Examen cuantitativo de susceptibilidad antibiótica de Neisseria gonorrhoeae utilización del ATP utilizando agregados comerciales ensayos y manchas de vivos/muertos

Immunology and Infection

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Summary

Un simple análisis de la medición de ATP y live/dead tinción fueron utilizados para cuantificar y visualizar Neisseria gonorrhoeae supervivencia después del tratamiento con ceftriaxona. Este protocolo puede ser extendido para examinar los efectos antimicrobianos de cualquier antibiótico y puede usarse para definir la concentración inhibitoria mínima de antibióticos en biopelículas bacterianas.

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Wang, L. C., Wagner, J., Capino, A., Nesbit, E., Song, W., Stein, D. C. Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining. J. Vis. Exp. (144), e58978, doi:10.3791/58978 (2019).

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Abstract

La aparición de resistencia a antibióticos Neisseria gonorrhoeae (GC) es una amenaza para la salud en todo el mundo y destaca la necesidad de identificar a las personas que no tratamiento. Esta bacteria gram negativa causa gonorrea exclusivamente en los seres humanos. Durante la infección, son capaces de formar agregados o biofilms. La prueba de la concentración mínima inhibitoria (CMI) se utiliza para determinar la susceptibilidad a los antibióticos y para definir el tratamiento adecuado. Sin embargo, se desconoce el mecanismo de la erradicación en vivo y su relación con resultados de laboratorio. Se desarrolló un método que examina cómo la agregación GC afecta la sensibilidad a los antibióticos y muestra la relación entre el tamaño total y sensibilidad a los antibióticos. Cuando agregado de GC, son más resistentes a los antibióticos matanza, con las bacterias en el centro de sobrevivir ceftriaxona tratamiento mejor que los de la periferia. Los datos indican que la agregación de N. gonorrhoeae puede reducir su susceptibilidad a la ceftriaxona, que no se ve reflejado mediante los métodos de micro basados en placa de agar estándar. El método utilizado en este estudio permitirá a los investigadores probar susceptibilidad bacteriana bajo condiciones clínicamente relevantes.

Introduction

La gonorrea es que una común de transmisión sexual de infecciones (ITS)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), una bacteria gram negativa de la diplococcal, es el agente causal de esta enfermedad. Los síntomas de la infección genital pueden resultar en dolor durante la micción, generalizado dolor genital y secreción uretral. La infección suele ser asintomática2,3,4,5, y esto permite la colonización extendida. Estas infecciones no tratadas son un problema de salud importante, ya que tienen el potencial para facilitar la transmisión del organismo y esto puede llevar a complicaciones como enfermedad pélvica inflamatoria (EPI) y diseminada infección gonocócica (DGI)6. Gonorrea resistente a los antibióticos es una crisis de salud pública importante y un aumento de la carga socioeconómica7. Reducida susceptibilidad a las cefalosporinas ha producido cambio de régimen de tratamiento de un antibiótico único a la terapia dual, que combina la azitromicina o doxiciclina con ceftriaxona8. El mayor fracaso de ceftriaxona y azitromicina9,10, en combinación con infecciones asintomáticas, destaca la necesidad de entender los fracasos de tratamiento de la gonorrea.

La prueba de la concentración mínima inhibitoria (CMI), incluyendo agar dilución y disco pruebas de difusión, se ha utilizado como la prueba médica estándar para la identificación de resistencia a un antibiótico. Sin embargo, no está claro si la prueba MIC refleja resistencia antibiótica bacteriana in vivo. La formación de biofilms bacterianos contribuye a la supervivencia de las bacterias en presencia de concentraciones bactericidas de antibiótico: la prueba de MIC es incapaz de detectar este efecto11. Porque la GC puede formar biofilms en superficies de la mucosa12, presumimos que antibiótico susceptibilidad dentro de agregados sería distinta al visto en GC individual. Además, los estudios han demostrado que las moléculas de superficie variable, Pili, opacidad asociada a proteina (Opa) de tres fases, y lipooligosaccharides (LOS), que regulan las interacciones entre bacterias, conducen a diferentes agregados tamaño13, 14 , 15. la contribución de estos componentes para resistencia a los antibióticos no ha sido examinada por la falta de métodos adecuados.

