नेइसेरिया gonorrhoeae समुच्चय के एंटीबायोटिक संवेदनशीलता की मात्रात्मक परीक्षा एटीपी उपयोग वाणिज्यिक परख और जीने/मृत धुंधला

Immunology and Infection

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Summary

एक साधारण एटीपी-परख और जीवित/मृत धुंधला विधि को मापने और ceftriaxone के साथ उपचार के बाद नेइसेरिया gonorrhoeae अस्तित्व कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया । इस प्रोटोकॉल को किसी भी एंटीबायोटिक के रोगाणुरोधी प्रभाव की जांच करने के लिए बढ़ाया जा सकता है और बैक्टीरियल फिल्म में एंटीबायोटिक दवाओं की ंयूनतम निरोधात्मक एकाग्रता को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Wang, L. C., Wagner, J., Capino, A., Nesbit, E., Song, W., Stein, D. C. Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining. J. Vis. Exp. (144), e58978, doi:10.3791/58978 (2019).

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Abstract

एंटीबायोटिक प्रतिरोधी नेइसेरिया gonorrhoeae (जीसी) के उद्भव एक विश्वव्यापी स्वास्थ्य खतरा है और जो लोग इलाज असफल की पहचान करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया । इस ग्राम-नकारात्मक जीवाणु का कारण बनता है सूजाक विशेष रूप से मनुष्यों में । संक्रमण के दौरान, यह समुच्चय के रूप में सक्षम है और/ न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) परीक्षण एंटीबायोटिक दवाओं के लिए संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए और उचित उपचार को परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, vivo में उंमूलन और उसके संबंध प्रयोगशाला परिणामों के लिए तंत्र का पता नहीं है । एक तरीका है कि कैसे GC एकत्रीकरण एंटीबायोटिक संवेदनशीलता को प्रभावित करता है और कुल आकार और एंटीबायोटिक संवेदनशीलता के बीच संबंध से पता चलता है की जांच का विकास किया गया था । जब जीसी कुल, वे और अधिक एंटीबायोटिक की हत्या के लिए प्रतिरोधी रहे हैं, ceftriaxone उपचार की परिधि में उन लोगों से बेहतर केंद्र में बैक्टीरिया के साथ । डेटा इंगित करता है कि N. gonorrhoeae समुच्चय ceftriaxone करने के लिए अपनी संवेदनशीलता को कम कर सकते हैं, जो मानक आगार प्लेट आधारित MIC तरीकों का उपयोग कर प्रतिबिंबित नहीं है । इस अध्ययन में इस्तेमाल विधि शोधकर्ताओं नैदानिक प्रासंगिक स्थितियों के तहत बैक्टीरियल संवेदनशीलता का परीक्षण करने की अनुमति देगा ।

Introduction

सूजाक एक आम यौन संचारित संक्रमण (STI)1है । नेइसेरिया gonorrhoeae (GC), एक ग्राम नकारात्मक diplococcal जीवाणु, इस रोग का प्रेरणा का एजेंट है । जननांग संक्रमण के लक्षण पेशाब के दौरान दर्द में परिणाम कर सकते हैं, सामान्यीकृत जननांग दर्द, और मूत्रमार्ग निर्वहन । संक्रमण अक्सर स्पर्शोन्मुख2,3,4,5, और यह विस्तारित औपनिवेशीकरण के लिए अनुमति देता है । ये अनुपचारित संक्रमण एक प्रमुख स्वास्थ्य चिंता का विषय है, क्योंकि वे शरीर के संचरण की सुविधा के लिए क्षमता है और इस तरह श्रोणि भड़काऊ रोग (PID) और प्रसार gonococcal संक्रमण (DGI)6के रूप में जटिलताओं के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । एंटीबायोटिक प्रतिरोधी सूजाक एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य संकट और एक बढ़ती सामाजिक बोझ7है । सेफालोस्पोरिन्स को कम संवेदनशीलता एक एंटीबायोटिक से उपचार आहार परिवर्तन में हुई है दोहरी थेरेपी, जो8ceftriaxone के साथ azithromycin या doxycycline को जोड़ती है । ceftriaxone और azithromycin9,10, स्पर्शोन्मुख संक्रमण के साथ संयोजन में वृद्धि की विफलता, सूजाक उपचार विफलताओं को समझने के लिए की जरूरत पर प्रकाश डाला गया ।

