"مقايسة الانقسام الببتيد فلوروجينيك" على الشاشة "النشاط بروتيوليتيك": تطبيقات للفيروس التاجي المسبّب لارتفاع البروتين التنشيط

* These authors contributed equally
Biochemistry

GE Global Research must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

ونقدم مقايسة انقسام ببتيد فلوروجينيك التي تسمح فرز سريع لنشاط البروتياز proteolytic على الببتيدات يمثل موقع الانقسام الببتيدات الانصهار الفيروسية. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب على أي فكرة من الأحماض الأمينية الأخرى ضمن تسلسل بروتين لاختبار النشاط حوزتي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jaimes, J. A., Millet, J. K., Goldstein, M. E., Whittaker, G. R., Straus, M. R. A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation. J. Vis. Exp. (143), e58892, doi:10.3791/58892 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تتطلب المغلفة الفيروسات مثل فيروس الإنفلونزا أو كورونافيروس الانقسام بروتيوليتيك على بروتين الانصهار لتكون قادرة على إصابة الخلية المضيفة. الفيروسات غالباً ما يحمل انتحاء الخلايا والأنسجة، وهي تتكيف مع البروتياز خلية أو نسيج معين. وعلاوة على ذلك، يمكن إدخال هذه الفيروسات الطفرات أو الملاحق في المجين بهم أثناء النسخ المتماثل التي قد تؤثر الانقسام، وهكذا يمكن أن تسهم التعديلات إلى مضيف جديد. نقدم هنا، مقايسة انقسام ببتيد فلوروجينيك التي تسمح فحص سريع من الببتيدات محاكاة الموقع الانقسام من البروتينات الفيروسية الانصهار. الأسلوب مرن جداً ويمكن استخدامها للتحقيق في نشاط بروتيوليتيك حوزتي واحدة على ركائز مختلفة كثيرة، وعلاوة على ذلك، كما يسمح الاستكشاف لنشاط البروتياز متعددة على واحد أو أكثر من ركائز الببتيد. في هذه الدراسة، استخدمنا الببتيدات محاكاة زخارف موقع الانقسام من البروتين سبايك الفيروس التاجي. نحن اختبار الإنسان والجمل المستمدة كورونافيروس "الشرق الأوسط بالالتهاب الرئوي" (CoV الصرف) لإثبات أن الاستبدالات مفردة ومزدوجة في موقع الانقسام يمكن أن يغير نشاط فارين وتغيير كفاءة الانقسام بشكل كبير. كنا أيضا هذا الأسلوب بالاقتران مع المعلوماتية الحيوية نشاط انشقاق فارين من الفيروس التاجي الماكر سبايك البروتينات من اللقاح مختلفة وسلالات الاختبار. هذا الأسلوب القائم على الببتيد أقل العمال-والوقت مكثفة من الأساليب التقليدية المستخدمة في تحليل النشاط بروتيوليتيك للبحث عن الفيروسات، ويمكن الحصول على نتائج في غضون يوم واحد.

Introduction

الانصهار الفيروسية مع غشاء الخلية المضيفة هو خطوة حاسمة في دورة حياة الفيروسات المغلفة ويسهل دخول الخلية والنسخ المتماثل لهذا الفيروس. نموذجياً، تمتلك فيروسات بروتين متخصصة (أو البروتينات) التي تربط المستقبلات على غشاء الخلية المضيفة ومشغلات الانصهار غشاء خلية الفيروس1. تم تجميع البروتينات الفيروسية الانصهار في ثلاث فئات رئيسية (الأول-الثالث)1. عدد من الفيروسات التي حاليا مصدر قلق رئيسيا للصحة العامة، مثل فيروس الإنفلونزا (تمثل ظهور الحيوانية المنشأ منذ أمد بعيد من الطيور) و "الشرق الأوسط الرئوي" متلازمة التاجي (أسعار الصرف السوقية-CoV) (يمثل الأخيرة الحيوانية ظهور من الإبل)، استخدام ما يسمى بالفئة الأولى الانصهار والبروتينات، والتي تتطلب معالجة proteolytic من البروتياز المضيف، أن تبذل نشاط فوسوجينيك2. وبالمثل، الفيروس التاجي الماكر (فكوف)، الذي يمثل تهديدا أمراض رئيسية للقطط البرية والمحلية، كما تمتلك فئة أنا البروتين الانصهار. الفئة الأولى الانصهار الفيروسية عادة ما يتم تصنيعه كسلائف أونكليفيد البروتينات، وتتألف عموما من بين المجالات التي المسؤولة عن مستقبلات ملزم وتشغيل الحدث الانصهار على التوالي. حتى الآن، هو هيماغلوتينين الإنفلونزا (ها) فهم الأفضل البروتين الانصهار وقد وصف العديد من الدراسات بدورها آليا في المضيف خلية الإدخال والانصهار3. وفي هذه الحالة حدوث انشقاق البروتين الانصهار في تسلسل معين أو موقع الانقسام داخل هكتار، وفي تركيبة مع التغييرات conformational تعتمد على درجة الحموضة، والنتائج في التعرض للانصهار الفيروسية الببتيد1،2.

