Isolamento, purificazione e differenziazione dei precursori dell'osteoclast dal midollo osseo del ratto

Biology

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Summary

Gli osteoclasti sono polykaryons di macrofage specifici del tessuto derivato dal lignaggio dei monociti-macrofage delle cellule staminali ematopoietiche. Questo protocollo descrive come isolare le cellule del midollo osseo in modo da ottenere grandi quantità di osteoclasti riducendo il rischio di incidenti riscontrati nei metodi tradizionali.

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Wang, L., Zheng, S., Guo, Y., Pan, Y., Sun, J., Xu, W., Lu, J., Li, W., Ma, Y. Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow. J. Vis. Exp. (147), e58895, doi:10.3791/58895 (2019).

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Abstract

Gli osteoclasti sono cellule grandi, multinucleate e di riassorbimento osseo del lignaggio dei monociti-macrofage che sono formate dalla fusione di monociti o precursori di macrofage. Un eccessivo riassorbimento osseo è uno dei meccanismi cellulari più significativi che portano a malattie osteolitiche, tra cui l'osteoporosi, la parodontite e l'osteolisi periprotesica. La principale funzione fisiologica degli osteoclasti è quella di assorbire sia la componente minerale di idrossiapatite che la matrice organica dell'osso, generando l'aspetto caratteristico del riassorbimento sulla superficie delle ossa. Ci sono relativamente pochi osteoclasti rispetto ad altre cellule del corpo, soprattutto nelle ossa adulte. Studi recenti si sono concentrati su come ottenere osteoclasti più maturi in meno tempo, che è sempre stato un problema. Diversi miglioramenti nelle tecniche di isolamento e cultura si sono sviluppati nei laboratori al fine di ottenere osteoclasti più maturi. Qui, introduciamo un metodo che isola il midollo osseo in meno tempo e con meno sforzo rispetto alla procedura tradizionale, utilizzando un dispositivo speciale e semplice. Con l'uso di centrifugazione a gradiente di densità, otteniamo grandi quantità di osteoclasti completamente differenziati dal midollo osseo del ratto, che sono identificati con metodi classici.

Introduction

L'omeostasi ossea è un processo fisiologico complesso che è regolato da osteoclasti di riassorbimento osseo e osteoblast che formano ossa1. Un equilibrio tra attività osteoblastica e osteoclastica mediata attraverso osteoblasti e osteoclasti, rispettivamente, è altamente essenziale per mantenere la salute ossea e l'omeostasi, perché le perturbazioni nell'omeostasi ossea possono portare a malattie ossee, come come crescita ossea anormale o perdita di densità ossea. Come cellule di riassorbimento osseo uniche, gli osteoclasti sono importanti nelle malattie legate alla distruzione ossea anormale, tra cui l'osteoporosi, la parodontite e l'osteolisi periprotesica2,3.

Lo sviluppo di una cultura osteocultima è diviso principalmente in due fasi. I metodi stabiliti da Boyde et al.4 e Chambers et al.5 hanno composto la prima tappa negli anni ottanta. Hanno ottenuto osteoclasti relativamente abbondanti dalle ossa degli animali appena nati, che è il periodo di rimodellamento rapido. Gli osteoclasti vengono rilasciati frammentare e mescolare le ossa in un mezzo speciale. Tuttavia, le cellule ottenute con questo metodo sono a basso contenuto di quantità e purezza. Il secondo stadio è stato lo sviluppo di colture a lungo raggio di formazione di degli osteoclasti, utilizzando cellule di lignaggio ematopoietiche derivate dal midollo osseo6. Le citochines, come 1 α, 25-diidrossiamina D3, prostaglandina E2 (PGE-2), e l'ormone paratiroideo (PTH), che vengono aggiunti nel mezzo di coltura, agiscono attraverso il sistema di osteoblasti/cellule stromali per stimolare la formazione di degli osteoclasti7,8 . Tuttavia, la purezza e la quantità degli osteoclasti ottenuti con questo metodo non possono soddisfare le esigenze della moderna ricerca sulla biologia molecolare. Quindi, la scoperta del fattore stimolante le colonie di macrofage (m-CSF) e dell'attivatore del recettore per il ligando del fattore nucleare-κB (RANKL) rende l'osteoclastogenesi più facile9,10,11e il metodo di utilizzo di m-CSF e RANKL per stimolare direttamente la formazione di degli osteoclasti è ampiamente usato in tutto il mondo. Tuttavia, ci sono ancora alcuni dettagli nella metodologia che devono essere migliorate.