Actualmente, existen varios métodos para medir la eliminación del biofilm. El método cuantitativo más utilizado es mediante la medición de los cambios en la biomasa usando cristal violeta16la coloración. Sin embargo, el método requiere manipulación experimental importante, que potencialmente puede generar errores en el experimento se repite17. El método de coloración en vivo/muerto aquí permite la visualización de bacterias vivas y muertas y su distribución dentro de la biopelícula. Sin embargo, la estructura del biofilm puede plantear como una barrera física que reduce la penetración del tinte. Por lo tanto, para cuantificar las bacterias muertas o vivir dentro de un grupo, la tinción se limita a pequeñas biofilms o su precursor microcolonias o agregaciones. Otros métodos, incluyendo los agar dilución y disco pruebas de difusión, no son capaces de medir los efectos de la agregación. Para examinar la susceptibilidad de la GC dentro de la agregación después de la exposición a antibióticos, un método ideal necesitan tener tanto un ensayo que puede medir viven bacterias y visualizar su distribución.

El procedimiento descrito aquí combina una medida de la utilización del ATP y un vivo/muerto tinción análisis cuantitativo a y examinar visualmente la susceptibilidad de la GC dentro de agregados en presencia de antibióticos.

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Protocol

1. general mantenimiento de cepas de GC

  1. Raya de cepas de N. gonorrhoeae en el agar de GCK con 1% Kellogg suplementos18 (tabla 1, tabla 2) de las existencias de congelador e incubar a 37 ° C con 5% CO2 para 16-18 h. uso MS11 expresando fase variable Opa (MS11Opa +), no hay Opa (MS11ΔOpa), o a LOS truncada (MS11ΔLgtE).
  2. Cuidadosamente escoge pili negativo (Colonia sin borde oscuro) o positivo (Colonia con borde oscuro) colonias de cada cepa basada en morfología de Colonia19 mediante una disección microscopio y raya en una nueva placa de GCK.
  3. Incubar a 37 ° C con 5% CO2 para 16-18 h antes de su uso.

2. cuantificación de viabilidad de agregaciones de GC

  1. Recoger el GC mediante un aplicador estéril. Hisopo de GC de la placa y volver a suspender GC en caldo precalentado (GCP, tabla 3) había complementada con 4.2% de NaHCO3 y 1% Kellogg soluciones18. Uso de espectrofotometría a una longitud de onda de 650 nm (un OD650 de 1 = ~ 1 x 109 ufc/mL) para determinar la concentración de bacterias suspendidas.
  2. Ajustar la concentración de GC ~ 1 x 108 UFC/mL.
  3. Añadir 99 μl de la suspensión ajustada de GC en los pocillos de una placa de 96 pocillos.
  4. Incube la placa durante 6 h a 37 ° C con 5% CO2 para permitir que las bacterias a agregado.
  5. Añadir 1 μl de serie ceftriaxona diluida (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0.4, 0.2 μg/mL) en cada pocillo. Dejar algunos pozos sin tratamiento como controles.
  6. Incubar la placa de 24 h a 37 ° C con 5% CO2.
  7. Someter a ultrasonidos la suspensión 3 veces en cada pozo de 5 s en 144 W y 20 kHz.
  8. Añada 100 μl de reactivo de resplandor de utilización de ATP disponible en el mercado en cada pozo, pipeta para arriba-abajo 3 veces e Incubar 15 min a 37 ° C con 5% CO2.
  9. Cuidadosamente transfiera 150 μL de mezcla de cada pozo en un nuevo pozo en una microplaca de 96 pozos negro y evitar la introducción de burbujas.
  10. Medir la absorbancia de cada pocillo a 560 nm con el lector.
  11. Calcular la tasa de supervivencia por la relación de la lectura obtenida después del tratamiento de ceftriaxona serial a la lectura de los pozos sin tratar.