الببتيد الانصهار ولها تسلسل الاعتراف بحوزتي السابقة حاسمة بالنسبة للأمراض التي تسببها وتكييف المضيفة للفيروس. يمكن تغيير التغييرات في التسلسل الاعتراف بحوزتي الانقسام إلى حد كبير مع عواقب وخيمة محتملة للفيروس و المضيف4. من ناحية، ويمكن إلغاء الانقسام وبالتالي القضاء على دورة حياة الفيروس. ولكن من ناحية أخرى، طفرة يمكن زيادة خصوصية الركيزة حوزتي معين و/أو السماح حوزتي "جديدة" تهزم البروتين الانصهار. وفي وقت لاحق، وهذا أيضا توسيع انتحاء الخلايا والأنسجة، وكما لوحظ، مثلاً، مع الإنفلونزا فيروس الأنواع الفرعية5،6. عادة ما تكون منخفضة القدرة الإمراضية فيروسات إنفلونزا الطيور (LPAI) وفيروسات الإنفلونزا البشرية الأكثر تنحصر في الجهاز الهضمي أو الجهاز التنفسي بسبب التعريب محدودة من البروتياز التي تنشط فيها. عادة، يجب أن يسبقه الببتيد الانصهار هذه البروتينات هكتار أربعة أمينية حمض تسلسل يتكون من 1-2 غير متتالية الأحماض الأساسية الأمينية، التي تعترف بها مثل التربسين سيرين البروتياز مثل التربسين، أو ماتريبتاسي، أو، TMPRSS27 8-عندما يكتسب الفيروس الملاحق أو الطفرات أن تغير موقع الانقسام إلى موقع بوليباسيك، فإنه يسمح فارين لتفعيل هكتار ويحتمل أن تسبب عدوى المجموعية أشد6،9. هذه الفيروسات يشار إلى ارتفاع القدرة الإمراضية فيروس إنفلونزا الطيور (إنفلونزا الطيور)، اتسمت بسلالات فيروس H5N1.

وعلى النقيض من الإنفلونزا هكتار، قد كورونافيروس كثيرة، مثل أسعار الصرف السوقية-CoV، موقعين الانقسام ومتميزة داخل البروتين المصطلحات الخاصة بهم. الموقع S1/S2 يفصل المجال ملزم مستقبلات الطرفي ن (S1) من مجال الانصهار ج-الطرفية (S2)، مع موقع انقسام ثاني، يسمى S2 '، والمتلقين للمعلومات من الموقع S1/S2، بالقرب من الببتيد الانصهار10. واقترح أن المواقع هي المشقوق حسب ترتيبها في S1/S2 تليها S2 '. وعلى النقيض من ها معظم سلالات فيروس الإنفلونزا والبروتين S CoV الصرف S1/S2 S2 ' مواقع يمكن التعرف عليه بواسطة البروتياز الأسرة كونفيرتاسي بروبروتين (PC)، مثل فارين. أفراد هذه الأسرة تنشق في المخلفات الأساسية المقترنة مع عزر R/K-(X)0,2,4,6K(X, any amino acid)-R/2. وبصفة عامة، الأحماض الأمينية المنبع لموقع الانقسام ويشار إلى P1، P2، P3، إلخ. العد من موقع الانقسام والأحماض الأمينية المصب بوصفها P1 '، P2'، P3 '، إلخ. 11-سلالات فكوف يمكن أن يكون أما وحيدة أو موقع انقسام مزدوج. مثل أسعار الصرف السوقية-CoV، تمتلك بعض سلالات فكوف أيضا موقعين الانقسام (S1/S2 و S2 ') في البروتين S بهم. ومع ذلك، هذه الخاصية استثناء النمط المصلي المسيطر أنا فكوفس (طور A). في المقابل، لا تملك إلا أعضاء التجمع الثاني (طور ب) النمط المصلي المسيطر موقع انشقاق واحد (S2 ')2،12. قد اقترحت عدة البروتياز تهزم مواقع الانقسام فكوف، بما في ذلك فارين، مثل التربسين البروتياز وكاثيبسين. وقد اقترح أن البروتين S من فكوف المعوي (المعروف أيضا الماكر الفيروس التاجي المعوي أو فيكف) من المحتمل أن يكون المشقوق فارين في الموقع S1/S2، والطفرات في هذا الموقع (، وكذلك إزاء S2 ') يؤدي إلى تغييرات في متطلبات حوزتي. وكانت هذه الطفرات المرتبطة بالتغيرات في انتحاء والأمراض التي تسببها هذه الفيروسات، والسماح للفيروس لتصبح النظمية وبلعم-تروبيك (فيروس التهاب الصفاق المعدية المعروف أيضا الماكر أو فيبف)13.

بطبيعة الحال إدخال الفيروسات الطفرات في الجينوم بهم خلال كل دورة النسخ المتماثل والأنواع الفرعية الجديدة كثيرا وسلالات من الإنفلونزا، وأسعار الصرف السوقية CoV وفكوف وصف14،،من1516. كجزء من تقييم سريع لتقييم تهديد الصحة العامة للفيروسات الناشئة، من الضروري التحقيق في التغييرات في الموقع الانقسام، وكيف يؤثر ذلك على مجموعة البروتياز تفعيل هذه الفيروسات. هنا، يمكننا وصف تحليل القائم على الببتيد التي تسمح بتقييم سريعة جداً لكيف تؤثر التغييرات موقع الانقسام في البروتين S CoV الصرف على خصوصية الركيزة حوزتي معين وسرعة الشاشة البروتياز المختلفة لقدرتها على تنشق عينها أو سلاسل متعددة4. في مجموعة ثانية من التجارب، استخدمنا التقنية لتحديد النشاط انشقاق فارين عبر مختلف فكوف اللقاح والسلالات.