Attualmente, il metodo di coltura degli osteoclasti più comunemente usato, come descritto da Marino et al.12 e Pei et al.13, spesso richiede la rimozione del tessuto circostante intorno all'osso e utilizza un ago sterilizzato per lavare la cavità del midollo con supporti completati. Ci sono alcuni inconvenienti a questo processo, compreso il fatto che (1) la rimozione del tessuto circostante intorno all'osso richiede molto tempo e grande tecnica chirurgica, (2) le ossa sono fragili e possono portare a deflusso del midollo osseo, (3) la cavità del midollo osseo potrebbe essere troppo piccolo per lavare, e (4) c'è il rischio di lesioni dell'ago. Per evitare questi problemi, centrifugheremo i tubi contenenti le ossa per il midollo osseo invece di lavare l'ago al midollo osseo. Qui, introduciamo un metodo stabile e sicuro che isola il midollo osseo in meno tempo e con meno sforzo rispetto alla procedura tradizionale. Insieme all'uso della centrifugazione con gradiente di densità, otteniamo grandi quantità di osteoclasti completamente differenziati in vitro.

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Protocol

Tutti i metodi che coinvolgono gli animali qui descritti sono approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università di medicina cinese di Nanchino.

1. impostazione del Setup

  1. Preparare diversi puntali per pipette da 1 mL longitudinalmente tagliati (1 cm) e diversi provette per microcentrifuga da 1,5 mL. Mettere i puntali per pipette e le provette per microcentrifuga a 103 kPa e 121 ° c per 20 minuti e assicurarsi che siano sterili.
  2. Preparare una scatola di ghiaccio e diversi piatti sterili per preservare i tessuti isolati durante la procedura di isolamento.

2. preparazione del mezzo di coltura

  1. Prepara il mezzo di coltura completo. Utilizzare l'alfa medio essenziale minimo (α-MEM) che contiene una soluzione finale dell'1% di penicillina/streptomicina e 10% di siero bovino fetale (FBS).
  2. Filtrare il supporto dal passaggio 2,1 utilizzando un filtro da 0,22 μm.
  3. Preparare il mezzo di induzione del midollo osseo. Per 50 mL di soluzione, aggiungere 125 μL di M-CSF a una concentrazione di 10.000 ng/mL (tabella dei materiali) a 49,875 ml di mezzo di coltura completo (dal passo 2,2) per effettuare una soluzione finale di 25 ng/ml di m-CSF.
  4. Preparare il mezzo di induzione degli osteoclasti. Per 50 mL di soluzione, aggiungere 500 μL di RANKL a una concentrazione di 10.000 ng/mL (tabella dei materiali) a 49,5 ml di mezzo di induzione del midollo osseo (dal passo 2,3) per effettuare una soluzione finale di 25 ng/ml di M-CSF e 100 ng/ml RANKL.

