Longitudinale morfologiche e fisiologiche monitoraggio di sferoidi tridimensionale del tumore usando la tomografia a coerenza ottica

Cancer Research

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Summary

Tomografia a coerenza ottica (OCT), una tecnologia di imaging tridimensionale, è stata utilizzata per monitorare e caratterizzare la cinetica di crescita di sferoidi multicellulari del tumore. Precisa quantificazione volumetrica di sferoidi tumore usando un voxel contando approccio e rilevamento di tessuto morto privo di etichetta in sferoidi basato sul contrasto intrinseco attenuazione ottica, sono stati dimostrati.

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Huang, Y., Zou, J., Badar, M., Liu, J., Shi, W., Wang, S., Guo, Q., Wang, X., Kessel, S., Chan, L. L., Li, P., Liu, Y., Qiu, J., Zhou, C. Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (144), e59020, doi:10.3791/59020 (2019).

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Abstract

Sferoidi di tumore sono stati sviluppati come un modello di cultura tridimensionale (3D) delle cellule nella scoperta della droga del cancro ricerca e anti-cancro. Tuttavia, attualmente, modalità di formazione immagine ad alta velocità che utilizza il rilevamento di campo o fluorescenza brillante, si riesce a risolvere la struttura nel complesso 3D della sferoide di tumore a causa della limitata penetrazione della luce, diffusione di coloranti fluorescenti e profondità-possibilità di risoluzione. Recentemente, il nostro laboratorio ha dimostrato l'uso della tomografia a coerenza ottica (OCT), un'etichetta-free e non-distruttivo modalità, per eseguire la caratterizzazione longitudinale di sferoidi multicellulari del tumore in una piastra a 96 pozzetti di imaging 3D. OCT è stato in grado di ottenere informazioni morfologiche e fisiologiche 3D di sferoidi tumore cresce fino a circa 600 µm in altezza. In questo articolo, dimostriamo un sistema di imaging OCT (HT-OCT) ad alta velocità che analizza il piatto intero multi-pozzetto e ottiene automaticamente dati 3D OCT di sferoidi del tumore. Descriviamo i dettagli degli orientamenti HT-OCT sistema e costruzione nel protocollo. Dai dati OCT 3D, si può visualizzare la struttura complessiva della sferoide con 3D rendering e sezioni ortogonali, caratterizzano la curva di crescita longitudinale della sferoide di tumore sulla base delle informazioni morfologiche di dimensione e volume e monitorare la crescita delle le regioni di morti-cellula nella sferoide di tumore basato sul contrasto di attenuazione ottica intrinseca. Mostriamo che HT-OCT utilizzabile come una modalità di imaging ad alta produttività per la droga di screening come pure che caratterizzano i campioni biofabricated.

Introduction

Il cancro è la seconda causa di morte nel mondo1. Lo sviluppo di farmaci targeting per cancro è di cruciale importanza per i pazienti. Tuttavia, si stima che oltre il 90% di nuovi farmaci anti-cancro non riuscire in fase di sviluppo a causa di una mancanza di efficacia e tossicità inattesa in studi clinici2. Parte della ragione può essere attribuita all'uso di modelli della coltura semplice cellulare bidimensionale (2D) per lo screening di composto, che forniscono risultati limitati valori predittivi di composto efficacia e tossicità per le seguenti fasi di drug discovery2 , 3 , 4. recentemente, tridimensionale (3D) tumore sferoide modelli sono stati sviluppati per fornire i dati fisiologici e farmacologici clinicamente rilevanti per farmaco anti-cancro discovery3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Poiché questi sferoidi possono imitare il tessuto-specifica proprietà di tumori in vivo, quali nutrienti e l'ossigeno gradiente, hypoxic nucleo così come farmaco resistenza19, l'uso di questi modelli potenzialmente possibile abbreviare droga scoperta sequenze temporali, ridurre i costi di investimento e portare nuovi farmaci ai pazienti in modo più efficace. Un approccio critico alla valutazione dell'efficacia di composto in fase di sviluppo di tumore 3D sferoide è monitorare la crescita della sferoide e ricorrenza sotto trattamenti9,26. Per effettuare questa operazione, caratterizzazioni quantitative della morfologia del tumore, che coinvolge il suo diametro e volume, con modalità di imaging ad alta risoluzione, sono di importanza fondamentale.

Modalità di imaging convenzionale, come campo chiaro, contrasto fase7,9,22,24e fluorescenza microscopia8,9,16, 18,22 può fornire una misura del diametro di sferoide ma non riesce a risolvere la struttura complessiva della sferoide nello spazio 3D. Molti fattori contribuiscono a queste limitazioni, tra cui la penetrazione della luce sondaggio in sferoide; diffusione delle tinture fluorescenti in sferoide; che emettono segnali fluorescenti da tinture fluorescenti eccitati all'interno o sulla superficie opposta di sferoide a causa di forte assorbimento e scattering; e profondità-possibilità di risoluzione di queste modalità di formazione immagine. Questo spesso porta a una misura di volume imprecise. Sviluppo del nucleo necrotico in sferoidi imita necrosi in vivo i tumori6,10,15,19,25. Questa caratteristica patologica è improbabile riprodotto in 2D cell culture19,25,27,28. Con una dimensione di sferoide superiore a 500 µm di diametro, una struttura a tre strati concentrica, tra cui uno strato esterno delle cellule di proliferazione, uno strato intermedio di cellule quiescenti e un core necrotico, può essere osservato in sferoide6,10 ,15,19,25, per mancanza di ossigeno e sostanze nutritive. Formazione immagine di fluorescenza cellulare vivi e morti è l'approccio standard per etichettare il contorno del nucleo necrotico. Tuttavia, ancora una volta, penetrazioni di questi coloranti fluorescenti e la luce visibile e ostacolare il potenziale per sondare il nucleo necrotico per monitorare il suo sviluppo nella sua forma attuale.

