Wash Buffer e centrifugar a 12.000 x g por 1 min.
    2. Num tubo de RNase-livre, adicione 5 µ l de DNase I e 75 µ l de 1 x digestão do DNA de buffer e misture. Adicione a mistura diretamente para a matriz de coluna.
    3. Incube a temperatura ambiente por 15 min.
  7. Adicione 400 µ l de solução prélavagem RNA para a coluna e centrifugar a 12.000 x g por 1 min. descarte o escoamento e repita este passo.
  8. Adicione 700 µ l de tampão de lavagem do RNA para a coluna e centrifugar a 12.000 x g por 1 min. descartar o escoamento.
  9. Centrifugar a 12.000 x g por 2 min remover o restante reserva. Transferi a coluna para um tubo de RNase-livre.
  10. Para eluir RNA, adicione 35 µ l de DNase/RNase-livre água diretamente para a matriz de coluna e centrifugar a 12.000 x g por 1,5 min.
  11. Medir a concentração de RNA total (260 nm) e pureza usando um espectrofotômetro. Siga as instruções para realizar a quantificação de RNA em uma amostra de 1,5 µ l alíquota. Branco do instrumento com DNase/RNase-livre a água utilizada para a eluição.
    Nota: Uma relação de 260/280 de ~2.0 é geralmente aceite como "pura" para o RNA. Concentração de RNA típica geralmente varia entre 750 e 2.500 ng / µ l.
  12. Loja a-80 ° C.

5. miRNA Profiling

  1. Retrô-transcrever RNAs pequeno, uso 200 ng do RNA total.
    1. Prepare a mistura de transcrição reversa reação no gelo (volume total por reação é de 20 µ l). Para cada reação, adicione 4 µ l de 5 x tampão, 2 µ l de 10 x nucleotídeos misturam, 2 µ l de transcriptase reversa e 2 µ l de água livre de RNase. Misture todos os componentes e alíquota em 600 µ l livre de RNAse tubos plásticos (10 µ l do mix por reação).
      Nota: A mistura de transcrição reversa mestre contém todos os componentes necessários para a síntese do cDNA da primeiro-costa exceto modelo RNA.
      Nota: Calcule o volume em excesso (10%) ao preparar a mistura de mestre.
    2. Adicionar o modelo de RNA (200 ng em 10 µ l) para cada tubo contendo a mistura de mestre-transcrição reversa. Mix, centrifugar por 15 s a 1.000 x ge armazená-los no gelo até colocação em thermocycler ou bloco seco.
    3. Incubar durante 60 min a 37 ° C.
    4. Incubar durante 5 min à 95 ° C e coloque os tubos no gelo.
    5. Dilua o cDNA adicionando-se 200 µ l de água livre de RNase para cada reação de transcrição reversa 20 µ l.
  2. Realize o PCR em tempo real usando o Mouse resposta inflamatória e auto-imunidade miRNA matriz de PCR.
    1. Preparar uma mistura de reação (volume total 1100 µ l): para cada reação, adicionar 550 µ l do mix de mestre 2 x PCR, 110 µ l de mistura universal da primeira demão de 10x, 340 µ l de água livre de RNase e 340 µ l do modelo cDNA (diluído reação da etapa 5.1.5).
    2. Adicione 10 µ l da mistura de reação para cada poço da miRNA pré-carregado matriz de PCR usando uma pipeta multicanal.
    3. Selo da placa de matriz de PCR com película adesiva ótica miRNA.
    4. Centrifugue a placa por 1 min a 1.000 x g , à temperatura ambiente para remover as bolhas.
    5. Programar o reciclador em tempo real, passo de ativação inicial de PCR durante 15 minutos a 95 ° C, 3-etapa desnaturação contendo ciclismo por 15 s a 94 ° C, recozimento por 30 s a 55 ° C e extensão por 30 s a 70 ° C para 40 número de ciclos.
      Nota: Siga fabricante ciclismo condições instruções para configurar o reciclador em tempo real. Execute a etapa de curva de dissociação construída no software do reciclador em tempo real.
    6. Realizar análise de dados.