न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) परीक्षण, आगर कमजोर पड़ने और डिस्क प्रसार परीक्षण सहित, एक एंटीबायोटिक के लिए प्रतिरोध की पहचान करने के लिए मानक चिकित्सा परीक्षण के रूप में इस्तेमाल किया गया है. फिर भी, यह स्पष्ट नहीं है अगर MIC परीक्षण vivo में बैक्टीरियल एंटीबायोटिक प्रतिरोध को दर्शाता है । बैक्टीरियल फिल्म के गठन एंटीबायोटिक के जीवाणुनाशक सांद्रता की उपस्थिति में बैक्टीरिया के अस्तित्व के लिए योगदान देता है: MIC परीक्षण इस प्रभाव11का पता लगाने में असमर्थ है. क्योंकि gc12सतहों श्लैष्मिक पर फिल्म फार्म कर सकते हैं, हम परिकल्पना कि समुच्चय के भीतर एंटीबायोटिक संवेदनशीलता व्यक्तिगत GC में देखा है कि से अलग हो जाएगा । इसके अतिरिक्त, अध्ययनों से पता चला है कि तीन चरण चर सतह अणु, पिली, अस्पष्टता से जुड़े प्रोटीन (Opa), और lipooligosaccharides (लॉस), कि अंतर जीवाणु बातचीत को विनियमित, विभिंन आकार समुच्चय13के लिए सीसा, 14 , 15. एंटीबायोटिक प्रतिरोध करने के लिए इन घटकों के योगदान की जांच उचित तरीकों के अभाव के कारण नहीं की गई है ।

वर्तमान में, फिल्म उन्मूलन को मापने के लिए कई विधियाँ हैं । सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल मात्रात्मक विधि बायोमास क्रिस्टल बैंगनी दाग16का उपयोग कर में परिवर्तन को मापने के द्वारा है । हालांकि, विधि महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक हेरफेर, जो संभावित रूप से प्रयोग में त्रुटियाँ उत्पन्न कर सकते हैं17दोहराता है की आवश्यकता है । जीवित/मृत धुंधला विधि यहां इस्तेमाल किया जीने और मृत बैक्टीरिया और उनके वितरण के दृश्य के भीतर फिल्म की अनुमति देता है । हालांकि, फिल्म संरचना एक शारीरिक बाधा है कि डाई पैठ कम कर देता है के रूप में मुद्रा कर सकते हैं । इसलिए, एक समूह के भीतर जीवित/मृत जीवाणुओं का अंदाजा लगाने के लिए, दाग छोटी सी फिल्म या उसके प्रणेता-microcolonies या एकत्रीकरण तक सीमित है । आगर कमजोर पड़ने और डिस्क प्रसार परीक्षणों सहित अन्य तरीकों से एकत्रीकरण के प्रभाव को मापने में सक्षम नहीं हैं । एंटीबायोटिक एक्सपोजर के बाद एकत्रीकरण के भीतर जीसी संवेदनशीलता की जांच करने के लिए, एक आदर्श विधि दोनों एक मात्रात्मक परख कि जीवित बैक्टीरिया को मापने और उनके वितरण कल्पना कर सकते है की आवश्यकता होगी ।

यहां वर्णित प्रक्रिया को एक एटीपी-उपयोग माप और एक जीवित/मृत धुंधला परख को मात्रात्मक और नेत्रहीन एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में समुच्चय के भीतर जीसी संवेदनशीलता की जांच को जोड़ती है ।