Un'alternativa 3D modalità di imaging, tomografia a coerenza ottica (OCT) è stato introdotto per caratterizzare le sferoidi di tumore. L'OCT è una tecnica di imaging biomedicina che è in grado di acquisire dati 3D privo di etichetta, non distruttive da fino a 1-2 mm profondità nei tessuti biologici29,30,31,32,33 ,34. L'OCT impiega interferometria di basso-coerenza per rilevare i segnali sparsi indietro da diverse profondità del campione e fornisce immagini ricostruite risolta in profondità a livello di micron risoluzioni spaziali in direzione laterale e verticale. OCT è stato ampiamente adottato in Oftalmologia35,36,37 e angiografia38,39. Gli studi precedenti hanno usato OCT di osservare la morfologia in vitro di sferoidi di tumore nella matrice della membrana basale (ad es., Matrigel) e valutare le loro risposte alla terapia fotodinamica40,41. Recentemente, il nostro gruppo istituito una piattaforma di imaging OCT ad alta produttività per monitorare e quantificare la cinetica di crescita di sferoidi 3D del tumore in piastre multi-pozzetto42sistematicamente. Precisa quantificazione volumetrica di sferoidi tumore 3D utilizzando un voxel contando approccio e rilevamento di tessuto necrotico privo di etichetta in sferoidi basato sul contrasto intrinseco attenuazione ottica sono stati dimostrati. Questo articolo descrive i dettagli di come la piattaforma di imaging OCT è stata costruita e impiegata per ottenere immagini ad alta risoluzione 3D di sferoidi del tumore. Le dettagliate analisi quantitativa della cinetica di crescita di sferoidi 3D del tumore, tra cui misure accurate di diametro sferoide e volumi, è descritto. Inoltre, il metodo di rilevazione non distruttiva delle regioni di tessuto necrotico mediante OCT, basata sul contrasto intrinseco attenuazione ottica è presentato.

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Protocol

1. preparazione delle celle

  1. Ottenere linee cellulari da un fornitore qualificato.
    Nota: Verificare che le cellule da linee cellulari di interesse possono formare sferoide in terreni di coltura o con l'aiuto di un substrato (matrice della membrana basale come Matrigel). Esaminare la letteratura9 o esegue un round di un pre-esperimento per un controllo.
  2. Scongelare le cellule congelate seguendo la procedura specifica fornita dal fornitore linea cellulare. Una procedura generale può essere trovata altrove43.
  3. Coltura delle cellule per 1-2 passaggi in matracci di cultura di 25 cm2 . Le cellule sono quindi pronte all'uso per la coltura cellulare 3D.
  4. Monitorare lo stato di salute delle cellule ogni giorno e mantenerli in un'incubatrice in condizioni standard (37 ° C, 5% CO2, 95% di umidità). Aggiornare i media come necessario.
    Nota: Il terreno di coltura costituito da DMEM (glucosio di 4,5 g/L), 10% di siero fetale bovino, 1% antibiotico antimicotico. Cellule di sottocultura prima che raggiungano la confluenza nella beuta di cultura. Seguire la Guida di riferimento di cultura cellulare fornito dal fornitore. Una procedura generale può essere trovata elsehwhere44.
  5. Eseguire coltura cellulare 3D in piastre multi-pozzetto basati sul seguente protocollo generale9.
    1. Rimuovere il supporto di cultura nel matraccio di cultura e lavare con soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS, riscaldata a 37 ° C).
    2. Risospendere le cellule aggiungendo 1 mL di tripsina acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, 0,5%) nel pallone per 3 min. Aggiungere quindi, terreni di coltura per diluire la tripsina.
    3. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare per 5 min a 500 x g e a temperatura ambiente.
    4. Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con 4 mL di terreno di coltura pre-riscaldato. Dispensare una goccia di campione su un emocitometro per conta cellulare per calcolare la concentrazione cellulare. Diluire le celle a concentrazione appropriata per il seeding (ad es., 3.000 cellule/mL).
      Nota: Ottimizzare la concentrazione iniziale delle cellule di sferoide per ogni linea cellulare e ogni tipo di piastra multi-pozzetto (96 pozzetti, 384 pozzetti o 1536 pozzetti).
    5. Celle di seme in una piastra di multi-pozzetto di fondo tondo attacco ultra-basso (ULA). Aggiungere 200 µ l della sospensione di cellule in ogni pozzetto alla concentrazione di 3.000 cellule/mL, in modo che ognuno ha ben circa 600 celle.
    6. A RT, centrifugare tutta la piastra utilizzando un adattatore piastra per 7 min, giusto dopo la semina, a una velocità di 350 x g o la velocità più bassa disponibile.
      Nota: La centrifuga aiuta a raccogliere le cellule al centro del pozzo per facilitare formando uno sferoide singolo, uniforme. La fase di centrifuga viene eseguita una sola volta all'inizio per formare sferoidi del tumore. Non sarà ripetuta quando sferoidi tumorali iniziano a crescere.
    7. Mantenere la piastra multi-pozzetto a 37 ° C e 5% di CO2 in un incubatore di cultura e aggiornare i terreni di coltura ogni 3 giorni.
      Nota: Tempo di crescita può variare per differenti 3D condizioni di coltura. Nel nostro studio, 3.000 cellule/mL è usato per sia U-87 MG e HCT 116 linee cellulari in piastre da 96 pozzetti, affinché la sferoide può crescere a ~ 500 μm in 4\u20127 giorni per cellule HCT 116. Considerare l'aggiunta di integratori di media e fattori di crescita per i modelli differenti della sferoide, basato sul generale protocollo 3D cultura.
    8. Eseguire imaging OCT di sferoidi tumore ogni giorni 3\u20124 per uno studio longitudinale della loro crescita.
      Nota: Punti di tempo raccomandato per l'imaging OCT sarebbe giorno 4, giorno 7, giorno 11, giorno 14, giorno 18 e giorno 21.