3. isolamento delle cellule derivate dal midollo osseo

  1. eutanasia
    1. Euthanize quattro ratti di Sprague Dawley di CO2 inalazione seguita da lussazione cervicale, e immergerli in 75% etanolo per 1 min.
      Nota: Assicurarsi che gli animali siano dello stesso sesso e di un'età simile. Si raccomandano animali di età da 2 a 3 settimane. Due ratti sono preparati per il metodo centrifugo, mentre gli altri due sono per il metodo tradizionale.
  2. Metodo tradizionale
    1. Collocare gli animali su una scheda disinfettante in posizione supina. Fare una piccola incisione (circa 1 cm) al femore prossimale per sbucciare la pelle, utilizzando forbici sterili.
    2. Dissezionare i femori e le tibias. Tagliare le parti di collegamento bilaterali intorno alle articolazioni dell'anca, del ginocchio e della caviglia per isolare le tibia e i femori con attenzione e delicatezza. Tagliare parte dei tessuti intorno all'osso; essere approfondita. Non fratturare la tibia e femori durante l'intero processo.
    3. Mettere le ossa pulite in un piatto con 5 mL del mezzo di coltura completo. Tagliare l'osso lungo con le forbici sterili e utilizzare un ago siringa da 1 mL per lavare accuratamente la cavità del midollo con 10 mL di supporto completo fino a quando la cavità del midollo diventa bianca.
    4. Trasferire la sospensione cellulare dal punto 3.2.3 a un tubo da 50 mL, quindi filtrarla con un filtro da 70 μm per rimuovere il tessuto rimanente.
    5. Aggiungere 5 mL di tampone di lisi dei globuli rossi (tabella dei materiali) alla sospensione cellulare. Incubare le cellule per 8 min sul ghiaccio. Quindi, centrifugare le cellule a 250 x g per 5 min per produrre il pellet cellulare.
    6. Aspirare il fluido e risospendere le cellule in 10 mL di supporto completo. Contare le cellule utilizzando un emocytometro e calcolare il tempo speso sui passi da questa sezione (sezione 3,2).
  3. Metodo migliorato
    1. Collocare gli animali su una scheda disinfettante in posizione supina. Fare una piccola incisione (circa 1 cm) al femore prossimale con forbici sterili per sbucciare la pelle.
    2. Dissezionare i femori e le tibias. Tagliare correttamente la parte dei tessuti intorno all'osso (non è necessario rimuovere completamente). Non fratturare la tibia e femori durante l'intero processo.
    3. Sciacquare le tibia e i femori con 12 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e tagliarli a metà. Posizionare le tibia e le femore da cattura in una punta di pipetta da 1 ml (dal passo 1,1), che viene poi messa in una provetta per microcentrifuga e viene centrifugata 3x a 1.000 x g per 45 s a 4 ° c.
    4. Dopo la centrifugazione, rimuovere la punta della pipetta contenente l'osso e lasciare il midollo osseo nel tubo. Aggiungere 200 μL di supporto completo nel tubo della microcentrifuga e ripetere il pipettaggio per disintegrare accuratamente il midollo.
    5. Trasferire la sospensione cellulare dal passaggio 3.3.4 a un tubo da 50 mL, quindi filtrarla con un filtro da 70 μm per rimuovere il tessuto rimanente.
    6. Contare le cellule utilizzando un emocytometro e calcolare il tempo speso sui passi da questa sezione (sezione 3,3).

4. purificazione per centrifugazione con gradiente di densità

  1. Regolare la sospensione cellulare dal punto 3.2.6 o dal passaggio 3.3.5 a 2 mL con α-MEM.
  2. Preparare un tubo centrifugo silicificato sterile e aggiungere 8 mL della soluzione di separazione cellulare (tabella dei materiali) al tubo.
  3. Aggiungere la sospensione cellulare dal passaggio 4,1 alla soluzione di separazione delle cellule. Aderire la punta della pipetta alla superficie interna del tubo e mantenere un 45 ° alla superficie interna. Dopo aver aggiunto la sospensione, apparirà un limite chiaro tra lo strato delle cellule e la soluzione di separazione.
    Nota: L'operazione richiede molta cura e deve essere eseguita lentamente.
  4. Centrifugare la soluzione stratificata in una centrifuga orizzontale a 500 x g per 30 min. Dopo la centrifugazione, aspirare il secondo strato nuvoloso, che contiene le cellule bersaglio, dall'alto verso il basso.
    Nota: Annullare l'accelerazione e la decelerazione della centrifuga prima della centrifugazione. Ci sono sei strati dopo la centrifugazione; il primo strato è lo strato di diluente, il secondo strato è lo strato monociti, il terzo strato è lo strato di cellule mononucleate, il quarto strato è il liquido di separazione trasparente uno strato, il quinto è lo strato di cellule granulari, e il sesto strato è la cella rossa strato.
  5. Trasferire le celle di destinazione in un nuovo tubo. Aggiungere 5 mL di PBS per lavare le cellule 3x. Dopo ogni lavaggio, centrifugare le cellule bersaglio a 250 x g per 5 min per produrre il pellet cellulare.
  6. Risospendere il pellet cellulare con il mezzo di induzione del midollo osseo e contare le cellule utilizzando un emocytometro. Aggiungere 5 – 8 mL di mezzo di induzione del midollo osseo dal passo 2,3 per ottenere una soluzione di cellule finali di 300.000 cellule/mL. Aggiungere 1 mL per ogni pozzetto di una piastra 24-well.