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Protocol

1. GC उपभेदों के सामांय रखरखाव

  1. लकीर N. gonorrhoeae उपभेदों के साथ GCK आगर पर 1% केलॉग की खुराक18 (तालिका 1, टेबल 2) से फ्रीजर स्टॉक और ३७ ° c के साथ 5% सह2 के लिए 16-18 h. Use MS11 व्यक्त चरण-चर Opa (MS11Opa +), सं Opa (MS11ΔOpa), या एक कटा हुआ लॉस (MS11ΔLgtE) ।
  2. ध्यान से एक नई GCK प्लेट पर एक विदारक प्रकाश माइक्रोस्कोप और लकीर का उपयोग कॉलोनी आकृति19 पर आधारित प्रत्येक तनाव से पिली नकारात्मक (डार्क एज के बिना कॉलोनी) या सकारात्मक (डार्क एज के साथ कॉलोनी) कालोनियों उठाओ ।
  3. उपयोग करने से पहले 16-18 एच के लिए 5% सह2 के साथ ३७ ° c पर मशीन ।

2. GC एग्रीगेट की व्यवहार्यता ठहराव

  1. एक बाँझ applicator का उपयोग कर GC लीजिए. प्लेट और फिर से झाड़ू जीसी पूर्व में gc निलंबित-गर्म शोरबा (जीसीपी, तालिका 3) ४.२% NaHCO3 और 1% केलॉग समाधान18के साथ पूरक । ६५० एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर spectrophotometry का प्रयोग करें (एक आयुध डिपो६५० 1 = ~ 1 x १०९ CFU/एमएल) निलंबित बैक्टीरिया की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए ।
  2. जीसी की एकाग्रता को समायोजित करने के लिए ~ 1 x 108 CFU/एमएल ।
  3. एक ९६-अच्छी तरह से थाली के कुओं में समायोजित GC निलंबन के ९९ µ एल जोड़ें ।
  4. 5% सह2 के साथ ३७ ° c पर 6 एच के लिए थाली मशीन समग्र करने के लिए बैक्टीरिया की अनुमति दें ।
  5. सीरियल पतला ceftriaxone के 1 µ एल जोड़ें (१०००, १००, ५०, 25, १२.५, ६.२, ३.१, १.५, ०.८, ०.४, ०.२ µ g/एमएल) प्रत्येक कुआं में । कुछ कुओं के लिए नियंत्रण के रूप में सेवा अनुपचारित छोड़ दें ।
  6. 5% CO2के साथ ३७ ° c में 24 घंटे के लिए थाली मशीन ।
  7. Sonicate निलंबन 3 बार के लिए एक अच्छी तरह से 5 एस में १४४ डब्ल्यू और 20 kHz ।
  8. एक अच्छी तरह से, पिपेट ऊपर-और नीचे 3 बार के लिए, और 5% CO2के साथ ३७ ° c पर 15 मिनट के लिए मशीन में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एटीपी उपयोग चमक एजेंट के १०० µ एल जोड़ें ।
  9. ध्यान से एक अच्छी तरह से एक ९६-अच्छी तरह से काले microplate में एक नया में एक तरह से मिश्रण के १५० µ एल स्थानांतरण और बुलबुले शुरू करने से बचें ।
  10. एक अच्छी तरह से ५६० एनएम प्लेट रीडर का उपयोग कर के अवशोषण को मापने ।
  11. अनुपचारित कुओं से पढ़ने के लिए धारावाहिक ceftriaxone उपचार के बाद प्राप्त पढ़ने के अनुपात से जीवित रहने की दर की गणना ।

3. प्रतिदीप्ति के सूक्ष्म विश्लेषण जी के/

  1. एक बाँझ applicator का उपयोग कर GC लीजिए. झाड़ू प्लेट से जीसी और फिर से पूर्व में gc निलंबित-गर्म जीसीपी मीडिया प्लस 1% केलॉग की खुराक ।
  2. ६५० एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर spectrophotometry द्वारा बैक्टीरिया की संख्या का निर्धारण और GC की एकाग्रता को समायोजित करने के लिए ~ 1 x 107 CFU/
  3. में 8-अच्छी तरह से coverslip-नीचे कक्षों में GC निलंबन के १९८ µ एल जोड़ें ।
  4. 5% सह2 के साथ ३७ ° c पर 6 एच के लिए चैंबर की मशीन एकत्रीकरण गठन की अनुमति के लिए ।
  5. प्रत्येक एकत्रीकरण शर्त के भीतर प्रत्येक अच्छी तरह से ceftriaxone (१०० µ जी/एमएल या विभिन्न कमजोर पड़ने) के 2 µ एल जोड़ें । 5% CO2के साथ ३७ ° c पर वांछित समय के लिए मशीन ।
  6. एक अच्छी तरह से और 5% CO2के साथ ३७ ° c में 20 मिनट के लिए गर्मी में जीवित/मृत धुंधला समाधान मिश्रण के ०.६ µ एल जोड़ें ।
  7. प्राप्त Z-श्रृंखला एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों (एक समकक्ष माइक्रोस्कोप इस्तेमाल किया जा सकता है) ।
  8. GC समुच्चय के आकार की माप के लिए ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण और प्रत्येक समग्र में जीने के लिए मृत धुंधला के प्रतिदीप्ति तीव्रता अनुपात (एफआईआर).