2. high-throughput OCT piattaforma di Imaging

Nota: Vedi riferimento lavoro29,30,31,32,33,34 per una revisione approfondita dei principi e applicazioni di OCT. Vedere Figura 1 e Huang et al. 42 per i dettagli di personalizzazione di Office personalizzato sistema utilizzato in questo studio di imaging.

  1. Scegliere una sorgente di luce a banda larga appropriata per il sistema di OCT per imaging tumorale sferoide.
    Nota: Qui, un diodo superluminescent (SLD, Figura 1A,B) con una lunghezza d'onda centrale di ~ 1.320 nm e ~ 110 nm di larghezza di banda è stata utilizzata come una sorgente di luce a banda larga.
  2. Costruire il braccio di riferimento e campione del sistema OCT seguendo lo schema elettrico (Vedi Figura 1A,B per i dettagli). Vedi la Tabella materiali per un elenco di componenti ottici per costruire il sistema di OCT. Assicurarsi che la lunghezza del percorso ottico del braccio di riferimento e del braccio del campione sono strettamente abbinati.
  3. Costruire lo spettrometro, tra cui un collimatore, una grata, una lente di F-teta e una fotocamera di scansione lineare (Vedi Figura 1 per installazione34) per dettagli di design di spettrometro di ott. in alternativa, selezionare uno spettrometro commerciale che corrisponde alla lunghezza d'onda concentrare della sorgente luminosa. Assicurarsi che lo spettrometro è allineato correttamente per coprire la larghezza di banda intera laser, collezione di fotoni ad alta efficienza e fornire lento sbiaditura di interferenza.
  4. Caratterizzare le prestazioni del sistema OCT, tra cui le seguenti metriche come forza nelle braccia del campione, totale profondità-dipendente sensibilità, profondità, profondità di messa a fuoco e laterale ad alta risoluzione, risoluzione assiale di imaging. Posizionare un riflettore debole (ad esempio, uno specchio con un filtro a densità neutra) come un campione per misurare la profondità-dipendente sensibilità, risoluzione assiale e profondità di fuoco. Inserire una destinazione di grafico del test di risoluzione USAF come il campione per controllare la risoluzione laterale.
    Nota: Vedi riferimenti34,45 per le definizioni delle metriche di performance OCT e protocolli per caratterizzare queste metriche45. Vedere la tabella 1 per un elenco dei parametri misurati per il sistema OCT personalizzato utilizzato nel nostro studio.
  5. Selezionare un traslatore motorizzato per fornire il movimento orizzontale della piastra multi-pozzetto per immagine tumore sferoidi in diversi pozzi (Vedi Figura 1B). Utilizzare un palco con una gamma di corsa maggiore di 108 mm x 72 mm per garantire una completa scansione di tutti i pozzetti della piastra multi-pozzetto. Utilizzare un traslatore motorizzato a 2D o 3D con software di controllo per abilitare la precisa posizione di ciascun pozzetto e automazione del sistema OCT per l'imaging ad alta velocità.
  6. Utilizzare un adattatore piastra o progettare un portatarga (dalla stampa 3D) per tenere la piastra multi-pozzetto in posizione fissa.
  7. Correggere l'inclinazione e la rotazione del piatto multi-pozzetto usando un 2D inclinando il palcoscenico e una fase di rotazione montati sul palco traslazionale (Vedi Figura 1 D), prima di condurre qualsiasi OCT imaging per minimizzare la variazione del piano centrale da diversi pozzi. Utilizzare D2, D6, D11, B6, G6 come i pozzi di guida durante il monitoraggio di loro posizioni relative nelle immagini OCT (Figura 1A).
  8. Regolare la rotazione del piatto per assicurare che i bordi della piastra sono paralleli con la direzione del movimento scenico, in modo che i pozzi rimangano alle stesse posizioni orizzontale nelle immagini OCT (Figura 1E). Regolare l'inclinazione della piastra devono essere paralleli alla tabella ottica affinché i pozzi rimangono nelle stesse posizioni verticali per OCT imaging (Figura 1F).
    Nota: Regolazione dell'angolo di inclinazione e la messa a fuoco aiutano ad ottimizzare la qualità dell'immagine OCT per tutti i pozzi. Tuttavia, variazioni dell'altezza della coltura in diversi pozzetti possono causare cambiamenti nei percorsi ottici che possono portare ad effetti sfocati dell'immagine sferoide. Messa a fuoco automatica può essere attuato per controllare il piano focale di OCT imaging per ottenere una qualità di immagine ottimizzata. Il passo di regolazione non risolve la scarsa qualità di immagine OCT della sferoide di tumore a causa dei seguenti problemi: il decentramento della sferoide grazie alla posizione iniziale di semina; elevazione della sferoide quando incorporato in biofabricated matrici extracellulari; qualità scadente piastra con grandi variazioni dell'altezza dei fondali ben. Software aggiuntivo di controllo con funzioni di messa a fuoco automatica o di auto-allineamento può essere implementato per ottimizzare le prestazioni dello strumento di personalizzazione sistema di imaging.
  9. Utilizzare un programma di computer personalizzati per controllare l'acquisizione di immagini OCT e il movimento di fase per raccogliere dati da ogni bene in sequenza.