يتم تعديل الببتيدات المستخدمة في هذا التحليل مع الأسفار الرنين الطاقة نقل (الحنق) الزوج، 7-ميثوكسيكومارين-4-يل أسيتيل (MCA) في تيرمينوس N و N-2، 4-دينيتروفينيل (DNP) في ج-المحطة. أثناء الفحص، هو متحمس MCA وتنبعث منه الطاقة الضوئية هو مروي بإدارة التخطيط الوطني ما دام الزوج في الجوار لبعضها البعض. في حالة حدوث انشقاق، بيد أن التثقيف ليست قادرة على إخماد الانبعاثات بعد الآن ويمكن قراءتها من قبل القارئ لوحة الأسفار. يتم قياس التغيرات التي طرأت الأسفار خلال التجربة لتحديد معدل الانقسام الببتيد، وحساب السرعة التي حوزتي كليفس الببتيد محددة (تعرف أيضا باسم Vmax)17.

من أجل تصميم الببتيدات، الجين للبروتين الانصهار كل منها يجب أن يكون تم متسلسلة و/أو متاحة في قاعدة بيانات. ومع ذلك، الأسلوب أقل عمالة مكثفة ومكلفة من الأساليب التقليدية التي عادة ما تتطلب استنساخ جين البروتين الانصهار في ناقلات التعبير التعبير عن ذلك في خلايا الثدييات لتحليل الانقسام. من البداية إلى النهاية، قد يستغرق هذا بضعة أيام حتى بضعة أسابيع بينما فحوصات الببتيد المعروضة هنا يمكن أن يتم خلال يوم واحد حالما تتوفر الببتيدات والبروتياز. الإعداد الفحص يستغرق بين 5 و 30 دقيقة استناداً إلى عدد العينات ووقت التشغيل في قارئ لوحة fluorescence حاء 1 تحليل البيانات قد يستغرق ما يصل إلى 2 س مرة أخرى تبعاً لحجم العينة.

وهنا اخترنا مثالين مختلفة أن يقدم المقايسة. في المثال الأول، نقدم البيانات التي تقارن انشقاق فارين بوساطة من CoV تتبعه البشرية والمستمدة من الإبل، تقييم إمكانات سلالات المستمدة من الإبل أن تنشط في البشر إذا كانوا عبور حاجز الأنواع. في المثال الثاني، استخدمنا مقايسة ببتيد فلوروجينيك لتحديد انشقاق فارين بوساطة من S1/S2 و S2 'مواقع أو S2' موقع اثنين سرتيب الأول وهما النمط المصلي المسيطر سلالات "فكوف الثاني"، على التوالي. لهذه التجارب، واستخدمنا الانقسام التربسين كعنصر إيجابي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-تصميم وإعداد الببتيدات

  1. الحصول على تسلسل البروتين الانصهار للفائدة من قاعدة بيانات عامة مثل نكبي (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) أو قاعدة بيانات الفيروسات الخاصة بالعوامل الممرضة (https://www.viprbrc.org). اختر موقع الاعتراف بحوزتي السابقة الببتيد الانصهار وتشمل الأحماض الأمينية 2-3 المنبع والمصب لهذا التسلسل.
  2. عندما يأمر الببتيدات، تعديلها مع أسيتيل 7-ميثوكسيكومارين-4-يل زوج الحنق (MCA) في تيرمينوس N و N-2، 4-دينيتروفينيل (DNP) في ج-المحطة.
    ملاحظة: توفر عدة موردين هذه التعديلات. الأسعار والتسليم وقت تعتمد على مورد للاختيار. ولكن توجد تعديلات البديلة التي تتباين من حيث الحساسية وتتطلب تعديلات للقارئ لوحة من حيث أطوال موجية.
  3. ريسوسبيند الببتيد وفقا لتوصيات المصنعين بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً. على سبيل المثال، ريسوسبيند الببتيدات في الإيثانول 70% بتركيز نهائي 1 مم.
  4. يمكنك بشكل اختياري إضافة أنبوب يحتوي على الببتيد والمذيب في حمام سونيكيشن حتى أنه هو حراكه تماما إذا لم ريسوسبيند الببتيد جيدا قبل بيبيتينج.
  5. الكوة الببتيد إلى الملطف الخفيفة أو مقاومة أنابيب لحماية الببتيد من التبييض. الاحتفاظ الكوة الأحجام الصغيرة لتجنب دورات تجميد/ذوبان الجليد متعددة (علىسبيل المثال، 100 ميليلتر). تخزين مختبرين في-20 درجة مئوية.

2-إعداد القارئ لوحة الأسفار

  1. قم بتشغيل القارئ لوحة والانتظار حتى يتم الانتهاء من الاختبار الذاتي.
  2. افتح برنامج التشغيل على الكمبيوتر المرفقة وتأكد من أنه متصل مع قارئ لوحة.
  3. فتح تحديد درجة الحرارة، وتعيين إلى 30 درجة مئوية (أو درجة الحرارة المطلوبة لتحقيق الأداء الأمثل حوزتي).
  4. انقر فوق عنصر التحكم | أداة الإعداد لإعداد هذه التجربة.
  5. اختر الحركية.
  6. حدد الأسفار.
  7. أدخل أطوال موجية الإثارة والانبعاثات: 330 نانومتر و 390 نيوتن متر على التوالي.
  8. إلغاء تحديد الوقف التلقائي.
  9. حدد حساسية متوسطة، عادية.
  10. اختر وقت غيل ح 1 للمقايسة وحدد قياس واحدة كل 60 ثانية.
  11. S مجموعة 5 خلط قبل القياس الأولى و 3 s قبل كل قياس
  12. تحديد الآبار لقراءة والبدء الفحص.