3. análisis microscópico fluorescencia de vivos/muertos de agregados de GC

  1. Recoger el GC mediante un aplicador estéril. GC de la torunda de la placa y GC vuelva a suspender en precalentado media BPC más 1% suplementos Kellogg.
  2. Determinar el número de bacterias por espectrofotometría a una longitud de onda de 650 nm y ajustar la concentración de GC ~ 1 x 107 UFC/mL.
  3. Añadir 198 μl de suspensión de la GC en cámaras de 8-bien fondo cubreobjetos.
  4. Incubar la cámara durante 6 h a 37 ° C con 5% CO2 para permitir la formación de agregación.
  5. Añadir 2 μl de ceftriaxone (100 μg/mL o varias diluciones) en cada pocillo dentro de cada estado de agregación. Incubar durante el tiempo deseado a 37 ° C con 5% CO2.
  6. Añadir 0,6 μl de live/dead coloración mezcla de solución en cada pocillo e incubar durante 20 min a 37 ° C con 5% CO2.
  7. Adquisición de imágenes de la serie Z utilizando un microscopio confocal (un microscopio equivalente puede ser utilizado).
  8. Analizar las imágenes utilizando el software ImageJ para medición del tamaño de agregados de la GC y la relación de intensidad de fluorescencia (FIR) de vivo a muerto la coloración en cada agregado.

4. Análisis de la imagen

  1. Estimación del tamaño de agregados bacterianos.
    1. Abra ImageJ y abra una imagen arrastrando un archivo de imagen raw a la barra de menú de ImageJ.
    2. Haga clic en Las líneas a mano alzada en la barra de menú de ImageJ y el área de cada agregación en la imagen del círculo.
    3. Haga clic en analizar | Medida en la barra de menú de ImageJ.
    4. Obtener el número en una nueva ventana en la columna de la zona .
  2. Cuantificación del porcentaje de vivo a muerto de agregaciones
    1. Abra ImageJ y abra una imagen arrastrando un archivo de imagen raw a la barra de menú de ImageJ.
    2. Haga clic en analizar | Establecer las medidas en la barra de menú de ImageJ.
    3. Comprobar la densidad integrada en la ventana emergente y haga clic en Aceptar.
    4. Haga clic en imagen | Color | Herramienta de los canales en la barra de menú y seleccionar el Color.
    5. Ver canal 1 como la fluorescencia de la tinción de bacterias vivas.
    6. Haga clic en Las líneas a mano alzada en la barra de menú de ImageJ y el área de cada agregación del círculo.
    7. Haga clic en analizar | Medida en la barra de menú de ImageJ.
    8. Obtener el número en la columna de IntDen .
    9. Ver canal 2 como la fluorescencia para la tinción de bacterias muertas. Repita los pasos 4.2.6-4.2.8.
    10. Obtener la relación de vivo a muerto dividiendo el número de paso 4.2.8 número de paso 4.2.9.
  3. Análisis estadístico
    1. Abra GraphPad Prism y escriba los números obtenidos de ImageJ a la columna deseada.
    2. Haga clic en analizar y seleccionar pruebas t bajo análisis de la columna.
    3. Verifique la columna deseada para la comparación y haga clic en Aceptar.
    4. Obtener el valor de P en la ventana de análisis .
    5. Seleccione la Regresión lineal bajo análisis XY en el paso 4.3.3
    6. Obtener el R-cuadrado y el Valor de P debajo de la ventana de análisis.

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Representative Results

Dos métodos fueron empleados: un análisis de utilización de ATP y una prueba de tinción vivo/muerto. Los resultados pueden combinar o utilizar individualmente para estudiaron la supervivencia bacteriana en agregados después del tratamiento antibiótico. Ha demostrado el análisis de utilización de ATP para medir exactamente viables bacterias en biofilms de S. aureus 20,21. Aquí, MS11Opa + Pil + cepa fue utilizado para examinar el papel de la agregación de GC en la susceptibilidad antibiótica. Agregado no MS11Opa + Pil +, MS11Opa + Pil agregado +, o agregan y luego interrumpido por sonicación MS11Opa + Pil + fueron tratados con diluciones seriadas de ceftriaxone y el ATP nivel medido (figura 1A). Al comparar la supervivencia porcentual con y sin tratamiento antibiótico, GC previamente agregado tuvieron supervivencia significativamente mayor que GC no agregada o interrumpe la agregación con igual o por encima de 0.015 μg/mL de ceftriaxona (MIC de prueba de dilución de agar ( Tabla 4)). MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa o MS11ΔLgtE, que tienen la misma dilución agar MIC (tabla 4), pero formar agregados más pequeños, fue examinado y Comparado con el MS11Opa + Pil + (figura 1B). MS11Opa + Pil +, forman agregados más grandes, tenían el nivel más alto de la ATP con tratamiento de ceftriaxona que las cepas mutantes.