3. OCT, scansione e l'elaborazione di tumore sferoidi

  1. Il giorno dell'imaging OCT di sferoidi di tumore, prendere la piastra multi-pozzetto dall'incubatrice. Trasferire la piastra multi-pozzetto sotto il OCT sistema di imaging. Posizionarlo sopra l'adattatore piastra.
    Nota: Formazione immagine OCT di sferoidi di tumore devono essere eseguita con il coperchio in polistirolo piastra on o off. Tuttavia, le condensazioni di acqua sul coperchio a causa dell'evaporazione dai pozzetti possono influenzare la trasmissione della luce e distorcere il percorso della luce, producendo immagini OCT meno ottimale da sferoidi.
  2. Regolare l'altezza della piastra spostando lungo la direzione z della fase di traduzione. Mantenere la posizione del piano focale a ~ 100 – 200 μm sotto la superficie superiore di ogni sferoide, per ridurre al minimo l'effetto di non-uniforme depth-wise profilo focale.
  3. Impostare un corretto intervallo scansione OCT (ad es., 1 x 1 mm) nel software personalizzato per coprire la sferoide di intero tumore secondo le sue fasi di sviluppo. Fare clic su Salva parametri per salvare l'impostazione.
  4. Utilizzare il software personalizzato per acquisire immagini OCT 3D di sferoidi tumore uno per tutti i pozzetti della piastra che contengono sferoidi. Fare clic sul pulsante Anteprima per visualizzare l'immagine di anteprima e fare clic sul pulsante Acquisisci per acquisire l'immagine OCT.
    Nota: Assicurarsi che i dati di sferoide OCT sono raccolti quando il palco non è in movimento. La sferoide è solitamente situata al centro della U-fondo. Tuttavia, la sferoide potrebbe essere spostata nel mezzo di coltura, quando il palco è accelerazione o decelerazione a causa dell'inerzia della sferoide in terreni di coltura.
  5. Processo 3D OCT DataSet di sferoidi di tumore per generare immagini strutturali di ottobre con un codice di elaborazione personalizzata di C++. Per un diagramma di flusso di post-processing dei dati OCT, vedere Figura 2A .
    Nota: Vedi Figura 4A per le immagini generate 3D OCT strutturali.
    1. Vedere il capitolo 5 di Drexler e Fujimoto34 e Jian et al. 46 per una descrizione di dettaglio delle operazioni post-elaborazione dei dati di OCT. Calibrare le dimensioni dei pixel in tutte e tre le dimensioni. Ri-scalare le immagini strutturali di ottobre sulle scale corrette.
      Nota: La distanza in direzione assiale (direzione z) di immagini di ottobre è una misura la differenza di cammino ottico tra il braccio di riferimento e campione. Così, l'indice di rifrazione del campione (n) deve essere presi in considerazione quando la dimensione in pixel in direzione assiale per il ridimensionamento di calibratura. Nel nostro studio, usiamo n = 1.37 come l'indice di rifrazione del tumore sferoide42.
  6. Generare il collage di immagini di sferoide utilizzando immagini OCT 2D in tre piani XY, XZ e YZ a sezione trasversale attraverso il baricentro della sferoide. Vedere Figura 3E per l'output rappresentanza di collage di immagini di sferoide. Eseguire la registrazione di immagine per tutti gli sferoidi, utilizzando la funzione MATLAB dftregistration47, per garantire che i centroidi di tutti la sferoide si trovano approssimativamente nella stessa posizione.
  7. Ottenere rendering 3D di sferoide utilizzando un software commerciale o personalizzato.
    Nota: I passaggi seguenti mostrano come ottenere il rendering 3D di sferoidi tumore utilizzando un software commerciale.
    1. Caricare i dati di OCT 3D nel software.
    2. Fate clic sul pannello Surpass . Quindi, fare clic su Aggiungi nuovo Volume. Scegliere il metodo di fusione da utilizzare per il rendering 3D.
    3. Regolare l'angolo di visualizzazione trascinando l'immagine utilizzando il puntatore del mouse.

4. quantificazione morfologica del tumore 3D sferoidi

Nota: Un codice personalizzato scritto in MATLAB elabora questa quantificazione. Fare clic sul pulsante Esegui per avviare il processo. Vedi Figura 2B per il diagramma di flusso dei passaggi di quantificazione morfologica di sferoidi.

  1. Quantificare sferoide diametro, altezza e diametro-based del volume.
    1. Selezionare immagini OCT 2D in tre piani XY, XZ e YZ cross-sectional che attraversano il baricentro della sferoide.
    2. Misurare il diametro e l'altezza di sferoide nei piani XY e XZ, rispettivamente.
    3. Calcolare sferoide basata su diametro volume tramite: Equation 1 , con una presunzione di forma sferica del tumore.
  2. Quantificare il volume di voxel-based sferoide.
    1. Applicare un filtro di media 3D sui dati strutturali OCT di sferoide per rimuovere le macchioline.
    2. Segmento sferoidi tumore utilizzando il filtro di Canny edge rilevamento48 , fotogramma per fotogramma, con un'adeguata soglia che separa la regione di sferoide di tumore dal fondo ben.
    3. Gruppo connettivo voxel per dati 3D (vedere funzione incorporata: bwconncomp).
    4. Calcolare la distanza media tra ogni voxel connettivo nel gruppo e il centroide di sferoide (scelti manualmente), per ogni gruppo. Identificare l'area di sferoide come il gruppo con la minima distanza media.
    5. Contare il numero di voxel all'interno della regione di sferoide e quindi moltiplicare per il volume effettivo di un singolo voxel (volume/voxel), producendo il volume totale della sferoide.

