Producción de partículas Pseudotyped estudiar coronavirus altamente patógena en un ambiente de nivel 2 de bioseguridad

Immunology and Infection
 

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para generar partículas pseudotyped en un entorno de BSL-2 incorporación de la proteína de la espiga del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo y síndrome respiratorio de la Oriente de virus altamente patógenos. Estas partículas pseudotyped contienen un gen reportero de luciferasa que permite la cuantificación de la entrada del virus en las células blanco del huésped.

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Millet, J. K., Tang, T., Nathan, L., Jaimes, J. A., Hsu, H. L., Daniel, S., Whittaker, G. R. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. J. Vis. Exp. (145), e59010, doi:10.3791/59010 (2019).

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Abstract

El protocolo tiene como objetivo generar la proteína de la fusión de coronavirus (CoV) punto (S) de células pseudotyped partículas con una leucemia murina virus (MLV) núcleo y luciferase reporter, mediante un procedimiento simple de la transfección de la ampliamente disponible HEK-293T. Una vez formado y liberado de las células del productor, estas pseudovirions incorporan un gen reportero de luciferasa. Puesto que sólo contienen el coronavirus heterólogo spike proteína en su superficie, las partículas se comportan igual que sus contrapartes nativas coronavirus para pasos de entrada. Como tal, son los sustitutos excelentes de los viriones nativos para el estudio de entrada viral en las células del huésped. Entrada exitosa e infección en las células diana, el reportero de luciferasa es integrado en el genoma de la célula huésped y se expresa. Usando un análisis simple de la luciferasa, células transduced pueden ser fácilmente cuantificadas. Una ventaja importante del procedimiento es que puede realizarse en bioseguridad nivel 2 (BSL-2) instalaciones en lugar de BSL-3 instalaciones requeridas para el trabajo con coronavirus altamente patógenos como el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente (MERS-CoV) y coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV). Otro de los beneficios proviene de su versatilidad como se puede aplicar a las proteínas de envoltura pertenecientes a las tres clases de proteínas de fusión viral, como la clase influenza hemaglutinina (HA) y glicoproteína de virus de Ebola (GP), el virus del bosque Semliki II clase E1 proteína, o la glicoproteína de clase III estomatitis vesicular virus G. Una limitación de la metodología es que pueden recapitular sólo pasos de la entrada de virus mediadas por la proteína investigada. Para el estudio de otros pasos del ciclo de vida viral, se requieren otros métodos. Ejemplos de las muchas aplicaciones de en que estas partículas de pseudotype pueden ser utilizadas investigación de la susceptibilidad de la célula huésped y tropismo y probando los efectos de los inhibidores de la entrada de virus a diseccionar las vías de entrada viral utilizadas.

Introduction

Entrada de la célula anfitrión constituye los primeros pasos del ciclo vital viral infeccioso. Para virus envueltos, se trata de atar a un receptor de la célula de host único o varios receptores, seguidos por la fusión de las membranas virales y celulares. Estas funciones esenciales se llevan a cabo por envoltura viral glicoproteínas1,2. La glicoproteína de envoltura de coronavirus se llama la proteína de la espiga (S) y es miembro de la clase me víricas fusión proteínas2,3,4,5,6. Estudio de glicoproteínas de la envoltura vírica es fundamental para entender muchas de las características importantes de un determinado virus, tales como: iniciación del ciclo de vida, su acogida y tropismo celular, transmisión interespecies, patogenesia viral, así como host de entrada la célula vías. Partículas virales pseudotyped, también llamadas pseudovirions, son poderosas herramientas que nos permiten estudiar fácilmente la función de proteínas de fusión viral. Partículas pseudotyped o pseudovirions son viriones quiméricos que consisten en un núcleo viral sustituta con una proteína de la envuelta viral heterólogo en su superficie. Propósito principal del protocolo es mostrar cómo obtener coronavirus spike pseudotyped partículas que se basan en un núcleo de leucemia murina (MLV) de virus y contienen un gen reportero de luciferasa. Como ejemplos, se presentan el método para producir partículas pseudotyped con las proteínas de la espiga de la altamente patógeno síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y el coronavirus del síndrome respiratorio (MERS) de Oriente. El protocolo describe el procedimiento de transfección involucrado, cómo objetivo susceptible de infectar las células y la cuantificación de la infectividad por ensayo de luciferasa.