4. छवि विश्लेषण

  1. बैक्टीरियल समुच्चय के आकार का आकलन ।
    1. ImageJ खोलें और एक raw छवि फ़ाइल को ImageJ मेनू पट्टी पर खींच कर कोई छवि खोलें ।
    2. ImageJ मेनू पट्टी में मुक्तहस्त रेखाएं क्लिक करें और प्रत्येक एकत्रीकरण के क्षेत्र को छवि में घूमेगा ।
    3. विश्लेषण क्लिक करें | ImageJ मेनू पट्टी में उपाय ।
    4. क्षेत्र स्तंभ के अंतर्गत किसी नई विंडो में संख्या प्राप्त करें ।
  2. ठहराव के लिए जीते-समुच्चय का अनुपात मृत
    1. ImageJ खोलें और एक raw छवि फ़ाइल को ImageJ मेनू पट्टी पर खींच कर कोई छवि खोलें ।
    2. विश्लेषण क्लिक करें | ImageJ मेनू पट्टी में माप सेट करें ।
    3. पॉप-अप विंडो में एकीकृत घनत्व की जांच करें और ठीकक्लिक ।
    4. क्लिक करें छवि । रंग | मेनू पट्टी में चैनल उपकरण और रंगका चयन करें ।
    5. लाइव बैक्टीरिया धुंधला के लिए प्रतिदीप्ति के रूप में चैनल 1 की जाँच करें ।
    6. ImageJ मेनू पट्टी में मुक्तहस्त रेखाएं क्लिक करें और प्रत्येक एकत्रीकरण के क्षेत्र को घेरे ।
    7. विश्लेषण क्लिक करें | ImageJ मेनू पट्टी में उपाय ।
    8. IntDen स्तंभ के अंतर्गत संख्या प्राप्त करें ।
    9. मृत जीवाणु धुंधला के लिए प्रतिदीप्ति के रूप में चैनल 2 की जाँच करें । दोहराएँ चरण 4.2.6-4.2.8.
    10. चरण 4.2.9 से संख्या द्वारा चरण 4.2.8 से संख्या विभाजित करके जीवित करने के लिए मृत अनुपात प्राप्त करें ।
  3. सांख्यिकीय विश्लेषण
    1. GraphPad चश्मे खोलें और इच्छित स्तंभ के लिए ImageJ से प्राप्त संख्या दर्ज करें ।
    2. विश्लेषण पर क्लिक करें और स्तंभ विश्लेषणके अंतर्गत t परीक्षण चुनें.
    3. तुलना के लिए इच्छित स्तंभ जाँचें और ठीकपर क्लिक करें.
    4. विश्लेषण विंडो के अंतर्गत P-मान प्राप्त करें ।
    5. चरण 4.3.3 से XY विश्लेषण के अंतर्गत रेखीय प्रतीपगमन का चयन करें
    6. R-वर्ग और P-मान विश्लेषण विंडो के अंतर्गत प्राप्त करें ।