5. dead-cella regione rilevazione del tumore 3D sferoidi

Nota: In un mezzo omogeneo, intensità retro-sparsi di OCT rilevato in funzione della profondità (io(z)) può essere descritta dalla legge di Lambert-Beer49: Equation 2 , dove z rappresenta la profondità, μ è l'attenuazione ottica coefficiente, e ho0 è l'intensità incidente al campione. Quindi il coefficiente di attenuazione ottica derivata può essere espresso come: Equation 3 . Dal momento che immagini di ottobre vengono spesso tracciati su una scala logaritmica, la pendenza del profilo intensità OCT può essere recuperata per ricavare il coefficiente di attenuazione ottica. Vedere Figura 2 per un diagramma di flusso della generazione delle mappe attenuazione ottica.

  1. Eseguire la segmentazione per rimuovere aree indesiderate di fuori della sferoide. Eseguire 3D filtro medio per sopprimere il rumore di macchiolina che è insito nelle immagini OCT.
  2. Pixel-wise ottenere i coefficienti di attenuazione ottica di lineare montaggio del profilo di intensità scala logaritmica OCT sopra una certa gamma di profondità (finestra mobile), estrarre il relativo pendio e moltiplicare la pendenza -1/2.
    Nota: Il coefficiente di attenuazione a ciascun voxel all'interno della regione segmentata sferoide è calcolato basato sul versante del profilo di intensità OCT in una finestra di profondità 10-voxel (~ 40 μm in profondità), con i voxel situato al centro della finestra.
  3. Applicare i metodi di cui sopra (punti 5.1 e 5.2) a ogni scansione assiale in una cornice e ogni fotogramma in un dataset 3D contenente la regione segmentata sferoide, fino a quando vengono calcolati i coefficienti di attenuazione ottica per tutti i voxel della regione segmentata sferoide.
  4. Eseguire il binaria soglia per evidenziare la regione alta-attenuazione.
    Nota: Vedere Huang et al. 42 per la determinazione della soglia della regione alta-attenuazione utilizzando analisi Istogramma.
  5. Evidenziare la mappa di attenuazione ottica binarizzato sull'immagine originale per etichettare la regione di morti-cella (blending). Generare l'immagine 3D-rendering della mappa blended attenuazione per visualizzare la distribuzione 3D della regione morti-cella.

6. istologia ed immunoistochimica

Nota: L'istologia e immunohistochemistry (IHC) macchiato immagini di sferoidi di tumore sono ottenuti per correlare con i risultati corrispondenti di OCT.

  1. Intervalli di tempo selezionati, selezionare sferoidi di tumore di 1-2 dalla piastra multi-pozzetto per istologia e colorazione IHC. Utilizzare una pipetta con le punte di Pipetta 1ml per trasferire la sferoide dal pozzo a una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
    Nota: Tagliare la punta della pipetta 1ml prima del trasferimento per garantire che l'apertura della punta è maggiore della dimensione della sferoide di tumore per evitare di danneggiare la struttura della sferoide.
  2. Raccogliere ogni sferoide di tumore in un tubo del microcentrifuge singolo 1,5 mL riempita con formaldeide al 10% e correzione per 48 h.
  3. Eseguire i processi IHC e istologia per ogni sferoide, utilizzando tecniche di inclusione a paraffina standard.
    Nota: Macchia 5 μm sezioni spesse di sferoidi di tumore per ematossilina ed eosina (H & E) e terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling rilevazione di apoptosis (TUNEL). Una colorazione di contrasto dell'ematossilina è applicato a TUNEL. Un scanner per diapositive digitale era usato per analizzare il campione macchiato e ottenere alta risoluzione istologica e immagini IHC.

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Representative Results

Formazione immagine di tomografia ottica di coerenza di elevato Throughput di sferoidi in una piastra a 96 pozzetti

Figura 3 presenta il risultato della scansione di una piastra a 96 pozzetti con sferoidi tumore HCT 116 il giorno 3 di HT-OCT. La scansione sequenza di tutta la piastra inizia dal pozzo inferiore destro (H12). Figura 3B Mostra il diagramma di flusso di implementazione del software del sistema HT-OCT. Dopo uno sferoide dati sono stati raccolti e trattati, la piastra si muoverebbe in avanti bene, attendere per ~ 2 s per consentire la sferoide riposare e raccogliere i dati di sferoide successivi. Ciascun PTOM dati costituiti da 400 x 400 x 1024 voxel, che ha corrisposto ad un volume effettivo di 1.0 x 0,84 x 2,3 mm3. Figura 3 Mostra un collage di face it immagini OCT HCT 116 sferoidi generati da dati trattati. Il risultato è paragonabile con le immagini da altri 2D ad alta velocità imaging system22. Data la capacità di imaging 3D di personalizzazione di Office, potremmo anche generare il collage di immagini 2D sferoide a sezione trasversale da 96 pozzetti (Figura 3D) per monitorare altezze sferoide e visualizzare le disomogeneità di sferoide in direzione verticale. Un collage di immagini 3D-rendering sferoide è fattibile anche da qualsiasi angolazione predefiniti (Figura 3E) per visualizzare la forma nel complesso 3D e valutare la rotondità della sferoide. Si noti che il generale OCT imaging e processo di tempo per la piastra a 96 pozzetti intero sarebbe 21 ~ e ~ 25 min quando la fotocamera linea-scan è in esecuzione ad una velocità di 92 e 47 kHz, rispettivamente. Per un esempio, vedere Video 1 .