Puesto que los pasos de la entrada de las pseudovirions se rigen por el coronavirus S en su superficie, entran en las células de manera similar a sus contrapartes nativas. Como tal, son excelentes sustitutos de ensayos de infectividad funcional. Pseudotyped partículas habitualmente derivan de virus modelo parental como retrovirus (MLV7,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 y el lentivirus virus de la inmunodeficiencia humano, VIH23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) o rhabdoviruses (virus de la estomatitis vesicular, VSV36,39,40,41,42,43,44 , 45 , 46 , 47). cuando se usa en pseudotyping, genomas de los virus parentales se modifican para eliminar genes esenciales, hacerlas defectuosas para llevar a cabo un ciclo de replicación completa. Esta característica les permite ser utilizado en instalaciones de nivel intermedio de bioseguridad (BSL-2) y es una importante ventaja sobre usar virus hiperpatógenos nativas que requieren más instalaciones de bioseguridad (BSL-3 y BSL-4, que no son tan fácilmente disponible) cuando llevando a cabo estudios de entrada de virus. Aquí, las proteínas S de riesgo grupo 3 patógenos SARS-CoV y MERS-CoV se utilizan como ejemplos de proteínas de la envuelta viral incorporadas a MLV pseudotyped partículas, generando pseudovirions SARS-CoV y MERS-CoV (SARS- y MERS-Spp, respectivamente). Estos pseudovirions se han utilizado con éxito en estudios centrados en eventos de entrada de estos virus48,49,50,51. Otra ventaja es que la técnica aquí descrita no se limita a pseudotyping coronavirus S proteínas: es muy flexible y se puede utilizar para incorporar a representantes de las tres clases de proteínas de fusión viral. Algunos ejemplos son la hemaglutinina de la gripe (HA, clase I)52, glicoproteína del virus de Ebola (GP clase I), la proteína E1 de los alphavirus virus de Semliki Forest (SFV, clase II) y glicoproteína VSV (G, clase III)53. Además, más de un tipo de glicoproteína viral puede ser co incorporado en una partícula pseudotyped, como en el caso de la gripe HA y NA partículas pseudotyped51.

Basado en el trabajo realizado por Bartosch et al20, este protocolo describe la generación de MLV pseudotyped partículas con una estrategia de transfección Co tres plásmidos utilizando el HEK-293T ampliamente disponible y altamente competente en la transfección de células 54. el primer plásmido codifica la MLV base genes gag y pol pero carece el gene MLV envoltura env . El segundo plásmido es un vector de transferencia que codifica un gen de reportero de luciferasa de luciérnaga, una señal de embalaje Ψ-RNA de MLV, junto con 5'- y 3'-que flanquean regiones de repetición terminal larga (LTR) MLV. El tercer plásmido codifica la proteína de fusión del interés, en este caso tampoco la proteína SARS-CoV o MERS-CoV. En la transfección de la tres plásmidos utilizando un reactivo de transfección, viral RNA y proteínas Haz expresadas dentro de las células transfected permitiendo la generación de partículas pseudotyped. Desde MLV se utiliza como columna vertebral pseudovirion, esto ocurre en la membrana plasmática: el ARN que contiene la señal de empaque y reportero de luciferasa gene Haz encapsulado en partículas nacientes que también incorporan coronavirus expresó membrana plasmática pico proteínas. Las partículas que bud hacia fuera de las células contienen la proteína coronavirus S en su superficie y se cosechan para su uso en ensayos de infectividad. Porque partículas pseudotyped puerto la proteína S del coronavirus y no el MLV proteína, cuando se utiliza para infectar las células, se comportan igual que sus contrapartes nativas coronavirus para pasos de entrada. Entonces se libera el ARN viral que contiene el reportero de luciferasa y flanqueando litros dentro de la célula y las actividades de polimerasa retrovirus permiten la reversa de la transcripción en el ADN y su integración en el genoma de la célula huésped. Cuantificación de la infectividad de las partículas pseudotyped virales en células infectadas se lleva a cabo con un análisis de la actividad de luciferasa simple. Porque la secuencia de ADN que es integrada en el genoma de la célula huésped contiene sólo el gen de la luciferasa y en ninguno de los genes codifican proteínas MLV o coronavirus, son inherentemente más seguras que virus nativos réplica-competente.

Además de ser sustitutos más seguros y altamente adaptables para permitir la incorporación de diversos tipos de glicoproteínas de la envoltura, las partículas pseudotyped aquí descritas también son muy versátiles y pueden utilizarse para estudiar muchos aspectos de la entrada de virus. Esto incluye pero no se limita a: pruebas de susceptibilidad de célula anfitrión a la infección por virus, analizar las vías de entrada celular utiliza un virus, estudiando los efectos de los inhibidores farmacológicos y exámenes de drogas, realización de anticuerpos de neutralización ensayos, caracterización de entrada celular de host de virus envueltos que no pueden ser cultivados y la generación de vectores virales para la entrega del gene, estables de expresión celular de los genes de interés, o el silenciamiento de genes.

Protocol

1. célula de siembra para la producción de partículas Pseudotyped

Nota: Realizar este paso en el gabinete de seguridad de la biotecnología.

  1. Por técnicas de cultivo de célula estándar, obtener un frasco de2 75 cm confluentes de 80-90% de células HEK-293T/17 pasados en Dulbecco completa del medio de Eagle modificado (DMEM-C) que contenga 10% (vol/vol) de suero bovino fetal (FBS), 10 mM 4-(2-hidroxietil) -1- -1-ácido ácido (HEPES), penicilina 100 UI/mL y 100 μg/mL estreptomicina. Preparar medio DMEM-T transfecciones (su composición es la misma que el DMEM-C pero sin antibióticos).
  2. Lavar las células con 10 mL de Dulbecco precalentado (37 ° C) fosfato tampón salino (DPBS) dos veces.
    Nota: Manejar las células HEK293T/17 con cuidado como suelte fácilmente.
  3. Aspirar el sobrenadante y separar las células con 1 mL de solución de tripsina 0,25% previamente calentado a 37 ° C. Coloque el frasco de las células a 37 ° C, 5% CO2 incubadora 3−5 min o hasta que las células comienzan a separar.
    Nota: No incubar las células con tripsina para más de 5 min como esto normalmente lleva a la aglutinación celular.
  4. Desactivar tripsina añadiendo 4 mL de DMEM-C medio y conteo de las células usando una célula contando diapositiva y microscopio de luz.
    Nota: Para evitar tener que contar demasiadas células, un paso de dilución adicional puede requerirse previamente. No olvide el factor en esta dilución en el cálculo de la densidad real de la célula de células tripsinizaron.
  5. Diluir las células 5 x 105 células/mL con DMEM-C.
  6. Placa de cultivo de tejidos de pozo de 6 con 2 mL de solución de células por pocillo de la semilla y suavemente mueva el plato hacia delante y hacia atrás y de lado a lado para distribuir las células, evitando el movimiento circular.
    Nota: Este es un paso clave. Las células uniformemente distribuidas se asegurarán de que las células no grupo en el centro de los pozos. A su vez, Esto garantizará eficiencia de transfección buena y partícula pseudotyped producción.
  7. Incubar la placa durante la noche (16 – 18 h) a 37 ° C, 5% CO2 célula cultura la incubadora.

2. tres-plásmido transfección Co

Nota: Realizar este paso en el gabinete de seguridad de la biotecnología.

  1. Observar las células bajo un microscopio de luz invertido para verificar la densidad y la morfología de la célula.
    Nota: Idealmente, densidad celular debe estar en el rango de 40 a 60% confluency. Es esencial que las células no son ni demasiado confluente (80−90% confluente) ni demasiado escaso distribuidos (20−30% confluente) en cada pocillo. Una densidad celular de 40−60% confluencia asegurará la producción de partículas pseudotyped buena.
  2. Mezcla de plásmidos
    1. Calcular la mezcla de plásmido para cada glicoproteína de envoltura las cantidades para un pozo de una placa de 6 pozos que se muestra en la tabla 1. Multiplicar cantidades si transfectar varios pozos e incluyen un pozo extra para evitar problemas de mezcla.
      Nota: Junto con el SARS-CoV S y MERS-CoV S codificación plásmidos, incluyen control de vectores vacíos para la generación de partículas del control negativo que carecen de glicoproteínas de la envuelta viral (partículas de Δenv) junto con una glicoproteína control positivo como vesicular estomatitis virus (VSV) G la glicoproteína que se sabe para infectar enérgicamente una gama muy amplia de células (VSV-Gpp). Los plásmidos son disponibles bajo petición.
    2. Mezclar volúmenes calculados de plásmidos y suero reducido medio de cultivo celular (véase Tabla de materiales) en un tubo de microcentrífuga.
  3. Reactivo de transfección basada en lípidos de la mezcla (véase Tabla de materiales)
    1. Calcular los volúmenes para la combinación de reactivo de transfección de las cantidades que se muestra en la tabla 2 para un pozo (1:3 relación de transfección, multiplicar cantidades según sea necesario). Incluyen pozos adicionales para evitar el funcionamiento de la combinación de reactivo de transfección.
    2. Mezcla calcula volúmenes de reactivo de transfección basada en lípidos (3 μl por pocillo) y suero reducido medio de cultivo celular (47 μl por pozo) en un tubo de microcentrífuga, asegúrese de agregar el reactivo de transfección en el medio de cultivo celular suero reducido y no al revés alrededor.
  4. Incubar ambas mezclas (de un pozo: 50 μl de plásmidos de la mezcla y 50 μl de reactivo de transfección basada en lípidos de la mezcla) por separado por 5 min a temperatura ambiente.
  5. Agregar el contenido de la combinación de reactivo de transfección para la mezcla de plásmidos en una proporción 1:1 (para el bien de la 1: 50 μl de cada mezcla)
  6. Realizar cuidadosa pipeteo arriba-abajo de la mezcla resultante.
  7. Incubar la mezcla por al menos 20 min a temperatura ambiente.
  8. Aspire el medio gastado de las células.
  9. Agregar cuidadosamente 1 mL de medio de cultivo de celular reducido suero precalentado (37 ° C) por pozo.
  10. Añadir gota a gota 100 μl de mezcla de transfección a cada pocillo.
    Nota: Tenga cuidado al agregar la mezcla de transfección a pozos de HEK-293T que separan fácilmente.
  11. Incube las células a 37 ° C, incubadora de cultura de célula 5% CO2 para 4-6 h.
  12. Añada 1 mL por pocillo de medio DMEM-T de precalentado (37 ° C), que no contienen antibióticos
    Nota: Este es un paso clave. Reactivos de transfección aumentan la permeabilidad de la célula y aumentan la sensibilidad a los antibióticos. Para asegurar eficacia de transfección buena y partícula pseudotyped producción, es importante evitar el uso de medio de cultivo celular con antibióticos
  13. Incube las células a 37 ° C, incubadora de cultura 5% CO2 célula durante 48 h.

3. colección de las partículas pseudotyped

Nota: Realizar este paso en el gabinete de seguridad de la biotecnología.

  1. Observar las células bajo el microscopio de luz invertido para verificar la morfología de la célula y el estado general. También Compruebe el color del medio que debe ser luz rosa, ligeramente anaranjado.
    Nota: Este es un paso importante. Si hay demasiada muerte celular asociados a la transfección o el color medio dado vuelta anaranjado/amarillo (pH ácido), por lo general será asociada con un menor rendimiento en partículas infecciosas pseudotyped
  2. Transferencia de sobrenadantes de células transfected a tubos de centrífuga cónico de 50 mL.
  3. Centrifugar los tubos a 290 x g por 7 min eliminar restos celulares.
  4. Filtrar el sobrenadante clarificado a través de un filtro estéril 0.45 μm tamaño de poro.
  5. Hacer alícuotas de pequeño volumen (por ejemplo., 500 μl ó 1 mL) de solución de virus pseudotyped en crioviales.
  6. Tienda a-80 ° C.
    Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí. Pseudotyped partículas son estables a-80 ° C durante muchos meses pero una vez descongelado, evitar volver a congelarlas como perder infectividad.

4. pseudotyped partícula infección de células susceptibles

Nota: Realizar este paso en el gabinete de seguridad de la biotecnología.

  1. Siembra de células susceptibles en placa de 24 pozos de la célula
    1. Obtener por estándar de la célula cultura técnicas 80−90% confluente 75 cm2 frasco de células susceptibles: células Vero-E6 por SARS-CoV pseudotyped partículas (SARS-Spp) y Huh-7 células para MERS-CoV S pseudotyped partículas (MERS-Spp).
      Nota: Para confirmar si las partículas pseudotyped que se han producido son infecciosas, es importante elegir cuidadosamente una línea de células susceptibles apropiados para los ensayos de infectividad pseudovirion. Utilizando células permisivas mal dará lugar a la baja infectividad.
    2. Lavar las células dos veces con 10 mL de precalentado (37 ° C) DPBS.
    3. Aspirar el sobrenadante y separar las células con 1 mL de solución de tripsina 0,25% previamente calentado a 37 ° C. Coloque el frasco de las células a 37 ° C, 5% CO2 incubadora 3−5 min o hasta que las células comienzan a separar.
      Nota: No incubar las células con tripsina para más de 5 minutos como esto normalmente lleva a la aglutinación celular. Huh-7 células son especialmente sensibles a este efecto.
    4. Desactivar la tripsina al agregar DMEM-C medio y conteo de las células usando una célula contando diapositiva y microscopio de luz.
    5. Diluir las células 5 x 105 células/mL con DMEM-C.
    6. Pozos de la semilla de un pozo de 24 con 0,5 mL de solución de células por pocillo de la placa y suavemente mueven el plato hacia delante y hacia atrás y de lado a lado para distribuir las células, evitando el movimiento circular
      Nota: Este es un paso clave. Las células uniformemente distribuidas se asegurarán de que las células no grupo en el centro de los pozos. A su vez, esto asegurará ensayos de infectividad buena. Para cada partícula pseudotyped (SARS-Spp, MERS-Spp) y la condición, se preparan tres pozos para tres réplicas experimentales. Incluyen pozos para las no infectadas (N.I.), vector vacío Δenv partículas y partículas, control positivo como VSV-Gpp
    7. Incubar la placa durante la noche (16−18 h) a 37 ° C, 5% CO2 célula cultura la incubadora
  2. Infección por partículas pseudotyped
    1. Observar las células bajo el microscopio y confirme visualmente que hay una alfombra confluente de células.
    2. Traer crioviales de virus pseudotyped para descongelar el hielo.
    3. Células de lavado tres veces con 0,5 mL previamente calentado (37 ° C) DPBS
      Nota: Este es un paso clave. Células que no son enjuagadas correctamente antes de la infección por lo general conducen a lecturas de infectividad pobre
    4. Aspirar el sobrenadante de las células.
    5. Inocular las células con 200 μL de solución de partícula pseudotyped descongeladas.
    6. Incube las células a 37 ° C, incubadora 5% CO2 célula cultura h 1−2.
    7. Añadir 300 μL de precalentado (37 ° C) medio DMEM-C.
    8. Incubar a 37 ° C, incubadora 5% CO2 célula cultura 72 h las células.

5. infectividad cuantificación por lectura del ensayo de luciferasa

Nota: Realice los pasos iniciales en el gabinete de seguridad de la biotecnología.

  1. Sustrato de luciferin de deshielo (almacenados a-80 ° C) y 5 x luciferase ensayo tampón de lisis (almacenado a-20 ° C) hasta que alcance la temperatura ambiente.
  2. Diluir el tampón de lisis de ensayo de luciferasa a 1 x con agua estéril.
  3. Aspirar el sobrenadante de células infectadas con partículas pseudotyped.
  4. Añadir 100 μl de tampón de lisis de ensayo de luciferasa 1 de x a cada pocillo.
  5. Coloque la placa en un eje de balancín e incubar durante 15 min con oscilación en la temperatura ambiente (de aquí en adelante que la placa puede ser manejada fuera de un gabinete de bioseguridad).
  6. Preparar los tubos de microcentrífuga para cada bien añadiendo 20 μl de substrato de luciferin en cada tubo.
  7. Gire en el luminómetro.
  8. Realizar medición de la actividad de luciferasa uno bien en un momento al transferir 10 μl de lisado a un tubo conteniendo 20 μl de substrato de luciferin.
  9. Flick el tubo suavemente para mezclar el contenido, pero evite desplazar el líquido en las paredes del tubo.
  10. Coloque el tubo en el dispositivo y cierre la tapa.
  11. Miden el valor de luminiscencia del tubo con el luminómetro.
  12. Registrar la medida de la relativa unidad luz.
  13. Repita los pasos 5.8 – 5.12 hasta que se analizan todos los pocillos.
    Nota: Con el equipo apropiado tal como una placa lectura luminómetro, se puede realizar este proceso automáticamente. El ensayo tendrá que ampliarse al placa formato (por ejemplo,, placa de 96 pocillos).

6. Análisis de datos

  1. Cálculo y trazado de promedios y desviaciones estándar relativas luciferase unidades
    1. Utilice un gráfico trazado software para calcular medida de ensayo de luciferasa promedios y desviaciones estándar de experimental y biológico Replica.
    2. Trama de datos como gráfico de barras con desviaciones estándar.
      Nota: Al realizar análisis estadísticos de datos, asegúrese de incluir al menos tres réplicas biológicas en conjuntos de datos.

Representative Results

Resultados representativos de ensayos de infectividad de SARS-CoV S y MERS-CoV S pseudotyped partículas se muestran en la figura 1. Como era de esperar, ambas figura 1A y 1B, el VSV G pseudotyped positivo control de partículas (VSV-Gpp) dieron muy alta infectividad media 106 107 unidades de luciferase relativas (RLU) rango respectivamente. Para SARS-CoV S infección pseudotyped partículas (figura 1A) de células Vero-E6 susceptibles, a fuerte contagiosidad promedio mide alrededor de 9.8 x 104 RLU. Este valor es casi 3 órdenes de magnitud superiores a los valores medidos para el control no infectado (1.1 x 102 RLU), o las partículas de Δenv (1,5 x 102 RLU), que no abrigue ningún glicoproteínas de la envuelta viral en su superficie. Del mismo modo, para MERS-CoV S infección pseudotyped partículas (figura 1B) de Huh-7 células, una alta infectividad promedio mide alrededor de 1.0 x 106 RLU. Esta es casi 4 órdenes de magnitud superiores a los valores medidos para el control no infectado (0.8 x 102 RLU), o las partículas de Δenv (2.0 x 102 RLU). Un ensayo de infectividad adicionales fue realizado en el que el SARS- y MERS-Spp fueron en serie diluido y utilizado para infectar a las células Vero-E6 (figura 2A). Este análisis confirma que la actividad de luciferasa medida es dependiente en la concentración de las partículas usadas para infectar las células. Para confirmar el papel de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y dipeptidil peptidasa 4 (DPP4), los receptores de SARS-CoV y MERS-CoV, respectivamente, en la mediación de fijación y entrada de las partículas pseudotyped, utilizamos células HEK-293T poco permisiva y transfectadas para expresar ACE2 o DPP4 (figura 2B). Las células transfected entonces fueron utilizadas para un ensayo de infectividad. Este análisis demuestra que a sobreexpresión de ACE2 y DPP4, existe un aumento del ~ 4-log y log de ~ 2 de infectividad SARS- y MERS-Spp, respectivamente, confirmando que el uso del receptor de pseudovirions es similar a la del virus nativos.

Los ejemplos mostrados aquí demuestran la importancia de incluir negativa (no infectados, las partículas de Δenv) así como las condiciones de control positivo (VSV-Gpp) al producir partículas pseudotyped. De hecho, las partículas de control positivo VSV-Gpp nos permiten evaluar si un determinado lote de partículas pseudotyped tuvo éxito en rendimiento funcionales y contagiosas pseudovirions. Resultados esperados de la típica infección por partículas VSV-Gpp en células de mamífero más líneas están en la 106−107 RLU gama. Problemas con las células HEK-293T/17 productor (paso alto número, problemas con las densidades de célula) o eficacias de transfección deficiente pueden afectar producción general partículas pseudotyped e infectividad. Además, las condiciones de control negativo también son importantes ya que permiten evaluar las líneas de base de las mediciones de RLU en una línea celular particular (condición de no infectados) y no específica internalización de partículas (infección Δenv) que no es mediada por por una proteína de la envuelta viral. Idealmente, para un determinado tipo de partícula pseudotyped con una proteína de la envuelta viral de interés, se recomienda para obtener valores que sean unos pocos órdenes de magnitud superiores a los valores del control negativo, como se muestra a continuación en la figura 1A, B. Sin embargo, si para un tipo celular dado una infección del virus pseudotyped da muy poca contagiosidad (es decir,, cercano a controles negativos tales como en la figura 2B en condiciones de N.T. no transfectadas) no necesariamente significa que el pseudotyped producción de partículas era defectuoso. Bien podría ser que la línea de celular particular utilizada no es ni mal permisivo a la infección. Se recomienda para comprobar si un tipo celular determinado se espera que sea susceptible a la infección por el virus de la investigada. Transfectar células poco permisivas con plasmid(s) expresando en que la receptor(s) viral puede permitir más eficiente entrada viral y la infección que se produzca, como se muestra en la figura 2B, donde a transfección de receptores ACE2 y DPP4 destino HEK-293T células, hay un 4 ~- y ~ 2-log incremento en infectividad, respectivamente.

Reactivo de plásmido Cantidad
MLVgagpol pCMV MLV gag y pol codificación plásmido 300 ng
vector de transferencia pTG-Luc con reportero de luciferasa 400 ng
vectores pcDNA-SARS-S, pcDNA-MERS-S o vacío 300 ng
Medio de cultivo celular suero reducido A 50 μl

Tabla 1: cantidades de plásmidos y reducido suero celular medio de cultivo necesario para transfectar un pocillo de una placa de 6 pozos de células HEK-293T/17 para la producción de partículas pseudotyped. De la concentración de las preparaciones de plásmidos, calcular el volumen requerido para alcanzar la cantidad necesaria de ADN plásmido. Si bien más de uno está transfected con la misma plásmidos, multiplicar los volúmenes por número de pozos para transfectar e incluyen un pozo adicional en los cálculos para evitar problemas de mezcla en los pasos posteriores. La cantidad total de ADN ser transfectada es 1 μg/pocillo. Los plásmidos son disponibles bajo petición a los autores.

Reactivo de Cantidad
Reactivo de transfección 3 ΜL
Medio de cultivo celular suero reducido 47 ΜL

Tabla 2: cantidades de suero reducido y reactivo de transfección celular medio de cultivo necesario para transfectar un pocillo de una placa de 6 pozos de células HEK-293T/17 para la producción de partículas pseudotyped. Multiplicar el volumen por el número de pozos para transfectar y pozos adicionales se incluyen en los cálculos para evitar problemas de mezcla en los pasos posteriores. El reactivo de transfección: proporción de DNA de plásmido utilizada es 3:1.

Figure 1
Figura 1 : Coronavirus S-pseudotyped ensayos de infectividad de partículas en las células del huésped susceptible con un leucemia murina (MLV) columna vertebral y luciferasa reportero gene virus. (A) ensayo de infectividad de partícula pseudotyped S SARS-CoV en células Vero-E6. (B) ensayo de infectividad de partícula pseudotyped MERS-CoV S en Huh-7 células. Para ambos (A) y (B), datos trazados corresponden a las unidades de luciferase relativa promedio de tres experimentos independientes, con barras de error correspondientes a la desviación estándar (d.e.). Datos graficados en escala de10 log en eje y. N.I.: control no infectado; Δenv: infección con partículas pseudotyped falta VSV-Gpp y glicoproteínas de la envuelta viral: infección con partículas pseudotyped teniendo control positivo VSV G Glicoproteína de envoltura. Otra abreviatura usada, SARS-Spp: infección por SARS-CoV S pseudotyped partículas, MERS-Spp: infección con MERS-CoV S partículas pseudotyped. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Dependencia de la concentración de CoV S-pseudovirion infectividad y papel de los receptores ACE2 y DPP4 en entrada del SARS- y MERS-Spp. (A) dependencia de concentración de infectividad SARS- y MERS-Spp, medido por análisis de actividad de luciferasa. Pseudovirions en serie diluidos y utilizados para infectar a las células Vero-E6. Infectividad de (B) análisis de SARS- y MERS-Spp en mal permisivos dianocitos HEK-293T transfectado a ACE2 expreso y receptores de DPP4, respectivamente. Datos se graficó en escala log10 de eje y como en la figura 1 de los experimentos duplicados, con barras de error correspondientes a la desviación estándar (d.e.). N.T.: las células control no transfectadas HEK-293T; ACE2: angiotensina enzima 2 (receptor de SARS-CoV) y DPP4: dipeptidil peptidasa 4 (receptor de MERS-CoV). Otras abreviaturas utilizadas son las mismas como en la figura 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este protocolo describe un método para producir eficientemente las partículas pseudotyped teniendo la proteína S de riesgo grupo 3 coronavirus, SARS-CoV y MERS-CoV, en un entorno de BSL-2. Estas partículas, que incorporan un gen reportero de luciferasa, nos permiten cuantificar fácilmente coronavirus eventos de entrada S-mediada por un relativamente simple luciferase ensayo48,49,50,51. En los ensayos de infectividad con células permisivas, se confirma que la actividad de luciferasa medida depende de la concentración de partículas. Además, ACE2 y DPP4 transfección del receptor permite la entrada más eficiente en las líneas de células poco permisivo, como las células HEK-293T. El método es altamente adaptable a otras glicoproteínas de la envoltura vírica y se ha utilizado extensivamente48,49,50,51,52,53, 55,56,57,58,59, a menudo para complementar otros ensayos como análisis bioquímicos o infecciones por virus nativo.

El protocolo que se describe aquí se basa en el retrovirus MLV que incorpora un reportero de luciferasa. Sin embargo, es importante destacar que existe una muy amplia gama de otros sistemas pseudotyping que se han desarrollado con éxito para embalaje coronavirus S12,13,25,26, 30 , 31 , 32 y otros envuelta viral glicoproteínas10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. algunos de estos otros sistemas se basan en el uso común MLV retroviral core7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,la20, o basado en el ampliamente utilizado lentivirales VIH-1 sistema Pseudotyping utilizando diferentes estrategias23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34,35, o con el virus de la estomatitis vesicular de rhabdovirus (VSV) como base, lo que permite incorporar una amplia variedad de las glicoproteínas de envoltura y otra vez con diferentes estrategias emplean37,38,39,40,41,42,43 ,44,45,46,47. Además, otros periodistas como proteínas fluorescentes como GFP11,13 y RFP36o enzimas que no sean de la luciferasa como β-galactosidasa16,17 y secretada fosfatasa alcalina (SEAP)42 han sido empleados con éxito para la medición. Además, en el análisis presentado en este protocolo, una transfección transitoria se utiliza para expresar el MLV y CoV S genes y proteínas. Sin embargo, existen otras estrategias para la expresión, como la generación de líneas celulares estables para la producción de virus pseudotyped7,14. Como cada uno de estos sistemas tiene sus ventajas y desventajas, es importante considerar los siguientes parámetros importantes al momento de decidir que sistema pseudotyping mejor adapte a las necesidades de un investigador: pseudovirion core (MLV, VIH-1, VSV u otros), cómo un núcleo particular pseudotyping selectiva es en la incorporación de una glicoproteína de la envuelta viral específico, reportero para la lectura del ensayo (GFP, luciferasa, Paes u otro) y la estrategia de transfección (número de plásmidos en la transfección, transitoria transfección o generación de líneas celulares estables).

Hay una serie de pasos críticos en el método que son importante destacar. Densidad celular, particularmente de la línea de células HEK-293T/17 productor es un factor crítico para garantizar la exitosa transfección. Una densidad de celdas en el rango de 40 a 60% de confluencia fue encontrada para ser óptimo. Mayores densidades típicamente resultan en eficiencia de transfección baja y la producción de partículas baja. También, es importante tener en cuenta que las células HEK-293T/17 son menos adherentes que otras líneas celulares. Debe tener cuidado al manipularlos para evitar separarlas innecesariamente. Una opción es para el tratamiento de superficies de plástico de cultivo celular con poly-D-lisina para mejorar la adherencia. Además, mayor paso de células a menudo resulta en tasas de transfección deficiente. Después de agregar el reactivo de transfección en células HEK-293T/17, también es importante recordar que aumenta la permeabilidad de la célula. Por esta razón en este punto es mejor evitar el uso de antibióticos que contienen medio como pueden aumentar la citotoxicidad. Antes de recoger partículas pseudotyped, compruebe el color de transfected sobrenadantes de células HEK-293T/17. Por lo general, después de 48 h de la transfección, el color del medio de cultivo celular toma un tinte naranja-color de rosa. Medio de color amarillo generalmente se traduce en rendimientos pobres partículas pseudotyped y es a menudo el resultado de problemas con siembra paso alto número o densidad de la célula.

En este protocolo, partícula pseudotyped producción se realiza en un formato de placa de 6 pozos. Para aumentar el volumen de partículas producidas, varios pozos de una placa de 6 pozos pueden ser transfectadas con la misma mezcla de plásmidos y los sobrenadantes pueden combinarse juntos. La piscina puede ser clarificado, filtrado y alícuotas. Por otra parte, a escala de producción, otros tipos de vasos (p. ej., 25, o2 frascos de 75 cm) pueden utilizarse. En este caso, las condiciones de la transfección deben ampliarse en consecuencia. En el presente Protocolo, el ensayo de infectividad se realiza utilizando un formato de placa de 24 pozos y un luminómetro que sólo permite las mediciones de un tubo a la vez. Para proyecciones de rendimiento alta, otros formatos son posibles, como el formato de la placa de 96 pocillos y un luminómetro de lector de la placa. Volúmenes y reactivos para el ensayo de luciferasa deben adaptarse en consecuencia. Almacenamiento de partículas pseudotyped en crioviales a-80 ° C mantiene su estabilidad por varios meses sin disminución notable en la infectividad. No se recomienda someter a ciclos de congelación y descongelación ya que esto reducirá su infectividad en el tiempo. Por lo tanto, es mejor almacenar en alícuotas pequeñas como 0,5 – 1 mL y descongelar antes de una infección.

El método presentado aquí tiene varias limitaciones. Importante es el hecho de que las partículas pseudotyped recapitulan eventos de entrada sólo viral. Para analizar otras medidas en el ciclo de vida infeccioso, otros ensayos son necesarios. Además, como MLV brote de partículas en la membrana plasmática, es importante tener en cuenta que la glicoproteína de envoltura está estudiando las necesidades también tráfico a la membrana plasmática para su incorporación al pseudovirions durante la producción. Como tal, es importante saber donde en la celda una glicoproteína de la envuelta viral particular se expresa en las condiciones de la transfección, como visualizando localización subcelular con un análisis de la inmunofluorescencia, o comprobando las señales de retención dentro la proteína. También, mientras que el protocolo describe pasos para producir y probar la infectividad, no detallan cómo medir la incorporación de las glicoproteínas de la envuelta viral partículas pseudotyped. Un método consiste en realizar ensayos de western blot en soluciones concentradas de partículas, como descrito anteriormente50,51 para incorporación de MERS-CoV S. En estos ensayos, la glicoproteína de envoltura de S de MERS-CoV es investigada junto con la proteína de la cápside (p30) de MLV, que nos permite normalizar la incorporación de la proteína S en partículas. Otros ejemplos de tales ensayos analizando la incorporación de la glicoproteína de envoltura vírica en pseudovirions se han realizado para la incorporación de SARS-CoV S en un HIV-1 pseudovirion lentivirales sistema32 , Ebola glicoproteína (GP) en otro MLV pseudotyped partícula sistema17y hemaglutinina de la gripe (HA) y neuraminidasa (NA) en el VSV pseudovirions38. Un desarrollo reciente en la caracterización de partículas pseudotyped producción es el uso de dispositivos innovadores como Nanosight: nos permite visualizar, cuantificar y tamaño de las partículas virales50directamente. El dispositivo proporciona información detallada sobre la producción total de la partícula; sin embargo, es importante tener en cuenta que no proporciona información sobre la incorporación de glicoproteína de envoltura. Una futura dirección para la aplicación de estas partículas pseudovirion versátil es analizar los eventos de fusión virales individuales utilizando rastreo de partículas individuales, microfluídica y reflexión interna total de fluorescencia microscopía60,61 ,62. Estos enfoques se aplicaron con éxito a virus de la influenza y partículas de coronavirus felino como gripe HA - y NA-pseudotyped VSV-base pseudovirions63. Actualmente se está desarrollando la implementación de estas técnicas aplicadas a coronavirus S pseudotyped partículas basado en MLV.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Queremos agradecer a todos los miembros de los laboratorios de Whittaker y Daniel para comentarios. Financiación de la investigación fue proporcionada por el NIH concede AI111085 R21 y R01 AI135270. T.T. reconoce apoyo de la beca presidencial de Ciencias de la vida en la Universidad de Cornell y programa nacional de ciencia Fundación postgrado investigación becas bajo la subvención no. DGE-1650441. L.N. reconoce apoyo de un Samuel C. Fleming familia beca de postgrado y programa nacional de ciencia Fundación postgrado investigación becas bajo la subvención no. DGE-1650441. Este trabajo es apoyado también por la nacional Science Foundation 1504846 (a Dakota del sur y G.R.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells  ATCC CRL-11268 Clone 17 cells are highly competent for transfection.
African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells ATCC CRL-1586
Human hepatic Huh-7 cells  Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition JCRB0403
Inverted light microscope with 10 × objective  Nikon TS100
Dulbecco’s modification of Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate Corning Mediatech 10-017-CV
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Gibco 1614071
1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES)  Corning Mediatech 25-060-Cl
100 × penicillin-streptomycin (PS) solution Corning Mediatech 30-002-Cl
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+  Corning Mediatech 21-030-CV
0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 × solution  Corning Mediatech 25-053-Cl
Cell counting slides with grids  Kova 87144
Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) Thermo Fisher Scientific, Gibco 31985-070
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific, Invitrogen 11668-027
0.45 µm pore-size sterile filter  Pall 4184
10 mL syringes  BD 309604
5 × luciferase assay lysis buffer  Promega E1531
Luciferin, substrate for luciferase assay Promega E1501
Sterile water  VWR E476-1L
GloMax 20/20 luminometer  Promega 2030-100

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