5. cultura e differenziazione

  1. Dopo aver incubato le cellule a 37 ° c per 24 ore, aspirare delicatamente il fluido e aggiungere 1 mL del mezzo di induzione dell'degli osteoclasti ad ogni pozzetto. Agitare delicatamente la piastra e metterla in incubatore a 37 ° c.
  2. Cambiare il mezzo di induzione degli osteoclasti ogni 48 h. Mentre si fa così, cambiare 0,8 mL di mezzo nel pozzo e agitare delicatamente la piastra.
    Nota: Gli osteoclasti grandi, motili e multinucleati devono essere osservati nel pozzo sotto un microscopio invertito, tipicamente intorno ai giorni 4 – 6.

6. colorazione della fosfatasi acida resistente al tartrato

Nota: Gli osteoclasti multinucleati saranno presenti dopo 4 – 6 giorni se l'induzione (sezione 5) ha esito positivo.

  1. Preparare la soluzione fissativa combinando 4 mL di 37% di formaldeide, 32,5 mL di acetone e 12,5 mL di una soluzione di citrato. Conservare la soluzione fissativa a 4 ° c.
  2. Preparare la soluzione di colorazione della fosfatasi acida (TRAP) resistente ai tartrati (tabella dei materiali) aggiungendo 50 μl di nitrito di sodio, 50 μl di soluzione di base di Fast Garnet gbc, 50 μl di soluzione di naftolo As-bi fosfato, 200 μl di soluzione di acetato e 100 μl di soluzione di tartrato in 4,55 mL di acqua deionizzata che viene preriscaldato a 37 ° c. Poi, mescolare delicatamente per inversione per 1 min, e lasciarlo riposare per 2 min.
  3. Dopo l'induzione di successo di osteoclasti, aspirare il mezzo, e lavare delicatamente i pozzi 3x con PBS.
  4. Portare la soluzione fissativa a temperatura ambiente (RT). Aggiungere 2 mL di soluzione fissativa ai pozzetti per 30 s e non lasciare asciugare le cellule.
  5. Aspirare la soluzione fissativa, lavarla delicatamente 3x con acqua deionizzata che viene preriscaldato a 37 ° c, e quindi aspirare l'acqua.
  6. Aggiungere 2 mL di soluzione di colorazione TRAP per 1 h a 37 ° c e conservare il campione al buio.
  7. Dopo 1 h, aspirare la macchia, e lavare delicatamente il campione con acqua deionizzata che viene preriscaldato a 37 ° c, e quindi aspirare l'acqua.
  8. Contromacchia le cellule per 1 minuto in una soluzione di ematossilina. Dopo la colorazione, aspirare la soluzione di ematossilina e lavare delicatamente le cellule 3x con acqua deionizzata.
  9. Osteoclasti immagine utilizzando microscopia campo chiaro, e TRAP+ celle con tre o più nuclei appariranno viola.