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Representative Results

दो तरीके कार्यरत थे: एक एटीपी उपयोगिता परख और एक जीवित/ परिणाम या तो संयुक्त या व्यक्तिगत रूप से एंटीबायोटिक उपचार के बाद समुच्चय के भीतर बैक्टीरियल अस्तित्व की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एटीपी उपयोगिता परख के लिए एस aureus 20,21में सही व्यवहार्य बैक्टीरिया को मापने दिखाया गया है । यहां, MS11Opa + पीआईएल + तनाव एंटीबायोटिक संवेदनशीलता में जीसी एकत्रीकरण की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । गैर-एकत्रित MS11Opa + पीआईएल +, एकत्रित MS11Opa + पीआईएल +, या एकत्रित और फिर sonication MS11Opa द्वारा बाधित + पीआईएल + ceftriaxone के सीरियल कमजोर पड़ने और एटीपी स्तर मापा (चित्रा 1) के साथ इलाज किया गया । के साथ और एंटीबायोटिक उपचार के बिना प्रतिशत जीवित रहने की तुलना में, पूर्व एकत्रित जीसी गैर-एकत्रित या एकत्रीकरण-बाधित gc की तुलना में बराबर या ऊपर ०.०१५ µ g/ceftriaxone (MIC से आगर कमजोर पड़ने परीक्षण ( के साथ काफी अधिक अस्तित्व था तालिका 4)) । MS11Opa + पीआईएल-, MS11ΔOpa या MS11ΔLgtE, जो एक ही आगर कमजोर पड़ने MIC (तालिका 4) है, लेकिन छोटे समुच्चय फार्म, जांच की और MS11Opa + पीआईएल + (चित्रा 1बी) की तुलना में किया गया था । MS11Opa + पीआईएल +, बड़ा समुच्चय बनाने, उत्परिवर्ती उपभेदों की तुलना में ceftriaxone उपचार के साथ उच्च एटीपी स्तर था ।

जीवित/मृत धुंधला कई में इस्तेमाल किया गया है फिल्म/एकत्रीकरण संबंधित अध्ययन22,23। एकत्रीकरण के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए, पूर्व-एकत्रित MS11Opa + पीआईएल + को ceftriaxone और imaged के साथ या उसके बिना व्यवहार किया गया था । यह दोनों दृश्य (जो quantified जा सकता है) और एंटीबायोटिक उपचार के बाद रहते है और मृत GC के वितरण (चित्रा 2एक-दो पैनलों छोड़ दिया) की अनुमति देता है । मृत जीवाणु (लाल) मोटे तौर पर बाहरी परतों पर स्थित रहते थे जीसी (ग्रीन) मुख्य रूप से ceftriaxone के कोर में स्थित थे समुच्चय का इलाज किया । इस प्रक्रिया के साथ प्रदर्शन किया गया था MS11Opa + पीआईएल-, MS11ΔOpa या MS11ΔLgtE, एकत्रीकरण आकार और जीवित रहने की दर की जांच करने के लिए (चित्रा 2). MS11Opa + पीआईएल + सबसे बड़ी और MS11Opa + पीआईएल-सबसे छोटी समुच्चय (चित्रा 2ए, बी) के रूप में दिखाया गया था । MS11Opa + पीआईएल + समुच्चय MS11ΔOpaPil के छोटे ढीले समुच्चय में GC जबकि कोर परत में अभी भी जीवित थे +, MS11Opa + पीआईएल-, और MS11ΔLgtEPil + मर चुके थे (चित्रा 2ए, सी) । आकार और अस्तित्व के आधार पर, एक सहसंबंध ग्राफ एकत्रीकरण आकार और एंटीबायोटिक अस्तित्व (चित्रा 2डी) के रिश्ते की जांच करने के लिए साजिश रची जा सकती है ।

Table 1
1 तालिका: GCK आगर प्लेट के 1 एल के लिए नुस्खा ।

Table 2
तालिका 2:100x है केलॉग पूरक के 1 एल के लिए नुस्खा ।

Table 3
तालिका 3: जीसीपी बैक्टीरियल विकास मीडिया के 1 एल के लिए नुस्खा ।

Table 4
तालिका 4: GC उपभेदों ceftriaxone के साथ इलाज के ंयूनतम निरोधात्मक एकाग्रता । MS11Opa + पीआईएल +, MS11ΔOpa, MS11ΔLgtE, और MS11Opa + पीआईएल-बड़े थे और जीसीपी में निलंबित कर दिया । आगर कमजोर पड़ने परीक्षण तो ०.००१६-०.२५ µ g/एमएल से ceftriaxone के धारावाहिक एकाग्रता के साथ प्रदर्शन किया था ।