Longitudinale morfologiche e fisiologiche monitoraggio della sferoide tumore

Dopo che abbiamo ottenuto le immagini strutturali OCT di sferoidi del tumore dalla piastra per più punti di tempo, abbiamo potuto analizzare ulteriormente questi dati quantificando le informazioni morfologiche e fisiologiche di sferoidi del tumore. La figura 4 Mostra i diversi approcci per caratterizzare sferoidi di tumore e ottenere da loro informazioni morfologiche e fisiologiche longitudinale.

Figura 4B Mostra diversi modi per visualizzare la sferoide di tumore. Con l'ausilio del software sia commercio che gratuito, abbiamo potuto caricare i dati 3D nel software e creare un "volume" di sferoide il tumore (rendering 3D), che mostra la struttura generale della sferoide di tumore nello spazio 3D. Con adeguata soglia, abbiamo potuto generare una trama superficiale della sferoide di tumore (Figura 4B), che poteva essere utilizzata per segmentare la sferoide e misurare il volume. Potremmo anche generare le diapositive ortogonale (ortho diapositive) da differenti sezioni aerei in diversi orientamenti (Figura 4B, XZ, YZ e XY) e misurare il diametro e l'altezza della sferoide di tumore da queste diapositive ortho.

Raccogliendo i dati di OCT della sferoide stesso da più punto di tempo, potremmo quantificare le informazioni morfologiche e generare la curva di crescita di sferoide per mostrare i suoi cambiamenti longitudinali. Figura 4 Mostra dati rappresentativi di uno sferoide di tumore HCT 116 monitorato per 21 giorni. Dai dati segmentati e diapositive ortho, abbiamo misurato il diametro, l'altezza e la voxel-based del volume della sferoide per tutti i punti di tempo, che sono stati elencati nella tabella. Abbiamo anche calcolato il volume base di diametro per un confronto. Le curve di crescita in dimensioni e volume sono state tracciate, rispettivamente. Le curve di crescita, abbiamo potuto vedere che questa sferoide di tumore HCT 116 ha seguito un modello di crescita lineare nel volume prima di giorno 11. Prima di questo punto di tempo, la sferoide tenuto in crescita e mantenuto una forma relativamente uniforme. Tuttavia, dopo il giorno 11, la sferoide è diventato perturbata, appiattita e completamente crollata il giorno 21. La curva di crescita dei volumi di voxel-based mostra chiaramente la tendenza, con una graduale diminuzione dei volumi dopo giorno 11.

Base ai dati di OCT, possiamo ottenere anche le informazioni fisiologiche della distribuzione delle cellule morte all'interno di sferoidi tumore analizzando l'attenuazione ottica pixel-per-pixel dalle immagini a sezione trasversale 2D. Seguendo le modalità illustrate nella Figura 2 e 5 del protocollo, potremmo quantitativamente determinare le regioni di morti-cella e monitorare la crescita di queste regioni come funzione del tempo. Figura 4 Mostra un risultato rappresentativo di monitoraggio longitudinale dell'aumento di morti-cella aree nella sferoide di tumore. Le aree evidenziate in rosso, che ha avuto alta attenuazione ottica, mostrano le aree necrotiche con etichettate. Dal 3D rendering attenuazione ottica mappa durante lo sviluppo di 14 giorni, abbiamo potuto vedere il settore rosso in espansione, indicando l'aumento delle regioni necrotiche. Come la percentuale delle zone necrotiche è aumentato, la sferoide di tumore non potrebbe effettuare una forma perfetta. Di conseguenza, essi tendono a disgregare e crollo, che sono stati veduti nel monitoraggio longitudinale della morfologia del tumore in Figura 4.

La tecnica di rilevamento regione proposta di tessuto morto non distruttivo è stata verificata confrontando la mappa di attenuazione ottica OCT di sferoide tumore HCT 116 con corrispondenti immagini ottenute dall'istologia e IHC. Figura 4 presenta tale confronto con uno sferoide di giorno 14 HCT 116. Una buona corrispondenza tra l'attenuazione OCT mappa e corrispondente H & E e TUNEL fette sono stati trovati, che è stato indicato analizzando le caratteristiche all'interno delle regioni a fette H & E e TUNEL, segnate da dash linee derivate dal contorno di elevata attenuazione OCT regioni. In fette di H & E, le regioni di tessuto morto sono state indicate da meno denso e aggregato struttura che si trova all'interno della regione di linea tratteggiata. A fette TUNEL, una buona partita è stata osservata fra alta attenuazione regione e regione cellulare apoptotica TUNEL-etichettati.