6. análise de dados

  1. Extraia valores de Ct a partir do software PCR em tempo real para cada amostra em um software de análise.
    Nota: Valor de uma tomografia de 34 é considerado como ponto de decisão. Se as amostras contêm pico-no controle (por exemplo,, cel-mir-39), normalize os valores de Ct para o pico de controle para cada amostra. Valores de limiar podem precisar ser configurado manualmente. Valores basais são definidas automaticamente.
  2. Normalizar os valores de Ct para o Ct média de seis controles de limpeza de miRNA: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, utilizando a seguinte equação:
    ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)
  3. Desistência alterar cálculos, calcular valores de ΔΔCt usando uma amostra específica como o controle, usando a expressão relativa equação12:
    miRNA de expressão relativa:
    2-∆∆Ct, onde - ∆∆Ct =-[teste ∆ - ∆ controle]
    Nota: Uma mudança de dobra de 200 é considerada como limite.
  4. Dobra de exportação alterar valores de expressão para realizar análise estatística no R usando o pacote se em Bioconductor8.
  5. Corrigi para comparações múltiplas, usando o método de Hochberg Benjamini13.
    Nota:  Uma cópia do script R está disponível em: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Conjuntos de dados e os dados analisados também estão disponíveis para a expressão do Gene Omnibus sob número GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.

7. dados de análise: Análise funcional de Software

  1. Organize o conjunto de dados. Incluem os miRNAs com seus rácios de registro de expressão respectivos e p-valores. Consulte a tabela 1 para a formatação do conjunto de dados específico.
  2. Software de análise funcional aberto (versão 01-10).
  3. Carregar o dataset usando o seguinte formato: formato de arquivo: "formato flexível", contém o cabeçalho de coluna: "Sim", selecione o tipo de identificador: "miRBase (maduro)", plataforma de matriz usada para experiências: escolha a plataforma de matriz.
    Nota: Aceita formatos de arquivos são. txt (delimitado por tabulação arquivos de texto),. xls (excel arquivos) e diff (arquivos. cuffdiff).
  4. Selecione "Observações inferir" e verifique se que o grupo experimental de rotulagem está correto.
  5. Ir para "Resumo de Dataset" para rever o montante total dos miRNAs mapeados e não mapeados.
  6. Clique no botão "novo" na parte superior esquerda do programa. Selecione "Novo filtro de alvo do MicroRNA" e carregar um dataset microRNA.
    1. Definir a fonte: TarBase, engenho conclusões de especialistas, miRecords.
    2. Conjunto de confiança para: experimentalmente observada ou alta (previsto).
    3. Selecione "Adicionar colunas" para incluir uma variedade de informações biológicas sobre os alvos, como espécie, doenças, tecidos, percursos e muito mais.
    4. Para se concentrar em metas que mudaram a expressão no experimento, selecione "Adicionar / substituir mRNA dataset". Use o "Emparelhamento de expressão" para localizar microRNAs com os níveis de expressão iguais ou diferentes.
      Nota: A análise de filtro irá fornecer microRNA nomes e símbolos, alvos de mRNA, a fonte que descreve o relacionamento do alvo e o nível de confiança da relação prevista (Figura 2).
  7. Clique em "Adicionar ao meu caminho" para enviar o conjunto de dados filtrado para uma tela de percurso e explorar relações biológicas mais.
  8. Use caminho Designer para criar um modelo de qualidade de publicação de microRNA efeitos.
  9. Uma opção alternativa é criar um núcleo de análise.
    1. Para o tipo de análise principal, selecione "Análise de expressão".
    2. Tipo de medição, selecione "Expr Log Ratio".
    3. Resumo de filtro de análise: considerar apenas as moléculas e/ou relacionamentos onde: (espécie = rato) e (confiança = observados experimentalmente) e (fontes de dados = "Engenho especialista descobertas", "Ingenuidade ExpertAssist descobertas", "miRecords", "TarBase", ou " TargetScan humanos").
    4. Selecione um limite de p-valor = 0,05.
    5. Execute a análise.
      Nota: O relatório incluirá: caminhos canônicos, análise do montante de reguladores, doenças e funções, efeitos de regulador, redes, moléculas e muito mais.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Os diferentes tipos de células observados em esfregaços são usados para identificar o estágio do ciclo estral de rato (Figura 1). Estes são identificados pela morfologia celular. Durante o proestro, as células são quase exclusivamente de aglomerados de células epiteliais nucleadas redondas, bem formados (figura 1A). Quando o mouse está na fase de estro, as células são células epiteliais escamosas cornificadas, presentes nos clusters densamente (figura 1B). Durante metestrus, células epiteliais cornificadas e leucócitos polimorfonucleares são vistos (Figura 1). No diestro, leucócitos (células pequenas) são geralmente mais prevalente (Figura 1).