7. saggio di riassorbimento osseo utilizzando la colorazione blu di toluidina

  1. Pretrattamento delle fette ossee
    1. Tagliare la corteccia ossea femorale bovina fresca in fette spesse 2 cm lungo l'asse longitudinale mediante sega Microelettrica. Quindi, tagliare e macinare le fette con le smerigliatrici dei tessuti duri in 80 μm.
    2. Lavare le fette in un bicchiere con acqua deionizzata e 100 Hz ultrasuoni per 1 h, e ripetere 3x.
    3. Immergere le fette in 75% alcool per 2 h. Quindi, aspirare l'alcol ed esporre ogni lato delle fette alla luce ultravioletta per 1 h su una piattaforma pulita.
    4. Prima di piantare le cellule, immergere le fette nel terreno di coltura per almeno 2 h.
  2. Colorazione Blu toluidina
    1. Posizionare le fette ossee pretrattate nella piastra a 24. Piantare le cellule come indicato al punto 4,6 e indurre le cellule come indicato nel paragrafo 5.
    2. Dopo la comparsa di osteoclasti (dopo 4 – 6 giorni), lavare le fette con 1 mL di 0,25 di idrossido di ammonio M, e Sonicare loro 3x per 5 min ciascuno per rimuovere le cellule viventi per consentire l'analisi dei pozzi di riassorbimento sulle fette ossee. Poi, rimuovere l'idrossido di ammonio e macchiare le fette con 1 mL di 1% (wt/vol) toluidina soluzione blu per porzione per 2 min.
    3. Lavare le fette con PBS. Selezionare casualmente cinque viste ed eseguire un'analisi semiquantitativa dell'area di riassorbimento utilizzando un software di analisi delle immagini.

8. microscopia elettronica a scansione

  1. Anteporre le fette ossee dal punto 7.2.1 con 1 mL di 2,5% di glutaraldeide per porzione per 2 h a RT, quindi, Sonicare le fette 3x per 3 min ciascuna con 1 M di idrossido di ammonio per rimuovere le cellule e rimuovere l'idrossido di ammonio.
  2. Lavare le fette di osso 3x per 12 min ciascuna con PBS.
  3. Fissare le fette di osso con 1% di acido osmico per 2 h a RT.
  4. Eseguire disidratazione a gradiente di etanolo, con 50%, 70%, 80%, 90%, e 95% etanolo, per 15 min per ogni gradiente, e poi, sostituire l'etanolo con acetato di isoamile per 15 min.
  5. Rivestire le fette con oro palladio, e poi, analizzare scansionando microscopia elettronica.

9. colorazione di immunofluorescenza del recettore della calcitonina

Nota: Gli osteoclasti multinucleati saranno presenti dopo 4 – 6 giorni se l'induzione ha esito positivo (paragrafo 5).

  1. Aspirare il mezzo e lavare delicatamente il pozzo 3x con PBS.
  2. Fissare le cellule per 10 min con 4% paraformaldeide, che è preraffreddato a 4 ° c.
  3. Aggiungere 1 mL di PBS con 0,3% tensioattivo non ionico per pozzo per 30 min su ghiaccio. Quindi, aspirare il PBS con 0,3% tensioattivo non ionico e aggiungere 1 mL di PBS con 5% FBS per pozzo per 30 min su ghiaccio.
  4. Aspirare il PBS e incubare le membrane con il recettore anti-calcitonina (anti-CTR) ad una diluizione 1:100 in PBS a 4 ° c durante la notte.
  5. Aspirare la soluzione e incubare le membrane con anticorpi IgG anti-coniglio coniugati con Alexa-488 a una diluizione 1:1000 in PBS per 1 ora a RT.
  6. Aspirare la soluzione e lavare delicatamente le cellule 3x con PBS. Contromacchia i nuclei con Hoechst 33342 macchia per 3 minuti a RT.
  7. Aspirare la soluzione, e lavare delicatamente le cellule 3x con PBS. Osservare l'intensità del CTR mediante microscopia a fluorescenza.

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Representative Results

Lo scopo del protocollo era quello di isolare e purificare un gran numero di precursori degli osteoclasti convenientemente e indurre osteoclasti con successo. Completando con M-CSF e RANKL, osteoclasti giganti sono stati osservati nei giorni 5 – 6. La formazione di osteoclasti è stata identificata con successo dalla colorazione TRAP (Figura 1a). Le cellule grandi e viola sono state considerate come cellule trappola-positive con nuclei multipli (tipicamente ≥ tre nuclei). Attraverso questo metodo, era tipico per ottenere 800 osteoclasti, contenenti fino a 30 nuclei per osteoclast, in una piastra 24-Well (Figura 1B). Rispetto al metodo tradizionale, il metodo migliorato ha risparmiato circa 20 minuti nell'intero stato di isolamento (Figura 1C).