3-التحضير الفحص

  1. إعداد المخزن المؤقت المقايسة بحساب الكميات المناسبة لكل عنصر وإضافته. لفارين، جعل المخزن المؤقت المكونة من 100 ملم حبيس، 1 مم كاكل2، 1 مم 2-mercaptoethanol، 5% X-100 تريتون. التربسين، مخزنة الفوسفات القياسية استخدام المحلول الملحي (PBS).
    ملاحظة: وحدات التخزين من 10 مل أو أقل تكفي. اعتماداً على protease(s) المستخدمة في المقايسة يختلف المخزن المؤقت.
  2. البرد على الجليد المخزن المؤقت.
  3. ضع لوحة الفحص على الجليد مع صفيحة معدنية رقيقة تحت التبريد الدعم والاستقرار. استخدام صلبة السوداء البوليستيرين لوحة 96-جيدا مع قاع مسطح وغير المعالجة.
    ملاحظة: من الضروري استخدام اللوحات السوداء لمنع فلوري "التسرب" من الآبار المجاورة.
  4. حساب المقدار المناسب من مبطلات لإضافة لكل رد فعل يستند إلى بيانات تجريبية أو المنشورات السابقة. لفارين، استخدم 1 وحدة لكل رد فعل هو ما يعادل 0.5 ميليلتر. التربسين، استخدام 0.5 ميليلتر من 160 نانومتر تبكك التربسين.
  5. كل نموذج إعداد 3 replicates التقنية كل مقايسة في إجمالي حجم 100 ميليلتر كل عينة.
    ملاحظة: أنه تم تقييم تجريبيا أن أنها لا تحدث فرقا سواء بيبيتينج تحت ظروف الإضاءة العادية أو خافتة الضوء. ومع ذلك، الببتيدات ينبغي أن لا يتعرض للضوء لفترة ممتدة من الوقت.
  6. "الماصة؛" المبلغ المناسب لفحص المخزن المؤقت (94.5 ميليلتر كما هو موضح في الخطوة 3، 1) في كل بئر.
  7. أضف حوزتي لكل بئر. على حد سواء، فارين وتبكك التربسين، استخدام 0.5 ميليلتر كل عينة. 6 آبار (3 آبار لعنصر تحكم فارغ) و 3 آبار لعنصر تحكم ببتيد، إضافة 0.5 ميليلتر العازلة بدلاً من مبطلات كل منهما.
  8. إضافة الببتيد إلى تركيز نهائي من 50 ميكرون لكل بئر باستثناء عنصر التحكم فارغاً. وفي هذه الحالة، "الماصة؛" 5 ميليلتر الببتيد إعداد كما هو موضح في "الخطوة 1، 3". إضافة 5 ميليلتر من المخزن المؤقت إلى عنصر التحكم فارغة بدلاً من الببتيد.
    ملاحظة: تم اختبار عدة تركيزات من الببتيد في البداية مع تركيزات الإنزيم وصف التأكد أن كانت مشبعة الإنزيمات.
  9. إدراج اللوحة قارئ لوحة الأسفار وانقر فوق ابدأ.

4. تحليل البيانات

  1. حفظ الملف بالتجربة.
  2. انقر فوق تصدير ، ثم تصدير الملف.txt.
  3. استيراد ملف.txt في جدول بيانات.
  4. لكل تكرار التقنية كل عينة، إنشاء رسم بياني التآمر وحدات الفلورسنت النسبي (رفو) على المحور الصادي ضد الوقت على المحور السيني (تكميلية الشكل 1).
  5. حدد نطاق البيانات حيث يتم الرسم البياني في مجموعة خطي والأقرب إلى بداية زيادة الأسفار.
  6. رسم البيانات المحدد على الرسم بياني ثاني وإضافة خط اتجاه خطي.
  7. حدد خيارات اتجاه عرض المعادلة على الرسم البياني. وسوف تظهر المعادلة في Vmax.
  8. حساب المتوسط Vmax بالنسبة لكل عينة من 3 التقنية وإنشاء نسخ متماثلة.
  9. كرر التجربة أكثر من مرتين للحصول على 3 replicates البيولوجية.
  10. حساب الانحراف المعياري استناداً إلى البيانات البيولوجية المستقلة 3 وإنشاء نسخ متماثلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في الجزء الأول من هذه الدراسة، استخدمنا الببتيدات التي تمثل S2 ' موقع الانقسام والبروتينات S CoV الصرف متميزة ثلاثة: من السلالة البشرية EMC/2012 تنميط (بنك الجينات AFS88936.1) وهما تحديد الجمل المستمدة من الصرف-كوفس، نرسي-HKU205 (بنك الجينات AHL18090.1) و Mor215 (AVN89324.1 بنك الجينات) السلالات المعزولة في مصر والمغرب، على التوالي (الجدول 1)16،18.

مقارنة لسلالة EMC/2012، HKU205 S2 'موقع الانقسام قد الطفرات اثنين في P2 و P1' المواقف التي يمكن أن يحتمل أن تؤثر على اعترافها بواسطة فارين ويغير كفاءة الانقسام (الجدول 1). وبالإضافة إلى ذلك، نحن مهتمون بالتحقيق إذا وكيف يؤثر كل الطفرات الفردية الموجودة في سلالة HKU205 انشقاق فارين. أننا، لذلك، شملت الببتيدات اثنين حيث أدخلت الاستبدالات الفردية في تسلسل الببتيد EMC/2012 (EMC/2012 مسمارية-S S2 'و mutS EMC/2012-أنا S2') (الجدول 1). فارين استطاعت أن تهزم الببتيد EMC/2012 كفاءة مع Vmax من 6.3 ± 1.2 رفو/دقيقة، في حين أننا نكتشف تقريبا لا انشقاق عند استخدام S2 ' ببتيد سلالة HKU205 (Vmax 0.5 ± 0.1 رفو/دقيقة) (الشكل 1a). عند التحقيق في S2 مسمارية-S EMC/2012 ' الببتيد، وجدنا أن الانقسام انخفض بشدة مقارنة بتسلسل نوع البرية (Vmax 3.6 ± 1 رفو/دقيقة). وكان هناك تقريبا لا انشقاق عند اختبار mutS EMC/2012-أنا S2 ' الببتيد (Vmax 1.1 ± 0.9 رفو/دقيقة) (الشكل 1a).