Nós extraímos o RNA de quatro pulmões de rato, seguindo o protocolo descrito anteriormente. As concentrações de ácido nucleico (ng / µ l) variou entre 1197.9 e 2178.1, com uma média de 1583.1 ± 215 (tabela 1). A média A260/A280 proporção oscilou de 2,010 de 2.020 com uma média de 2.016 ± 0,002. Por outro lado, os rácios A260/A230 observados oscilou entre 2,139 e 2.223 com uma média de 2.179 ± 0,018.

A tabela 2 mostra os resultados de expressão diferencial obtidos com se na R. Calculamos que top miRNAs diferencialmente expressos entre ratos expostos ao ozônio ou filtrada ar no proestro (usando o comando toptable)14. A primeira coluna dá o valor da mudança log2-dobra dobra em expressão de miRNA entre ozônio e ar filtrado exposto animais. A coluna t representa moderada-estatística t calculada para cada miRNA na comparação. As colunas p.value e adj.p.value representam p-valores associados para cada comparação antes e depois de vários testes de ajuste, respectivamente. Ajuste para comparações múltiplas foi feito com o Benjamini e do Hochberg método para controlar a taxa de descoberta falsa15. Representa a coluna B a log-probabilidade do miRNA é diferencialmente expressos8.

Realizamos a miRNA alvo filtro e núcleo de análise que inclui a análise do percurso de enriquecimento. Depois de carregar uma lista de 14 miRNAswith a relação de registro de expressão significativa e p-valor, todos eles foram mapeados pelo filtro de alvo de miRNA (tabela 3). Os resultados foram filtrados e ordenados para chegar a certos caminhos, neste caso a "resposta imune celular". A análise do núcleo forneceu informações sobre caminhos canônicos, doenças e função, reguladores e redes (tabela 4). O software de análise funcional produziu uma análise de rede que mostra a relação entre os miRNAs de interesse e outras moléculas (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: identificação das fases do ciclo estral. (A) proestro (células epiteliais predominantemente nucleadas); (B) estro (predominantemente anucleadas cornificadasm células); (C) metestrus (todos os três tipos de células); e diestro (D) 2 (maioria dos leucócitos). Barra de escala = 100 µm. ampliação = x 20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: resultados representativos de software de análise funcional: filtro de alvo de miRNA. Perfil abrangente de miRNAs em diferentes fases do ciclo estral. Depois de executar o filtro de miRNA, o software oferece listas detalhadas de genes e compostos implicados em doenças e outros fenótipos, que podem ser filtrar e classificar para chegar a certos caminhos, neste caso "Resposta imune de celular". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: resultados representativos de software de análise funcional: redes. Comparação das redes afetadas pela exposição de ar ou ozônio filtrada em fêmeas em diferentes fases do ciclo estral. Diagrama de redes biológicas associados miRNAs nos pulmões de ratos fêmeas, expostos ao ar filtrado vs ozônio no proestro (A) ou não-proestro estágios (B). Esta figura foi modificada de Fuentes et al.6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ID Ácido nucleico (ng / µ l) A260/A280 A260/A230
Amostra 1 1197.930 2.015 2.192
Amostra 2 1355.703 2.018 2.223
Amostra 3 2178.104 2.020 2.163
Amostra 4 1600.837 2,010 2,139
Média 1583.144 ± 215 2.016 ± 0,002 2.179 ± 0,018