Figure 1
Figura 1: costruzione di un sistema di tomografia (HT-OCT) coerenza ottica ad alta velocità per imaging tumorale sferoide. (A) schemi del sistema HT-OCT. Accanto al sistema di OCT viene tracciato un diagramma della piastra 96 pozzetti. Cinque pozzi (D2, D11, B6, D6, G6) contrassegnati in giallo sono utilizzati per la regolazione fine delle fasi (D). (B) la configurazione attuale del sistema HT-OCT. Vedi Tabella materiali per componenti ottici utilizzati per ogni parte del sistema. (C) spettrometro di design per il sistema HT-OCT. (D) fase di installazione per il sistema HT-OCT. Corretto allineamento del Stadio 6-assi e la sincronizzazione tra l'acquisizione di OCT e il movimento di fase sono necessari per l'imaging ad alta velocità. (E) e (F) mostrano gli effetti di rotazione e inclinazione su immagine finale di diversi pozzi. Rotazione provoca le immagini OCT diversi pozzi a spostare orizzontalmente mentre inclinando porterà a spostamento verticale dei diversi pozzi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: elaborazione di dati per immagini di ottobre di sferoidi tumore. (A) diagramma di flusso della procedura generale post-elaborazione per dati OCT. (B) diagramma di flusso di quantificazione morfologica della sferoide tumore. Diagramma di flusso (C) di rilevamento regione cellula morta della sferoide tumore. Barra della scala: 100 µm per tutti i sottofigure. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: OCT ad alta velocità di scansione di un 96 ben piastra contiene U-87 MG tumore sferoidi. (A) l'installazione effettiva con il 96-ben piatto sotto l'obiettivo. (B) diagramma di flusso di implementazione del software di sistema HT-OCT. Collage di 96 en face (C), della sezione trasversale (D) e proiezione 3D rendering massima intensità (MIP) (E) OCT immagini di giorno 3 HCT 116 sferoidi sono stati generati dai dati elaborati. Barra della scala: 200 µm per tutti i sottofigure. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: longitudinale morfologiche e fisiologiche quantificazione del tumore sferoidi con dati 3D OCT. (A), ottenute 3D immagini strutturali di ottobre di uno sferoide di tumore dopo post-un'elaborazione generale del OCT. Dai dati OCT, possiamo generare una trama di superficie 3D e sezioni ortogonali XZ, YZ e XY per visualizzare la struttura della sferoide di tumore in qualsiasi direzione (B). Possiamo eseguire monitoraggio longitudinale di uno sferoide di singolo tumore (C), che caratterizzano il suo diametro, altezza e voxel-based del volume (elencati in Tabella materiali) e tracciare le curve di crescita in dimensioni e volume durante i 21 giorni sviluppo. Nell'esempio, come la sferoide sviluppata, è diventato interrotto il giorno 11 e completamente crollato il giorno 21. Possiamo monitorare ulteriormente lo stato fisiologico di uno sferoide di tumore longitudinalmente basato sul contrasto attenuazione ottica intrinseca (D). 3D renderizzate di immagini di uno sferoide di tumore ha mostrato l'aspetto e la crescita delle regioni morti-cellula dal giorno 7 al giorno 14. Le aree di morti-cella alta-attenuazione-contrassegnati in rosso sono state abbinate con istologica e immunoistochimica (IHC) risultati. Mappa di attenuazione di OCT, H & E e TUNEL risultato nella Figura 4 vengono modificati da Ref. 42. Scala bar: 100 µm per tutti i sottofigure. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1
Video 1: formazione immagine OCT High-throughput di sferoidi tumore. Un flusso di lavoro di imaging OCT 3D, elaborazione di base OCT e movimento scenico è stato presentato nel video con una velocità di 5x. Sono state presentate anche le anteprime delle immagini strutturali elaborate OCT di sferoidi. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

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Discussion

Attività del tumore è molto importante per la sua struttura morfologica. Simile alla curva di crescita caratteristici per colture cellulari 2D di monitoraggio, rilevamento la curva di crescita per sferoidi 3D del tumore è anche un approccio convenzionale per caratterizzare il comportamento di crescita a lungo termine della sferoide per differenti linee cellulari. In particolare, noi possiamo caratterizzare la risposta di droga analizzando la degradazione del tumore o ricrescita del tumore riflettuto direttamente la curva di crescita. Pertanto, la valutazione quantitativa di sferoidi 3D del tumore, tra cui la dimensione e il volume, per ricavare la curva di crescita, è di grande importanza per la caratterizzazione di sferoidi del tumore e la valutazione dell'effetto composto. Attualmente, piattaforme di imaging basata su campo chiaro, contrasto di fase o formazione immagine di fluorescenza sono stati stabiliti per l'imaging di routine e analisi della morfologia o funzioni del tumore 3D sferoidi8,9,18, 22. Tuttavia, essi sono in grado di risolvere la struttura intera, grande tumore a causa della penetrazione di profondità limitata, così come profondità-possibilità di risoluzione a bassa risoluzione. Nei risultati rappresentativi, abbiamo dimostrato OCT per visualizzare l'intera struttura 3D della sferoide di tumore sviluppando nel tempo. Imaging 3D OCT potrebbe fornire la vista della sferoide in qualsiasi orientamento e qualsiasi sezione trasversale con possibilità di alta risoluzione, che non era disponibile in modalità di imaging convenzionale che mancano la risoluzione lungo la profondità. Inoltre, quantificazione di voxel-based del volume basato su dati 3D OCT ha reso un'accurata quantificazione dei volumi di sferoide senza assumere loro forme originali. Di conseguenza, abbiamo dimostrato che l'OCT è una robusta modalità di imaging per la caratterizzazione della morfologia 3D di sferoidi del tumore, che assicura misurazioni accurate di modelli di crescita caratteristici per diverse linee cellulari e potenzialmente può servire come un alternativa per la valutazione della risposta di droga.

Test di vitalità tramite colorazione fluorescente rimangono un approccio popolare per analisi funzionali delle sferoidi di tumore, soprattutto per lo screening di18. Tuttavia, la natura dirompente di coloranti fluorescenti indica che questi test sono adatti solo per studi di end-point. Nei nostri risultati rappresentativi (Figura 4), abbiamo dimostrato un metodo alternativo che possa caratterizzare la vitalità cellulare entro l'intera sferoide. I nostri risultati hanno dimostrato che OCT ha potuto distinguere la regione di morti-cella dalla regione praticabile in sferoide basata sul contrasto di attenuazione ottica intrinseca. Inoltre, con capacità di imaging 3D e la natura distruttiva del sistema OCT, valutazione quantitativa delle distribuzioni morti-cella e monitoraggio della progressione delle regioni di morti-cella all'interno della sferoide in situ sono fattibili, che potenzialmente fornire informazioni più preziose del modello di crescita di sferoide. Tuttavia, notiamo che, nei nostri risultati rappresentativi, non siamo in grado di distinguere diversi tipi di modalità di morte cellulare, come apoptosi e necrosi, nella mappa di attenuazione del binaria OCT.