في الآونة الأخيرة، أبلغ CoV الصرف المعزولة من غرب أفريقيا أن فيلوجينيتيكالي متميزة من الصرف-CoV موجودة في شبه الجزيرة العربية16. واحد يعزل وصف مؤخرا هو سلالة Mor213، الذي يحمل لوسين بدلاً من ارجينين في موقف P4 S2 ' الموقع (الجدول 1)، والتي يمكن أن يحتمل أن تؤثر على اعترافها بواسطة فارين ويغير كفاءة الانقسام. لدينا الإنزيم الببتيد أظهرت أن ليس هناك سوى الحد الأدنى من الانقسام من Mor213 S2 ' الموقع مقارنة بالموقع EMC/2012 (الشكل 1b). Vmax الببتيد Mor213 هو 1.0 ± 0.1.

الجزء الثاني من هذه الدراسة، كنا الإنزيم الببتيد نفس تقييم الانقسام فورين بوساطة من مواقع الانقسام وبروتين S فكوف. كنا الببتيدات محاكاة موقع الانقسام S1/S2 اثنين فكوف النمط المصلي المسيطر أنا الفيروسات: فيكف I و-4 (من مختبر ويتاكر) وفيبف أنا الأسود (بنك الجينات AB088223.1). كنا أيضا الببتيدات محاكاة S2 ' الموقع من هذه الفيروسات، فضلا عن اثنين فكوف النمط المصلي المسيطر الثاني: فيكف الثاني 1683 (بنك الجينات AFH58021.1) وسلالات فيبف الثاني 1146 (بنك الجينات AAY32596.1) (الجدول 1). نموذجياً، يحدث انشقاق فارين عند بقايا الأساسية (ارجينين ويسين) موجودة في مواقف P1 و P4 موقع الانقسام. الطفرات في P1, P4 و P1 ' اقترحت مناصب لتتداخل مع فورين كليفابيليتي، وبالتالي تغيير متطلبات حوزتي من البروتين. (الجدول 1). لوحظ انشقاق فارين لتنميط S1/S2 الببتيد فيكف I و 4 S1/S2 (± Vmax 100.36 7.61 رفو/دقيقة) ولكن ليس في الببتيد S1/S2 تحور فيبف أنا الأسود S1/S2 (Vmax-1.37 ± 1.29 رفو/دقيقة) (الشكل 2A). وبالمثل، تمكنت فارين من تنشق S2 تنميط 'الببتيد S2 FECV الثاني 1683' (Vmax 5.46 ± 0.97 رفو/دقيقة)، لكن لا تحور S2 'الببتيدات S2 و 4 فيكف I' (Vmax 0.26 ± 0.11 رفو في الدقيقة)، فيبف أنا S2 الأسود '(Vmax 0.30 ± 0.14 رفو في الدقيقة) و S2 فيبف الثاني 1146' (Vmax-0.36 ± 0.11 رفو /دقيقة) (الشكل 2). كنا التربسين كعنصر إيجابي لانشقاق الببتيد ولاحظنا الانقسام التربسين في جميع الببتيدات المستخدمة (تكميلية الشكل 2).

Table 1

الجدول 1. سلاسل الأحماض الأمينية المستخدمة والمقابلة الببتيدات. الببتيدات المستخدمة في الاختبارات تحتوي على زوج الحنق (MCA/التثقيف) أسيتيل/2، 4-دينيتروفينيل (7-ميثوكسيكومارين-4-يل). P4 و P1 الانقسام الموقع المتمركزة ارجينين (R) المخلفات، التي تعترف بها فارين، بخط غامق. المخلفات باللون الأحمر تتوافق مع الطفرات مقارنة بتسلسل المرجعية.

Figure 1
الشكل 1 . انشقاق proteolytic فارين بوساطة من S2 CoV تتبعه البشرية والمستمدة من الإبل ' مواقع الببتيدات فلوروجينيك. ألف المقايسة انشقاق فارين من البشرية السائدة-CoV EMC/2012 S2 ' الموقع والمستمدة من الإبل سلالة HKU205 (المسخ مزدوجة)، جنبا إلى جنب مع المتغيرات متحولة واحدة من EMC/2012 (مؤتة-S و mutS--أنا). باء فورين الانقسام ومقايسة للبشرية السائدة-CoV EMC/2012 S2 ' موقع والمستمدة من الإبل سلالة Mor213. للوحات كانت المحتضنة A و الببتيدات مع فارين المؤتلف، وتم قياس الزيادة في الأسفار نتيجة proteolytic تجهيز استخدام فلوروميتير. فحوصات أجريت في تريبليكاتيس مع النتائج تمثل متوسطات Vmax من ثلاث تجارب مستقلة (n = 3). أشرطة الخطأ تشير إلى التنمية المستدامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . انشقاق proteolytic فارين بوساطة من فكوف S1/S2 و S2 ' مواقع الببتيدات فلوروجينيك. أ الانقسام فورين الاعتداء فيكف I و-4 وفيبف أنا المواقع السوداء S1/S2. كانت المحتضنة الببتيدات مع المؤتلف فارين. باء فارين الانقسام الإنزيم فيكف I و-4، فيبف أنا أسود، 1683 الثاني FECV و S2 فيبف الثاني 1146 ' المواقع. وتم قياس الزيادة في الأسفار نتيجة proteolytic تجهيز استخدام فلوروميتير. فحوصات أجريت في تريبليكاتيس مع النتائج تمثل متوسطات Vmax من ثلاث تجارب مستقلة (n = 3). أشرطة الخطأ تشير إلى التنمية المستدامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