Vivo/muerto de tinción se ha utilizado en varios estudios relacionados con el biofilm y agregación,22,23. Para determinar el efecto de agregación, los agregados MS11Opa + Pil + trataron con o sin ceftriaxona y reflejada. Esto permite la visualización (que puede ser cuantificada) y la distribución de GC vivo y muerto después del tratamiento antibiótico (figura 2A- dos paneles a la izquierda). Bacterias muertas (rojo) eran en gran parte se encuentra en las capas externas mientras que en GC (verde) se encontraban principalmente en la base de agregados de ceftriaxona tratado. Este procedimiento se realizó con MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa o MS11ΔLgtE, para examinar el tipo de tamaño y supervivencia de agregación (figura 2A). MS11Opa + Pil + mostró el más grande y MS11Opa + Pil-los agregados más pequeños (figura 2A, B). MS11Opa + Pil + agregados estaban todavía vivos en la capa de la base mientras que GC en el pequeños agregados sueltos de MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, MS11ΔLgtEPil + estaba muerta (figura 2A, C). Basado en el tamaño y la supervivencia, se puede trazar un gráfico de correlación para examinar la relación de agregación tamaño y supervivencia antibiótica (figura 2D).

Table 1
Tabla 1: Receta para 1 L de la placa de Agar GCK.

Table 2
Tabla 2: Receta para 1 L de 100 x suplemento de Kellogg.

Table 3
Tabla 3: Receta para 1 L de medios del crecimiento bacteriano de GCP.

Table 4
Tabla 4: concentración inhibitoria mínima de las cepas de GC tratados con ceftriaxona. MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpa, MS11ΔLgtE y MS11Opa + Pil - fueron cultivados y suspendido en GCP. Prueba de dilución de agar entonces fue realizado con la serie concentración de ceftriaxona de 0.0016 - 0.25 μg/mL.

Figure 1
Figura 1 : Datos representativos de la tasa de supervivencia de GC agregado bajo tratamiento de ceftriaxona por análisis de la utilización del ATP. Comparación de MS11Opa + Pil + suspensión la tasa de supervivencia (A) sin la adición, la agregación durante 6 h o interrumpir después de la adición para la comparación de tasa de supervivencia de 6 h. (B) de 6 h agregado MS11Opa + Pil + MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil- o MS11ΔLgtEPil +. Se muestran los valores promedio (±SD) obtienen de tres experimentos independientes. p < 0.001; p < 0.01; p < 0.05. Esta cifra fue publicada con anterioridad 24 y es usada con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Datos representativos de la distribución de las bacterias muertas o vivir dentro de agregados bajo tratamiento ceftriaxona. (A) agregados pre-MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, o MS11ΔLgtEPil + era ya sea incubado en presencia o ausencia de 1 μg/mL ceftriaxona para h. 2 agregados fueron manchadas para visualizar viable (verde) y GC muertos (rojo) y visualizados con microscopio de fluorescencia confocal. Barra de escala: 50 μm. imágenes luego fueron analizadas para el tamaño de la agregación (B) y (C) relación entre GC y (D) un gráfico de correlación muerto vivo fue creado entonces. Se muestran los valores promedio (SD) obtienen de > 40 imágenes de tres experimentos independientes. p < 0.001; p < 0.01; p < 0.05. Esta cifra fue publicada con anterioridad 24y es usada con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Las bacterias pueden formar biofilms durante la infección del ser humano. Prueba de MIC tradicionales puede no reflejar la concentración necesaria para erradicar las bacterias de la biopelícula. Para probar efectos antimicrobianos en un biofilm, métodos basados en la biomasa de biofilm como unidades formadoras de colonias de la galjanoplastia pueden ser erróneos debido al impacto de la estructura del biofilm. Por ejemplo, el método de placas sólo funciona si el biofilm puede ser interrumpido. Por lo tanto, la UFC obtenida puede ser menor que el número de bacterias viables. Visualizing bacterias muertas y vivir dentro de la biopelícula se han establecido para la medición de la supervivencia de las bacterias en el biofilm, sin embargo, dependiendo de la estructura y densidad de biofilm, la coloración puede no penetrar en el biofilm y producir una tasa de supervivencia inexacta y subestimado.