Figure 1
चित्रा 1 : ceftriaxone उपचार के तहत एटीपी उपयोगिता परख द्वारा एकत्रित जीसी के जीवित रहने की दर के प्रतिनिधि डेटा । () पूर्व-एकत्रीकरण, 6 एच के लिए पूर्व-एकत्रीकरण, या 6 एच के लिए पूर्व-एकत्रीकरण के बाद बाधित के बिना MS11Opa + पीआईएल + निलंबन की जीवित दर की तुलना () 6 एच के लिए जीवित रहने की दर की तुलना MS11Opa + पीआईएल + MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + के साथ पीआईएल-, या MS11ΔLgtEPil + । दिखाया औसत मूल्यों (± एसडी) तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त कर रहे हैं । p < ०.००१; * *p < ०.०१; *p < ०.०५. यह आंकड़ा पहले 24 प्रकाशित किया गया था और अनुमति के साथ उपयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : ceftriaxone उपचार के अंतर्गत समुच्चय के भीतर जीवित/मृत जीवाणु वितरण के प्रतिनिधि डेटा । () पूर्व एग्रीगेट MS11Opa + पीआईएल +, MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + पीआईएल-, या MS11ΔLgtEPil + या तो उपस्थिति या 1 µ जी के अभाव में मशीन था/एमएल ceftriaxone 2 एच के लिए समुच्चय तो व्यवहार्य (हरे) और मृत (लाल) जीसी कल्पना दाग थे और साथ visualized फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप । स्केल बार: ५० µm. images इसके बाद () समुच्चय आकार के लिए विश्लेषण किया गया और () जीने का अनुपात-मृत GC और () एक सहसंबंध ग्राफ तो बनाया गया था । दिखाया औसत मूल्यों (एसडी) तीन स्वतंत्र प्रयोगों की > ४० छवियों से प्राप्त कर रहे हैं. p < ०.००१; * *p < ०.०१; *p < ०.०५. यह आंकड़ा पहले 24प्रकाशित किया गया था और अनुमति के साथ उपयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

बैक्टीरिया मानव शरीर के संक्रमण के दौरान एक फिल्म फार्म कर सकते हैं । पारंपरिक MIC परीक्षण एकाग्रता के लिए एक फिल्म में बैक्टीरिया उंमूलन की जरूरत को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं । एक फिल्म पर रोगाणुरोधी प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, के रूप में अच्छी तरह से बायोमास के रूप में फिल्म CFUs चढ़ाना पर आधारित तरीकों गलत हो सकता है के कारण फिल्म संरचना के प्रभाव । उदाहरण के लिए, चढ़ाना विधि केवल काम करता है अगर इस फिल्म को बाधित किया जा सकता है । इसलिए, प्राप्त CFU व्यवहार्य बैक्टीरिया की वास्तविक संख्या से कम हो सकता है । इस फिल्म के भीतर मृत और जीवित बैक्टीरिया visualizing, लेकिन, संरचना और फिल्म के घनत्व पर निर्भर करता है, इस फिल्म के भीतर जीवाणुओं के अस्तित्व को मापने के लिए स्थापित किया गया है, धुंधला करने के लिए एक में फिल्म और परिणाम में घुसना विफल हो सकता है गलत और आंका जीवित रहने की दर ।

यहां विधि समुच्चय के उपचार के बाद बैक्टीरियल अस्तित्व को मापने के लिए दोनों एक मात्रात्मक और एक दृश्य परख का उपयोग करता है । इस विधि का लाभ यह है कि यह एक वातावरण है कि क्या एक असली संक्रमण में देखा है के करीब है में जीवाणु अस्तित्व के उपाय । गैर-एकत्रित और एकत्रित बैक्टीरिया के बीच जीवित रहने की दर में अंतर हमें अगर इन विट्रो mic में vivo mic के साथ संबद्ध निर्धारित करने की अनुमति देगा.