Tabela 1: exemplo de concentrações de RNA e rácios de absorvância no 230, 260 e 280 nm de amostras de tecido pulmonar purificado de quatro ratos. As concentrações foram medidas com um espectrofotômetro.

logFC t P.Value adj. P.Val B
MMU-miR-694 1.492 4.071 0.000153 0.009514 0.759
MMU-miR-9-5 p 0.836 3.916 0.000254 0.009514 0.289
MMU-miR-221-3 p 0,385 3.106 0.003014 0.075361 -1.982
MMU-miR - 181d - 5P 0.597 2.891 0.005516 0.103424 -2.526
MMU-miR-98-5 p 0.558 2.699 0.009243 0.138649 -2.987
MMU-miR-712-5 p 0.667 2.563 0.013169 0.164609 -3.299
MMU-miR-106a - 5P -0.528 -2.412 0.019278 0.206547 -3.632

Tabela 2: Se resultados da análise por miRNAs diferencialmente expressos em fêmeas expostas ao ozônio vs . ar filtrado na fase de proestro.

os miRNAs ID Observação 1 Observação 1 Observação 2 Observação 2
Relação de expr Log Valor de P Relação de expr Log Valor de P
MMU-miR-694 1.492 0.000153 0.543319208 0.0021385
MMU-miR-9-5 p 0.836 0.000254 0.677595421 0.004997439
MMU-miR-221-3 p 0,385 0.003014
MMU-miR - 181d - 5P 0.597 0.005516 0.342276659 0.106467657
MMU-miR-98-5 p 0.558 0.009243 0.455392799 0.034724699
MMU-miR-712-5 p 0.667 0.013169
MMU-miR-106a - 5P -0.528 0.019278

Tabela 3: formato de exemplo para observação multi upload de conjuntos de software de análise funcional de. Várias expressões diferenciais experimentais podem ser agrupados em uma única planilha e carregados, e podem ser adicionadas como muitas observações conforme necessário. Colunas: ID de miRNAs 1); 2) Observação 1: Relação de Expr Log; 3) Observação 1: Valor de P; 4) Observação 2: Relação de Expr Log; 5) Observação 2: Valor de P.

Non-proestro Proestro
R. Genes alvejados de diferencialmente expressaram miRNAs
CAMK2N1 PAFAH1B2 SEC23A ABCB9 FGD4 SLC25A27
CARROS PDE4B SNX5 APOO FRMD4B SLC38A1
CYP24A1 PDE7A SYT4 ARHGEF38 GPR137B TMCC1
DBF4 PGM3 THAP12 AVEN HMBS TRIM71
HMGN2 PNP TMED7 CASP3 METAP1 XKR8
KMT5A REV1 TNFAIP2 CCNJ MITF ZCCHC11
LRRC17 RPS19BP1 TNFRSF10C CMTR2 MYC ZIM3
MDH2 RRAD TP53 CNMD RGMB ZNF181
MIS18A SEC62 UBE2V2 DSCR8 SLC14A1
ZNF420
B. diferenças de doenças da parte superior e biofunctions
Doenças e distúrbios Valor de P Doenças e distúrbios Valor de P
Doença inflamatória 3.84E-02 - 3.84E-05 Anormalidades e a lesão 4.96E-02 - 2.77E-14
Resposta inflamatória 3.84E-02 - 3.84E-05 Doença do sistema reprodutivo 2.15E-02 - 2.77E-14
Anormalidades e a lesão 4.17E-02 - 4.17E-05 Câncer 4.96E-02 - 1.27E-10
C. principais funções moleculares e celulares
Funções moleculares e celulares P Valor Funções moleculares e celulares P Valor
Desenvolvimento celular 2.05E-02 - 5.26E-07 Movimento celular 3.77E-02 - 4.47E-07
Compromisso de celular 3.75E-04 - 3.75E-04 Sobrevivência e morte celular 4.91E-02 - 5.61E-06
Ciclo celular 2.62E-03 - 2.62E-03 Desenvolvimento celular 4.97E-02 - 1.38E-06
D. top sistema fisiológico desenvolvimento e função
Desenvolvimento e função P Valor Desenvolvimento e função P Valor
Desenvolvimento dos 4.17E-02 - 1.31E-03 Desenvolvimento embrionário 3.30E-02 - 2.12E-05
Desenvolvimento embrionário 1.29E-02 - 1.29E-02 Função e desenvolvimento do tecido conjuntivo 1, 79E-02 - 6.10E-05
Função e desenvolvimento do tecido conjuntivo 1.93E-02 - 1.93E-02 Morfologia do tecido 7.88E-05 - 7.88E-05
E. Top associado funções de rede
Associada a funções de rede Pontuação Associada a funções de rede Pontuação
Desenvolvimento celular, doença inflamatória, resposta inflamatória A lesão e anormalidades, doença do sistema reprodutivo, câncer
6 19