تكميلية الجدول 1: قيم Vmax يستخدم الشكل 1 و الشكل 2- Vmax وحسبت قيم من الرسوم البيانية كما هو موضح في تكميلية الشكل 1 وكما هو موضح في القسم 4 من البروتوكول. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

تكميلية الشكل 1: رسم توضيحي للبيانات الأولية المستمدة من برنامج قارئ لوحة. زيادة الأسفار على الرسوم البيانية في الوقت التي كانت تستخدم لتحديد Vmax. اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-

تكميلية الشكل 2: الانقسام proteolytic التربسين بوساطة من فكوف S1/S2 و S2 ' مواقع الببتيدات فلوروجينيك. انشقاق التربسين الاعتداء فيكف I و-4 وفيبف أنا المواقع السوداء S1/S2 و FECV I و-4، فيبف أنا أسود، 1683 الثاني FECV و S2 فيبف الثاني 1146 ' المواقع. اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نحن الحاضرين هنا مقايسة ببتيد فلوروجينيك التي تسمح لفحص سريع لتسلسل البروتين لانتهاء الانقسام proteolytic من البروتياز. في المثال الأول اخترنا الانقسام المختلفة زخارف الموقع من البروتين الصرف CoV سبايك (S) لتوضيح تطبيق واحد لهذا التحليل. عدة يلفها الفيروسات التي تمتلك فئة لدى الانصهار البروتينات مثل CoV الصرف و CoV-السارس (الالتهاب الرئوي اللانمطى) وإنفلونزا هي الشواغل الرئيسية للصحة العامة والمخططات الجديدة تتطور باستمرار أن احتمال عبور الأنواع الحواجز من مضيفيهم الطبيعية للبشر1،،من1516. عزل الفيروسات ويزرعون لهم في المعمل قد لا يكون ممكناً دائماً أو يتطلب المختبرات الخاصة التي لا تتوفر في كل مرفق البحوث. ومن ثم، هناك حاجة إلى أساليب لتقييم تهديد الصحة العامة المحتملة الناشئة من الفيروسات التي يمكن أن تجري تحت ظروف المختبر العادية. بالإضافة إلى الفيروسات التي تستهدف البشر، بعض الفيروسات الحيوانية مثل فكوف كما تمتلك نفس الفئة الأولى الانصهار البروتينات، ولذلك، تقاسم خصائص مماثلة من نظرائهم من البشر. عزل هذه الفيروسات يمكن أيضا تحديا، مما يجعل استخدام أدوات مبتكرة لدراسة هذه الضرورة.

خطوة حاسمة في دورة حياة الفيروسات المذكورة أعلاه هو إدخال خلية المضيف والانصهار بتجهيز بروتيوليتيك من البروتين الانصهار كل وساطة المضيف البروتياز1،2. هو طريقة قياسية للتحقيق في هذا الجزء من دورة الحياة الفيروسية استنساخ جين البروتين الانصهار في ناقل تعبير الثدييات، ترانسفيكت خلايا الثدييات التي تسمح بالتعبير البروتين، واحتضان أو ترانسفيكت المشترك بحوزتي الفائدة، عزل البروتين، وإجراء تحليل لطخة غربية. ويأتي هذا الأسلوب مع العديد من القيود: توافر الحمض النووي الفيروسي/الجيش الملكي النيبالي لاستنساخ، تكاليف لتوليف الجين إذا كان لا الحمض النووي الريبي أو متوفراً، توفر لجسم مضاد للكشف عن البروتين الانصهار في المنتج (المنتجات) الانقسام، وأنه يمكن أن يستغرق عدة أسابيع حتى يتم تنفيذ الدراسة بأكملها. حتى يصبح أكثر مضيعة للوقت، المال والعمل المكثف إذا كان اهتمام الدراسة للتحقيق عدة طفرات في موقع الانقسام لأنها تتطلب الطفرات الموجهة من الموقع. ليس لديه الإنزيم الببتيد فلوروجينيك ونحن تصف هنا هذه القيود. الببتيدات الفائدة يمكن أن تصمم استناداً إلى تسلسل متاحة للجمهور، وهناك العديد من الموردين التي توفر مجموعة واسعة من البروتياز المؤتلف ذات الصلة لهذه الأنواع من الدراسات ويمكن إجراء الفحص بما في ذلك التحليل داخل يوم واحد.

في هذا المثال، قمنا بفحص انشقاق فارين بوساطة من S2 ' موقع الاعتراف بحوزتي من البروتين S CoV الصرف المستمدة من البشر والإبل من مصر والمغرب. EMC للبشرية/عام 2012 والجمل HKU205 S2 ' مواقع تحتوي على فكرة انقسام فورين ركسكسر نموذجية. ومع ذلك، ووفقا للانقسام PiTou 2.0 التهديف خوارزمية HKU205 S2 ' الموقع لا يتوقع أن يكون المشقوق فارين، ونحن مؤكدة تجريبيا19. والسبب لماذا HKU5 S2 'لم تتم معالجتها بواسطة فارين قد يكون سبب آيسولوسين في P1' الموقف. عندما اختبرنا اثنين الببتيدات التي حملت الطفرات الفردية في S2 EMC/2012 'تسلسل، كنا قادرين على التأكد من أن آيسولوسين في P1' إلى حد كبير ويلغي الانقسام بينما ألانين لاستبدال سيرين أدت إلى انشقاق مخفضة. Mor213 S2 ' لا يحتوي الموقع على فكرة انقسام فورين، وليس من المستغرب للكشف عن ما يقرب من لا انشقاق. درسنا أيضا كيف كليفس فارين S1/S2 و S2 ' مواقع الاعتراف بحوزتي من البروتين S فكوف. كنا قادرين على مراقبة انشقاق فارين من كلا الببتيدات فيكف (فيكف I و 4 S1/S2 و S2 FECV الثاني 1683 ')، في حين كانت لا المشقوق متواليات تحور من الفيروسات فيبف فارين.