Utilizzando le fette ossee per valutare l'attività del riassorbimento osseo è tipico metodo in vitro. Attraverso la colorazione blu di toluidina, l'area di riassorbimento è stata visualizzata come verde chiaro (Figura 2a) ed è stata calcolata. La struttura e le caratteristiche delle cavità ossee sono state chiaramente osservate mediante la microscopia elettronica a scansione (Figura 2B).

Il CTR, uno dei marcatori cellulari specifici per l'osteoclast, è fondamentale per identificare gli osteoclasti e studiare la formazione di osteoclasti nell'osso. L'espressione positiva del CTR identifica chiaramente gli osteoclasti e li distingue dai polykaryons di macrofage. Il CTR è stato rilevato dai saggi di immunofluorescenza. Il colore verde indicava l'espressione del CTR e il blu indicava i nuclei (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: osteoclastogenesi da cellule derivate dal midollo osseo. A) immagine rappresentativa della colorazione trap. Il micrografo a campo luminoso a ingrandimento 10x Mostra più giganteschi osteoclasti multinucleati che sono positivi per la trappola e sono stati osservati con un ingrandimento di 20x. Un esempio di un nucleo all'interno di un degli osteoclasti multinucleato è mostrato dalla freccia rossa. (B) il Micrografo del campo chiaro con ingrandimento 10x dimostra che erano presenti un gran numero di osteoclasti positivi alla trappola. Un esempio di un grande degli osteoclasti multinucleato è delineato dalla linea tratteggiata rossa. C) raffronto tra il tempo impiegato per i due metodi di isolamento. Tutte le operazioni sono state eseguite dallo stesso gruppo di sperimentatori. I dati rappresentano i mezzi ± deviazione standard. * P < 0,05, n = 3. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 2
Figura 2: saggi di riassorbimento osseo da fette ossee. (A) il campo luminoso Micrografo a 4x ingrandimento dimostra l'area di riassorbimento osseo, è macchiato verde chiaro dalla macchia blu toluidina, ed è rotondo-, ovale-o a forma di salsiccia. Un esempio dell'area di riassorbimento osseo è mostrato dalla freccia rossa. (B) pozzi di riassorbimento osservati con microscopia elettronica a scansione a ingrandimento 500x. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 3
Figura 3: caratterizzazione dell'espressione del CTR negli osteoclasti mediante colorazione con immunofluorescenza. Il pannello mostra un segnale di CTR chiaro intorno alle celle. (A) le cellule positive del CTR. B) nuclei. C) fusi. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

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Discussion

La capacità di ottenere e studiare osteoclasti in vitro è un'abilità critica e fondamentale per qualsiasi ricercatore che desideri studiare il metabolismo osseo, che può aiutare a comprendere i meccanismi delle malattie che assorbono le ossa e sviluppare nuovi agenti terapeutici. Il presente studio ha descritto un protocollo con alcune modifiche basate su metodi precedenti.

Utilizzando puntali per pipette e provette per microcentrifuga per ottenere il midollo osseo, ha ridotto in gran parte il tempo di funzionamento dell'ottenimento del midollo osseo e il carico di lavoro del personale di laboratorio rispetto ai metodi tradizionali. Nel frattempo, il metodo evita il rischio di perdita del midollo osseo o lesione dell'ago. In uno studio precedente, le cellule derivate dal midollo osseo sono state placcate immediatamente dopo l'isolamento12,13. La centrifugazione con gradiente di densità è stata utilizzata per selezionare i monociti del midollo osseo in base alle differenze nei coefficienti di insediamento. Nel processo di centrifugazione con gradiente di densità, l'aggiunta dei mezzi di separazione delle cellule deve essere eseguita delicatamente e con attenzione lungo la parete, al fine di rendere chiari i confini. Tuttavia, la tecnica è limitata dalla funzione della centrifuga e se è impostata con i parametri di accelerazione e decelerazione. La densità di semina è la condizione chiave per la coltivazione di osteoclasti. Più volte, il protocollo non è riuscito a causa di una densità di semina improprio durante la placcatura delle cellule. Pertanto, in questo protocollo si consiglia approssimativamente 300.000 celle per pozzetto a 24 pozzo. Questo protocollo è adatto anche per l'ottenimento di vari tipi di cellule derivate dal midollo osseo in ratti o altri animali (ad esempio, topo, coniglio e pollo).