El método utiliza cuantitativo y un análisis de la visualización para medir supervivencia bacteriana después del tratamiento de áridos. La ventaja de este método es que mide la supervivencia bacteriana en un ambiente que está más cerca de lo que se ve en una infección real. Las diferencias de tasa de supervivencia entre las bacterias no agregadas y agregadas nos permitirá determinar si la CMI in vitro se correlaciona con el micrófono en vivo.

El análisis de la utilización de ATP, que mide la producción de ATP, puede medir cuantitativamente la supervivencia de los agregados. El ensayo es más sensible y puede distinguir entre pequeñas diferencias en la concentración de antibiótico, en comparación con otros ensayos similares de la supervivencia. Sin embargo, debido a la alta sensibilidad de este ensayo, aseguramiento de la lisis celular bacteriana es fundamental. Por lo tanto, se utilizó un paso de sonicación. Además, este método no puede utilizarse para medir supervivencia bacteriana in vivo debido a la gran cantidad de ATP que producen las células del huésped que puede enmascarar el nivel de ATP bacteriano. Por otra parte, la interacción de las células del huésped con las bacterias puede afectar la producción bacteriana de ATP. Usando este análisis sobre las bacterias con pigmentos se puede limitar como los pigmentos pueden interferir con la lectura.

La mancha en vivo/muerto ha sido ampliamente utilizada en estudios de biofilm. Sin embargo, la penetración de los colorantes de tinción puede manchar sólo las bacterias más externas, mientras que el núcleo no puede ser manchado. Por lo tanto, sólo se puede utilizar para la visualización pero no cuantificación, debido a la desigual distribución del colorante. Utiliza pequeños agregados para esta tinción y demostró que este ensayo puede utilizarse para cuantificar la supervivencia bacteriana en general dentro de los agregados. Además, controles positivos y negativos son necesarios para ajustar la concentración del tinte para diferentes bacterias.

En combinación con el protocolo MIC, la mancha de ensayo y vivo/muerto de utilización de ATP puede servir como un método eficaz cuantitativamente y visualmente analizar N.gonorrhoeae , así como otras agregaciones bacteriana25,26. La aplicación del protocolo combinado podría proporcionar una mejor comprensión de la formación de la enfermedad junto con sus usos versátiles en la detección de drogas basado en biofilms de las bacterias. Este método puede reflejar con mayor precisión la en vivo MIC de un antibiótico.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional de salud para D.C.S. y W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., y E.N. fueron apoyadas en parte o participar en el programa "La experiencia y de investigación primer año innovación" financiado por la Universidad de Maryland. Los fundadores no tenían ningún papel en el estudio de diseño, recopilación de datos y análisis, decisión de publicar o preparación del manuscrito. Reconocemos el UMD CBMG Imaging Core para todos los experimentos de microscopía.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x Kellogg's supplement
Agar United States Biological A0930
BacTiter Assay  Promega G8232
Ceftriaxone TCI C2226
Difco GC medium base  BD 228950
Ferric nitrate, nonahydrate  Sigma-Aldrich 254223-10G
Glucose Thermo Fisher Scientific BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder Fisher Scientific BP379-100
BacLight live/dead staining Invitrogen L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP329-1
Proteose Peptone  BD Biosciences 211693
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-10
Soluble Starch Sigma-Aldrich S9765
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754-5G
Equipment
Petri Dishes VWR 25384-302
8-well coverslip-bottom chamber  Thermo Fisher Scientific 155411
96-well tissue culture plates  Corning, Falcon 3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) Nuaire 32776
CO2 Incubator Fisher Scientific  Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber Leica SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate  Corning 3904
Glomax Illuminator  Promega E6521
Pipette tips (0.1-10 µL) Thermo Fisher Scientific 02-717-133
Pipette tips (1000 µL) VWR 83007-382
Pipette tips (200 µL) VWR 53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV Pharmacia Biotech 80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes VWR 21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) Sorenson BioScience 16070
Sterile polyester-tipped applicators Fisher Scientific 23-400-122
Sonicator Kontes Equivelent to 9110001

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References

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