Tabela 4: análise funcional de software Resumo de fêmeas expostas ao ozônio na non-proestro vs. fases de proestro. O software de análise funcional permite a análise de caminhos canônicos superiores, montante reguladores, doenças & funções, principais funções, redes de efeito regulador e muito mais. Esta tabela foi modificada de Fuentes et al.6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MicroRNA perfis é uma técnica vantajosa para diagnóstico da doença e investigação mecanicista. Neste manuscrito, definimos um protocolo para avaliar a expressão de miRNAs que são previstos para regular os genes inflamatórios nos pulmões de ratos fêmeas expostos ao ozônio nas fases do ciclo estral diferente. Métodos para a determinação do ciclo estral, tais como o método de detecção visual, têm sido descritos16. No entanto, estes dependem de medições one-time e, portanto, não são confiáveis. Para identificar com precisão todas as fases do ciclo estral de fêmeas que ciclo regularmente, recomenda-se o método descrito aqui. Além disso, este protocolo simples também pode ser usado para estimar indiretamente flutuações hormonais diárias em camundongos. Para evitar a ativação de respostas inflamatórias indesejáveis devido à irritação vaginal, a amostragem deve ser realizada apenas uma vez por dia. Devido à variabilidade da duração do ciclo e influências de habitação, é importante executar o protocolo para dois ou três ciclos completos antes de utilizar animais em um experimento, considerando o estágio do ciclo.

Para a bem sucedida extração do RNA do tecido pulmonar, um procedimento exato é crítico. Este protocolo descreve um método de um dia para isolar o RNA do tecido pulmonar que produz RNA de alta qualidade. Modificações ao protocolo do fabricante foram necessárias para extrair eficientemente RNA de pulmões. Nós adicionamos uma centrifugação adicional após a adição do tampão de lavagem para remover a reserva tanto quanto possível. Nós também eluída RNA com 35 µ l de DNase/RNase-livre de água, centrifugação a coluna para 1,5 min garantir níveis de alta concentração. Spectrofluorometer resultados confirmaram a eficácia do nosso protocolo de extração de RNA. A relação da absorvência a 260 e 280 nm (A260/280 ratio) é frequentemente usada para avaliar a pureza das preparações do RNA. A absorvância máxima para os ácidos nucleicos é 260 e 280 nm, respectivamente. Aceita-se como "pura" para o RNA se a proporção é de aproximadamente 2,017. Da mesma forma, para a relação de absorvância de contaminação A260/A230, os valores para a pureza estão na faixa de 2,0 – 2,218. Neste estudo, os rácios de A260/A280 e A260/A230 médios observados foram 2.016 ± 0,002 e 2.179 ± 0,018, respectivamente (tabela 1). Portanto, o nosso protocolo de extração de RNA foi bem sucedido. Outra vantagem do protocolo utilizado é a adição do tratamento DNAse. Isto é importante para evitar a contaminação de DNA genômico19. Uma limitação do presente protocolo de isolamento do RNA é a utilização de colunas de purificação para descartar resíduos através de precipitação usando álcool porque alguns destroços do pulmão podem obstruir a membrana ou parcialmente ou completamente, resultando em baixos rendimentos. Também, se a etapa de homogeneização não é executada cuidadosamente, grandes quantidades de pulmão RNA podem ser facilmente perdidas ou degradadas. Se o baixo rendimento do RNA é obtido, RNA pode ser re-purificado e eluído em um volume menor. Como alternativa, o RNA pode ser precipitado durante a noite seguinte protocolos publicados20.