Il metodo più classico per valutare l'attività degli osteoclasti è il saggio del pozzo di riassorbimento. La corteccia ossea bovina è comunemente usata per il saggio del pozzo di riassorbimento perché le sue fonti sono ampiamente disponibili. Con l'aiuto di un moderno sistema di sezionamento, possiamo ottenere più facilmente fette sottili di osso. Il saggio del pozzo di riassorbimento ha tre fattori. Per generare con successo un pozzo di riassorbimento nelle fette, le sezioni devono essere trattate rigorosamente come descritto per il deingrassaggio nel protocollo. Inoltre, gli osteoclasti del ratto vengono attivati per formare pozzi di riassorbimento in un ambiente leggermente acido e la funzione di riassorbimento sarà essenzialmente "spenta" quando il pH sale sopra 7,214,15. Pertanto, è degno di nota che l'apertura della porta dell'incubatore frequentemente durante il progresso degli esperimenti può portare a perturbazioni dei valori di pH e pCO2 , anche influenzando la funzione di riassorbimento degli osteoclasti16. Infine, le fette di osso dovrebbero rimanere nella parte inferiore dei pozzi e non devono essere spostate o galleggiare quando si cambia il mezzo, al fine di evitare irritazioni.

Il CTR è un membro della sottofamiglia di classe II dei recettori accoppiati con proteina G 7-transmembrana che contengono anche l'ormone paratiroideo e i recettori secretina17. Oltre alla colorazione TRAP e al saggio del pozzo di riassorbimento, gli osteoclasti sono identificati dalla morfologia e dalla funzione e il CTR-positivo identifica gli osteoclasti in immunologia. Ora, possiamo anche usare la colorazione fluorescente dell'anello di actina e misurare i Crosslink di piridinolina nel supernatante per identificare gli osteoclasti.

Anche se diversi ricercatori hanno diverse familiarità con tecniche sperimentali e la quantità totale di cellule nel midollo osseo è certa, abbiamo ottenuto cellule del midollo osseo in un tempo più breve, relativamente, e alla fine, ottenuto grandi quantità di completamente osteoclasti differenziati dal midollo osseo del ratto.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (81473692) a Yong ma. Gli autori ringraziano tutto il personale del centro di ricerca medica del primo collegio di medicina clinica presso l'Università di medicina cinese di Nanchino.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit Sigma-Aldrich 387A
Automatic Hard Tissue Slicer Lecia RM2265
Bovine femoral bone Purchased by ourselves
Cell Incubator Heraus BB16/BB5060
Fetal Bovine Serum Sarana s-fbs-au-015
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150077
Hard Tissue Grinders Lecia SP-2600
Histopaque Kit TianJing Haoyang TBD2013DR Silicified centrifugal tube amd cell separation solution
Hochest33342 Sigma-Aldrich B2261
Inverted Phase Contrast Microscope Olympus CKX31
Inverted Fluorescence Microscope Lecia DMI-3000
MEM, no Glutamine Gibco 11090-081
Penicillin-Streptomycin, Liquid Gibco 15140122
Rabbit Anti-Calcitonin receptor Bioss bs-0124R
Recombinant Rat M-CSF PeproTech 400-28
Recombinant Rat sRANK Ligand PeproTech 400-30
Red Blood Cell Lysis Buffer Absin abs47014932
Scanning Electron Microscopy FEI Quanta 200
Toluidine Blue Sigma-Aldrich 89649

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References

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