Poiché un farmaco composto biblioteca può essere estesa (> 10.000), un sistema ad alta produttività e robusto per caratterizzare sferoidi di tumore in piastre multi-pozzetto durante lo screening di stupefacenti è imperativo. L'attuale sistema di imaging ad alta velocità può raggiungere uno screening della piastra intera 96 pozzetti in < 5 min in 2D scansione modalità22. OCT può essere adattato per scopo di screening ad alta resa, con l'ausilio di un tavolino motorizzato. Uno può anche ottenere un sistema OCT commercialmente disponibile (Vedi Tabella materiali per un elenco dei sistemi commerciali di OCT) con una performance simile al nostro sistema personalizzato di OCT e incorporare un tavolino motorizzato nel sistema. Tuttavia, gli sforzi occorre modificare il sistema commerciale di OCT per integrare il tavolino motorizzato. Inoltre, l'implementazione di software personalizzato per realizzare la sincronizzazione tra il trigger di acquisizione OCT e grilletto movimento è necessaria. Per il nostro prototipo sistema HT-OCT, ci sono voluti 2-18 secondi per acquisire dati OCT 3D da uno sferoide di singolo tumore, a seconda della velocità della macchina fotografica. Così, il tempo di acquisizione totale può essere più breve ~3.2 min per una piastra a 96 pozzetti utilizzando il sistema HT-OCT. Tuttavia, i passaggi intermedi per l'attuale sistema HT-OCT, inclusa l'elaborazione di dati, leggere e scrivere dati su dischi rigidi e spostamenti di fase è rimasto molto tempo. Sarebbero necessari ulteriori ~ 18 min in cima il tempo di acquisizione dati minimi di ~3.2 min. Totale tempo di imaging può essere ulteriormente ridotto in diversi aspetti: utilizzare state-of-the-art OCT sistemi dotati di una fonte laser sintonizzabile ad alta velocità50,51; ottimizzate il flusso di lavoro organizzando passaggi critici (acquisizione dati, elaborazione dati, scrittura, movimento scenico) lavorano in parallelo; impiegare un imaging OCT parallelo con un space division multiplexing installazione52. Con ottimizzazione del sistema, il sistema di OCT ad alta velocità possa essere utilizzato nella scoperta della droga di cancro così come la caratterizzazione di altri esempi di bio-fabbricato 3D (ad es., tessuto 3D organoids) per varie applicazioni biomediche.

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Disclosures

Gli autori non divulgare alcun interesse concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da NSF concede IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (IIP-1640707), fondo di avvio di NIH sovvenzioni, R21EY026380, R15EB019704 e R01EB025209 e Lehigh University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom Spectral Domain OCT imaging system Developed in our lab
Superluminescent Diode (SLD) Thorlabs SLD1325 light source
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio AC Photonics WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Focusing Lens Thorlabs
Kinematic Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
1D Translational Stage Thorlabs
Continuous neutral density filter Thorlabs
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Sample Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Galvanometer Thorlabs
Relay Lens Thorlabs AC254-100-C two Relay lens to make a telescope setup
Triangle Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
Objective Mitutoyo
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Polarization Controller Thorlabs
30mm Cage Mount Thorlabs
Cage Rod Thorlabs
Stage
3D motorized translation stage Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. JTH360XY
2D Tilting Stage
Rotation Stage
Plate Holder 3D printed
Spectrometer
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Grating Wasatch G = 1145 lpmm
F-theta Lens Thorlabs FTH-1064-100
InGaAs Line-scan Camera Sensor Unlimited SU1024-LDH2
Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Component
HCT 116 Cell line ATCC CCL-247
Cell Culture Flask SPL Life Sciences 70025
Pipette Fisherbrand 14388100
Pipette tips Sorenson Bioscience 10340
Gibco GlutaMax DMEM Thermo Fisher Scientific 10569044
Fetal Bovine Serum, certified, US origin Thermo Fisher Scientific 16000044
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) Thermo Fisher Scientific 15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3120
Gloves VWR 89428-750
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Transfer pipets Globe Scientific 138080
Centrifuge Eppendorf 5702 R To centrifuge the 15 mL tube
Centrifuge NUAIRE AWEL CF 48-R To centrifuge the 96-well plate
Microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Histology & IHC
Digital slide scanner Leica Aperio AT2 Obtain high-resolution histological images
Histology Service Histowiz Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid
Name Company Catalog Number Comments
List of Commerical OCTs
SD-OCT system Thorlabs Telesto Series
SD-OCT system Wasatch Photonics WP OCT 1300 nm
Name Company Catalog Number Comments
Software for Data Analyses
Basic Image Analysis NIH ImageJ Fiji also works.
3D Rendering Thermo Fisher Scientific Amira Commercial software. Option 1
3D Rendering Bitplane Imaris Commercial software. Option 2. Used in the protocol
OCT acquisition software custom developed in C++.
Stage Control Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. MRC_3 Incorporated into the custom OCT acquisition code
OCT processing software custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code.
Morphological and Physiological Analysis custom developed in MATLAB

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