Microarray tecnologias aplicadas à criação de perfil de miRNA são ferramentas promissoras em muitos campos de investigação. Em nosso estudo, usamos matrizes PCR, que oferecem a vantagem de maior soleira de detecção e estratégias de normalização para a deteção de miRNAs diferencialmente expressos vs outras tecnologias tais como miRNA baseada em investigação matrizes21. Uma limitação do presente protocolo é que ele requer uma quantidade mínima de material de RNA e disponibilidade de conjuntos específicos de primers para os miRNAs de interesse, ao contrário de outras técnicas disponíveis, como RNAseq a começar. Outra vantagem dos conjuntos baseados em PCR é a opção de usar genes de referência não-miRNA para qPCR normalização (como pequenos RNAs nucleolares ou SNORDs) para calcular a expressão diferencial de miRNAs. Finalmente, usar matrizes PCR fornece várias opções para análise de dados, que variam de ferramentas on-line fornecidas pelos fabricantes, para os métodos convencionais para detectar a expressão diferencial porém, PCR em tempo real. Análise estatística com se é conveniente para ambos os microarrays e conjuntos baseados em PCR e usa o empírico - estatísticas do Bayes moderado f22. Aqui, nós mostramos que tanto p-valores e q (ajustado para múltiplo testes) podem ser obtido com o comando toptable ajustando o limite de taxa falsa da descoberta e identificando diferencialmente expressos miRNAs.