عند مقارنة انشقاق فارين بوساطة من S2 EMC/2012 ' الببتيد (الشكل 1A) مع الببتيدات فيكف I و 4 S1/2 (الشكل 2A)، وجدنا أن هناك فرق 26-fold تقريبية في Vmax. وهذا يمكن تفسيره بفكرة الانقسام فورين في كل تسلسل (الجدول 1). بينما الحد الأدنى لمتطلبات انشقاق فارين فكرة ركسكسر، هو تسلسل ركسر مواتية أكثر2. ولذلك، S2 EMC/2012 ' هو المشقوق الببتيد، الذي لديه فكرة رسار، مع خصوصية أقل بالمقارنة مع الببتيد فيكف I و 4 S1/2 التي تحتوي على موقع انشقاق فارين رسرر (الجدول 1).

غير حد الرئيسية واحد من الفحص أن الببتيدات لا تعكس هيكل التعليم العالي البروتين عادة أنها مضمنة في. يعرض انقسام البروتين الانصهار الكامل طول الببتيد الانصهار ومشغلات استضافة خلية الإدخال1. التفاعل بين البروتين مبطلات والانصهار قد أيضا يتأثر بهيكل التعليم العالي البروتين الانصهار في حين أننا نفترض أن الببتيدات الخطي أكثر أو أقل. ومن ثم الانقسام والكشف عنها في مقايسة الببتيد قد تكون مصطنعة، وقد لا تعكس الحالة في فيفو . وأبلغت هذا للانقسام وإنفلونزا H3N2 ها النوع الفرعي ماتريبتاسي. بينما وصف عدة مجموعات الانقسام H3N2 هكتار من ماتريبتاسي في فحوصات الببتيد، فإنه يظهر أيضا أن الحضانة لكامل طول ها H3N2 البروتين وماتريبتاسي في خلية ثقافة لم يؤد إلى فوسوجينيك هكتار بروتين4،20، 21. وهناك أمثلة أخرى تبين أن تنظيم الانقسام proteolytic هامة بيولوجيا على مستوى تشكيل البروتين. وقد وصفت أن البروتينات الانصهار في بعض الأحيان بحاجة إلى سلسلة من الأحداث قبل الانصهار لتكون قادرة على كشف مواقع الانقسام عند الانصهار. البروتين الانصهار الفيروس سيمليكى للغابات، على سبيل المثال، يتطلب ترتيبات هيكلية جديدة خلال عدد من الأحداث بريفوسيون من أجل الكشف عن البروتين الانصهار وجعلها متاحة لتفعيل proteolytic22. ولذلك، النتائج التي تحققت في مقايسة ببتيد فلوروجينيك تحتاج إلى التحقق من صحتها بخلية الانصهار فحوصات أو تجارب مماثلة. ومع ذلك، لا يزال يسمح الإنزيم الببتيد لفحص سريع للعديد من تركيبات حوزتي/الببتيد و للحد من العمل والوقت لمتابعة التجارب منذ التركيبات التي لا تظهر الانقسام ومن المرجح جداً أن يحمل نفس النتيجة في فيفو.

الحد الرئيسية الثانية من الفحص الشواغل البروتياز. حتى الآن من الممكن فقط لاختبار البروتياز قابل للذوبان ولكن لا transmembrane البروتياز. تبعاً للقصد من هذه التجربة، وهذا يمكن أن يكون مشكلة. على سبيل المثال، قد الإنفلونزا يتم تنشيط عدد من البروتياز transmembrane الكائنة في أغشية الخلية8. إلى حد ما، يمكن التحايل على هذه المشكلة باستخدام المجالات النشطة proteolytic القابلة للذوبان، ولكن النتائج التي يجب أن تفسر بحذر ويجب أن يتم التحقق من صحة بالأساليب التقليدية. أننا نريد أن أشير إلى مثال بيفوريمينتيونيد مع ماتريبتاسي ونشاطها نحو H3N2 هكتار. في فيفو ماتريبتاسي يقع في غشاء الخلية ولكن الإنزيم المتاحة تجارياً هو المجال الحفاز للذوبان. كما تمت مناقشته فيما يتعلق بالبروتينات الانصهار، قد يكون من الممكن أنه يتطلب أيضا حوزتي كاملة الطول للتفاعل مع الركيزة البروتين كاملة الطول للحصول على الانقسام وأن اختبار مجالات واحدة فقط قد يسفر عن إيجابيات كاذبة.

وقد أظهرت هذه المنهجية أن تكون فعالة بدارسة الانقسام وتسلسل معين من الأحماض الأمينية فارين. ومع ذلك، تطبيقات بدرجات تقنية في أي حوزتي المتاحة (مثلاً، كاثيبسينس، كونفيرتاسي بروبروتين)، يجعلها وسيلة مفيدة للشاشة الببتيد المرشحين للانقسام ومبطلات. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن هذا التحليل يمكن أيضا استخدامها لاختبار فعالية مثبطات البروتياز ومن ثم يوفر سريعة وسهلة لأداة للشاشة مثبطات البروتين23.