एटीपी उपयोग परख, जो एटीपी उत्पादन उपायों, मात्रात्मक समुच्चय के अस्तित्व को मापने कर सकते हैं । परख अधिक संवेदनशील है और एंटीबायोटिक एकाग्रता में छोटे मतभेदों के बीच अस्तित्व को अलग कर सकते हैं, अंय समान परख की तुलना में । हालांकि, इस परख के उच्च संवेदनशीलता के कारण, बैक्टीरियल कोशिका lysis के आश्वासन महत्वपूर्ण है । इसलिए, एक sonication चरण उपयोग किया गया था । इसके अलावा, इस विधि एटीपी कि मेजबान कोशिकाओं का उत्पादन है कि बैक्टीरियल एटीपी स्तर मुखौटा कर सकते हैं की बड़ी राशि के कारण vivo में बैक्टीरियल अस्तित्व को मापने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । इसके अलावा, बैक्टीरिया के साथ मेजबान कोशिकाओं की बातचीत बैक्टीरियल एटीपी उत्पादन को प्रभावित कर सकता है । pigments के साथ बैक्टीरिया पर इस परख का उपयोग कर के रूप में pigments पढ़ने के साथ हस्तक्षेप कर सकते है सीमित हो सकता है ।

जीवित/मृत दाग व्यापक रूप से फिल्म अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, दाग रंग की पैठ केवल सबसे बाहरी बैक्टीरिया दाग सकता है, जबकि कोर दाग नहीं हो सकता है । इसलिए, यह केवल दृश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन नहीं ठहराव, डाई के असमान वितरण के कारण. हम इस धुंधला के लिए छोटे समुच्चय का इस्तेमाल किया और इस परख का प्रदर्शन किया समुच्चय के भीतर समग्र जीवाणु अस्तित्व यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण अलग बैक्टीरिया के लिए डाई की एकाग्रता का समायोजन करने के लिए आवश्यक हैं ।

MIC प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में, एटीपी उपयोग परख और जीवित/मृत दाग मात्रात्मक और नेत्रहीन gonorrhoeae के रूप में अच्छी तरह के रूप में अन्य जीवाणु एकत्रीकरण25,26के लिए एक प्रभावी विधि के रूप में सेवा कर सकते हैं । संयुक्त प्रोटोकॉल के आवेदन बैक्टीरिया के आधार पर दवा स्क्रीनिंग में अपने बहुमुखी उपयोग के साथ रोग के गठन की एक बेहतर समझ प्रदान कर सकता है । इस विधि और अधिक सही रूप में एक एंटीबायोटिक की vivo MIC में प्रतिबिंबित हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से D.C.S. और एंडरसन AI123340 के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । एल-C.W., J.W., एसी, और E.N. भाग में समर्थन किया गया/"प्रथम वर्ष के नवाचार & अनुसंधान अनुभव" मैरीलैंड विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित कार्यक्रम में भाग लेते हैं । funders अध्ययन डिजाइन में कोई भूमिका नहीं थी, डेटा संग्रह, और विश्लेषण, प्रकाशित करने के लिए निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी । हम सभी सूक्ष्म प्रयोगों के लिए UMD CBMG इमेजिंग कोर स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x Kellogg's supplement
Agar United States Biological A0930
BacTiter Assay  Promega G8232
Ceftriaxone TCI C2226
Difco GC medium base  BD 228950
Ferric nitrate, nonahydrate  Sigma-Aldrich 254223-10G
Glucose Thermo Fisher Scientific BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder Fisher Scientific BP379-100
BacLight live/dead staining Invitrogen L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP329-1
Proteose Peptone  BD Biosciences 211693
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-10
Soluble Starch Sigma-Aldrich S9765
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754-5G
Equipment
Petri Dishes VWR 25384-302
8-well coverslip-bottom chamber  Thermo Fisher Scientific 155411
96-well tissue culture plates  Corning, Falcon 3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) Nuaire 32776
CO2 Incubator Fisher Scientific  Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber Leica SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate  Corning 3904
Glomax Illuminator  Promega E6521
Pipette tips (0.1-10 µL) Thermo Fisher Scientific 02-717-133
Pipette tips (1000 µL) VWR 83007-382
Pipette tips (200 µL) VWR 53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV Pharmacia Biotech 80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes VWR 21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) Sorenson BioScience 16070
Sterile polyester-tipped applicators Fisher Scientific 23-400-122
Sonicator Kontes Equivelent to 9110001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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