Software de análise funcional é um aplicativo baseado na web para análise de dados no contexto do percurso. O software dá a investigadores habilidades de pesquisa poderoso que podem ajudar a conjuntos de dados de quadro ou alvos específicos no contexto, dentro de um quadro maior de significância biológica. Embora o ambiente de software é flexível para diferentes tipos de análise (i.e., metabolomics, SNPs, proteômica, microRNA, toxicologia, etc.), nosso objetivo aqui é destacar os aspectos da análise de miRNA. Depois de carregar uma lista de 14 miRNAs com significativa expressão log-rácios e p-valores, todos foram mapeados pelo software. Realizamos a miRNA alvo filtro e núcleo de análise, que inclui a análise do percurso de enriquecimento. No entanto, tais análises consideram os genes para que os 14 miRNAs estão previstos para o alvo e não os miRNAs próprios. A seção de resultados lista saídas, tais como: vias canônicas, doenças e função, genes alvejados de miRNAs diferencialmente expressos, desenvolvimento de sistemas fisiológicos, reguladores e redes (tabela 4). A visualização do caminho é mostrada na guia rede, onde os miRNAs e moléculas são mostradas como nós clicáveis que são vinculados com informações associadas ao gene de interesse (Figura 3). Uma vantagem do software de análise funcional é as conclusões de miRNA-relacionados de alta qualidade, incluindo interações experimentalmente validadas e previstas. Os bancos de dados do software de análise funcional incluem: experimentalmente validados microRNA-mRNA interações bancos de dados23,24, banco de dados de interação previsto microRNA-mRNA com interações de baixa confiança excluídos (por exemplo, Alvo Scan)25, humanos experimentalmente validados, rato e rato microRNA-mRNA interações de bancos de dados (por exemplo, miRecords)26e achados da literatura (por exemplo,, do microRNA-relacionados descobertas manualmente, com curadoria de literatura publicada por peritos científicos). Outros estudos comparando a eficácia e a usabilidade das ferramentas de Bioinformática para analisar caminhos associados a expressão miRNA confirmam a eficácia deste software27. Métodos computacionais, globais são cost-effective, menos demorado e podem ser facilmente validados por métodos moleculares. Com o constante crescimento e acumulação de dados biomédicos, métodos de Bioinformática se tornará cada vez mais poderosos na descoberta dos mecanismos mediados por miRNA dos processos biológicos e doença.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses concorrente.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada por concessões do NIH K01HL133520 (PS) e K12HD055882 (PS). Os autores Dr. Joanna Floros agradecer a assistência com experimentos de exposição de ozônio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory 000664 8 weeks old
UltraPure Water Thermo Fisher Scientific 10813012
Sterile plastic pipette Fisher Scientific 13-711-25 Capacity: 1.7 mL
Frosted Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 2951TS
Light microscope Microscope World MW3-H5 10x and 20x objective
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP Henry Schein Animal Health 55853 90 mg/kg. Controlled drug.
Xylazine Sterile Solution Lloyd Laboratories 139-236 10 mg/kg. Controlled Drug.
Ethanol Fisher Scientific BP2818100 Dilute to 70% ethanol with water.
21 G gauge needle BD Biosciences 305165
Syringe Fisher Scientific 329654 1 mL
Operating Scissors World Precision Instruments 501221, 504613 14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip
Tweezer Kit World Precision Instruments 504616
Spectrum Bessman Tissue Pulverizers Fisher Scientific 08-418-1 Capacity: 10 to 50 mg
RNase-free Microfuge Tubes Thermo Fisher Scientific AM12400 1.5 mL
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026
Direct-zol RNA MiniPrep Plus Zymo Research R2071
NanoDrop Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
miScript II RT kit Qiagen 218161
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array Qiagen MIMM-105Z
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes Thermo Fisher Scientific AM12225 for 20 μL reactions
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610
Microsoft Excel Microsoft Corporation https://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R Software The R Foundation https://www.r-project.org/
Thermal cycler or chilling/heating block General Lab Supplier
Microcentrifuge General Lab Supplier
Real-time PCR cycler General Lab Supplier
Multichannel pipettor General Lab Supplier
RNA wash buffer Zymo Research R1003-3-48 48 mL
DNA digestion buffer Zymo Research E1010-1-4 4 mL
RNA pre-wash buffer Zymo Research R1020-2-25 25 mL
Ultraviolet ozone analyzer Teledyne API Model T400 http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Mass flow controllers Sierra Instruments Inc Flobox 951/954 http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132, (1), 15-26 (2013).
  2. Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical Society Transactions. 36, (Pt 6), 1224-1231 (2008).
  3. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13, (5), 358-369 (2012).
  4. Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2, (1), 63-71 (2013).
  5. Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3, (2), 315-328 (2013).
  6. Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9, (1), 18 (2018).
  7. Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148, (5), 1363-1372 (1993).
  8. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43, (7), e47 (2015).
  9. Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30, (4), 523-530 (2014).
  10. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  11. Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12, (1), 1-16 (2002).
  12. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, (4), 402-408 (2001).
  13. Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10, (2), 946-963 (2016).
  14. Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide. Bioconductor. (2002).
  15. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57, (1), 289-300 (1995).
  16. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7, (4), e35538 (2012).
  17. Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50, (2), 108-115 (2016).
  18. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22, (3), 478-481 (1997).
  19. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55, (4), 611-622 (2009).
  20. Walker, S. E., Lorsch, J. RNA purification- precipitation methods. Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).
  21. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16, (5), 991-1006 (2010).
  22. Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. 397-420 (2005).
  23. Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
  24. Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12, (2), 192-197 (2006).
  25. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
  26. Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
  27. Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics