人血清抗水药物蛋白-4 免疫球蛋白 g 的细胞检测

Immunology and Infection

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Summary

细胞基检测是检测血清抗水品-4 免疫球蛋白 G 的一种广泛使用的方法。该方法可用于神经髓炎光谱疾病的临床诊断和科学研究。

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Liu, C., Zhu, M., Wang, Y. Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay. J. Vis. Exp. (146), e59014, doi:10.3791/59014 (2019).

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Abstract

抗水蒸汽蛋白-4 (AQP4) 免疫球蛋白 G (IgG) 是诊断视神经标志物的核心诊断视神经标志物的视神经功能性的视神经功能障碍。细胞基检测 (CBA) 是一种广泛使用的检测人血清抗 AQP4 IgG 的方法, 具有较高的灵敏度和特异性。简单地说, 血清抗 AQP4 IgG 是由 AQP4 转染细胞捕获的, 该细胞固定在生物芯片上, 然后由荧光标记的二级抗体检测到。荧光显微镜用于可视化荧光, 荧光强度由至少两名有经验的临床医生进行评估。可以结合抗 AQP4 IgG 检测结果、临床表现和神经放射学结果, 对 NMOSD 进行最终诊断。根据以往的研究, CBA 比其他抗 AQP4 IgG 检测方法更敏感、更具体, 可用于 NMOSD 的临床诊断和研究。该方法有局限性;例如, 目前还缺乏评估血清抗 AQP4 IgG 滴度的国际量表。本文介绍了一种利用 CBA 检测人血清抗 AQP4 IgG 的详细方案。

Introduction

血清 AQP4 IgG 是诊断视神经髓炎视神经标志物的视神经标志物 (NMOSD)1。细胞基检测 (CBA) 是一种应用广泛的抗 AQP4 IgG 检测方法, 具有较高的灵敏度和特异性。这里介绍了 CBA 的详细协议。

AQP4 是一种水通道蛋白, 有六个跨越膜的单位和两个围绕一个水孔2的螺旋域。抗 AQP4 IgG 通过与目标 AQP4 结合参与 NMOSD 的发病机制, 其主要位于星形胶质细胞3的端部。研究表明, 在约三分之二的 NMOSD 患者, 抗 Aqp4 igg 呈阳性。在最新的 NMOSD 国际诊断标准中, 抗 AQP4 IgG 被认为是一个核心诊断生物标志物5。在这方面, 建立可靠的检测人血清抗 AQP4 IgG 的方案, 促进 NMOSD 的临床诊断至关重要。

目前, 有各种抗 aqp4 igg 检测方法, 如 cba、组织基检测、酶联免疫吸附法和流式细胞术67。CBA 采用欧盟90细胞捕获抗 AQP4 igg, 这些细胞与人体 AQP4 转染。通过荧光二级抗体检测捕获的抗 AQP4 IgG, 然后通过显微镜观察。越来越多的证据表明, cba 比其他抗 aqp4 igg 检测方法敏感、更具体, 6、7.根据 meta 分析, CBA 的敏感性和特异性分别为76% 和 99%, 高于组织基和酶联免疫吸附法 6.此外, 还对抗 AQP4 IgG 的诊断检测进行了多中心比较.共有来自15个欧洲诊断中心的193个研究对象注册了7人。采用四种不同的检测血清抗 AQP4 IgG7的方法。结果表明, CBA 比其他方法更敏感和具体7。由于 AQP4 是以两个主要异形 (AQP4-M1 和 AQP4-MO音二) 表示的, 抗 AQP4 IgG 捕获单元是用 AQP4-M1 或 AQP4-MOT 转染的。然而, 哪种类型的捕获细胞更好仍有争议。一项调查支持了以 aqp4-m1 为基地的 cba8, 而另一些调查表明, 以 aqp4-"3·23" 运动为基地的 cba 更好地7910.然而, 由于 IGG 约束不具体, 基于 AQP4-"3·23" 运动的 CBA 可能会产生错误的阳性结果.Jarius 等11. 11个国家报告说, aqp4-m1 和 AQP4----"3·23" 运动 cba 的抗性 Aqp4 igg 探测率没有明显差异。

总之, 血清抗 AQP4 IgG 是 NMOSD 的核心生物标志物。与其他抗 AQP4 IgG 检测方法相比, CBA 具有更高的特异性和敏感性。目前仍有争议的是, AQP4-M1-或基于 AQP4-23 的 CBA 更好。本文介绍了一种基于 AQP4-M1 的 CBA 的详细方案, 该方案可用于 NMOSD 的临床诊断和研究。

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Protocol

这一程序得到了吉林大学第一医院伦理委员会的批准, 并在大约 1, 500个科目上进行。

1. 患者注册和血液样本采集

  1. 将血清抗 AQP4 IgG 的实验室检测应用于临床患者的主要投诉和症状, 如下所示。也要进行身体检查。

    视神经炎: 患者视力缺陷, 如视力丧失和视力下降。
    急性骨炎: 患者可能出现瘫痪、感觉缺陷和自主功能障碍。
    区域后发组综合征: 患者可能有不明原因的打嗝、恶心或呕吐的症状。
    急性脑干综合征: 脑干病变可能会导致不同的症状和体征, 这取决于病变的位置。
    症状性嗜睡症或急性二脑临床综合征与 nmosd 典型的二脑 MRI 病变。
    典型脑损伤的症状性脑综合征。

    请注意:根据 nmosd5的国际共识诊断标准, 如果患者是血清抗 aqp4 igg 阳性, 并且至少具有上述核心临床特征之一, 则可以对 NMOSD 进行诊断。然而, 我们不建议检测抗 AQP4 IgG 只在视神经炎患者。
  2. 血样采集
    注:
    患者不需要禁食。
    1. 在4毫升真空采血管中绘制2-3 毫升的静脉血液。
    2. 在室温 (RT) 下, 让血清凝结30分钟。
      请注意:长期凝血会增加血清水平, 由于从血小板泄漏。
    3. 离心以 2100 x g的速度进行 5分钟, 小心地将血清转移到新的试管中。
    4. 立即分析血清或精华素, 并储存在-20°c 或-80°c。
      请注意:在-20°c 下存储用于存储月, 而-80°c 用于存储年份。

2. 抗 AQP4 抗体检测

注意事项:患者样本和使用过的试剂试剂应被视为传染性材料。试剂盒中含有氮化钠的试剂是有毒的。图 1提供了该协议的流程图。

  1. 制备
    1. 使用前将试剂盒带至 RT。
      注: 将试剂盒存放在2-8°c。
    2. 准备至少200毫升含有0.2% 特温20的 PBS 洗涤缓冲液。将100毫升的洗涤缓冲液倒进500毫升的烧杯。
    3. 用洗涤缓冲液稀释血清样品10倍。根据经销商的指示准备正负控制。
  2. 样品孵育
    1. 在试剂托盘的反应场中加入30Μl 的预稀释样品、正控制或负控制 (图 2)。
      请注意:避免气泡。
    2. 卸下生物芯片幻灯片上的保护盖。
      请注意:不要接触生物芯片, 以避免固定细胞的分离和污染。取下机盖前, 请并排按住幻灯片。
    3. 将生物芯片滑块应用于试剂托盘 (图 2)。在 RT 开始30分钟的孵化。
      请注意:每个样品都应该是一个单独的液滴连接到相应的生物芯片, 而不与其他液滴混合。
    4. 用洗涤缓冲液轻轻冲洗一次生物芯片滑块。将生物芯片滑入装有100毫升洗涤缓冲液的500毫升烧杯中至少 5分钟. 如有可能, 将烧杯放在振动台上。
    5. 从洗涤缓冲液中取出生物芯片滑块。用纸巾小心擦拭反应场外残留的洗涤缓冲液。在露天暴露生物芯片滑块 1-2分钟, 蒸发反应场上的残留洗涤缓冲液。
      请注意:不要把反应场擦干。不要用纸巾触摸生物芯片。
  3. 二级抗体培养
    1. 根据分配器的指示准备二级抗体溶液。
    2. 在清洁试剂托盘的反应场中加入25μl 的荧光二级抗体。
    3. 将生物芯片滑块涂在装有二级抗体的试剂托盘上。在 RT 孵化30分钟。
  4. 安装
    1. 将使用过的洗涤缓冲液倒出, 并在烧杯中加入100毫升的新鲜洗涤缓冲液。按照步骤2.2.4 和2.2.5 中的说明重复清洗。
    2. 小心地将嵌入介质添加到生物芯片滑块上的反应场 (每个反应场一个滴)。用一块盖板玻璃密封生物芯片滑梯。避免气泡。
  5. 荧光检测
    1. 打开显微镜的荧光灯, 预热 15分钟. 选择488纳米滤光片。
    2. 打开照片软件。从所有反应场的转染和未转染区域拍摄不同放大倍率的照片。首先, 拍摄一张放大4倍的照片进行概述, 然后拍摄更多具有10倍和20x 放大倍率的照片。
      请注意:详细的协议如表 1所示。对结果的解释将在具有代表性的结果部分进行讨论。

3. 患者的诊断

  1. 如果患者血清抗 AQP4 igg 阳性, 并显示至少一个核心临床特征的 NMOSD (见讨论部分), 诊断患者与 NMSOD5。然而, 如果患者是抗 AQP4 igg 阴性, NMOSD 的诊断可能不被排除。

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Representative Results

使用这里描述的程序, 血清中的特异性抗 AQP4 IgG 是可检测的。在手术过程中, 在反应场中添加了预稀释样品、阳性对照和负对照, 其中包含转染和未转染的区域 (图 2)。在转染区的负对照荧光主要表明二级抗体与生物芯片上转染细胞的非特异性结合 (图 3)。同质弱荧光可见 (图 3)。在阳性对照中, 在反应场中加入了抗 AQP4 抗体。在转染区观察到强荧光, 表明转染细胞中抗 AQP4 IgG 与 AQP4-M1 的特异性结合 (图 4)。在未转染的区域, 阳性对照的荧光显示出抗 AQP4 IgG 与生物芯片固定细胞的非特异性结合的迹象 (图 4)。对于10倍稀释的样品, 抗 AQP4 igg 阴性血清显示荧光模式类似于阴性对照, 而阳性血清显示类似阳性对照的模式 (图 5)。荧光强度与抗 AQP4 IgG 滴度有关。图 5给出了不同强度荧光的例子。图 5A5b来自抗 aqp4 igg 阴性样品, 图5C-h来自抗 aqp4 igg 阳性样品。只要在转染区域出现异质和颗粒荧光, 无论荧光强度如何, 样品都被认为是抗 AQP4 igg 阳性。基于血清抗 AQP4 IgG 的 NMOSD 诊断标准将在讨论部分进一步说明。

在少数样本中, 只有少量细胞在转染区域被强烈染色, 很难确定血清是抗 AQP4 igg 阳性还是阴性 (图 6)。在这种情况下, 可以报告 "可能是肯定的"。在罕见的情况下, 样品在转染区域的荧光比在未转染区域的荧光强度均匀 (图 7)。在这种情况下, 样品应被视为抗 AQP4 igg-阴性。背景荧光的高强度可能是非特异性的。为了创建一个可靠的报告, 所有照片应盲目评估至少两名临床医生。临床医生应在评估前接受培训。在该协议中, 向他们展示了不同样本类型的代表性照片, 并了解了如何评价结果。然后, 他们与一位经验丰富的临床医生一起评估照片。最后, 受过训练的临床医生独立工作。在理想的情况下, 它应该总是相同的临床医生谁评估结果。

Figure 1
图 1: 反 Aqp4 igg 检测协议流程图.AQP4-M1 转染或未转染的欧盟90细胞固定在生物芯片上。在生物芯片中添加血清时, 固定转染细胞在血清中的抗 AQP4 IgG 被捕获。然后, 应用荧光素标记的二级抗体检测抗 aqp4 IgG。荧光可以通过各种放大倍率的显微镜进行可视化。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 样品孵育.(A) 试剂托盘的顶部视图。每个试剂托盘包含五个单独的反应场。应将正控制、样本和负控制添加到单独的反应场。(B) 生物芯片幻灯片的顶视图。每个生物芯片幻灯片包含五个反应场, 其中有两个子部分。转染的小节包含固定的 AQP4-M1 转染细胞, 而未转染的子部分包含未转染的细胞。(C) 试剂托盘和生物芯片滑块的正面视图。试剂托盘和生物芯片滑块上的反应场相互配对。添加到试剂托盘上的反应场的样品应连接到生物芯片滑块上的相应反应场。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 负控制的代表性数字.(A) 通过4倍放大显微镜获得了负控制转染区域的概况。在整个地区观察到同种异体弱荧光。(B、C)在 10倍 (b) 和 x (c) 放大照片中观察到更多细节。一般情况下, 细胞膜和血浆有轻微染色, 细胞核未染色。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4积极控制的代表性数字.(A、B)显示转染 (a) 和未转染 (b) 阳性控制区域。在未转染的区域观察到同种弱荧光, 表明抗 AQP4 IgG 与固定细胞的非特异性结合。相反, 在转染区域观察到异质强荧光, 表明抗 AQP4 IgG 与在固定细胞上表达的 AQP4-M1 有特异性结合。(C-F)在 10倍 (c, d) 或 20x (e,f) 放大倍率下观察转染 (c, e) 和未转染 (d, f)区域的更多细节。弱荧光和均匀的荧光出现在未转染的区域。然而, 在转染区域的很大比例的细胞显示出强烈的荧光。在强染色细胞的血浆中, 抗 AQP4 IgG 呈光滑颗粒荧光。细胞核未染色或轻微染色。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 抗 aqp4 抗体阴性或阳性样本的代表性数字.样品稀释了 10倍, 所显示的所有数字都是以10倍的目标拍摄的。(A、B)阴性荧光样品: 在转染的区域和 (b) 未转染的区域, 荧光均处于均匀弱。(C, D)弱荧光样本: 与未转染区域 (d) 相比, 少量细胞 (约25% 至 50%)在转染区域 (c) 显示出更强烈的荧光。(英、法)中度荧光样品: 在转染区域 (e), 在中等数量的细胞中观察到强颗粒荧光 (约 50% ~ 75%)。(G, H)强荧光样品: 未转染区域 (H) 的细胞被微弱地染色。然而, 在转染区域 (g), 在大量细胞 (约超过 75%) 中出现高强度的颗粒荧光。一般来说, 随着抗 AQP4 IgG 滴度的增加, 荧光强度和强染色细胞的百分比也相应升高。未转染区域的荧光总是均匀较弱。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 抗 AQP4 抗体 "可能呈阳性" 样本的代表性数字.(A、B)在4倍放大倍率下转染 (a) 和未转染 (b) 区域的荧光模式没有显著差异。(C-E)在 10倍 (c, d)或 20x (e, f) 放大倍率下, 转染区域 (c、e) 中的少数细胞显示出强烈的颗粒荧光。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 非典型抗 aqp4 igg 阴性样品的例子.转染 (a) 和未转染的 (b) 区域均有均匀染色。然而, 转染区的荧光比未转染区域的荧光强。请点击这里查看此图的较大版本.

放大 转染区域 未转染的区域
4倍 1张图片 1张图片
10倍 4幅图片 1张图片
20x 5幅图片 1张图片

表 1: 荧光显微镜.建议使用4倍、10倍和20x 目标对转染和未转染区域进行成像。

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Discussion

我们描述了一种广泛使用的检测人血清中抗 AQP4 IgG 的方法。抗 AQP4 IgG 与 NMOSD 密切相关, 建立可靠的抗 AQP4 IgG 检测方法对 NMOSD 的临床诊断至关重要。首先, 抗 AQP4 IgG 是 NMOSD 特有的。多发性硬化症也是一种免疫介导的中枢神经系统疾病, 与 NMOSD12有许多相似之处。然而, 抗 AQP4 IgG 在 NMOSD13中只有阳性。其次, 抗 AQP4 IgG 在 NMOSD 患者中很常见。约三分之二的 NMOSD 患者是血清抗 AQP4 igg 阳性4。第三, NMOSD 的最新诊断标准是基于血清抗 AQP4 IgG 检测5。综合来看, 血清抗 AQP4 IgG 检测可促进 NMOSD 的临床诊断。

在各种抗 aqp4 igg 检测方法中, cba 以其高灵敏度和 67 的特异性被广泛用于临床诊断。虽然 CBA 是一种快速而直接的方法, 但应该解决一些关键点。首先, 实验者在使用生物芯片时应小心, 因为 AQP4-M1 转染和未转染的细胞被固定在生物芯片上。在整个过程中, 生物芯片不应该用手接触或干涸。此外, 应轻轻处理带有生物芯片的幻灯片, 否则生物芯片上的固定细胞可能会掉落或受到污染, 这可能会导致荧光缺陷区或高荧光背景。其次, 在试剂托盘上的反应场中添加样品时, 研究人员必须确保样品的滴量不相互混合。应避免样品和生物芯片之间的气泡。

此方法有其局限性;例如, 当使用 CBA 检测抗 AQP4 IgG 时, 很难量化荧光强度和描述血清中的抗 AQP4 IgG 滴度。目前, 在我们的诊断中心, 两名临床医生在比较样品与对照组的照片后, 主观地报告了荧光的强度。在大多数情况下, 不难确定血清是抗 AQP4 igg 阳性还是阴性。然而, 在极少数情况下, 样本中的荧光似乎只比阴性对照略强, 样本被认为是 "可能的阳性"。在这种情况下, 临床医生在做出诊断时应该更加小心。另一个可能的解决方案是重复 CBA。需要一种更准确的方法来量化荧光强度, 并需要一个 "抗 AQP4 igg 阳性" 的国际定义。值得注意的是, 脑脊液中抗 aqp4 igg 的阳性率远远低于血清, 脑脊液中抗 aqp4 igg 的检测没有提供信息14,15

CBA 可用于 NMOSD 的临床诊断和科学研究。NMOSD 的临床诊断是基于临床表现, 血清抗 AQP4 IgG, 和神经放射学的结果的结合。血清抗 AQP4 igg 阳性患者至少有一个核心临床特征的 Nmosd 可以诊断为 NMOSD5;然而, 如果患者是抗 aqp4 igg 阴性, nmosd的诊断不应排除5, 临床医生应进一步评估临床表现和神经放射学发现 5,16,17.血清髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体可被检测, 以协助诊断18,19,20。值得注意的是, 虽然血清抗 aqp4 igg 滴度可能会改变与利妥昔单抗治疗 21, 它不是预测病程和反应的免疫治疗 22,23。CBA 也被广泛用于科学研究。例如, Yang 等24 描述了抗 aqp4 IGG 阳性 NMOSD 患者的临床特征。此外, Kitley 等25 分析了抗 aqp4 IGG 阳性 NMOSD 25 例患者的预后因素。这两项研究都使用 CBA 检测血清抗 AQP4 IgG。

总之, CBA 是一种广泛使用的抗 AQP4 IgG 检测方法, 可用于 NMOSD 的临床诊断和科学研究。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢国家科学基金会 (31600820)、吉林省卫生计划生育委员会 (原为 2016年 Q036号) 和吉林省科技规划项目 (编号) 的资助。20180520110JH)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-aquaporin-4 IIFT Euroimmun FA 1128-2005-50 Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium. 
CellSens Dimension OLYMPUS N/A photograph software
Gel & clot activator tube Improve medical 623040202 From a local Chinese company

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