Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kvantitativ undersökning av antibiotikakänsligheten hos Neisseria gonorrhoeae aggregat använder ATP-utnyttjande kommersiella analyser och Live/Dead färgning
Chapters
Summary February 8th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
En enkel mätning av ATP-analysen och live/dead färgning metod användes för att kvantifiera och visualisera Neisseria gonorrhoeae överlevnad efter behandling med ceftriaxon. Detta protokoll kan utvidgas till att undersöka de antimikrobiella effekterna av alla antibiotika och kan användas för att definiera den minsta hämmande koncentrationen av antibiotika i bakteriell biofilm.
Transcript
Denna teknik gör det möjligt för oss att mäta antibiotika känslighet under mer kliniskt relevanta förhållanden. Tekniken gör det också möjligt för oss att bestämma den sanna antibiotikakoncentrationen som kan döda bakterier i ballast. Denna teknik kan tillämpas för att bestämma den koncentration som behövs för att eliminera GC aggregat.
Metoden kan också tillämpas för att mäta antimikrobiell mottaglighet för alla bakterier som kan bilda aggregat. Var noggrann uppmärksamhet på lysis stegen för att säkerställa att lysen är klar. Annars ATP mätanalys kommer att underskatta antalet livskraftiga bakterier.
Visualisering av denna metod kommer att tillåta andra forskare att följa och replikera detta experiment med konsekvens. Börja med strimmor Neisseria gonorré, eller GC stammar, på GCK agar kompletteras med 1%Kellogg för en 16 till 18-timmars inkubation vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. Nästa morgon, använd ett ljusmikroskop för att noggrant välja pili-negativa kolonier utan mörka kanter eller pili-positiva kolonier med mörka kanter från varje platta, och strimma de plockade kolonierna på nya GCK-plattor för en 16 till 18-timmarskultur vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid.
Nästa morgon, använd en steril applikator för att samla GC kolonier från varje platta och resuspend varje kompress i varm buljong kompletteras med 4,2%natriumbikarbonat och 1%Kellogg lösning. Mät den optiska densiteten vid 650 nanometer, eller OD650, för att bestämma koncentrationen av de upphängda bakterierna och justera GC-koncentrationen till ungefär en gång 10 till de åtta kolonibildande enheterna per milliliter. Därefter lägger du till 99 mikroliter av GC-suspensionen i enskilda brunnar av en 96-brunnsplatta och låter bakterierna samlas vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid i sex timmar.
I slutet av inkubationen, tillsätt en mikroliter av seriellt utspädd ceftriaxon till varje brunn lämnar några brunnar obehandlade att fungera som kontroller och returnera plattan till inkubatorn i ytterligare 24 timmar. Nästa dag, sonicate suspensionen i varje brunn tre gånger på 144 watt och 20 kilohertz i fem sekunder per ultraljudsbehandling och lägga till 100 mikroliter av kommersiellt tillgängliga ATP utnyttjande glöd reagens till varje brunn. Överför försiktigt 150 mikroliter av blandning från varje brunn in i enskilda brunnar av en ny 96-väl svart mikroplatta och mäta absorbansen för varje brunn vid 560 nanometer på en tallriksläsare.
Beräkna sedan överlevnadsgraden genom förhållandet mellan det avläsning som erhålls efter seriell antibiotikabehandling och avläsningen från de obehandlade brunnarna. För visualisering av levande / döda GC aggregat, använd en steril applikator för att samla in GC från natten odlade plattor och resuspend GC i förkrigade GCP medium kompletteras med 1%Kellogg. Mät OD650 genom spektrofotometri och justera koncentrationen till ungefär en gånger 10 till de sju kolonibildande enheterna per milliliter.
Därefter lägger du till 198 mikroliter av GC-suspension i åtta-brunns-coverslip-bottenkammare och inkubera kamrarna i 37 grader Celsius och 5%koldioxid i sex timmar. Vid slutet av inkubationen, behandla bakterierna med två mikroliter av ceftriaxon per aggregering skick och återföra kamrarna till inkubatorn för lämplig experimentell inkubationstid. I slutet av inkubationen, tillsätt 0,6 mikroliter av levande / död färgningslösning i varje brunn och returnera kamrarna till inkubatorn i ytterligare 20 minuter.
Använd sedan ett konfokalmikroskop för att få bilder i Z-serien. För mätning av storleken på GC-aggregaten öppnar du den första bilden i ImageJ och väljer frihandslinjer för att ringa in området för varje aggregering i bilden. Klicka på analysera och mäta.
Storleken på aggregaten kommer att anges under areakolumnen. För kvantifiering av fluorescens intensitet förhållandet mellan levande till döda färgning i varje aggregat, klicka på analysera och ställa in mätningar och kontrollera den integrerade densiteten i popup fönstret. Klicka på OK och klicka på bild, färg och kanaler verktyg.
Välj färg och kanal en som fluorescens för döda bakterier färgning. Välj frihandslinjer för att ringa in området för varje aggregering och klicka på Analysera och mät för att erhålla fluorescensintensitetsförhållandet för varje aggregat i kolumnen integrerad densitet. Välj kanal två för fluorescensen för den levande bakteriefärgningen och mät fluorescensintensiteten i varje aggregat som just visats.
Dela sedan upp livefluorescensintensitetsdata efter de döda fluorescensintensitetsdatan för att få live till död fluorescensintensitetsförhållande. I detta representativa experiment behandlades icke aggregerade pili positiva, aggregerade pili positiva eller aggregerade och störda pili positiva bakterier med serieutspädningar av ceftriaxon före mätning av deras ATP-nivåer. Preaggregerad GC påvisade en signifikant högre överlevnad än icke-aggregerade eller aggregeringsstörtande GC vid behandling med lika stora koncentrationer av ceftriaxon eller högre.
Pili-positiva stammar som bildar större aggregat uppvisade de högsta ATP nivåerna efter ceftriaxone behandling jämfört med de muterade stammarna. Oavsett stam testas, levande/döda färgning innan antibiotikabehandling visade döda bakterier till stor del ligger vid de yttre skikten av kulturen, medan levande GC identifierades främst inom kärnan i ceftriaxone-behandlade aggregat. Som väntat bildade pili-positiva bakterier de största aggregaten, medan pili-negativa kulturer utgjorde den minsta.
Särskilt var pili-positiva aggregat fortfarande vid liv i sina kärnlager efter antibiotikabehandling, medan GC i de små, lösa mutantaggregaten var döda. Baserat på storleken och överlevnaden av GC, en korrelation graf kan ritas för att undersöka förhållandet mellan aggregering storlek och antibiotika överlevnad av bakterierna. Ultraljudsbehandling är viktigt för att se till att ATP från varje enskild bakterie frigörs inom de tätt bundna aggregat.
Annars kommer mätningarna inte att vara konsekventa. Det är viktigt att platta bakterierna efter att de aggregerar och behandlas med antibiotika för att mäta både livskraftiga och de replikeringsdugliga bakterierna. Tekniken mäter bakterier aggregering inflytande på antibiotika känslighet tillåter forskare att utveckla bättre läkemedel för behandling av sjukdomar.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