والرزن الانقسام الببتيد فلوروجينيك الموصوفة هنا يمثل إضافة إلى انشقاق bioinformatic التهديف الخوارزميات، التي تتنبأ الانقسام والببتيد التي حوزتي العزم، استناداً إلى خصائص الأحماض الأمينية وتسلسل. يمكن استخدام هذه التقنيات اثنين، في تركيبة مع التقاليد الغربية النشاف التقنيات كوسيلة فعالة لدراسة حوزتي الانقسام في المختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

تمويل البحوث السوقية المشروع المقدم في هذه المخطوطة كان المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة منح R21 AI111085. وأيد منحا بحثية من مؤسسة موريس الحيوان ومؤسسة الماكر وين ومركز الصحة القطط كورنيل دراسة الفيروس التاجي المسبّب للقطط. ونود أيضا أن أشكر مالك بيريس على تزويدنا بتسلسل Mor213 قبل كانت متاحة للجمهور.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptides Biomatik N/A
Furin NEB P8077S
Trypsin, TPCK-treated Sigma-Aldrich 4352157-1KT
HEPES Sigma-Aldrich H3375
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Triton-X100 Sigma-Aldrich X100
PBS Corning 21-040-CV
SpectraMax Gemini XPS Molecular Devices XPS
SoftMax Pro 6.5.1  Molecular Devices N/A
96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated) Costar 3915
Light damping tubes Watson Lab 131-915BL or 131-915BR
Microsoft Excel Microsoft N/A
Prism 7 GraphPad N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Virology. 479-480, 498-507 (2015).
  2. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. (2014).
  3. Hamilton, B. S., Whittaker, G. R., Daniel, S. Influenza virus-mediated membrane fusion: Determinants of hemagglutinin fusogenic activity and experimental approaches for assessing virus fusion. Viruses. 4, (7), 1144-1168 (2012).
  4. Straus, M. R., Whittaker, G. R. A peptide-based approach to evaluate the adaptability of influenza A virus to humans based on its hemagglutinin proteolytic cleavage site. PloS one. 12, (3), e0174827 (2017).
  5. Kawaoka, Y., Webster, R. G. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, (2), 324-328 (1988).
  6. Abdelwhab, E. S. M., et al. A Unique Multibasic Proteolytic Cleavage Site and Three Mutations in the HA2 Domain Confer High Virulence of H7N1 Avian Influenza Virus in Chickens. Journal of Virology. 90, (1), 400-411 (2016).
  7. Steinhauer, D. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. Virology. 258, (1), 1-20 (1999).
  8. Böttcher-Friebertshäuser, E., Klenk, H. D., Garten, W. Activation of influenza viruses by proteases from host cells and bacteria in the human airway epithelium. Pathogens and disease. 69, (2), 87-100 (2013).
  9. Horimoto, T., Nakayama, K., Smeekens, S. P., Kawaoka, Y. Proprotein-processing endoproteases PC6 and furin both activate hemagglutinin of virulent avian influenza viruses. Journal of Virology. 68, (9), 6074-6078 (1994).
  10. Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, (14), 5871-5876 (2009).
  11. Polgar, L. General Aspects of Proteases. Mechanisms of Protease Action. 43-76 (1989).
  12. Whittaker, G. R., André, N. M., Millet, J. K. Improving Virus Taxonomy by Recontextualizing Sequence-Based Classification with Biologically Relevant Data: the Case of the Alphacoronavirus 1 Species. mSphere. 3, (1), 1-8 (2018).
  13. Licitra, B. N., et al. Mutation in spike protein cleavage site and pathogenesis of feline coronavirus. Emerging Infectious Diseases. 19, (7), 1066-1073 (2013).
  14. Sanjuan, R., Nebot, M. R., Chirico, N., Mansky, L. M., Belshaw, R. Viral Mutation Rates. Journal of Virology. 84, (19), 9733-9748 (2010).
  15. Trombetta, C., Piccirella, S., Perini, D., Kistner, O., Montomoli, E. Emerging Influenza Strains in the Last Two Decades: A Threat of a New Pandemic? Vaccines. 3, (1), 172-185 (2015).
  16. Chu, D. K. W., et al. MERS coronaviruses from camels in Africa exhibit region-dependent genetic diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1-6 (2018).
  17. Caprioli, R. M., Smith, L. Determination of Km and Vmax for Tryptic Peptide Hydrolysis Using Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 58, (6), 1080-1083 (1986).
  18. Millet, J. K., Goldstein, M. E., Labitt, R. N., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging microbes and infections. 5, (12), e126-e129 (2016).
  19. Tian, S., Huajun, W., Wu, J. Computational prediction of furin cleavage sites by a hybrid method and understanding mechanism underlying diseases. Scientific Reports. 2, (2012).
  20. Hamilton, B. S., Gludish, D. W. J., Whittaker, G. R. Cleavage Activation of the Human-Adapted Influenza Virus Subtypes by Matriptase Reveals both Subtype and Strain Specificities. Journal of Virology. 86, (19), 10579-10586 (2012).
  21. Beaulieu, A., et al. Matriptase Proteolytically Activates Influenza Virus and Promotes Multicycle Epithelium Replication in the Human Airway. Journal of virology. 30, (878), 4237-4251 (2013).
  22. Hammar, L., Markarian, S., Haag, L., Lankinen, H., Salmi, A., Holland Cheng, R. Prefusion rearrangements resulting in fusion peptide exposure in Semliki Forest virus. Journal of Biological Chemistry. 278, (9), 7189-7198 (2003).
  23. Hamilton, B. S., Chung, C., Cyphers, S. Y., Rinaldi, V. D., Marcano, V. C., Whittaker, G. R. Inhibition of influenza virus infection and hemagglutinin cleavage by the protease inhibitor HAI-2. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450, (2), 1070-1075 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics